JP2815449B2 - 低分子量へパリンの製造方法 - Google Patents
低分子量へパリンの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、低分子量ヘパリンの新規な製造方法に関す
る。
る。
ヘパリンは、動物組織に見いだされる硫酸基をもつグ
ルコサミノグリカンで、主要なくりかえし構造単位とし
て〔２−Ｏ−硫酸−Ｌ−イズロン酸−Ｎ−硫酸−６−Ｏ
−硫酸−Ｄ−グルコサミン〕を有し、平均分子量は約11
000から13000である。ヘパリンは抗凝固作用を有し、第
X a因子やトロンビンなどの多くの血液因子と相互作用
することにより血液凝固を抑制する。多くの血栓塞栓症
の治療や予防のために、さらに例えば体外治療や心臓手
術等の間血液の流動性を維持するために、ヘパリンはア
ンチトロンビン剤として広く利用されている。
ルコサミノグリカンで、主要なくりかえし構造単位とし
て〔２−Ｏ−硫酸−Ｌ−イズロン酸−Ｎ−硫酸−６−Ｏ
−硫酸−Ｄ−グルコサミン〕を有し、平均分子量は約11
000から13000である。ヘパリンは抗凝固作用を有し、第
X a因子やトロンビンなどの多くの血液因子と相互作用
することにより血液凝固を抑制する。多くの血栓塞栓症
の治療や予防のために、さらに例えば体外治療や心臓手
術等の間血液の流動性を維持するために、ヘパリンはア
ンチトロンビン剤として広く利用されている。
低分子量ヘパリンは、ヘパリンから誘導された硫酸基
をもつオリゴ糖フラグメントで、分子量は1000から6000
の範囲にあり、ヘパリンの化学的または酵素的な分解に
よって調製される。低分子量ヘパリンは抗凝固作用を示
すが、ヘパリンとは異なる生成有効性、清掃率、および
薬力学的側面をもつ。低分子量ヘパリンは、例えばアン
チトロンビン剤として臨床応用面での用途があり、また
凝血機序の研究や血液循環障害の研究に使用される。
をもつオリゴ糖フラグメントで、分子量は1000から6000
の範囲にあり、ヘパリンの化学的または酵素的な分解に
よって調製される。低分子量ヘパリンは抗凝固作用を示
すが、ヘパリンとは異なる生成有効性、清掃率、および
薬力学的側面をもつ。低分子量ヘパリンは、例えばアン
チトロンビン剤として臨床応用面での用途があり、また
凝血機序の研究や血液循環障害の研究に使用される。
ヘパリンを部分的に分解する方法として酵素的開裂が
望ましいのは、出発物質の損失や不必要な副生物の生成
なしに、高収率で、低分子量ヘパリンが得られるためで
ある。酵素的な開裂はヘパリナーゼ、別名ヘパリンリア
ーゼとして知られる酵素を用いて行われるが、この酵素
はヘパリンの特定のグリコシド結合を開裂させ、多糖基
質から鎖長の短くなったフラグメントを生成させること
ができる。従来ヘパリナーゼはフラボバクテリウム（Fl
avobacterium）属やバクテロイデス（Bacteroides）属
に属する細菌の発酵によって得られている。従来のヘパ
リナーゼはすべて熱変性に対して非常に感受性であり、
37℃以上の温度では完全かつ不可逆に変性する。従っ
て、従来の低分子量ヘパリンの酵素的製造方法は37℃以
上で行うことができない。37℃以下の温度でヘパリンを
分解するためにヘパリナーゼを用いることからなる従来
の低分子量ヘパリンの酵素的製造方法は、ヨーロッパ特
許No.244236−Ａ（1987年11月４日）に発表されてい
る。
望ましいのは、出発物質の損失や不必要な副生物の生成
なしに、高収率で、低分子量ヘパリンが得られるためで
ある。酵素的な開裂はヘパリナーゼ、別名ヘパリンリア
ーゼとして知られる酵素を用いて行われるが、この酵素
はヘパリンの特定のグリコシド結合を開裂させ、多糖基
質から鎖長の短くなったフラグメントを生成させること
ができる。従来ヘパリナーゼはフラボバクテリウム（Fl
avobacterium）属やバクテロイデス（Bacteroides）属
に属する細菌の発酵によって得られている。従来のヘパ
リナーゼはすべて熱変性に対して非常に感受性であり、
37℃以上の温度では完全かつ不可逆に変性する。従っ
て、従来の低分子量ヘパリンの酵素的製造方法は37℃以
上で行うことができない。37℃以下の温度でヘパリンを
分解するためにヘパリナーゼを用いることからなる従来
の低分子量ヘパリンの酵素的製造方法は、ヨーロッパ特
許No.244236−Ａ（1987年11月４日）に発表されてい
る。
最近、本発明者らは新規ヘパリナーゼ生産菌バチルス
属菌（Bacillus sp.）BH100株を発見し、該微生物を工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託し、ここで該菌株
は寄託番号FERM P−10408を与えられた。本菌株、特願
昭63−297807（1988年11月25日）に示したように、ヘパ
リナーゼの新規製造方法に使用される。従来の酵素とは
異なり、バチルス属菌（Bacillus sp.）BH100株（FERM
P−10408）由来のヘパリナーゼは、熱に対してより安定
で、40℃から55℃の温度で活性を有する。
属菌（Bacillus sp.）BH100株を発見し、該微生物を工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託し、ここで該菌株
は寄託番号FERM P−10408を与えられた。本菌株、特願
昭63−297807（1988年11月25日）に示したように、ヘパ
リナーゼの新規製造方法に使用される。従来の酵素とは
異なり、バチルス属菌（Bacillus sp.）BH100株（FERM
P−10408）由来のヘパリナーゼは、熱に対してより安定
で、40℃から55℃の温度で活性を有する。
従来の低分子量ヘパリンの酵素的製造方法には、一つ
ないしはそれ以上の欠点、すなわち酵素の安定性が低い
とか基質の分解を行う温度が低いといった実際の応用を
限定するような欠点がある。従来の方法に比べてより熱
に対して安定なヘパリナーゼを使用する製法が有利であ
るのは、より熱に対して安定なヘパリナーゼが精製、保
存、40℃以下の使用に際して優れた安定性を示し、それ
以上の温度であっても、55℃まで使用可能で、より速い
反応速度を達成するからである。
ないしはそれ以上の欠点、すなわち酵素の安定性が低い
とか基質の分解を行う温度が低いといった実際の応用を
限定するような欠点がある。従来の方法に比べてより熱
に対して安定なヘパリナーゼを使用する製法が有利であ
るのは、より熱に対して安定なヘパリナーゼが精製、保
存、40℃以下の使用に際して優れた安定性を示し、それ
以上の温度であっても、55℃まで使用可能で、より速い
反応速度を達成するからである。
本発明は、ヘパリンをヘパリナーゼにより40〜55℃で
使用することを特徴とする低分子量ヘパリンの製造法に
ある。そして、このヘパリナーゼは好ましくはバチルス
属菌（Bacillus sp.）BH100株（FERM P−10408）の産出
するヘパリナーゼが用いられる。
使用することを特徴とする低分子量ヘパリンの製造法に
ある。そして、このヘパリナーゼは好ましくはバチルス
属菌（Bacillus sp.）BH100株（FERM P−10408）の産出
するヘパリナーゼが用いられる。
更に、本発明は、上記ヘパリナーゼに代えてバチルス
属に属するヘパリーゼ生産菌の培養物、菌体又はその処
理物を使用し、これによりヘパリンを40〜55℃で処理し
て低分子量ヘパリンを製造する方法も含まれる。
属に属するヘパリーゼ生産菌の培養物、菌体又はその処
理物を使用し、これによりヘパリンを40〜55℃で処理し
て低分子量ヘパリンを製造する方法も含まれる。
なお、上記ヘパリナーゼ処理により得られた生成物の
ヘパリンは常法により回収される。
ヘパリンは常法により回収される。
本発明に使用されるヘパリナーゼはバチルス属菌（Ba
cillus sp.）GH 100株（FERM P−10408）の発酵によっ
て調整され、特願昭63−297807（1988年11月25日）に記
載されている方法によって調整される。
cillus sp.）GH 100株（FERM P−10408）の発酵によっ
て調整され、特願昭63−297807（1988年11月25日）に記
載されている方法によって調整される。
本発明に使用されるヘパリナーゼの酵素学的性質は以
下の通りである。
下の通りである。
反 応： 精製ヘパリナーゼはヘパリンおよびヘパラン硫酸の脱
離的開裂を触媒し、これらのグルコサミノグリカンか
ら、232nmに紫外吸収を示す鎖長の短くなったフラグメ
ントを生成させる。
離的開裂を触媒し、これらのグルコサミノグリカンか
ら、232nmに紫外吸収を示す鎖長の短くなったフラグメ
ントを生成させる。
基質特異性： 該酵素は、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を開裂させる
が、コンドロイチン−６−硫酸、コンドロイチン−４−
硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン硫
酸、およびポリガラクツロン酸は開裂させない。
が、コンドロイチン−６−硫酸、コンドロイチン−４−
硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン硫
酸、およびポリガラクツロン酸は開裂させない。
至適温度と熱安定性： 5.0mM CaCl2存在下での活性のための至適作用温度
は、約45℃から50℃までである。pH7.4で、5.0mM CaCl2
の存在下、80％以上の酵素活性が45℃で60分間加熱した
後に残存している。カルシウムイオンは安定性のために
必要である。該酵素は60℃で15分間インキュベートした
後では完全に失活する。
は、約45℃から50℃までである。pH7.4で、5.0mM CaCl2
の存在下、80％以上の酵素活性が45℃で60分間加熱した
後に残存している。カルシウムイオンは安定性のために
必要である。該酵素は60℃で15分間インキュベートした
後では完全に失活する。
至適pH: 活性のための至適作用pHは、pH7.2から7.8の範囲内に
ある。
ある。
無機イオンおよびその他の試薬の影響： 酵素活性は、Ca2+、Mg2+、およびBa2+の塩化物の存在
下で約50％増加する。1.0Mm Cu2+、Cu+、Zn2+、Fe3+、H
g2+、Co2+、およびNi2+の塩化物存在下では、活性は低
下する。Mn2+、Li2+、およびAg+の塩化物はこのような
濃度では活性にほとんど影響しない。酵素活性はNaClに
よって阻害される。
下で約50％増加する。1.0Mm Cu2+、Cu+、Zn2+、Fe3+、H
g2+、Co2+、およびNi2+の塩化物存在下では、活性は低
下する。Mn2+、Li2+、およびAg+の塩化物はこのような
濃度では活性にほとんど影響しない。酵素活性はNaClに
よって阻害される。
分子量： SDS−PAGEにより測定されたヘパリナーゼの見かけの
分子量は約120,000である。
分子量は約120,000である。
低分子量ヘパリン生成物は、ヘパリンにヘパリナーゼ
を作用させこるとよって調製される。反応は、ヘパリナ
ーゼをタンパク質濃度として0.05から5mg/ml含む反応液
を用いて、またpH5から８のバッファー溶液中で濃度1.0
から100mg/mlのヘパリンを使用して、行われる。バッフ
ァーは通常0.01から0.2Mの濃度で使用され、pH範囲５か
ら８を与える通常使用されるあらゆるバッファーが使用
できる。例えば燐酸カリウム、燐酸ナトリウム、酢酸ナ
トリウム、ほう酸ナトリウムおよびHEPESバッファーが
典型的な例として挙げられる。塩化カルシウムはヘパリ
ナーゼ活性に必須ではないが、0.1から10mMの濃度で、
望ましくは約5mMで反応液に添加することができる。出
発物質として使用したヘパリンは豚、牛、羊、またはそ
の他の動物組織に由来し、遊離のヘパリンとしてあるい
は塩として使用することができる。このヘパリンは豚、
牛、羊またはその他の動物組織から常法により調整され
たもの、または市販のもの（Sigma Chemical Company
製）が用いられる。反応は40℃から55℃で、望ましくは
45℃で行われる。反応の程度は、連続的にまたは頻繁
に、反応生成物の232nmの吸光度の増加をモニターする
ことにより測定される。反応生成物の吸光度がもはや増
加しなくなることによって示される、反応完了まで反応
を行うこともできるし、あるいはまた、完了前に、吸光
度が求める反応生成物の平均分子量に対応する値に達し
たときに、反応を終了させることもできる。反応終了に
は通常0.1から100時間を要し、必要な総時間数は反応温
度、ヘパリン濃度、反応液中に使用したヘパリナーゼの
量に依存する。本発明の方法に従って生産された低分子
量ヘパリンは、ヘパリンから誘導された硫酸基をもつオ
リゴ糖の混合物で、二糖、四糖、六糖、およびそれ以上
の約1000から6000までの範囲内の分子量を有するオリゴ
糖を含む。ヘパリナーゼをヘパリンに作用させることに
よって生産された低分子量ヘパリンは、通常のイオン交
換クロマトグラフィーやゲル瀘過クロマトグラフィーと
いった常法により、反応液から回収される。もし望むの
であれば、生成物は、例えば適当な溶媒沈澱や冷凍乾燥
により、濃縮することができる。
を作用させこるとよって調製される。反応は、ヘパリナ
ーゼをタンパク質濃度として0.05から5mg/ml含む反応液
を用いて、またpH5から８のバッファー溶液中で濃度1.0
から100mg/mlのヘパリンを使用して、行われる。バッフ
ァーは通常0.01から0.2Mの濃度で使用され、pH範囲５か
ら８を与える通常使用されるあらゆるバッファーが使用
できる。例えば燐酸カリウム、燐酸ナトリウム、酢酸ナ
トリウム、ほう酸ナトリウムおよびHEPESバッファーが
典型的な例として挙げられる。塩化カルシウムはヘパリ
ナーゼ活性に必須ではないが、0.1から10mMの濃度で、
望ましくは約5mMで反応液に添加することができる。出
発物質として使用したヘパリンは豚、牛、羊、またはそ
の他の動物組織に由来し、遊離のヘパリンとしてあるい
は塩として使用することができる。このヘパリンは豚、
牛、羊またはその他の動物組織から常法により調整され
たもの、または市販のもの（Sigma Chemical Company
製）が用いられる。反応は40℃から55℃で、望ましくは
45℃で行われる。反応の程度は、連続的にまたは頻繁
に、反応生成物の232nmの吸光度の増加をモニターする
ことにより測定される。反応生成物の吸光度がもはや増
加しなくなることによって示される、反応完了まで反応
を行うこともできるし、あるいはまた、完了前に、吸光
度が求める反応生成物の平均分子量に対応する値に達し
たときに、反応を終了させることもできる。反応終了に
は通常0.1から100時間を要し、必要な総時間数は反応温
度、ヘパリン濃度、反応液中に使用したヘパリナーゼの
量に依存する。本発明の方法に従って生産された低分子
量ヘパリンは、ヘパリンから誘導された硫酸基をもつオ
リゴ糖の混合物で、二糖、四糖、六糖、およびそれ以上
の約1000から6000までの範囲内の分子量を有するオリゴ
糖を含む。ヘパリナーゼをヘパリンに作用させることに
よって生産された低分子量ヘパリンは、通常のイオン交
換クロマトグラフィーやゲル瀘過クロマトグラフィーと
いった常法により、反応液から回収される。もし望むの
であれば、生成物は、例えば適当な溶媒沈澱や冷凍乾燥
により、濃縮することができる。
本発明では、ヘパリナーゼは（固定化されていない）
遊離型で使用される。ヘパリナーゼが常法により固定化
された後に使用されることは、明らかに本発明の範囲で
ある。常法とは、例えば（１）イオン交換樹脂等の固相
支持体に吸着させる（２）シアノーゲンブロマイドで活
性化されたセファロース（Sepharose）等の固相支持体
に共有結合させる（３）限外瀘過膜、ホローファイバー
フィルター等を用いて、バイオリアクター中に保持させ
る、ことである。さらに、固定化されたヘパリナーゼを
包含するリアクターにヘパリン溶液を連続的に添加する
ことによって、低分子量ヘパリン生成物が調製されるこ
とは、明らかに本発明の範囲にある。この場合、基質の
流速及び濃度は求める平均分子量の生成物が得られるよ
うに調整する。実に、ヘパリナーゼに代えて、バチルス
属に属するヘパリナーゼ生産菌の培養物、菌体又は粗酵
素等の菌体処理物を用いる方法も本発明の範囲である。
遊離型で使用される。ヘパリナーゼが常法により固定化
された後に使用されることは、明らかに本発明の範囲で
ある。常法とは、例えば（１）イオン交換樹脂等の固相
支持体に吸着させる（２）シアノーゲンブロマイドで活
性化されたセファロース（Sepharose）等の固相支持体
に共有結合させる（３）限外瀘過膜、ホローファイバー
フィルター等を用いて、バイオリアクター中に保持させ
る、ことである。さらに、固定化されたヘパリナーゼを
包含するリアクターにヘパリン溶液を連続的に添加する
ことによって、低分子量ヘパリン生成物が調製されるこ
とは、明らかに本発明の範囲にある。この場合、基質の
流速及び濃度は求める平均分子量の生成物が得られるよ
うに調整する。実に、ヘパリナーゼに代えて、バチルス
属に属するヘパリナーゼ生産菌の培養物、菌体又は粗酵
素等の菌体処理物を用いる方法も本発明の範囲である。
参考例１ 新規に見出された菌株、バチルス属sp.BH100（FERM P
−10408）は土壌から次の方法で分離された。
−10408）は土壌から次の方法で分離された。
約0.1gの土壌試料が1.5mlの培地〔１あたり〕ヘパ
リン2.0g,K2HPO40.35g,NH4Cl 0.27g,MgCl2・6H2O 0.2g,
リジン0.001g,ヒスチジン0.001g,メチオニン0.001g,ク
エン酸第一鉄0.0025mg,微量元素溶液0.1ml〔１あたり
にZnSO4 0.12g,MnSO4 0.5g,H3BO 0.13g,CuSO4 0.004g,N
a2MoO4 0.006g,及びCoCl2・6H2O 0.012gを含有〕及びビ
タミン溶液0.1ml〔１あたり、葉酸及びビオチン酸各1
0mg,リボフラビン,25mg,チアミン25mg,ニコチン酸25mg,
パントテン酸カルシウム25mgパラアミノ安息香酸25mg及
びピリドキシン塩酸塩を含有〕に添加された。該培養液
は、滅菌された24穴のマイクロタイタートレーに蒸発を
最小限におさえるためにプラスチックラップを密封され
たものに、45で振とうすることなく保持された。一週間
の培養後、微生物の成長の証拠を示したこれら試料か
ら、（１あたり）2.0gヘパリン,0.1g K2HPO4,1.0g Mg
Cl2・6H2O,及び8.0gゲルライトを含有する固体培地にpH
8.0,45℃で繰返し継代することにより該微生物学、生物
学的に純粋な形で分離された。
リン2.0g,K2HPO40.35g,NH4Cl 0.27g,MgCl2・6H2O 0.2g,
リジン0.001g,ヒスチジン0.001g,メチオニン0.001g,ク
エン酸第一鉄0.0025mg,微量元素溶液0.1ml〔１あたり
にZnSO4 0.12g,MnSO4 0.5g,H3BO 0.13g,CuSO4 0.004g,N
a2MoO4 0.006g,及びCoCl2・6H2O 0.012gを含有〕及びビ
タミン溶液0.1ml〔１あたり、葉酸及びビオチン酸各1
0mg,リボフラビン,25mg,チアミン25mg,ニコチン酸25mg,
パントテン酸カルシウム25mgパラアミノ安息香酸25mg及
びピリドキシン塩酸塩を含有〕に添加された。該培養液
は、滅菌された24穴のマイクロタイタートレーに蒸発を
最小限におさえるためにプラスチックラップを密封され
たものに、45で振とうすることなく保持された。一週間
の培養後、微生物の成長の証拠を示したこれら試料か
ら、（１あたり）2.0gヘパリン,0.1g K2HPO4,1.0g Mg
Cl2・6H2O,及び8.0gゲルライトを含有する固体培地にpH
8.0,45℃で繰返し継代することにより該微生物学、生物
学的に純粋な形で分離された。
参考例２ 実施例１に示されるようにして得られた生物学的に純
粋な分離株は、（１あたり）14gトリプトン,1.0g酵母
抽出物,3.5g K2HPO4,2gMgCl2,及び1.0gヘパリンを含有
し、NaOHでpH8.0に調節された液体培地20mlで該菌株を
培養することより、ヘパリナーゼ活性の生産性がテスト
された。該培養物は45℃で65rpmで回転振とうしインキ
ュベートされた。72時間の培養後、菌体は20分間8000×
ｇの遠心分離により回収され、上清はトルイデン ブル
ー メタクロマジー アッセイにより残存ヘパリンが測
定された。バチルスsp BH100株（FERM P−10408）を含
有する培養物では該培養物上清に残存するヘパリン量は
mlあたりゼロmgと定量された。ヘリナーゼ活性は45℃で
トルイデン ブルー メタクロマジー アッセイにより
定量され、該培養物上清はmlあたり0.074単位ヘパリナ
ーゼを含有すると認められた。
粋な分離株は、（１あたり）14gトリプトン,1.0g酵母
抽出物,3.5g K2HPO4,2gMgCl2,及び1.0gヘパリンを含有
し、NaOHでpH8.0に調節された液体培地20mlで該菌株を
培養することより、ヘパリナーゼ活性の生産性がテスト
された。該培養物は45℃で65rpmで回転振とうしインキ
ュベートされた。72時間の培養後、菌体は20分間8000×
ｇの遠心分離により回収され、上清はトルイデン ブル
ー メタクロマジー アッセイにより残存ヘパリンが測
定された。バチルスsp BH100株（FERM P−10408）を含
有する培養物では該培養物上清に残存するヘパリン量は
mlあたりゼロmgと定量された。ヘリナーゼ活性は45℃で
トルイデン ブルー メタクロマジー アッセイにより
定量され、該培養物上清はmlあたり0.074単位ヘパリナ
ーゼを含有すると認められた。
本発明において、熱に安定なヘパリナーゼを用いるこ
とにより、低分子量ヘパリンが副生物の生成なしに高収
率で得られる。
とにより、低分子量ヘパリンが副生物の生成なしに高収
率で得られる。
以下の実施例は本発明を説明するが、これを限定する
ものではない。
ものではない。
実施例１ 低分子量ヘパリンは、5mM塩化カルシウムを含む50mM
HEPESバッファー、pH7.4、中に10mg/mlヘパリン（ナト
リウム塩、豚腸由来）および50μg/mlのバチルス属菌BH
100株（FERM P−10408）由来の精製ヘパリナーゼを含む
反応液中で調製した。反応液は45℃でインキュベートし
た。一定時間毎に試料を採り、反応を終了させるために
pH2.0の20mM KCl−HClを添加して希釈し、232nmの吸光
度を測定して、反応の程度をモニターした。結果を以下
に示す。
HEPESバッファー、pH7.4、中に10mg/mlヘパリン（ナト
リウム塩、豚腸由来）および50μg/mlのバチルス属菌BH
100株（FERM P−10408）由来の精製ヘパリナーゼを含む
反応液中で調製した。反応液は45℃でインキュベートし
た。一定時間毎に試料を採り、反応を終了させるために
pH2.0の20mM KCl−HClを添加して希釈し、232nmの吸光
度を測定して、反応の程度をモニターした。結果を以下
に示す。
反応液からの各試料の一定量（５μ）を等量の50％
ショ糖と混合し、20から30％の直線濃度勾配ポリアクリ
ルアミドゲルに重層した。電気泳動は0.1Mほう酸、0.1M
Tris、0.01MEDTA、pH8.3（陽極バッファー）および0.2
M Tris、1.25Mグリシン、pH8.3（陰極バッファー）を用
い、50mA定常電流で約１時間行った。ゲル中の反応生成
物は0.08％ Azure A水溶液で染色した。ゲルは蒸留水で
洗浄し、反応生成物はさらに0.5％Alcian Blueの２％酢
酸溶液で30分間染色した後、ゲルは２％酢酸で脱色され
た。結果を第１図に示す。低分子量ヘパリンがヘパリナ
ーゼ反応の生成物として得られ、反応時間につれて、上
記反応生成物の232nmの吸光度の増加が観察されるにし
たがって、生成物の平均分子量が減少していることを、
この結果は示している。
ショ糖と混合し、20から30％の直線濃度勾配ポリアクリ
ルアミドゲルに重層した。電気泳動は0.1Mほう酸、0.1M
Tris、0.01MEDTA、pH8.3（陽極バッファー）および0.2
M Tris、1.25Mグリシン、pH8.3（陰極バッファー）を用
い、50mA定常電流で約１時間行った。ゲル中の反応生成
物は0.08％ Azure A水溶液で染色した。ゲルは蒸留水で
洗浄し、反応生成物はさらに0.5％Alcian Blueの２％酢
酸溶液で30分間染色した後、ゲルは２％酢酸で脱色され
た。結果を第１図に示す。低分子量ヘパリンがヘパリナ
ーゼ反応の生成物として得られ、反応時間につれて、上
記反応生成物の232nmの吸光度の増加が観察されるにし
たがって、生成物の平均分子量が減少していることを、
この結果は示している。
低分子量ヘパリン生成物は、蒸留水で前洗浄し、溶出
液として蒸留水を用いてSephadex G−25ゲル瀘過によっ
て、ヘパリナーゼを含まずに回収され、凍結乾燥で濃縮
された。低分子量ヘパリンの回収率は約85％であった。
液として蒸留水を用いてSephadex G−25ゲル瀘過によっ
て、ヘパリナーゼを含まずに回収され、凍結乾燥で濃縮
された。低分子量ヘパリンの回収率は約85％であった。
実施例２ 様々な起源のヘパリンの分解を以下のように調べた。
50mM HEPESバッファー、pH7.4、中に、5mg/mlヘパリン
および20μg/mlのバチルス属菌BH100株（FERM P−1040
8）由来の精製ヘパリナーゼを含む反応液を調製した。
様々な起源のヘパリンに対する反応の相対速度は、45℃
でインキュベートした反応液の232nmの吸光度をモニタ
ーすることによって測定した。結果を以下に示す。
50mM HEPESバッファー、pH7.4、中に、5mg/mlヘパリン
および20μg/mlのバチルス属菌BH100株（FERM P−1040
8）由来の精製ヘパリナーゼを含む反応液を調製した。
様々な起源のヘパリンに対する反応の相対速度は、45℃
でインキュベートした反応液の232nmの吸光度をモニタ
ーすることによって測定した。結果を以下に示す。
使用したヘパリンは、Sigma Chemical Company,U.S.
A.から入手した。そのカタログ番号を括弧内に示す。
A.から入手した。そのカタログ番号を括弧内に示す。
実施例３ ヘパリンの分解反応への温度の影響を以下のように調
べた。50mM HEPESバッファー、pH7.4、中に10mg/mlヘパ
リン（ナトリウム塩、豚腸由来）およびバチルス属菌BH
100株（FERM P−10408）由来の精製ヘパリナーゼを含む
反応液を調製した。様々な温度での相対反応速度は、反
応液の232nmの吸光度をモニターすることによって測定
した。結果を第２図に示す。低分子量ヘパリンの生成
は、40℃から55℃までの範囲の温度で起こり、最大反応
速度は約50℃に現れることをこの結果は示している。
べた。50mM HEPESバッファー、pH7.4、中に10mg/mlヘパ
リン（ナトリウム塩、豚腸由来）およびバチルス属菌BH
100株（FERM P−10408）由来の精製ヘパリナーゼを含む
反応液を調製した。様々な温度での相対反応速度は、反
応液の232nmの吸光度をモニターすることによって測定
した。結果を第２図に示す。低分子量ヘパリンの生成
は、40℃から55℃までの範囲の温度で起こり、最大反応
速度は約50℃に現れることをこの結果は示している。
実施例４ ヘパリンの分解反応へのpHの影響を以下のように調べ
た。様々なpHの50mMバッファー（MESバッファー、pH4か
ら6;HEPESバッファー、pH6から8;TAPSバッファー、pH8
から10）中に10mg/mlヘパリン（ナトリウム塩、豚腸由
来）および20μg/mlのバチルス属菌BH100株（FERM P−1
0408）由来の精製ヘパリナーゼを含む反応液を調製し
た。様々なpHでの相対反応速度は、45℃に保持された反
応液の232nmの吸光度をモニターすることによって測定
した。結果を第３図に示す。低分子量ヘパリンの生成
は、pH5.5から9.0までの範囲のpHで起こり、最大反応速
度は約pH7.5に現れることをこの結果は示している。
た。様々なpHの50mMバッファー（MESバッファー、pH4か
ら6;HEPESバッファー、pH6から8;TAPSバッファー、pH8
から10）中に10mg/mlヘパリン（ナトリウム塩、豚腸由
来）および20μg/mlのバチルス属菌BH100株（FERM P−1
0408）由来の精製ヘパリナーゼを含む反応液を調製し
た。様々なpHでの相対反応速度は、45℃に保持された反
応液の232nmの吸光度をモニターすることによって測定
した。結果を第３図に示す。低分子量ヘパリンの生成
は、pH5.5から9.0までの範囲のpHで起こり、最大反応速
度は約pH7.5に現れることをこの結果は示している。
第１図は、反応時間と生成物の分子量の減少との関係を
示すゲル電気泳動図、第２図はヘパリンの解重合反応へ
の温度の影響を示す図、第３図はヘパリンの解重反応へ
のpHの影響を示す図である。
示すゲル電気泳動図、第２図はヘパリンの解重合反応へ
の温度の影響を示す図、第３図はヘパリンの解重反応へ
のpHの影響を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】ヘパリンをヘパリナーゼにより40〜55℃で
処理することを特徴とする低分子量ヘパリンの製造方
法。 - 【請求項２】ヘパリナーゼがバチルス属菌菌株BH100（F
ERM P−10408）から得られるものであることを特徴とす
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】ヘパリンをバチルス属に属するヘパリナー
ゼ生産菌の培養物、菌体、又はその処理物により40〜55
℃で処理することを特徴とする低分子量ヘパリンの製造
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4129890A JP2815449B2 (ja) | 1990-02-23 | 1990-02-23 | 低分子量へパリンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4129890A JP2815449B2 (ja) | 1990-02-23 | 1990-02-23 | 低分子量へパリンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03247297A JPH03247297A (ja) | 1991-11-05 |
| JP2815449B2 true JP2815449B2 (ja) | 1998-10-27 |
Family
ID=12604560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4129890A Expired - Fee Related JP2815449B2 (ja) | 1990-02-23 | 1990-02-23 | 低分子量へパリンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2815449B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3110064B2 (ja) * | 1991-03-06 | 2000-11-20 | 生化学工業株式会社 | 新規ヘパリチナーゼ、その製造法及びその生産菌 |
-
1990
- 1990-02-23 JP JP4129890A patent/JP2815449B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03247297A (ja) | 1991-11-05 |
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