JPH04278087A - 新規ヘパリチナーゼ、その製造法及びその生産菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヘパラン硫酸及びヘパ
リンを分解する新規酵素ヘパリチナーゼ類、それらの製
法及びそれらの生産菌に関する。

【０００２】ヘパリチナーゼは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンとウロン酸との二糖単位の繰り返しを基本構
造とする、複合多糖であるヘパラン硫酸（以下ＨＳと略
す）やヘパリン（以下Ｈｅｐと略す）のグルコサミニド
結合を切断する酵素で、ＨＳやＨｅｐの生体内での機能
あるいは生体成分中のこれら物質の分析研究試薬として
有用である。また、近年、抗血栓剤として開発が進めら
れている低分子ヘパリン調製時の低分子化剤として、あ
るいは体外循環装置による治療の際問題となるＨｅｐの
副作用を軽減するための素材（Ｈｅｐ除去剤）としても
有用性が注目されており、診断、治療の目的に多様な用
途が期待される。

【０００３】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】これら
用途に用いうる酵素は、糖鎖に結合する硫酸基の有無、
結合位置など、糖鎖構造の違いを認識する種々の基質特
異性の異なるヘパリチナーゼを取り揃えることが必要で
あり、また、酵素源としては安定的に大量供給出来るも
のが望ましい。かかる観点から、本発明者らは上記用途
を満足する酵素を微生物起源に求め、該酵素生産菌を検
索し、既にフラボバクテリューム属細菌からヘパリチナ
ーゼを三種見いだした（特開平２−５７１８３号）。

【０００４】微生物起源のヘパリチナーゼに関して精製
や性質まで詳細に言及した報告としては、他にフラボバ
クテリューム属細菌やバチルス属細菌などから採取した
酵素が知られ、例えば第１０回国際グリココンジュゲー
トシンポジウム要旨集〔３３０頁、１９８９年〕や特開
平２−１４２４７０号公報に開示されている。これら公
知の酵素類は上記の目的のために有用であるが、更に基
質特異性の異なる新規ヘパリチナーゼが上記の目的達成
のために求められている。

【０００５】本発明者らはかかる理由から、更に新規ヘ
パリチナーゼ生産菌を広く自然界に検索した結果、埼玉
県下の土壌から分離したバチルス・サーキュランス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＨｐＴ２９８
菌株が新規ヘパリチナーゼを生産する能力を持つことを
見いだした。これらヘパリチナーゼを分画・精製し、理
化学的性質や特異性の異なる４種の新しいヘパリチナー
ゼを単離した。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記のような
課題を解決するためになされたもので、ＨＳおよびＨｅ
ｐを分解する新規酵素、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリ
チナーゼＴ−ＩＩ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ　及びヘ
パリチナーゼＴ−ＩＶ（以下、本酵素類と呼ぶ）に関す
るものであり、また本酵素類の生産能を有するバチルス
属の細菌から本酵素類を効率よく製造する方法に関する
ものである。以下に本発明を更に詳細に説明する。

【０００７】本酵素類の生産に用いる微生物は、本酵素
類の生産能を有するバチルス属細菌であればいずれの菌
株でもよいが、本発明の実施例に用いたバチルス・サー
キュランスＨｐＴ２９８株は本発明者らがＨｅｐ資化性
菌の検索によって埼玉県下の土壌から分離した新菌株で
、その菌学的性質は次の通りである。

【０００８】（Ａ）　　形態学的性質 グラム染色　　　　　　　　：　　陰性細胞の形状　　
：　　桿菌（０．４〜０．５μｍ×２．０〜３．６μｍ
） 胞子形状　　　　　　　　　　：　　卵円形胞子嚢の膨
潤　　　　　　：　　陽性 パラ胞子クリスタル：　　陰性 運動性　　　　　　　　　　　　：　　陽性

【０００９
】 （Ｂ）　　生育特性 　　　　　　　　　　好気的生育　　　　　　　　：　
　陽性　　　　　　　　　　嫌気的生育　　　　　　　
　：　　陰性　　　　　　　　　　生育温度　　　　１
５℃：　　陽性　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２０℃：　　陽性　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　３０℃：　　陽性　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　４０℃：　　陽性　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０℃：　　
陽性　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
１℃：　　陽性　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　５２℃：　　陰性　　　　　　　　　　リゾチ
ーム（０．００１％）存在下での生育：　　陽性　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮａＣｌ
存在下での生育　　２％：　　陽性　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　５％：　　陰性　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　７％：　　陰性
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ｐＨ６．８（栄養培地）での生
育：　　陽性　　　　　　　　　　ｐＨ５．７（サブロ
ーデキストロース培地）での生育：　　陽性　　　　　
　　　　　生育ｐＨ　　：　　５．０〜９．０、特に６
．５〜７．５が最適　　　　　　　　　　ＮａＣｌ及び
ＫＣｌの要求性：　　陰性

【００１０】（Ｃ）　　生理
学的性質及びその他の性質カタラーゼ　　　　　　　　
：　　陽性Ｖ−Ｐ試験　　　　　　　　：　　陰性Ｖ−
Ｐ培地でのｐＨ：　　６．０以下 酸生成 Ｄ−グルコースから　　：　　陽性 Ｄ−キシロースから　　：　　陽性 Ｄ−マンノースから　　：　　陽性 Ｌ−アラビノースから：　　陽性 Ｄ−マンニトールから：　　陽性 ソルビトールから　　　　：　　陰性 Ｄ−グルコースからのガス生成：　　陰性インドール生
成　　　　：　　陰性 カゼインの加水分解：　　陰性 デンプンの加水分解：　　陽性 チロシンの分解　　　　：　　陰性 フェニルアラニンの脱アミノ反応：　　陰性硝酸塩の還
元　　　　　　：　　陽性 クエン酸の資化性　　：　　陽性 プロピオン酸の資化性：　　陰性 ヘパリンの資化性　　：　　陽性 ヘパラン硫酸の資化性：　　陽性 コンドロイチン硫酸の資化性：　　陽性ケラト硫酸の資
化性：　　陰性 グアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量：　　５３．０モル
％主たるイソプレノイドキノン：　　メナキノン−７（
ＭＫ−７） 細胞壁ペプチドグリカン中のジアミノピメリン酸（ＤＡ
Ｐ） ：　　ｍｅｓｏ−ＤＡＰ

【００１１】上記の菌学的性質を有するＨｐＴ２９８株
の分類学上の位置を、バージェイズ・マニュアル・オブ
・システマテック・バクテリオロジー、第１版、第２巻
（１９８６年）を参照して検討すると、本菌は運動性を
有する好気性グラム陰性桿菌で芽胞を形成し、主たるイ
ソプレノイドキノンがメナキノン−７であり、細胞壁の
ペプチドグリカンにｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を含
むことから、バチルス属に属する菌株と判定された。更
にその他の性質をバチルス属の公知種と比較すると、本
菌株はバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の種に属すると同定された。し
かしながら、公知のバチルス・サーキュランス菌株、例
えばＩＦＯ１３６３２、ＩＦＯ１３６３５及びＩＦＯ１
３６３６は本発明の酵素を生産せず、この点で公知の菌
株と区別される新菌株である。

【００１２】バチルス属のＨＳ及びＨｅｐの分解酵素生
産菌は、バチルス・ＳＰ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｐ）Ｂ
Ｈ１００株が知られているが（特開平２−１４２４７０
号）、嫌気条件での生育、最高生育温度、Ｖ−Ｐ培地で
のｐＨ、デンプンの加水分解能、ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量
の項目で試験結果が異なることから明らかなように、前
記ＨｐＴ２９８株はＢＨ１００株とは相違する。なお、
前記ＨｐＴ２９８株は工業技術院微生物工業技術研究所
に微生物受託番号第１１９８３号として寄託されている
。

【００１３】本発明の新規なヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘ
パリチナーゼＴ−ＩＩ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ　及
びヘパリチナーゼＴ−ＩＶは、バチルス・サーキュラン
スＨｐＴ２９８株あるいはバチルス属に属する本酵素類
生産菌を、通常微生物の培養に用いられる栄養培地、好
ましくは酵素生産能を高めるためにＨｅｐやＨＳあるい
はこれらを含む物質を添加した培地で培養することによ
り、培地液あるいは菌体中に生産蓄積されるので、公知
の方法で精製酵素を得ることができる。

【００１４】更に具体的に説明すると、バチルス属に属
する本酵素生産菌を適当な栄養培地、例えば適当な炭素
源、窒素源、無機塩類とＨｅｐやＨＳあるいはこれらを
含む物質などを含む培地で菌を培養し、本酵素類を培地
中か菌体中に生産蓄積させる。炭素源としては、資化で
きるものはいずれの物質も利用でき、例えば、Ｄ−グル
コース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビ
ノース、Ｄ−マンニトール、澱粉及びその加水分解物、
糖蜜、クエン酸塩、各種ペプトン類などが挙げられる。 窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、各種ペプト
ン類、各種肉エキス類、大豆粉、脱脂大豆粉、コーンス
テープリカー、アミノ酸溶液、アンンモニウム塩など有
機無機の窒素化合物又はこれら含有物が利用できる。無
機塩としては、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウム
、ナトリウム、カルシウムなどの塩類が使用される。 そして更に必要に応じて菌の生育あるいは酵素生産に必
要な各種の無機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ
油、各種界面活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に
添加することができる。

【００１５】本発明においては、本酵素類の誘導物質と
してＨｅｐやＨＳまたはそれらを含有する物質を添加す
れば大量に本酵素類を生成させることができる。これら
誘導物質の添加は培養当初からでも培養途中に行っても
よい。添加量としてはＨｅｐやＨＳとして通常０．２％
〜２％添加すれば良い結果が得られる。

【００１６】培養の形態は液体培養でも固体培養でもよ
いが、通常は液体培養が好適であり、工業的には深部通
気撹拌培養を行うのが有利である。本発明における培養
条件は、本酵素類の生産に最も有利な条件を適当に選択
、調節して行う。培養温度は１５〜５１℃の範囲内で適
宜変更することができるが、特に好ましいのは４０〜４
５℃である。培養時間は培養条件によって異なるが１〜
２日程度であって、本酵素類が最高蓄積量になる時期に
培養を終了すればよい。培地のｐＨは培地調製時に中性
付近にあればよく、通常の場合特に調節の必要はない。

【００１７】このようにして得た培養液の上清液及び菌
体抽出液の双方から前記４種の酵素を得ることができる
。培養上清液については、硫酸アンモニウムを加え、０
．６飽和として析出した沈澱物を透析した後、ハイドロ
キシアパタイト、イオン交換樹脂、ゲルろ過剤、吸着剤
を用いて酵素を分画精製する。また、菌体内酵素につい
ては、菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波または機械
的破砕法によって菌体を破壊して酵素を抽出した後、そ
の遠心上清液を培養上清液に用いたのと同様の手法によ
り精製できる。しかし、これら精製の手法により本発明
は何ら制約を受けるものではない。

【００１８】これら酵素の力価は、本酵素類がいずれも
ヘキサミニド結合に作用するリアーゼであり、切断部の
断端のウロン酸の４位と５位の炭素に二重結合が作られ
紫外吸収を持つことを利用し、その増大を測定すること
により求められる。

【００１９】酵素の基質には、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、
ヘパリチナーゼＴ−ＩＩ及びヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ
　については、ウシ腎臓由来のＨＳを、ヘパリチナーゼ
Ｔ−ＩＶについては、ブタ腸粘膜由来のＨｅｐを用いる
。

【００２０】即ち、上記基質１０ｍｇ／ｍｌ水溶液２５
μｌ　に対し、酵素液１０μｌ　、１００ｍＭトリス・
酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５μｌ、２０ｍＭ塩化カル
シウム２５μｌ　及び水１５μｌ　を加え、４５℃で１
０分間反応させる。 この液に対し、０．０６Ｎ　塩酸溶液５００μｌ　を加
え反応を停止させ、２３２ｎｍにおける紫外吸収Ａを測
定する。対照液として同溶液のゼロ時間における紫外吸
収Ａ０　を測定する。

【００２１】酵素力価の表示は、上記反応条件で１分間
に１μｍｏｌ　の分解量を生じさせる力価を１単位とし
て、次の式から算出する。 Ａ−Ａ０　／５．５（分子吸光係数を用いたモル補正）
×６００／１０（酵素希釈補正）×１／１０（１分当り
の補正）＝Ｕ／ｍｌ（使用酵素１ｍｌ当りの単位）

【０
０２２】本発明の新規なヘパリチナーゼ類の理化学的性
質を示す。 （１）作　　用 いずれの酵素もヘパリン又はヘパラン硫酸のグリコサミ
ニド結合に作用するリアーゼであり、切断部のグルクロ
ン酸又はイズロン酸の４位と５位の炭素の間に二重結合
を形成する。

【００２３】（２）基質特異性（図１−図２）ヘパリチ
ナーゼＴ−１及びヘパリチナーゼＴ−ＩＩはＨｅｐには
殆ど作用せず、主としてＨＳに作用し、分解物として生
ずる不飽和二糖は非硫酸化物（以下「△ＤｉＨＳ−ＯＳ
」という）及び少量のウロン酸−グルコサミン−Ｎ−硫
酸（以下「△ＤｉＨＳ−ＮＳ」という）である。 ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ　はＨｅｐには殆ど作用せず
、主としてＨＳに作用し、分解物として生ずる不飽和二
糖は△ＤｉＨＳ−ＯＳ及び△ＤｉＨＳ−ＮＳである。ヘ
パリチナーゼＴ−ＩＶはＨｅｐ及びＨＳに作用し、分解
物として生ずる不飽和二糖は△ＤｉＨＳ−ＮＳ、ウロン
酸−グルコサミン−Ｎ，６−ジ硫酸（以下「△ＤｉＨＳ
−ｄｉＮ，６Ｓ」という）、ウロン酸−２−硫酸−グル
コサミン−Ｎ−硫酸（以下「△ＤｉＨＳ−ｄｉＵ，ＮＳ
」という）及びウロン酸−２−硫酸−グルコサミン−Ｎ
，６−ジ硫酸（以下「△ＤｉＨＳ−ｔｒｉＳ」という）
である。

【００２４】（３）至適ｐＨ（図３） 本酵素類の至適ｐＨを５０ｍＭの酢酸緩衝液、トリス・
酢酸緩衝液及びトリス・塩酸緩衝液を用い、４５℃、１
０分間の反応で調べたところ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ及
びヘパリチナーゼＴ−ＩＩはいずれもｐＨ５．５〜６．
５であり、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ　はｐＨ７．０〜
８．０、ヘパリチナーゼＴ−ＩＶはｐＨ７．５〜８．０
である。

【００２５】（４）安定ｐＨ範囲（図４）本酵素類の安
定ｐＨ領域を１００ｍＭの酢酸緩衝液、トリス・酢酸緩
衝液、トリス・塩酸緩衝液及びグリシン・水酸化ナトリ
ウム緩衝液を用い、３７℃、３０分間処理して調べたと
ころ、ヘパリチナーゼＴ−ＩはｐＨ４．５〜９．５、ヘ
パリチナーゼＴ−ＩＩはｐＨ５．０〜９．５、ヘパリチ
ナーゼＴ−ＩＩＩはｐＨ５．０〜９．５、ヘパリチナー
ゼＴ−ＩＶはｐＨ５．０〜１０．０の範囲でそれぞれ安
定である。

【００２６】（５）作用至適温度（図５）本酵素類の至
適温度を５０ｍＭのトリス・酢酸緩衝液ｐＨ７．０を用
い、１０分間の反応で調べたところ、ヘパリチナーゼＴ
−Ｉ及びヘパリチナーゼＴ−ＩＩはいずれも５５℃、ヘ
パリチナーゼＴ−ＩＩＩ　は５０℃、ヘパリチナーゼＴ
−ＩＶは４０℃である。

【００２７】（６）安定温度範囲（図６）本酵素類の安
定温度範囲を５０ｍＭのトリス・酢酸緩衝液ｐＨ７．０
を用い、６０分間各温度で処理して調べたところ、ヘパ
リチナーゼＴ−Ｉ及びヘパリチナーゼＴ−ＩＩはいずれ
も５０℃以下、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ　は４５℃以
下、ヘパリチナーゼＴ−ＩＶは４０℃以下でそれぞれ安
定である。

【００２８】（７）ｐＨ、温度などによる失活の条件（
図４、図６） 本酵素類を１００ｍＭの酢酸緩衝液、トリス・酢酸緩衝
液、トリス・塩酸緩衝液及びグリシン・水酸化ナトリウ
ム緩衝液を用い、３７℃、３０分間処理することにより
、調べたところ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリチナー
ゼＴ−ＩＩ及びヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ　はｐＨ４．
５以下、ｐＨ１０．０以上で、ヘパリチナーゼＴ−ＩＶ
はｐＨ４．５以下、ｐＨ１０．５以上でそれぞれ急激に
失活する。また、本酵素類を５０ｍＭのトリス・酢酸緩
衝液ｐＨ７．０を用い、６０分間各温度で処理して調べ
たところ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ及びヘパリチナーゼＴ
−ＩＩはそれぞれ５５℃以上、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩ
Ｉ　は５０℃以上、ヘパリチナーゼＴ−ＩＶは４５℃以
上でそれぞれ急激に失活する。

【００２９】（８）無機イオンの影響（表１）本酵素類
の活性は各種イオンにより賦活又は阻害される。ヘパリ
チナーゼＴ−ＩはＣａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ
２＋で賦活され、Ｚｎ２＋で阻害される。ヘパリチナー
ゼＴ−ＩＩはＢａ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋
、Ｍｎ２＋で賦活され、Ｚｎ２＋で阻害される。ヘパリ
チナーゼＴ−ＩＩＩ　はＺｎ２＋で阻害される。ヘパリ
チナーゼＴ−ＩＶはＢａ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋で賦
活され、Ｃｏ２＋、Ｚｎ２＋で阻害される。

【００３０】

【表１】

【００３１】これら４種のヘパリチナーゼの酵素化学的
性質を公知酵素と比較検討すると、ヘパリチナーゼＴ−
Ｉ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩ及びヘパリチナーゼＴ−Ｉ
ＩＩ　はヘパリンには殆ど作用せずヘパラン硫酸に作用
し、分解物がフラボバクテリューム属細菌の公知酵素の
ものと異なる理由から、また、ヘパリチナーゼＴ−ＩＶ
は、ヘパリン及びヘパラン硫酸に作用するがフラボバク
テリューム属細菌の公知酵素とは分解物が異なること及
びバチルス属細菌の酵素とは至適温度や温度安定性が異
なる等の理由から、上記４種のヘパリチナーゼは公知酵
素とは異なる性質を有する新規酵素と確認された。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限する
ものではない。 実施例 ペプトンＡ（極東製薬製）０．７５％、酵母エキス（極
東製薬製）０．５％、ヘパリンナトリウム（シンテック
ス製）０．５％、Ｋ２　ＨＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４
　・７Ｈ２　Ｏ　　０．０２％、ＮａＣｌ０．１％、消
泡剤アデカノールＬＧ１０９（旭電化製）０．００５％
（ｐＨ７．０）の組成からなる生産培地２００００ｍｌ
を３００００ｍｌ容のジャーファーメンターに仕込み、
１２０℃で２０分間蒸気滅菌後、予めハートインヒュー
ジョン寒天培地（栄研化学製）で４５℃一日培養後、生
産培地と同組成（但し、ヘパリンナトリウムは０．２％
、消泡剤は無添加）の種培地に接種して、４５℃、２０
時間振盪培養しておいたバチルス・サーキュランスＨｐ
Ｔ２９８株の培養液６００ｍｌ（３％）を無菌的に接種
し、４５℃で１８時間通気（１ｖ．ｖ．ｍ）撹拌（３０
０ｒｐｍ）培養を行った。培養終了後、培養液を連続遠
心分離にて処理して菌体を集め、この菌体（湿潤量１１
０ｇ　）のうち半量を３００ｍｌの０．１Ｍ　リン酸緩
衝液（ｐＨ６．８）中に懸濁し、超音波破砕器を用いて
破砕した。破砕後、遠心分離により不溶物を除去し、得
られた上清液に硫酸アンモニウムを加え０．６飽和とし
た。沈澱物を集め、２０ｍＭトリス・酢酸緩衝液ｐＨ７
．０で一夜透析し、透析液をＤＥＡＥ−セファセルカラ
ム（４．２×２５ｃｍ）に負荷し、同緩衝液で溶出させ
た。その溶出液をハイドロキシアパタイトカラム（３．
２×２４ｃｍ）に負荷し、同緩衝液中で食塩濃度を０〜
０．５Ｍまで直線的に上昇させることにより溶出させた
。ＨｅｐおよびＨＳを基質として活性を測定したところ
、通過液でヘパリチナーゼＴ−Ｉが、０．２Ｍ　前後で
ヘパリチナーゼＴ−ＩＩが、０．４Ｍ　前後でヘパリチ
ナーゼＴ−ＩＩＩ　及びヘパリチナーゼＴ−ＩＶが溶出
された。それぞれの画分を限外ろ過膜を用いて脱塩し、
次いで５０ｍＭトリス・酢酸緩衝液に置換した。 そのうちヘパリチナーゼＴ−ＩとヘパリチナーゼＴ−Ｉ
Ｉの両画分については、それぞれをセファクリルＳ−３
００カラム（３．８×１００ｃｍ）に負荷し、０．２Ｍ
　食塩を含む５０ｍＭトリス・酢酸緩衝液でゲルろ過を
行い、それぞれの活性画分を集め、限外ろ過膜を用いて
濃縮脱塩し、酵素液を得た。又、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ
ＩＩ　及びヘパリチナーゼＴ−ＩＶが同時に溶出された
画分については、硫酸化セルロファインカラム（３．２
×２０ｃｍ）に負荷し、５０ｍＭトリス・酢酸緩衝液中
で食塩濃度０〜０．３Ｍ　まで直線的に上昇させること
により溶出させた。０．１Ｍ　前後でヘパリチナーゼＴ
−ＩＩＩ　が、０．１５Ｍ　前後でヘパリチナーゼＴ−
ＩＶが溶出され、それぞれの画分を限外ろ過膜を用いて
濃縮脱塩し、酵素液を得た。

【００３３】各酵素の収量 ヘパリチナーゼＴ−Ｉ　　：　　１２Ｕヘパリチナーゼ
Ｔ−ＩＩ　　：　　　　６ＵヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ
　：　　５０ＵヘパリチナーゼＴ−ＩＶ　　：　　　　
６Ｕ

【００３４】

【発明の効果】本発明によれば、ヘパリン及びヘパラン
硫酸を分解する新規のヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリチ
ナーゼＴ−ＩＩ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ　及びヘパ
リチナーゼＴ−ＩＶを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヘパリン（ブタ腸粘膜由来）及びヘパラン硫酸
（ウシ腎臓由来）に対する各酵素の分解能を示す。

【図２】酵素分解物の二糖成分をそれぞれ調べた結果を
示す。

【図３】至適ｐＨを示す。

【図４】安定ｐＨ範囲を示す。

【図５】作用至適温度を示す。

【図６】安定温度範囲を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　下記の理化学的性質を有する新規酵素
   ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩ、ヘパ
   リチナーゼＴ−ＩＩＩ　及びヘパリチナーゼＴ−ＩＶ。 （Ａ）　　作　　用 いずれの酵素もヘパリン及びヘパラン硫酸のグリコサミ
   ニド結合に作用するリアーゼであり、切断部のグルクロ
   ン酸又はイズロン酸の４位と５位の炭素の間に二重結合
   を形成する。 （Ｂ）　　基質特異性 ヘパリチナーゼＴ−Ｉ及びヘパリチナーゼＴ−ＩＩは、
   ヘパリンには殆ど作用せず、主としてヘパラン硫酸に作
   用し、分解物として生ずる不飽和二糖は非硫酸化物及び
   少量のウロン酸−グルコサミン−Ｎ−硫酸である。ヘパ
   リチナーゼＴ−ＩＩＩ　は、ヘパリンには殆ど作用せず
   、主としてヘパラン硫酸に作用し、分解物として生ずる
   不飽和二糖は非硫酸化物及びウロン酸−グルコサミン−
   Ｎ−硫酸である。ヘパリチナーゼＴ−ＩＶは、ヘパリン
   及びヘパラン硫酸に作用し、分解物として生ずる不飽和
   二糖はウロン酸−グルコサミン−Ｎ−硫酸、ウロン酸−
   グルコサミン−Ｎ，６−ジ硫酸、ウロン酸−２−硫酸−
   グルコサミン−Ｎ−硫酸、ウロン酸−２−硫酸−グルコ
   サミン−Ｎ，６−ジ硫酸である。 （Ｃ）　　至適ｐＨ ヘパリチナーゼＴ−Ｉ　　：　　５．５−６．５ヘパリ
   チナーゼＴ−ＩＩ　　：　　５．５−６．５ヘパリチナ
   ーゼＴ−ＩＩＩ　：　　７．０−８．０ヘパリチナーゼ
   Ｔ−ＩＶ　　：　　７．５−８．０（Ｄ）　　安定ｐＨ
   範囲 ヘパリチナーゼＴ−Ｉ　　：　　４．５−９．５ヘパリ
   チナーゼＴ−ＩＩ　　：　　５．０−９．５ヘパリチナ
   ーゼＴ−ＩＩＩ　：　　５．０−９．５ヘパリチナーゼ
   Ｔ−ＩＶ　　：　　５．０−１０．０（Ｅ）　　至適温
   度 ヘパリチナーゼＴ−Ｉ　　：　　５５℃ヘパリチナーゼ
   Ｔ−ＩＩ　　：　　５５℃ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ　
   ：　　５０℃ヘパリチナーゼＴ−ＩＶ　　：　　４０℃
   （Ｆ）　　安定温度範囲 ヘパリチナーゼＴ−Ｉ　　：　　５０℃以下ヘパリチナ
   ーゼＴ−ＩＩ　　：　　５０℃以下ヘパリチナーゼＴ−
   ＩＩＩ　：　　４５℃以下ヘパリチナーゼＴ−ＩＶ　　
   ：　　４０℃以下（Ｇ）　　阻害及び活性化 ヘパリチナーゼＴ−Ｉ　　：　　Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、
   Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋で賦活され、Ｚｎ２＋で阻害される
   。 ヘパリチナーゼＴ−ＩＩ　　：　　Ｂａ２＋、Ｃａ２＋
   、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋で賦活され、Ｚｎ２＋
   で阻害される。 ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ　：　　Ｚｎ２＋で阻害され
   る。 ヘパリチナーゼＴ−ＩＶ　　：　　Ｂａ２＋、Ｃａ２＋
   、Ｍｇ２＋で賦活され、Ｃｏ２＋、Ｚｎ２＋で阻害され
   る。
2. 【請求項２】　　バチルス属に属するヘパリチナーゼＴ
   −Ｉ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ
   ＩＩ　及びヘパリチナーゼＴ−ＩＶ生産能を有する細菌
   を培養し、その培養液または菌体抽出液からヘパリチナ
   ーゼＴ−Ｉ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩ、ヘパリチナーゼ
   Ｔ−ＩＩＩ　及び／又はヘパリチナーゼＴ−ＩＶを採取
   することを特徴とするヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリチ
   ナーゼＴ−ＩＩ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ　及びヘパ
   リチナーゼＴ−ＩＶの製造法。
3. 【請求項３】　　ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリチナー
   ゼＴ−ＩＩ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ　及びヘパリチ
   ナーゼＴ−ＩＶ生産能を有するバチルス・サーキュラン
   スＨｐＴ２９８菌株。