JP3523285B2 - 糖分解酵素の製造法 - Google Patents
糖分解酵素の製造法Info
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Description
ギリスが菌体内に生産する種々の糖分解酵素を効率的に
分離、製造する方法に関する。詳しくは、クロマトグラ
フの手法により、バクテロイデス・フラギリスの培養菌
体抽出液から、段階的に糖分解酵素を分離、製造する方
法に関する。
物、また植物と種々の起源から得られることが知られて
いる。例えば、α−D−グルコシダーゼは酵母類から、
β−D−グルコシダーゼはアーモンドなどから、β−D
−ガラクトシダーゼは大腸菌やジャックマメなどから、
β−D−Nアセチルグルコサミニダーゼはウシ肝臓など
から、β−D−Nアセチルガラクトサミニダーゼはホラ
貝やアクレモニウム(Acremonium)属に属す
る微生物などから、α−L−フコシダーゼはホラ貝やフ
ザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxy
sporum)などから、シアリダーゼは連鎖球菌など
のバクテリア類から、それぞれ分離、精製されており、
市販もされている。
特に糖鎖を含む化合物の構造と機能が注目されてきてお
り、このような糖鎖含有化合物の構造解析や生理機能の
解明において、これらの糖分解酵素は、糖鎖を切るハサ
ミとして、今後、需要が増大することが予想されてい
る。ところが、これらの糖分解酵素を分離、精製するに
当たっては、酵素を抽出した後に、数段階にも及ぶクロ
マトグラフ処理が必要であり、工程として非常に煩雑で
あった。また、単一の生産系から一度に多種類の糖分解
酵素を得る方法についても知られていないのが現状であ
る。
元末端に存在しており、糖鎖を構成する糖の中でも、そ
の機能の重要性が注目されている物質である。そして、
これらの糖の機能を解明するためには、糖鎖からシアル
酸やフコースを意図的に遊離させることが必要であり、
これらのことができる酵素、すなわちシアリダーゼやフ
コシダーゼが必要となってくる。しかし、これらのシア
リダーゼやフコシダーゼを一度に効率的に生産する方法
は知られていない。
ような状況に鑑み、効率的に種々の糖分解酵素を製造す
る方法を確立すべく鋭意研究を重ねたところ、腸内細菌
の一種であるバクテロイデス・フラギリスが種々の糖分
解酵素を一度に、かつ比較的多量に生産することを見出
し、さらに、このバクテロイデス・フラギリスの培養菌
体抽出液をクロマトグラフ処理することにより、種々の
糖分解酵素を順次、分離、製造できることを見出し、本
発明を完成するに至った。したがって、本発明は、シア
リダーゼやフコシダーゼを含む種々の糖分解酵素を生産
するバクテロイデス・フラギリスから効率的に種々の糖
分解酵素を製造する方法を提供することを課題とする。
酵素を生産する微生物であるバクテロイデス・フラギリ
スを培養し、その培養菌体抽出液から、単一のクロマト
グラフ処理により、一度に、α−D−グルコシダーゼ、
β−D−グルコシダーゼ、α−D−ガラクトシダーゼ、
β−D−ガラクトシダーゼ、β−D−Nアセチルグルコ
サミニダーゼ、β−D−Nアセチルガラクトサミニダー
ゼ、α−L−フコシダーゼ及びシアリダーゼの8種の糖
分解酵素を効率的に分離、製造する方法である。
解酵素を生産する菌株の菌学的性質について、次の通り
示す。 (a)形態 BG寒天培地に嫌気培養後、生育した菌について以下を
観察した。 菌形 :桿菌 鞭毛 :なし グラム染色 :陰性 芽胞 :形成しない
検討した。 胆汁培地での生育 :発育促進 硫化水素産生 :あり インドール産生 :なし 硝酸塩還元 :なし ゼラチンの液化 :なし デンプンの加水分解 :あり エクスリンの加水分解 :あり
糖の分解性を判定した。 L−アラビノース :なし D−キシロース :あり D−ラムノース :なし リボース :なし グルコース :あり マンノース :あり フラクトース :あり ガラクトース :あり シュークロース :あり マルトース :あり セロビオース :なし ラクトース :あり トレハロース :なし メリビオース :あり ラフィノース :あり メレチトース :なし デンプン :あり グリコーゲン :あり イヌリン :あり グリセロール :なし マンニトール :なし ソルビトール :なし エリトリトール :なし イノシトール :なし エスクリン :不明 サリシン :なし アミグダリン :なし
y’s Manual of Systematic
Bacteriology 第1巻(1984年発行)
を参照して分類したところ、この菌株は、バクテロイデ
ス・フラギリス(Bacteroides fragi
lis)と同定された。なお、この菌株は、Bacte
roides fragilis SBT 3182株
として、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第12352号(FERM P−12352)の番号で
寄託されている。
リスを培養するには、通常の栄養培地を使用でき、炭素
源、窒素源、無機塩類などを適当に含有するものであれ
ば、天然培地、合成培地のいずれでも用いることができ
る。栄養培地中の炭素源としては、グルコース、フラク
トース、シュークロース、マルトース、マンノース、デ
ンプン、廃糖蜜、アルコール類、有機酸類など、あるい
は天然の栄養源であるペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、麦芽エキス、牛心臓や牛脳の浸出液、牛血液粉末な
どを用いることができる。また、栄養培地中の窒素源と
しては、アンモニア水、硫安、硝安、塩安、尿素など、
あるいは窒素を含有する有機物質であるペプトン、NZ
−アミン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイ
ン加水分解物、フィッシュミール、大豆消化物などを用
いることができる。さらに、栄養培地中の無機塩類とし
ては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化
カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一
鉄、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどを用いること
ができる。このような培地で、25〜37℃、1〜2日
間静置培養を行うことにより、バクテロイデス・フラギ
リスの菌体内に糖分解酵素が生成、蓄積される。
の菌体を遠心分離などの処理で捕集し、適当な緩衝液で
菌体を2〜3回洗浄した後、菌体を破砕する。菌体を破
砕するための処理方法としては、超音波処理、ポッター
型テフロンホモジナイザー処理、フレンチプレス処理、
高張液−低張液処理などを用いることができる。そし
て、この菌体破砕液を遠心分離し、その上清を糖分解酵
素の粗酵素液として、以下の分離、製造工程に供する。
し、クロマトグラフ処理を行う。まず、上記のようにし
て得られた糖分解酵素の粗酵素液をイオン交換樹脂やヒ
ドロキシアパタイトなどの担体と接触させ、糖分解酵素
を担体に吸着させる。そして、溶出液の濃度を段階的に
高めることにより、糖分解酵素を順次溶出させることが
できる。例えば、担体としてヒドロキシアパタイトを用
いたカラムクロマトグラフィーで糖分解酵素の分離、製
造を行う場合、糖分解酵素の粗酵素液をヒドロキシアパ
タイトカラムに通液して酵素活性を吸着させた後、5m
M程度のリン酸緩衝液で十分洗浄し、次いでリン酸緩衝
液の濃度を20mM、50mM、100mM、150m
M、200mM、250mM、300mMと段階的に高
めることにより糖分解酵素を順次カラムから溶出させる
ことができる。因みに、リン酸緩衝液濃度が20mMの
場合は、β−D−グルコシダーゼとβ−D−ガラクトシ
ダーゼが、50mMの場合は、β−D−Nアセチルガラ
クトサミニダーゼが、100mMの場合は、β−D−N
アセチルグルコサミニダーゼが、150mMの場合は、
シアリダーゼが、200mMの場合は、α−L−フコシ
ダーゼが、250mMの場合は、α−D−グルコシダー
ゼが、300mMの場合は、α−D−ガラクトシダーゼ
が、それぞれ溶出されてくる。なお、溶出画分中に2種
類以上の糖分解酵素が共存している場合は、必要に応じ
て、ゲル濾過などの手法を用い、分離精製を行えば良
い。次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
ン、0.5%酵母エキス、0.1%肝臓エキス、0.3
%グルコース、0.25%リン酸二水素ナトリウム、
0.3%食塩、0.5%可溶性デンプン及び0.03%
L−システイン塩酸塩を含むpH7.0の液体培地1l
を121℃、15分間滅菌した後、この液体培地にバク
テロイデス・フラギリス SBT 3182株(微工研
菌寄第12352号)の前培養液30mlを接種し、3
7℃、15時間静置培養した。培養終了後、この培養液
から8,900×g、10分間の遠心分離で菌体を捕集
し、pH7.0のリン酸緩衝液800mlで菌体を2回
洗浄した後、菌体をpH7.0のリン酸緩衝液120m
lに懸濁して超音波処理(2A、10分間)を行い菌体
を破砕した。そして、この菌体破砕液から45,000
×g、10分間の遠心分離で糖分解酵素の粗酵素液とし
て上清125mlを得た。
酵素活性は、α−D−グルコシダーゼ29.7単位/m
l、β−D−グルコシダーゼ21.4単位/ml、α−
D−ガラクトシダーゼ28.4単位/ml、β−D−ガ
ラクトシダーゼ8.4単位/ml、β−D−Nアセチル
グルコサミニダーゼ30.6単位/ml、β−D−Nア
セチルガラクトサミニダーゼ24.2単位/ml、α−
L−フコシダーゼ30.5単位/ml、シアリダーゼ2
9.9単位/mlであった。
ニル−α−D−グリコシド、パラニトロフェニル−β−
D−グリコシド、パラニトロフェニル−α−D−ガラク
トシド、パラニトロフェニル−β−D−ガラクトシド、
パラニトロフェニル−β−D−Nアセチルグルコシド、
パラニトロフェニル−β−D−Nアセチルガラクトシ
ド、パラニトロフェニル−α−L−フコシド及びパラニ
トロフェニル−α−D−シアル酸を各糖分解酵素の基質
として用い、酵素反応で遊離したパラニトロフェノール
の量を比色定量し、405nmの吸収度を酵素活性の指
標とした。すなわち、pH7.0のリン酸緩衝液0.1
9mlに5mMに調製した各基質0.01mlを加え、
さらに、酵素液0.05mlを加え反応を開始し、37
℃、2時間反応させた後、pH9.5の1Mホウ酸緩衝
液0.2mlを加え、直ちに405nmの吸収度を測定
した。そして、1分間に1μmolのパラニトロフェノ
ールを遊離させる酵素活性を1単位と定義した。
100mlをヒドロキシアパタイトを充填したカラム
(1.6×15cm)に通液した後、pH7.0の5m
Mリン酸緩衝液90mlを通液してカラムを洗浄した。
次に、20、50、100、150、200、250及
び300mMの各濃度に調整したpH7.0のリン酸緩
衝液をそれぞれ90mlずつ段階的に通液して、吸着し
た糖分解酵素を順次溶出させた。なお、溶出流速は1.
5ml/分とした。
れぞれの蛋白質の溶出ピークを10mlづつ回収し、2
0mMリン酸緩衝液の溶出ピーク1として148.5単
位/mlのβ−D−グルコシダーゼと107.0単位/
mlのβ−D−ガラクトシダーゼが、50mMリン酸緩
衝液の溶出ピーク2として41.5単位/mlのβ−D
−Nアセチルガラクトサミニダーゼが、100mMリン
酸緩衝液の溶出ピーク3として46.5単位/mlのβ
−D−Nアセチルグルコサミニダーゼが、150mMリ
ン酸緩衝液の溶出ピーク4として113.0単位/ml
のシアリダーゼが、200mMリン酸緩衝液の溶出ピー
ク5として87.0単位/mlのα−L−フコシダーゼ
が、250mMリン酸緩衝液の溶出ピーク6として14
9.5単位/mlのα−D−グルコシダーゼが、300
mMリン酸緩衝液の溶出ピーク7として119.5単位
/mlのα−D−ガラクトシダーゼが、それぞれ得られ
た。図1にリン酸緩衝液の塩濃度変化と蛋白質の溶出パ
ターンを示す。
るそれぞれの酵素活性の回収率は、α−D−グルコシダ
ーゼ50.3%、β−D−グルコシダーゼ69.4%、
α−D−ガラクトシダーゼ84.2%、β−D−ガラク
トシダーゼ100%、β−D−Nアセチルグルコサミニ
ダーゼ15.2%、β−D−Nアセチルガラクトサミニ
ダーゼ17.1%、α−L−フコシダーゼ28.5%、
シアリダーゼ37.8%、であった。
素を一度の操作で、効率良く、しかも簡便に分離、製造
できる。また、糖鎖の構造解析に重要な役割を果たすシ
アリダーゼやフコシダーゼなどの糖分解酵素を大量に製
造することができるので、これらの酵素を安価に提供す
ることが可能となる。
リン酸緩衝液の塩濃度変化と蛋白質の溶出パターンであ
る。
Claims (2)
- 【請求項1】 バクテロイデス・フラギリス(Bact
eroides fragilis)の培養菌体抽出液
をヒドロキシアパタイト担体と接触させて糖分解酵素を
担体に吸着させた後、溶出液の濃度を段階的に高めて糖
分解酵素を担体から順次溶出させることによって、α−
D−グルコシダーゼ、β−D−グルコシダーゼ、α−D
−ガラクトシダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、β−
D−Nアセチルグルコサミニダーゼ、β−D−Nアセチ
ルガラクトサミニダーゼ、α−L−フコシダーゼ及びシ
アリダーゼの8種の糖分解酵素を1回の処理で製造する
方法。 - 【請求項2】 バクテロイデス・フラギリスが、Bac
teroidesfragilis SBT 3182株
(微工研菌寄第12352号)である請求項1乃至2記
載の糖分解酵素の製造法。
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JP02602093A Expired - Fee Related JP3523285B2 (ja) | 1993-01-22 | 1993-01-22 | 糖分解酵素の製造法 |
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US6358724B1 (en) | 1993-09-23 | 2002-03-19 | New England Biolabs, Inc. | Isolation and composition of novel glycosidases |
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-
1993
- 1993-01-22 JP JP02602093A patent/JP3523285B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Appl. Environ. Microbiol., 1980, Vol.40, No.1, pages 40−7 |
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, Vol.189, No.1, pages 524−9 |
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