JP3482454B2 - 高純度キシログルカンオリゴ７糖の製造方法 - Google Patents
高純度キシログルカンオリゴ７糖の製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は高純度な高級ヘテロオリ
ゴ糖の製造に関するものであって、特に、イソプリメベ
ロシドの製造に際して有効な活性供与体として作用す
る、キシログルカンオリゴ７糖の高純度製造法に関する
ものである。
ゴ糖の製造に関するものであって、特に、イソプリメベ
ロシドの製造に際して有効な活性供与体として作用す
る、キシログルカンオリゴ７糖の高純度製造法に関する
ものである。
【０００２】イソプリメベロシドは、イソプリメベロー
ス単位をグリコン部分の構造としてもつヘテロオリゴグ
リコシドの総称であり、グリコン部分の構造がキシロシ
ル−α−１，６−グルコース（イソプリメベロース）と
いう通常の微生物により比較的分解されにくい構造を有
するため、オリゴグリコシド類の中では微生物汚染に対
して抵抗性を示す。一方、この構造は、古くから食品と
して利用されてきたタマリンド種子キシログルカンの基
本構造として存在し、安全性はすでに確立されている。
このようにイソプリメベロース単位は、微生物劣化に比
較的抵抗性があると同時に安全性も高いことから、これ
をグリコン部分にもつイソプリメベロシド群から、新し
い界面活性剤や機能性オリゴ糖の開発が進められてい
る。
ス単位をグリコン部分の構造としてもつヘテロオリゴグ
リコシドの総称であり、グリコン部分の構造がキシロシ
ル−α−１，６−グルコース（イソプリメベロース）と
いう通常の微生物により比較的分解されにくい構造を有
するため、オリゴグリコシド類の中では微生物汚染に対
して抵抗性を示す。一方、この構造は、古くから食品と
して利用されてきたタマリンド種子キシログルカンの基
本構造として存在し、安全性はすでに確立されている。
このようにイソプリメベロース単位は、微生物劣化に比
較的抵抗性があると同時に安全性も高いことから、これ
をグリコン部分にもつイソプリメベロシド群から、新し
い界面活性剤や機能性オリゴ糖の開発が進められてい
る。
【０００３】こうした特性が期待されるイソプリメベロ
シドを簡便に調製する方法として、最近、キシログルカ
ンオリゴ７糖を供与体として、イソプリメベロシル転移
酵素をもちい、供与体構造中に含まれイソプリメベロー
ス単位を適当な受容体に転移させる方法が開発された。
この方法は、供与体としてキシログルカンオリゴ７糖を
必要とするため、高純度の該オリゴ７糖を、簡便、大量
に調製する方法の開発が望まれるようになってきた。
シドを簡便に調製する方法として、最近、キシログルカ
ンオリゴ７糖を供与体として、イソプリメベロシル転移
酵素をもちい、供与体構造中に含まれイソプリメベロー
ス単位を適当な受容体に転移させる方法が開発された。
この方法は、供与体としてキシログルカンオリゴ７糖を
必要とするため、高純度の該オリゴ７糖を、簡便、大量
に調製する方法の開発が望まれるようになってきた。
【０００４】
【従来の技術】従来、高純度のキシログルカンオリゴ７
糖は、タマリンド種子より調製されるキシログルカン
を、エンド−１，４−β−グルカナーゼいわゆるエンド
型セルラーゼにより分解し、その分解産物中からゲル濾
過剤を用いたカラムクロマトグラフィーで分別する方法
により調製されていた。
糖は、タマリンド種子より調製されるキシログルカン
を、エンド−１，４−β−グルカナーゼいわゆるエンド
型セルラーゼにより分解し、その分解産物中からゲル濾
過剤を用いたカラムクロマトグラフィーで分別する方法
により調製されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】カラムクロマトグラフ
ィーでは、純度の高いオリゴ７糖が得られる反面、大量
処理が困難、もしくは大型のクロマトグラフ装置を設置
するために設備費が大きくなるという欠点があった。こ
うした事情から、比較的大量に、高純度のキシログルカ
ンオリゴ７糖を調製する簡便な方法の開発が望まれてい
た。そこで、上記のような問題点を有するカラムクロマ
トグラフィーを用いずに、比較的大量の高純度キシログ
ルカンオリゴ７糖を調製する方法について検討を開始し
た。
ィーでは、純度の高いオリゴ７糖が得られる反面、大量
処理が困難、もしくは大型のクロマトグラフ装置を設置
するために設備費が大きくなるという欠点があった。こ
うした事情から、比較的大量に、高純度のキシログルカ
ンオリゴ７糖を調製する簡便な方法の開発が望まれてい
た。そこで、上記のような問題点を有するカラムクロマ
トグラフィーを用いずに、比較的大量の高純度キシログ
ルカンオリゴ７糖を調製する方法について検討を開始し
た。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者らは、物理的ないし化学的な精製法を各種
試みてみたが成功するに至らず、そこで発想の転換を行
って生物的な方法の利用に着目した。
に、本発明者らは、物理的ないし化学的な精製法を各種
試みてみたが成功するに至らず、そこで発想の転換を行
って生物的な方法の利用に着目した。
【０００７】そして、本発明者らは、タマリンド種子キ
シログルカンのエンド型セルラーゼ分解により生成す
る、高級ヘテロオリゴ糖の混合物より、キシログルカン
オリゴ７糖を酵素的および生物的に選択する方法につい
て検討を重ねた。その結果、キシログルカンのエンド型
セルラーゼによる分解産物に、さらにβ−ガラクトシダ
ーゼを作用させることにより、キシログルカンヘテロオ
リゴ糖の混合物を、キシログルカンオリゴ７糖とガラク
トースの混合物へ酵素により完全に転換できること、ま
たこの転換後の混合物に対して、ガラクトース資化能を
有する酵母菌を接種・培養することにより、ガラクトー
スのみを選択的に消費させ、除菌後の培養母液中にほと
んど資化されることなくキシログルカンオリゴ７糖を高
純度で残存させることができることを見いだし、本発明
を完成するに至った。
シログルカンのエンド型セルラーゼ分解により生成す
る、高級ヘテロオリゴ糖の混合物より、キシログルカン
オリゴ７糖を酵素的および生物的に選択する方法につい
て検討を重ねた。その結果、キシログルカンのエンド型
セルラーゼによる分解産物に、さらにβ−ガラクトシダ
ーゼを作用させることにより、キシログルカンヘテロオ
リゴ糖の混合物を、キシログルカンオリゴ７糖とガラク
トースの混合物へ酵素により完全に転換できること、ま
たこの転換後の混合物に対して、ガラクトース資化能を
有する酵母菌を接種・培養することにより、ガラクトー
スのみを選択的に消費させ、除菌後の培養母液中にほと
んど資化されることなくキシログルカンオリゴ７糖を高
純度で残存させることができることを見いだし、本発明
を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、上記した新知見に基づ
いてなされたものであって、タマリンド種子キシログル
カンのエンド−１，４−β−グルカナーゼによる分解産
物から、酵素的および生物的分別方法により、キシログ
ルカンオリゴ７糖を高純度に製造する方法に関するもの
である。以下に、本発明の内容を具体的に説明する。
いてなされたものであって、タマリンド種子キシログル
カンのエンド−１，４−β−グルカナーゼによる分解産
物から、酵素的および生物的分別方法により、キシログ
ルカンオリゴ７糖を高純度に製造する方法に関するもの
である。以下に、本発明の内容を具体的に説明する。
【０００９】本発明は、タマリンド種子キシログルカン
をエンド型セルラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼで分解
し、キシログルカンオリゴ７糖とガラクトースの混合物
を生成する酵素分解工程と、生じた該混合物からガラク
トースを微生物により生物的に選択除去する工程の二つ
から構成される。
をエンド型セルラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼで分解
し、キシログルカンオリゴ７糖とガラクトースの混合物
を生成する酵素分解工程と、生じた該混合物からガラク
トースを微生物により生物的に選択除去する工程の二つ
から構成される。
【００１０】はじめの酵素分解工程に利用される酵素
は、エンド型セルラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼで
ある。これら酵素には各種起源のものが知られている
が、タマリンド種子キシログルカンに作用しこれを分解
する能力を有するものであれば、どのような起源の酵素
も利用できる。ただし、市販酵素標品中には、キシログ
ルカンオリゴ７糖に作用しこれをイソプリメベロース単
位に分解する、イソプリメベロース生成酵素が微量混在
しているものがあり、これを予め除去しておかなくては
ならない。イソプリメベロース生成酵素を除去するため
には公知の分別手法をもちいればよく、通常、市販酵素
標品を適当な緩衝液に溶解し、不溶物を除去したのち、
陰イオン交換体をもちいたクロマトグラフィーをおこな
えば容易に除去することができる。
は、エンド型セルラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼで
ある。これら酵素には各種起源のものが知られている
が、タマリンド種子キシログルカンに作用しこれを分解
する能力を有するものであれば、どのような起源の酵素
も利用できる。ただし、市販酵素標品中には、キシログ
ルカンオリゴ７糖に作用しこれをイソプリメベロース単
位に分解する、イソプリメベロース生成酵素が微量混在
しているものがあり、これを予め除去しておかなくては
ならない。イソプリメベロース生成酵素を除去するため
には公知の分別手法をもちいればよく、通常、市販酵素
標品を適当な緩衝液に溶解し、不溶物を除去したのち、
陰イオン交換体をもちいたクロマトグラフィーをおこな
えば容易に除去することができる。
【００１１】次に、ガラクトースを選択的に除去する工
程に利用できる微生物としては、上記によって得た混合
物からガラクトースを資化利用できる性質を有する微生
物であれば、すべての微生物が利用可能であるし、それ
に由来する酵素も利用可能である。
程に利用できる微生物としては、上記によって得た混合
物からガラクトースを資化利用できる性質を有する微生
物であれば、すべての微生物が利用可能であるし、それ
に由来する酵素も利用可能である。
【００１２】このような微生物としては、例えば公知の
ガラクトース資化能を有する酵母菌が広く利用でき、サ
ッカロミセス、チゴサッカロミセス、ハンゼヌラ、ピヒ
ア、クルイベロミセス属等の子のう菌酵母；スポロボミ
セス属等の外生胞子形成酵母；クリプトコッカス、トル
ロプシス、キャンディダ属等の非胞子形成酵母が適宜利
用できる。このように、ガラクトースの選択的除去に利
用する酵母菌は、公知のガラクトース資化能を有する酵
母菌のいずれも利用できるが、安全性の確認された菌株
が好ましい。本発明においては、例示菌株としてサッカ
ロマイセス セレビジェ ＩＦＯ ０２２４株（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ
０２２４）が有効に利用される。
ガラクトース資化能を有する酵母菌が広く利用でき、サ
ッカロミセス、チゴサッカロミセス、ハンゼヌラ、ピヒ
ア、クルイベロミセス属等の子のう菌酵母；スポロボミ
セス属等の外生胞子形成酵母；クリプトコッカス、トル
ロプシス、キャンディダ属等の非胞子形成酵母が適宜利
用できる。このように、ガラクトースの選択的除去に利
用する酵母菌は、公知のガラクトース資化能を有する酵
母菌のいずれも利用できるが、安全性の確認された菌株
が好ましい。本発明においては、例示菌株としてサッカ
ロマイセス セレビジェ ＩＦＯ ０２２４株（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ
０２２４）が有効に利用される。
【００１３】本発明にしたがい、これら酵素および酵母
を用いて、高純度キシログルカンオリゴ７糖を調製する
には、まず、タマリンド種子キシログルカンを酵素によ
り加水分解し、キシログルカンオリゴ７糖とガラクトー
スの混合物を得る必要がある。この酵素分解工程におい
ては、タマリンド種子より公知の方法で調製した純粋な
キシログルカン０．５〜１５％に対して、エンド−１，
４−β−グルカナーゼは０．１〜０．５単位／ｍｌの濃
度範囲で、またβ−ガラクトシダーゼは０．１〜１．０
単位／ｍｌの濃度範囲で作用させる。このときの酵素濃
度、反応ｐＨ、反応温度および反応時間は、酵素起源に
よりそれぞれ異なり、それぞれの起源の酵素に最適な条
件で行えばよいが、糸状菌起源の酵素を用いたときは、
通常、反応ｐＨ５．０付近、反応温度４５〜５０℃で４
〜２４時間の反応が選択される。また、添加の順番は特
に指定されず、どの様な順番で添加しても最終的に、キ
シログルカンオリゴ７糖とガラクトースの混合物が得ら
れるが、好ましくは、酵素を予め添加した適当な緩衝液
中へ、分解基質であるキシログルカンを添加する。これ
は、キシログルカンが高分子量であるため、その溶液は
濃度とともに粘性が増大し、濃度３％以上では均一な溶
液となりがたいが、分解酵素が予め存在することによ
り、粘度の増大を防ぐことができるためである。
を用いて、高純度キシログルカンオリゴ７糖を調製する
には、まず、タマリンド種子キシログルカンを酵素によ
り加水分解し、キシログルカンオリゴ７糖とガラクトー
スの混合物を得る必要がある。この酵素分解工程におい
ては、タマリンド種子より公知の方法で調製した純粋な
キシログルカン０．５〜１５％に対して、エンド−１，
４−β−グルカナーゼは０．１〜０．５単位／ｍｌの濃
度範囲で、またβ−ガラクトシダーゼは０．１〜１．０
単位／ｍｌの濃度範囲で作用させる。このときの酵素濃
度、反応ｐＨ、反応温度および反応時間は、酵素起源に
よりそれぞれ異なり、それぞれの起源の酵素に最適な条
件で行えばよいが、糸状菌起源の酵素を用いたときは、
通常、反応ｐＨ５．０付近、反応温度４５〜５０℃で４
〜２４時間の反応が選択される。また、添加の順番は特
に指定されず、どの様な順番で添加しても最終的に、キ
シログルカンオリゴ７糖とガラクトースの混合物が得ら
れるが、好ましくは、酵素を予め添加した適当な緩衝液
中へ、分解基質であるキシログルカンを添加する。これ
は、キシログルカンが高分子量であるため、その溶液は
濃度とともに粘性が増大し、濃度３％以上では均一な溶
液となりがたいが、分解酵素が予め存在することによ
り、粘度の増大を防ぐことができるためである。
【００１４】続いて、このようにして得られたキシログ
ルカンオリゴ７糖とガラクトースの混合液をそのまま、
あるいは適度に濃縮してガラクトース濃度を０．５〜４
％に調整した後、微量の窒素源および無機塩類を添加
し、ガラクトース資化性酵母を接種・培養してガラクト
ースを選択的に消費せしめる。このとき添加する、窒素
源および無機塩の種類は、用いる酵母菌の種類により異
なるが、通常、窒素源としては０．０２〜０．１％の硫
酸アンモニウムが、無機塩類としては０．００５〜０．
０２５％の硫酸マグネシウム、及び０．０１〜０．０５
％リン酸二水素カリウムが添加され、また必要に応じて
微量の酵母エキスが添加される。このように調製された
培地を通常の方法で滅菌後、これに酵母菌を接種し２０
〜３０℃で、１〜４日間好気的に培養して酵母菌を生育
させ、ガラクトースを完全に消費させる。培養終了後、
培養液を遠心分離して酵母菌体を分離し、上清にキシロ
グルカンオリゴ７糖液を得る。
ルカンオリゴ７糖とガラクトースの混合液をそのまま、
あるいは適度に濃縮してガラクトース濃度を０．５〜４
％に調整した後、微量の窒素源および無機塩類を添加
し、ガラクトース資化性酵母を接種・培養してガラクト
ースを選択的に消費せしめる。このとき添加する、窒素
源および無機塩の種類は、用いる酵母菌の種類により異
なるが、通常、窒素源としては０．０２〜０．１％の硫
酸アンモニウムが、無機塩類としては０．００５〜０．
０２５％の硫酸マグネシウム、及び０．０１〜０．０５
％リン酸二水素カリウムが添加され、また必要に応じて
微量の酵母エキスが添加される。このように調製された
培地を通常の方法で滅菌後、これに酵母菌を接種し２０
〜３０℃で、１〜４日間好気的に培養して酵母菌を生育
させ、ガラクトースを完全に消費させる。培養終了後、
培養液を遠心分離して酵母菌体を分離し、上清にキシロ
グルカンオリゴ７糖液を得る。
【００１５】キシログルカンオリゴ７糖は、上清を濃縮
後、凍結乾燥あるいはエタノール沈澱を行うことによ
り、粉末状に回収される。このようにして、得られた該
オリゴ糖はほとんどガラクトースを含まず、イソプリメ
ベロシド製造のための供与体として好適なものである
が、なお微量の塩類を含む。これら塩類は、混合型のイ
オン交換樹脂を添加することにより容易に除去すること
ができ、高純度のキシログルカンオリゴ７糖が得られ
る。
後、凍結乾燥あるいはエタノール沈澱を行うことによ
り、粉末状に回収される。このようにして、得られた該
オリゴ糖はほとんどガラクトースを含まず、イソプリメ
ベロシド製造のための供与体として好適なものである
が、なお微量の塩類を含む。これら塩類は、混合型のイ
オン交換樹脂を添加することにより容易に除去すること
ができ、高純度のキシログルカンオリゴ７糖が得られ
る。
【００１６】上記した本発明の工程により、従来のカラ
ムクロマトグラフィーを用いず、効率よく、比較的多量
の高純度キシログルカンオリゴ７糖を製造できる。
ムクロマトグラフィーを用いず、効率よく、比較的多量
の高純度キシログルカンオリゴ７糖を製造できる。
【００１７】次に、実施例をもって本発明をさらに詳細
に説明する。
に説明する。
【００１８】
【実施例１】タマリンド種子キシログルカン調整品とし
て大日本製薬製グリロイド３Ｓを用い、この５０ｇを５
０００ｍｌの水に溶解し約１％の水溶液を調製した。こ
れを遠心分離して不溶物を除き、上清に対して等量のエ
タノールを添加し、不溶化してくるキシログルカンを濾
過により回収し、精製タマリンド種子キシログルカンを
得た。収量は３５．６ｇであった。
て大日本製薬製グリロイド３Ｓを用い、この５０ｇを５
０００ｍｌの水に溶解し約１％の水溶液を調製した。こ
れを遠心分離して不溶物を除き、上清に対して等量のエ
タノールを添加し、不溶化してくるキシログルカンを濾
過により回収し、精製タマリンド種子キシログルカンを
得た。収量は３５．６ｇであった。
【００１９】
【実施例２】Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属菌由来の市販エ
ンド型セルラーゼ製剤として、ヤクルト生化学社製「セ
ルラーゼＯＮＯＺＵＫＡ Ｒ−１０」を用い、この１ｇ
を１０ｍｌの２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液ｐＨ
７．４に溶解し、不溶物を遠心分離により除去した。つ
づいて、ファルマシア ファイン ケミカルズ社製の陰
イオン交換体ＰＢＥ−９４を用いた、イオン交換クロマ
トグラフィーをおこなった。塩化ナトリウムの直線濃度
勾配による溶出をおこない、塩化ナトリウム濃度０．３
５Ｍ付近に溶出してくるエンド型セルラーゼ活性画分を
得た。この画分にはイソプリメベロース生成酵素活性は
全く存在せず、活性収率８．３％、比活性０．２１単位
／ｍｇタンパク質のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属菌由来の
エンド型セルラーゼ部分精製標品を調製できた。
ンド型セルラーゼ製剤として、ヤクルト生化学社製「セ
ルラーゼＯＮＯＺＵＫＡ Ｒ−１０」を用い、この１ｇ
を１０ｍｌの２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液ｐＨ
７．４に溶解し、不溶物を遠心分離により除去した。つ
づいて、ファルマシア ファイン ケミカルズ社製の陰
イオン交換体ＰＢＥ−９４を用いた、イオン交換クロマ
トグラフィーをおこなった。塩化ナトリウムの直線濃度
勾配による溶出をおこない、塩化ナトリウム濃度０．３
５Ｍ付近に溶出してくるエンド型セルラーゼ活性画分を
得た。この画分にはイソプリメベロース生成酵素活性は
全く存在せず、活性収率８．３％、比活性０．２１単位
／ｍｇタンパク質のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属菌由来の
エンド型セルラーゼ部分精製標品を調製できた。
【００２０】
【実施例３】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来の市販β
−ガラクトシダーゼ製剤として、シグマ社製「β−ガラ
クトシダーゼ」を用い、この１ｇを５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）２０ｍｌに溶解し、不溶物を遠心分離に
より除去したのち、ファルマシア ファイン ケミカル
ズ社製の陰イオン交換体Ｑ−セファロースＦＦを用いた
カラムクロマトグラフィーを行った。塩化ナトリウムの
直線濃度勾配により溶出し、塩化ナトリウム濃度０．０
８Ｍ付近に溶出される活性画分を得た。この画分には、
ほとんどイソプリメベロース生成酵素活性はなく、活性
収率２．１％、比活性０．０７単位／ｍｇタンパク質
の、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のβ−ガラクトシ
ダーゼ部分精製標品を調製できた。
−ガラクトシダーゼ製剤として、シグマ社製「β−ガラ
クトシダーゼ」を用い、この１ｇを５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）２０ｍｌに溶解し、不溶物を遠心分離に
より除去したのち、ファルマシア ファイン ケミカル
ズ社製の陰イオン交換体Ｑ−セファロースＦＦを用いた
カラムクロマトグラフィーを行った。塩化ナトリウムの
直線濃度勾配により溶出し、塩化ナトリウム濃度０．０
８Ｍ付近に溶出される活性画分を得た。この画分には、
ほとんどイソプリメベロース生成酵素活性はなく、活性
収率２．１％、比活性０．０７単位／ｍｇタンパク質
の、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のβ−ガラクトシ
ダーゼ部分精製標品を調製できた。
【００２１】
【実施例４】実施例１で調製した精製キシログルカン
０．５ｇを、５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍｌ
に溶解し、これに実施例２および３で調製した酵素をそ
れぞれ約０．１単位／ｍｌとなるよう添加し、４５℃で
１８時間反応させた。反応液の一部をＬｉＣｈｒｏｓｏ
ｒｂ ＮＨ2を用いた高速液体クロマトグラフィーで分
析した結果を図１に示す。図から明らかなように、キシ
ログルカンは約２０％のガラクトースと約８０％のキシ
ログルカンオリゴ７糖に完全に分解された。すなわち、
約０．１ｇのガラクトースと０．４ｇのオリゴ７糖が生
成していた。
０．５ｇを、５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍｌ
に溶解し、これに実施例２および３で調製した酵素をそ
れぞれ約０．１単位／ｍｌとなるよう添加し、４５℃で
１８時間反応させた。反応液の一部をＬｉＣｈｒｏｓｏ
ｒｂ ＮＨ2を用いた高速液体クロマトグラフィーで分
析した結果を図１に示す。図から明らかなように、キシ
ログルカンは約２０％のガラクトースと約８０％のキシ
ログルカンオリゴ７糖に完全に分解された。すなわち、
約０．１ｇのガラクトースと０．４ｇのオリゴ７糖が生
成していた。
【００２２】
【実施例５】実施例４で得られたキシログルカンの酵素
分解物を、減圧濃縮により約２．５倍に濃縮し、ガラク
トース濃度を約０．５％とした。これを２００ｍｌの三
角フラスコに移し、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウ
ム、及びリン酸二水素カリウムをそれぞれ終濃度が０．
１％、０．０２５％及び０．０５％となるよう添加し、
常法により滅菌した。こうして調製した培地に対し、ガ
ラクトース資化能をもつ酵母、サッカロマイセス セレ
ビジェ ＩＦＯ−０２２４株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ−０２２４）を接
種し、３０℃で１８時間好気的に培養した。培養液を遠
心分離し、菌体を除去した上清について、実施例４と同
様に高速液体クロマトグラフィーにより分析した。図２
に示したように、ガラクトースは消失し、オリゴ７糖の
みが残存していることが示された。
分解物を、減圧濃縮により約２．５倍に濃縮し、ガラク
トース濃度を約０．５％とした。これを２００ｍｌの三
角フラスコに移し、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウ
ム、及びリン酸二水素カリウムをそれぞれ終濃度が０．
１％、０．０２５％及び０．０５％となるよう添加し、
常法により滅菌した。こうして調製した培地に対し、ガ
ラクトース資化能をもつ酵母、サッカロマイセス セレ
ビジェ ＩＦＯ−０２２４株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ−０２２４）を接
種し、３０℃で１８時間好気的に培養した。培養液を遠
心分離し、菌体を除去した上清について、実施例４と同
様に高速液体クロマトグラフィーにより分析した。図２
に示したように、ガラクトースは消失し、オリゴ７糖の
みが残存していることが示された。
【００２３】
【実施例６】ユーペニシリウム属菌Ｍ９株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３３４２）のキシログルカン培養液より、公知の
方法で精製したエンド型セルラーゼおよび実施例３で調
製したβ−ガラクトシダーゼをそれぞれ０．５単位／ｍ
ｌおよび１．０単位／ｍｌの濃度で予め添加し、４５℃
に保温した５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００ｍｌ
に対して、実施例１で調製した精製キシログルカン１０
ｇを約３時間かけて徐々に添加し、粘度の増大を抑えな
がらキシログルカンの酵素分解を行った。さらに２０時
間４５℃で反応を継続したのち、生成物を実施例４と同
様に分析した。その結果、添加したキシログルカンは完
全に分解され、約２ｇのガラクトースと８ｇのオリゴ７
糖が生成していた。これに実施例５と同様に窒素源、無
機塩類を添加し、サッカロマイセス セレビジェ ＩＦ
Ｏ−０２２４を接種し、３０℃４８時間好気的に培養し
た。培養液を遠心分離し、酵母菌体を除去した上清液
に、さらにバイオラッド社製混合型イオン交換樹脂ＡＧ
−５０１Ｘを１ｇ添加して脱塩したのち、実施例５と同
様に分析した。その結果、ガラクトースは完全に消失し
ていた。脱塩した培養上清を減圧濃縮後、凍結乾燥して
オリゴ７糖の白色の粉末７．８ｇを得た。収量は、添加
したキシログルカンに対して７８％であり、高速液体ク
ロマトグラフィーをもちいた純度検定で、純度９６％で
あった。
Ｐ−１３３４２）のキシログルカン培養液より、公知の
方法で精製したエンド型セルラーゼおよび実施例３で調
製したβ−ガラクトシダーゼをそれぞれ０．５単位／ｍ
ｌおよび１．０単位／ｍｌの濃度で予め添加し、４５℃
に保温した５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００ｍｌ
に対して、実施例１で調製した精製キシログルカン１０
ｇを約３時間かけて徐々に添加し、粘度の増大を抑えな
がらキシログルカンの酵素分解を行った。さらに２０時
間４５℃で反応を継続したのち、生成物を実施例４と同
様に分析した。その結果、添加したキシログルカンは完
全に分解され、約２ｇのガラクトースと８ｇのオリゴ７
糖が生成していた。これに実施例５と同様に窒素源、無
機塩類を添加し、サッカロマイセス セレビジェ ＩＦ
Ｏ−０２２４を接種し、３０℃４８時間好気的に培養し
た。培養液を遠心分離し、酵母菌体を除去した上清液
に、さらにバイオラッド社製混合型イオン交換樹脂ＡＧ
−５０１Ｘを１ｇ添加して脱塩したのち、実施例５と同
様に分析した。その結果、ガラクトースは完全に消失し
ていた。脱塩した培養上清を減圧濃縮後、凍結乾燥して
オリゴ７糖の白色の粉末７．８ｇを得た。収量は、添加
したキシログルカンに対して７８％であり、高速液体ク
ロマトグラフィーをもちいた純度検定で、純度９６％で
あった。
【００２４】
【発明の効果】本発明によれば、生物的方法を有機的に
結合してなる新規な構成要件を採用することにより、高
純度のキシログルカンオリゴ７糖を効率よく製造するこ
とができる。
結合してなる新規な構成要件を採用することにより、高
純度のキシログルカンオリゴ７糖を効率よく製造するこ
とができる。
【図１】タマリンドキシログルカンをエンド−１，４−
β−グルカナーゼ、β−ガラクトシダーゼを作用させて
得たキシログルカンオリゴ７糖とガラクトースの混合液
をＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ2カラムを用いたＨＰＬ
Ｃで分析したクロマトグラムを示す。図中Ａは無機塩類
の溶出位置を、Ｂはガラクトースの溶出位置を、またＣ
はキシログルカンオリゴ７糖の溶出位置をそれぞれ示し
ている。
β−グルカナーゼ、β−ガラクトシダーゼを作用させて
得たキシログルカンオリゴ７糖とガラクトースの混合液
をＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ2カラムを用いたＨＰＬ
Ｃで分析したクロマトグラムを示す。図中Ａは無機塩類
の溶出位置を、Ｂはガラクトースの溶出位置を、またＣ
はキシログルカンオリゴ７糖の溶出位置をそれぞれ示し
ている。
【図２】上記の混合物に酵母菌を培養させ、ガラクトー
スを消費させた培養液の上清をＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ
ＮＨ2カラムを用いたＨＰＬＣで分析したクロマトグラ
ムを示す。図中Ａは無機塩類の溶出位置を、またＣはキ
シログルカンオリゴ７糖の溶出位置をそれぞれ示してい
る。
スを消費させた培養液の上清をＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ
ＮＨ2カラムを用いたＨＰＬＣで分析したクロマトグラ
ムを示す。図中Ａは無機塩類の溶出位置を、またＣはキ
シログルカンオリゴ７糖の溶出位置をそれぞれ示してい
る。
フロントページの続き
(56)参考文献 平成４年度日本生物工学会大会要旨
集，1992年10月，ｐ．103
日本農芸化学会誌，1993年 ３月，Ｖ
ｏｌ．67， Ｎｏ．３，ｐ．119 223
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12P 19/00 - 19/64
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (2)
- 【請求項１】 タマリンド種子キシログルカンに、エン
ド−１，４−β−グルカナーゼおよびβ−ガラクトシダ
ーゼを作用させ、キシログルカンオリゴ７糖とガラクト
ースの混合物を生じせしめ、続いて該混合物にガラクト
ース資化性菌を接種して培養し、ガラクトースのみを選
択的に消費させることを特徴とする高純度キシログルカ
ンオリゴ７糖の製造方法。 - 【請求項２】 ガラクトース資化性菌がガラクトース資
化能を有する酵母菌であることを特徴とする請求項１に
記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20125593A JP3482454B2 (ja) | 1993-07-22 | 1993-07-22 | 高純度キシログルカンオリゴ７糖の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20125593A JP3482454B2 (ja) | 1993-07-22 | 1993-07-22 | 高純度キシログルカンオリゴ７糖の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0731491A JPH0731491A (ja) | 1995-02-03 |
| JP3482454B2 true JP3482454B2 (ja) | 2003-12-22 |
Family
ID=16437915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20125593A Expired - Lifetime JP3482454B2 (ja) | 1993-07-22 | 1993-07-22 | 高純度キシログルカンオリゴ７糖の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3482454B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4859477B2 (ja) * | 2006-02-17 | 2012-01-25 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 酵母を利用した精糖方法 |
| TWI768314B (zh) * | 2019-03-28 | 2022-06-21 | 日商日產化學股份有限公司 | 感溫性液狀培養基組成物 |
-
1993
- 1993-07-22 JP JP20125593A patent/JP3482454B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 平成４年度日本生物工学会大会要旨集，１９９２年１０月，ｐ．１０３ |
| 日本農芸化学会誌，１９９３年 ３月，Ｖｏｌ．６７， Ｎｏ．３，ｐ．１１９ ２２３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0731491A (ja) | 1995-02-03 |
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |