JPH07255473A - トレハロースホスホリラーゼおよびその製造法 - Google Patents
トレハロースホスホリラーゼおよびその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 温度安定性に優れたトレハロースホスホリラ
ーゼを提供する。 【構成】 本発明のトレハロースホシホリラーゼは微生
物の培養物から得ることができ、温度安定性に優れ、ト
レハロースと無機リン酸またはその塩に作用してα−Ｄ
−グルコース １−リン酸とＤ−グルコースを生成し、
またα−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコース
に作用してトレハロースを生成する。また、このトレハ
ロースホスホリラーゼの調製方法およびこれを利用する
トレハロースまたはα−Ｄ−グルコース １−リン酸の
製造方法に関する。
ーゼを提供する。 【構成】 本発明のトレハロースホシホリラーゼは微生
物の培養物から得ることができ、温度安定性に優れ、ト
レハロースと無機リン酸またはその塩に作用してα−Ｄ
−グルコース １−リン酸とＤ−グルコースを生成し、
またα−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコース
に作用してトレハロースを生成する。また、このトレハ
ロースホスホリラーゼの調製方法およびこれを利用する
トレハロースまたはα−Ｄ−グルコース １−リン酸の
製造方法に関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トレハロースの製造に
有用なトレハロースホスホリラーゼ、特に温度安定性に
優れたトレハロースホスホリラーゼ、その製造方法およ
びその利用に関するものである。
有用なトレハロースホスホリラーゼ、特に温度安定性に
優れたトレハロースホスホリラーゼ、その製造方法およ
びその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、エンザイム・ノーメンクレイチャ
ー・１９９２ (Enzyme Nomenclature1992、Academic Pr
ess )に、トレハロースホスホリラーゼとして、ユーグ
レナグラシリス(Euglena gracilis）由来のＥＣ ２．
４．１．６４のトレハロースホスホリラーゼが記載報告
されている。また、フラムリナ ベルチペス（Flammuli
na velutipes)より得られる酵素がα−グルコース １
−リン酸とグルコースからトレハロースを生成させるト
レハロースホスホリラーゼとして報告されている（FEMS
Microbiology Letters, 55, 147-150 (1988) ）。しか
し、上記文献に記載されているフラムリナ ベルチペス
（Flammulina velutipes)由来のトレハロースホスホリ
ラーゼは、酵素精製が困難で十分精製されていない。こ
の酵素が十分に精製できない原因として、この酵素の安
定性が低いためと考えられる。従って、その酵素として
の性質の記載が十分になされているとはいいがたい。例
えば、酵素のｐＨ安定性、温度安定性、至適反応温度、
酵素の分子量に関する記載がなく、また至適反応ｐＨ、
基質特異性に関して十分な記載がなされているとはいい
がたい。また、α−グルコース １−リン酸とグルコー
スからのトレハロースの生産性も良いと言えない。エン
ザイム・ノーメンクレイチャー・１９９２(Enzyme Nome
nclature 1992、Academic Press) に記載されているＥ
Ｃ ２．４．１．６４のトレハロースホスホリラーゼ
は、β−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコース
からトレハロースを生成するトレハロースホスホリラー
ゼである。
ー・１９９２ (Enzyme Nomenclature1992、Academic Pr
ess )に、トレハロースホスホリラーゼとして、ユーグ
レナグラシリス(Euglena gracilis）由来のＥＣ ２．
４．１．６４のトレハロースホスホリラーゼが記載報告
されている。また、フラムリナ ベルチペス（Flammuli
na velutipes)より得られる酵素がα−グルコース １
−リン酸とグルコースからトレハロースを生成させるト
レハロースホスホリラーゼとして報告されている（FEMS
Microbiology Letters, 55, 147-150 (1988) ）。しか
し、上記文献に記載されているフラムリナ ベルチペス
（Flammulina velutipes)由来のトレハロースホスホリ
ラーゼは、酵素精製が困難で十分精製されていない。こ
の酵素が十分に精製できない原因として、この酵素の安
定性が低いためと考えられる。従って、その酵素として
の性質の記載が十分になされているとはいいがたい。例
えば、酵素のｐＨ安定性、温度安定性、至適反応温度、
酵素の分子量に関する記載がなく、また至適反応ｐＨ、
基質特異性に関して十分な記載がなされているとはいい
がたい。また、α−グルコース １−リン酸とグルコー
スからのトレハロースの生産性も良いと言えない。エン
ザイム・ノーメンクレイチャー・１９９２(Enzyme Nome
nclature 1992、Academic Press) に記載されているＥ
Ｃ ２．４．１．６４のトレハロースホスホリラーゼ
は、β−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコース
からトレハロースを生成するトレハロースホスホリラー
ゼである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述のよう
な現状に鑑み、α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−
グルコースからトレハロースを生成し、かつ、温度安定
性に優れたトレハロースホスホリラーゼを提供すること
を課題とし、またこのようなトレハロースホスホリラー
ゼの調整方法、さらにこれを用いたトレハロースの製造
方法を提供することを課題とする。本発明はα−Ｄ−グ
ルコース 1 −リン酸とＤ−グルコースからトレハロー
スを生産する酵素を見いだしたことによりなされたもの
であり、β−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコ
ースとからトレハロースを生産する上記公知の酵素とは
明らかに基質特異性が異なりまったく別種の酵素であ
る。以下、本発明において述べるトレハロースホスホリ
ラーゼとは、α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グ
ルコースからトレハロースを生成することができる酵素
である。
な現状に鑑み、α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−
グルコースからトレハロースを生成し、かつ、温度安定
性に優れたトレハロースホスホリラーゼを提供すること
を課題とし、またこのようなトレハロースホスホリラー
ゼの調整方法、さらにこれを用いたトレハロースの製造
方法を提供することを課題とする。本発明はα−Ｄ−グ
ルコース 1 −リン酸とＤ−グルコースからトレハロー
スを生産する酵素を見いだしたことによりなされたもの
であり、β−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコ
ースとからトレハロースを生産する上記公知の酵素とは
明らかに基質特異性が異なりまったく別種の酵素であ
る。以下、本発明において述べるトレハロースホスホリ
ラーゼとは、α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グ
ルコースからトレハロースを生成することができる酵素
である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、α−Ｄ−
グルコース １−リン酸とＤ−グルコースから温度安定
性に優れた、従来知られていないトレハロースホスホリ
ラーゼを求め鋭意研究した結果、グリフォラ(Grifola)
属、プレウロツス(Pleurotus) 属、リオフィルム(Lyoph
yllum)属、レンチヌス(Lentinus)属、アガリクス(Agari
cus)属、トラメテス(Trametes)属、コリオルス(Coriolu
s)属、レンチテス(Lenzites)属、シゾフィルム(Schizop
hyllum) 属、パヌス(Panus) 属、クレピドツス(Crepido
tus)属、ラエチポルス(Laetiporus)属、ポリポレルス(P
olyporellus)属、ファボルス(Favolus) 属、トリキャプ
ツム(Trichaptum)属、オウデマンシエラ(Oudemansiell
a)属、ナエマトロマ(Naematoloma) 属、ロドフィルス(R
hodophyllus)属、グロエオフィルム(Gloeophyllum)属、
ホメス(Fomes) 属、ガノデルマ(Ganoderma) 属、エルフ
ビンギア(Elfvingia) 属、フォミトプシス(Fomitopsis)
属、アルミラリエラ(Armillariella) 属、ランプテロミ
セス(Lampteromyces) 属、フォリオタ(Pholiota)属、ト
リコロマ(Tricholoma)属の菌株がトレハロースホスホリ
ラーゼを生産することを見いだした。また、これら微生
物の培養物から得られるトレハロースホスホリラーゼ
は、温度安定性に優れていることを見いだし本発明を完
成するに至った。本発明においてはじめて、温度安定性
に優れたトレハロースホスホリラーゼが単一酵素まで精
製され、また、その理化学的性質の解明がなされた。
グルコース １−リン酸とＤ−グルコースから温度安定
性に優れた、従来知られていないトレハロースホスホリ
ラーゼを求め鋭意研究した結果、グリフォラ(Grifola)
属、プレウロツス(Pleurotus) 属、リオフィルム(Lyoph
yllum)属、レンチヌス(Lentinus)属、アガリクス(Agari
cus)属、トラメテス(Trametes)属、コリオルス(Coriolu
s)属、レンチテス(Lenzites)属、シゾフィルム(Schizop
hyllum) 属、パヌス(Panus) 属、クレピドツス(Crepido
tus)属、ラエチポルス(Laetiporus)属、ポリポレルス(P
olyporellus)属、ファボルス(Favolus) 属、トリキャプ
ツム(Trichaptum)属、オウデマンシエラ(Oudemansiell
a)属、ナエマトロマ(Naematoloma) 属、ロドフィルス(R
hodophyllus)属、グロエオフィルム(Gloeophyllum)属、
ホメス(Fomes) 属、ガノデルマ(Ganoderma) 属、エルフ
ビンギア(Elfvingia) 属、フォミトプシス(Fomitopsis)
属、アルミラリエラ(Armillariella) 属、ランプテロミ
セス(Lampteromyces) 属、フォリオタ(Pholiota)属、ト
リコロマ(Tricholoma)属の菌株がトレハロースホスホリ
ラーゼを生産することを見いだした。また、これら微生
物の培養物から得られるトレハロースホスホリラーゼ
は、温度安定性に優れていることを見いだし本発明を完
成するに至った。本発明においてはじめて、温度安定性
に優れたトレハロースホスホリラーゼが単一酵素まで精
製され、また、その理化学的性質の解明がなされた。
【０００５】すなわち、本発明は、温度安定性に優れ、
α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコースから
トレハロースを生成することができるトレハロースホス
ホリラーゼであり、また他の発明は、グリフォラ(Grifo
la) 属、プレウロツス(Pleurotus) 属、リオフィルム(L
yophyllum)属、レンチヌス(Lentinus)属、アガリクス(A
garicus)属、トラメテス(Trametes)属、コリオルス(Cor
iolus)属、レンチテス(Lenzites)属、シゾフィルム(Sch
izophyllum) 属、パヌス(Panus) 属、クレピドツス(Cre
pidotus)属、ラエチポルス(Laetiporus)属、ポリポレル
ス(Polyporellu s)属、ファボルス(Favolus) 属、トリキ
ャプツム(Trichaptum)属、オウデマンシエラ(Oudemansi
ella) 属、ナエマトロマ(Naematoloma) 属、ロドフィル
ス(Rhodophyllus)属、グロエオフィルム(Gloeophyllum)
属、ホメス(Fomes) 属、ガノデルマ(Ganoderma) 属、エ
ルフビンギア(Elfvingia) 属、フォミトプシス(Fomitop
sis)属、アルミラリエラ(Armillariella) 属、ランプテ
ロミセス(Lampteromyces)属、フォリオタ(Pholiota)属
またはトリコロマ(Tricholoma)属に属しトレハロースホ
スホリラーゼ生産能を有する微生物を培養してトリハロ
ースホスホリラーゼを産生せしめ、培養物からトレハロ
ースホスホリラーゼを採取することからなるトレハロー
スホスホリラーゼの製造法である。
α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコースから
トレハロースを生成することができるトレハロースホス
ホリラーゼであり、また他の発明は、グリフォラ(Grifo
la) 属、プレウロツス(Pleurotus) 属、リオフィルム(L
yophyllum)属、レンチヌス(Lentinus)属、アガリクス(A
garicus)属、トラメテス(Trametes)属、コリオルス(Cor
iolus)属、レンチテス(Lenzites)属、シゾフィルム(Sch
izophyllum) 属、パヌス(Panus) 属、クレピドツス(Cre
pidotus)属、ラエチポルス(Laetiporus)属、ポリポレル
ス(Polyporellu s)属、ファボルス(Favolus) 属、トリキ
ャプツム(Trichaptum)属、オウデマンシエラ(Oudemansi
ella) 属、ナエマトロマ(Naematoloma) 属、ロドフィル
ス(Rhodophyllus)属、グロエオフィルム(Gloeophyllum)
属、ホメス(Fomes) 属、ガノデルマ(Ganoderma) 属、エ
ルフビンギア(Elfvingia) 属、フォミトプシス(Fomitop
sis)属、アルミラリエラ(Armillariella) 属、ランプテ
ロミセス(Lampteromyces)属、フォリオタ(Pholiota)属
またはトリコロマ(Tricholoma)属に属しトレハロースホ
スホリラーゼ生産能を有する微生物を培養してトリハロ
ースホスホリラーゼを産生せしめ、培養物からトレハロ
ースホスホリラーゼを採取することからなるトレハロー
スホスホリラーゼの製造法である。
【０００６】また本発明は上記トレハロースホスホリラ
ーゼ生産菌により生産されるトレハロースホスホリラー
ゼおよび／または温度安定性に優れたトレハロースホス
ホリラーゼを用い、α−Ｄ−グルコース １−リン酸と
Ｄ−グルコースからトレハロースを製造するトレハロー
スの製造法に関するものである。また、本出願発明は上
記トレハロースホスホリラーゼ生産菌により生産される
トレハロースホスホリラーゼおよび／または温度安定性
に優れたトレハロースホスホリラーゼを用いトレハロー
スからα−Ｄ−グルコース １−リン酸を製造するα−
Ｄ−グルコース１−リン酸の製造法に関するものであ
る。
ーゼ生産菌により生産されるトレハロースホスホリラー
ゼおよび／または温度安定性に優れたトレハロースホス
ホリラーゼを用い、α−Ｄ−グルコース １−リン酸と
Ｄ−グルコースからトレハロースを製造するトレハロー
スの製造法に関するものである。また、本出願発明は上
記トレハロースホスホリラーゼ生産菌により生産される
トレハロースホスホリラーゼおよび／または温度安定性
に優れたトレハロースホスホリラーゼを用いトレハロー
スからα−Ｄ−グルコース １−リン酸を製造するα−
Ｄ−グルコース１−リン酸の製造法に関するものであ
る。
【０００７】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
により得られたトレハロースホスホリラーゼは、次の理
化学的性質を有する。 １．作用：α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グル
コースからトレハロースを生成する（以下、「トレハロ
ース合成反応」と呼称する）。無機リン酸の存在下トレ
ハロースに作用してα−Ｄ−グルコース １−リン酸と
Ｄ−グルコースを生成する（以下「加リン酸分解反応」
と呼称する）。 ２．基質特異性：加リン酸分解反応の二糖基質としては
トレハロースに作用する。合成反応においては、糖供与
体としてα−Ｄ−グルコース １−リン酸に、糖受容体
としてＤ−グルコースに作用する。 ３．至適作用ｐＨ： トレハロース合成反応 （３５℃） 最大活性を示すｐＨ 約７．０ 最大活性の約５０％の活性を示すｐＨ範囲 ６．５
から７．５ 加リン酸分解反応 （３０℃） 最大活性を示すｐＨ ６．０から６．５ 最大活性の約５０％の活性を示すｐＨ範囲 ５．５
から７．５ ４．ｐＨ安定性： トレハロース合成反応 ５．０から１０．０
（４℃、２４時間） 加リン酸分解反応 ５．５から９．５
（４℃、２４時間） ５．至適反応温度： トレハロース合成反応（ｐＨ７．０） 最大活性を示す温度 ３５から３７．５℃ 最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲 ３０から
４０℃ 加リン酸分解反応（ｐＨ６．０） 最大活性を示す温度 ３０から３５℃ 最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲 ２５から
３７．５℃ ６．温度安定性： トレハロース合成反応 ３５℃、３０分にて安定
（ｐＨ７．０） 加リン酸分解反応 ３５℃、３０分にて安定
（ｐＨ６．０） ７．金属による阻害：亜鉛、銅により阻害 ８．金属の要求性：なし ９．分子量： 約１２０，０００ダルトン（ＧＰＣによる） 約６０，０００ダルトン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
により得られたトレハロースホスホリラーゼは、次の理
化学的性質を有する。 １．作用：α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グル
コースからトレハロースを生成する（以下、「トレハロ
ース合成反応」と呼称する）。無機リン酸の存在下トレ
ハロースに作用してα−Ｄ−グルコース １−リン酸と
Ｄ−グルコースを生成する（以下「加リン酸分解反応」
と呼称する）。 ２．基質特異性：加リン酸分解反応の二糖基質としては
トレハロースに作用する。合成反応においては、糖供与
体としてα−Ｄ−グルコース １−リン酸に、糖受容体
としてＤ−グルコースに作用する。 ３．至適作用ｐＨ： トレハロース合成反応 （３５℃） 最大活性を示すｐＨ 約７．０ 最大活性の約５０％の活性を示すｐＨ範囲 ６．５
から７．５ 加リン酸分解反応 （３０℃） 最大活性を示すｐＨ ６．０から６．５ 最大活性の約５０％の活性を示すｐＨ範囲 ５．５
から７．５ ４．ｐＨ安定性： トレハロース合成反応 ５．０から１０．０
（４℃、２４時間） 加リン酸分解反応 ５．５から９．５
（４℃、２４時間） ５．至適反応温度： トレハロース合成反応（ｐＨ７．０） 最大活性を示す温度 ３５から３７．５℃ 最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲 ３０から
４０℃ 加リン酸分解反応（ｐＨ６．０） 最大活性を示す温度 ３０から３５℃ 最大活性の約８０％の活性を示す温度範囲 ２５から
３７．５℃ ６．温度安定性： トレハロース合成反応 ３５℃、３０分にて安定
（ｐＨ７．０） 加リン酸分解反応 ３５℃、３０分にて安定
（ｐＨ６．０） ７．金属による阻害：亜鉛、銅により阻害 ８．金属の要求性：なし ９．分子量： 約１２０，０００ダルトン（ＧＰＣによる） 約６０，０００ダルトン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
【０００８】α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グ
ルコースからトレハロースを生成することができる上記
理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼは従
来報告がなく本発明において、初めて報告される。フラ
ムリナ（Flammulina）由来のトレハロースホスホリラー
ゼ（FEMS Microbiology Letters, 55, 147-150 (1988)
）は、トレハロース合成反応の至適ｐＨは６．３、ト
レハロースの加リン酸分解反応の至適ｐＨは７．０と報
告されている。また、本発明者らの研究によればフラム
リナ ベルチペス (Flammulina velutipes)由来のトレ
ハロースホスホリラーゼは、３０℃、３０分の温度処理
により酵素活性が失われた。従って本発明によるトレハ
ロースホスホリラーゼは温度安定性、至適ｐＨにおいて
フラムリナ由来のトレハロースホスホリラーゼと明らか
に異なる新規なトレハロースホスホリラーゼである。
ルコースからトレハロースを生成することができる上記
理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼは従
来報告がなく本発明において、初めて報告される。フラ
ムリナ（Flammulina）由来のトレハロースホスホリラー
ゼ（FEMS Microbiology Letters, 55, 147-150 (1988)
）は、トレハロース合成反応の至適ｐＨは６．３、ト
レハロースの加リン酸分解反応の至適ｐＨは７．０と報
告されている。また、本発明者らの研究によればフラム
リナ ベルチペス (Flammulina velutipes)由来のトレ
ハロースホスホリラーゼは、３０℃、３０分の温度処理
により酵素活性が失われた。従って本発明によるトレハ
ロースホスホリラーゼは温度安定性、至適ｐＨにおいて
フラムリナ由来のトレハロースホスホリラーゼと明らか
に異なる新規なトレハロースホスホリラーゼである。
【０００９】また、本発明者らはグリフォラ(Grifola)
属、プレウロツス(Pleurotus) 属、リオフィルム(Lyoph
yllum)属、レンチヌス(Lentinus)属、アガリクス(Agari
cus)属、トラメテス(Trametes)属、コリオルス(Coriolu
s)属、レンチテス(Lenzites)属、シゾフィルム(Schizop
hyllum) 属、パヌス(Panus) 属、クレピドツス(Crepido
tus)属、ラエチポルス(Laetiporus)属、ポリポレルス(P
olyporellus)属、ファボルス(Favolus) 属、トリキャプ
ツム(Trichaptum)属、オウデマンシエラ(Oudemansiell
a) 属、ナエマトロマ(Naematoloma) 属、ロドフィルス
(Rhodophyllus)属、グロエオフィルム(Gloeophyllum)
属、ホメス(Fomes) 属、ガノデルマ(Ganoderma) 属、エ
ルフビンギア(Elfvingia) 属、フォミトプシス(Fomitop
sis)属、アルミラリエラ(Armillariella) 属、ランプテ
ロミセス(Lampteromyces) 属、フォリオタ(Pholiota)属
及びトリコロマ(Tricholoma)属の微生物がトレハロース
ホスホリラーゼを生産することを見いだした。本菌属中
にこのような酵素が存在することは従来知られていな
い。
属、プレウロツス(Pleurotus) 属、リオフィルム(Lyoph
yllum)属、レンチヌス(Lentinus)属、アガリクス(Agari
cus)属、トラメテス(Trametes)属、コリオルス(Coriolu
s)属、レンチテス(Lenzites)属、シゾフィルム(Schizop
hyllum) 属、パヌス(Panus) 属、クレピドツス(Crepido
tus)属、ラエチポルス(Laetiporus)属、ポリポレルス(P
olyporellus)属、ファボルス(Favolus) 属、トリキャプ
ツム(Trichaptum)属、オウデマンシエラ(Oudemansiell
a) 属、ナエマトロマ(Naematoloma) 属、ロドフィルス
(Rhodophyllus)属、グロエオフィルム(Gloeophyllum)
属、ホメス(Fomes) 属、ガノデルマ(Ganoderma) 属、エ
ルフビンギア(Elfvingia) 属、フォミトプシス(Fomitop
sis)属、アルミラリエラ(Armillariella) 属、ランプテ
ロミセス(Lampteromyces) 属、フォリオタ(Pholiota)属
及びトリコロマ(Tricholoma)属の微生物がトレハロース
ホスホリラーゼを生産することを見いだした。本菌属中
にこのような酵素が存在することは従来知られていな
い。
【００１０】また、上記生産菌により生産されるトレハ
ロースホスホリラーゼおよび／または上記理化学的性質
を持ち温度安定性に優れたトレハロースホスホリラーゼ
によるトレハロースあるいはα−Ｄ−グルコース １−
リン酸の製造法については、従来知られていない。
ロースホスホリラーゼおよび／または上記理化学的性質
を持ち温度安定性に優れたトレハロースホスホリラーゼ
によるトレハロースあるいはα−Ｄ−グルコース １−
リン酸の製造法については、従来知られていない。
【００１１】本発明におけるトレハロースホスホリラー
ゼの製造法について説明する。本発明において使用する
微生物は、グリフォラ(Grifola) 属、プレウロツス(Ple
urotus) 属、リオフィルム(Lyophyllum)属、レンチヌス
(Lentinus)属、アガリクス(Agaricus)属、トラメテス(T
rametes)属、コリオルス(Coriolus)属、レンチテス(Len
zites)属、シゾフィルム(Schizophyllum) 属、パヌス(P
anus) 属、クレピドツス(Crepidotus)属、ラエチポルス
(Laetiporus)属、ポリポレルス(Polyporellus)属、ファ
ボルス(Favolus) 属、トリキャプツム(Trichaptum)属、
オウデマンシエラ(Oudemansiella) 属、ナエマトロマ(N
aematoloma) 属、ロドフィルス(Rhodophyllus)属、グロ
エオフィルム(Gloeophyllum)属、ホメス(Fomes) 属、ガ
ノデルマ(Ganoderma) 属、エルフビンギア(Elfvingia)
属、フォミトプシス(Fomitopsis)属、アルミラリエラ(A
rmillariella) 属、ランプテロミセス(Lampteromyces)
属、フォリオタ(Pholiota)属またはトリコロマ(Trichol
oma)属に属し、トレハロースホスホリラーゼの生産能を
有する菌株であればいかなる菌株でもよく、またこれら
の菌株の変異株でもよい。また、本発明においては上記
理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼを生
産することができる任意の微生物を使用することもでき
る。
ゼの製造法について説明する。本発明において使用する
微生物は、グリフォラ(Grifola) 属、プレウロツス(Ple
urotus) 属、リオフィルム(Lyophyllum)属、レンチヌス
(Lentinus)属、アガリクス(Agaricus)属、トラメテス(T
rametes)属、コリオルス(Coriolus)属、レンチテス(Len
zites)属、シゾフィルム(Schizophyllum) 属、パヌス(P
anus) 属、クレピドツス(Crepidotus)属、ラエチポルス
(Laetiporus)属、ポリポレルス(Polyporellus)属、ファ
ボルス(Favolus) 属、トリキャプツム(Trichaptum)属、
オウデマンシエラ(Oudemansiella) 属、ナエマトロマ(N
aematoloma) 属、ロドフィルス(Rhodophyllus)属、グロ
エオフィルム(Gloeophyllum)属、ホメス(Fomes) 属、ガ
ノデルマ(Ganoderma) 属、エルフビンギア(Elfvingia)
属、フォミトプシス(Fomitopsis)属、アルミラリエラ(A
rmillariella) 属、ランプテロミセス(Lampteromyces)
属、フォリオタ(Pholiota)属またはトリコロマ(Trichol
oma)属に属し、トレハロースホスホリラーゼの生産能を
有する菌株であればいかなる菌株でもよく、またこれら
の菌株の変異株でもよい。また、本発明においては上記
理化学的性質を持ったトレハロースホスホリラーゼを生
産することができる任意の微生物を使用することもでき
る。
【００１２】本発明のトレハロースホスホリラーゼは生
産菌の変異株取得は以下のように行われる。一般的に使
用される各種変異誘起剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタ
ンスルホネート（ＥＭＳ）、紫外線等を用いて、上記ト
レハロースホスホリラーゼ生産菌を処理することにより
変異株を得ることができる。本発明のトレハロースホス
ホリラーゼはまた、上記理化学的性質を持ったトレハロ
ースホスホリラーゼ、またはその修飾されたトレハロー
スホスホリラーゼの発現をコードする遺伝子を適当な宿
主に挿入し、そしてその宿主を培養することにより製造
することができる。上記理化学的性質を持ったトレハロ
ースホスホリラーゼをコードする遺伝子を得るための一
つの方法として下記の方法がある。該トレハロースホス
ホリラーゼのＮ末端アミノ酸から約２０番目までのアミ
ノ酸の配列より推定されるＤＮＡ塩基配列を合成し、こ
の部分ＤＮＡ塩基配列をプローブとする。上記理化学的
性質を持ったトレハロースホスホリラーゼ生産菌のゲノ
ミックＤＮＡをＥＭＢＬ３等のλファージにイン ビト
ロ パッケージングを行うことによりゲノミックライブ
ラリーを作製する。このゲノミックライブラリーのＤＮ
Ａと前述のプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション
により該トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝
子をクローニングすることができる。さらに、この遺伝
子を例えばサッカロマイセス属またはアスペルギルス属
中で発現できるベクターに挿入し、このベクターによっ
てサッカロマイセス属またはアスペルギルス属を形質転
換することにより該トレハロースホスホリラーゼを発現
する株を選択する。このような方法により該トレハロー
スホスホリラーゼの発現をコードする遺伝子を保有する
宿主を得ることができる。
産菌の変異株取得は以下のように行われる。一般的に使
用される各種変異誘起剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタ
ンスルホネート（ＥＭＳ）、紫外線等を用いて、上記ト
レハロースホスホリラーゼ生産菌を処理することにより
変異株を得ることができる。本発明のトレハロースホス
ホリラーゼはまた、上記理化学的性質を持ったトレハロ
ースホスホリラーゼ、またはその修飾されたトレハロー
スホスホリラーゼの発現をコードする遺伝子を適当な宿
主に挿入し、そしてその宿主を培養することにより製造
することができる。上記理化学的性質を持ったトレハロ
ースホスホリラーゼをコードする遺伝子を得るための一
つの方法として下記の方法がある。該トレハロースホス
ホリラーゼのＮ末端アミノ酸から約２０番目までのアミ
ノ酸の配列より推定されるＤＮＡ塩基配列を合成し、こ
の部分ＤＮＡ塩基配列をプローブとする。上記理化学的
性質を持ったトレハロースホスホリラーゼ生産菌のゲノ
ミックＤＮＡをＥＭＢＬ３等のλファージにイン ビト
ロ パッケージングを行うことによりゲノミックライブ
ラリーを作製する。このゲノミックライブラリーのＤＮ
Ａと前述のプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション
により該トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝
子をクローニングすることができる。さらに、この遺伝
子を例えばサッカロマイセス属またはアスペルギルス属
中で発現できるベクターに挿入し、このベクターによっ
てサッカロマイセス属またはアスペルギルス属を形質転
換することにより該トレハロースホスホリラーゼを発現
する株を選択する。このような方法により該トレハロー
スホスホリラーゼの発現をコードする遺伝子を保有する
宿主を得ることができる。
【００１３】また、本発明においては、上記理化学的性
質を持ったトレハロースホスホリラーゼと免疫化学的性
質が同一であるか、あるいは部分的に同一であるトレハ
ロースホスホリラーゼを生産する微生物を使用すること
もできる。本発明における免疫化学的性質が同一である
か、あるいは部分的に同一であるトレハロースホスホリ
ラーゼとは、公知のオクテロニー(Ouchterlony )二重免
疫拡散法（「免疫生化学研究法」ｐ．４０、１９８６、
東京化学同人）により本発明の理化学的性質を有するト
レハロースホスホリラーゼとの間に完全融合あるいは部
分融合するような沈降線を与えるトレハロースホスホリ
ラーゼである。具体的なトレハロースホスホリラーゼ生
産菌株の例としては、通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている表１に示すような菌株を使用
することができる。
質を持ったトレハロースホスホリラーゼと免疫化学的性
質が同一であるか、あるいは部分的に同一であるトレハ
ロースホスホリラーゼを生産する微生物を使用すること
もできる。本発明における免疫化学的性質が同一である
か、あるいは部分的に同一であるトレハロースホスホリ
ラーゼとは、公知のオクテロニー(Ouchterlony )二重免
疫拡散法（「免疫生化学研究法」ｐ．４０、１９８６、
東京化学同人）により本発明の理化学的性質を有するト
レハロースホスホリラーゼとの間に完全融合あるいは部
分融合するような沈降線を与えるトレハロースホスホリ
ラーゼである。具体的なトレハロースホスホリラーゼ生
産菌株の例としては、通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている表１に示すような菌株を使用
することができる。
【００１４】また、プレウロツス コルヌコピアエ(Ple
urotus cornucopiae)ＩＦＯ ３０５２８、ラエチポル
ス スルフレウス (Laetiporus sulphureus) ＩＦＯ
８４０６、ラエチポルス ベルシスポルス (Laetiporus
versisporus)ＩＦＯ ９０４３、ポリポレルス ピシ
ペス (Polyporellus picipes)ＩＦＯ ３０３５５、オ
ウデマンシエラ カナリ(Oudemansiella canarii)ＩＦ
Ｏ ３１２１６、ガノデルマ アプラナツム(Ganoderma
applanatum) ＩＦＯ ６４９８、フォリオタアディポ
サ (Pholiota adiposa)ＩＦＯ ９７７９、トラメテス
ヒルスタ (Trametes hirsuta)ＡＴＣＣ ２０５６
１、トラメテス ベルシコロル (Trametes versicolo
r) ＡＴＣＣ ２０５４７、コリオルス コンソルス (C
oriolusconsors)ＡＴＣＣ ２０５６５、コリオルス
パルガメヌス (Coriolus pargamenus) ＡＴＣＣ ２０
５６２のような菌株を使用することもできる。
urotus cornucopiae)ＩＦＯ ３０５２８、ラエチポル
ス スルフレウス (Laetiporus sulphureus) ＩＦＯ
８４０６、ラエチポルス ベルシスポルス (Laetiporus
versisporus)ＩＦＯ ９０４３、ポリポレルス ピシ
ペス (Polyporellus picipes)ＩＦＯ ３０３５５、オ
ウデマンシエラ カナリ(Oudemansiella canarii)ＩＦ
Ｏ ３１２１６、ガノデルマ アプラナツム(Ganoderma
applanatum) ＩＦＯ ６４９８、フォリオタアディポ
サ (Pholiota adiposa)ＩＦＯ ９７７９、トラメテス
ヒルスタ (Trametes hirsuta)ＡＴＣＣ ２０５６
１、トラメテス ベルシコロル (Trametes versicolo
r) ＡＴＣＣ ２０５４７、コリオルス コンソルス (C
oriolusconsors)ＡＴＣＣ ２０５６５、コリオルス
パルガメヌス (Coriolus pargamenus) ＡＴＣＣ ２０
５６２のような菌株を使用することもできる。
【００１５】 表１ 菌 名 寄託番号 グリフォラ フロンドサ(Grifola frondosa) 微工研条寄第３５号 プレウロツス オストレアツス (Pleurotus ostreatus) 微工研菌寄第１７４６号 リオフィルム ウルマリウム (Lyophyllum ulmarium) 微工研菌寄第９８５号 レンチヌス エドデス (Lentinus edodes) 微工研条寄第９４７号 アガリクス ビスポルス (Agaricus bisporus) 微工研菌寄第１７４８号 コリオルス ベルシコロル (Coriolus versicolor) 微工研菌寄第２４１２号 コリオルス ヒルスツス (Coriolus hirsutus) 微工研菌寄第２７１１号 コリオルス コンソルス (Coriolus consors) 微工研菌寄第９８８号 レンチテス ベツリナ (Lenzites betulina) 微工研条寄第２７号 シゾフィルム コムネ (Schizophyllum commune) 微工研菌寄第１７４４号 パヌス ルディス(Panus rudis) 微工研条寄第４５８８号 クレピドツス バリアビリス (Crepidotus variabilis) 微工研菌寄第５１６１号 ファボルス アルクラリウス (Favolus arcularius) 微工研条寄第４５９０号 トリキャプツム ビフォルメ (Trichaptum biforme) 微工研菌寄第２７１２号 ナエマトロマ サブラテリチウム (Naematoloma sublateritium) 微研菌寄第３０５１号 ロドフィルス クレペアツス (Rhodophyllus clypeatus) 微工研条寄第４５８９号 グロエオフィルム セピアリウム (Gloeophyllum sepiarium) 微工研条寄第２８号 ホメス ホメンタリウス(Fomes fomentarius) 微工研条寄第３０号 エルフビンギア アプラナタ (Elfvingia applanata) 微工研条寄第１８号 フォミトプシス ピニコラ (Fomitopsis pinicola) 微工研条寄第２６号 アルミラリエラ メレア(Armillariella mellea) 微工研条寄第２８１号 ランプテロミセス ジャポニクス (Lampteromyces japonicus) 微工研菌寄第９８４号 トリコロマ マツタケ (Tricholoma matsutake) 微工研条寄第４５９１号
【００１６】これら寄託菌の菌株の同定、命名は今関六
也氏、本郷次男氏共著による「原色日本菌類図鑑」（正
（昭和４９年）、続（昭和５０年）保育社）、「原色日
本新菌類図鑑」（Ｉ巻（昭和６２年）、II巻（平成元
年）保育社）および伊藤誠哉氏著「日本菌類誌」（II巻
１部（昭和１１年）、２部（昭和１４年）、３部（昭和
２５年）、４部（昭和３０年）、５部（昭和３４年）養
賢堂）に準拠するものである。
也氏、本郷次男氏共著による「原色日本菌類図鑑」（正
（昭和４９年）、続（昭和５０年）保育社）、「原色日
本新菌類図鑑」（Ｉ巻（昭和６２年）、II巻（平成元
年）保育社）および伊藤誠哉氏著「日本菌類誌」（II巻
１部（昭和１１年）、２部（昭和１４年）、３部（昭和
２５年）、４部（昭和３０年）、５部（昭和３４年）養
賢堂）に準拠するものである。
【００１７】本発明の方法に使用し、また通産省工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託した菌種は、該菌種
が着生している腐朽植物体の一部、その植物体上に発生
している子実体の組織、または胞子を適当な寒天培地に
移植し、適温で数週間培養するという培養操作を３回な
いし４回繰り返し行なって純粋分離した。
術院生命工学工業技術研究所に寄託した菌種は、該菌種
が着生している腐朽植物体の一部、その植物体上に発生
している子実体の組織、または胞子を適当な寒天培地に
移植し、適温で数週間培養するという培養操作を３回な
いし４回繰り返し行なって純粋分離した。
【００１８】次に、本発明において用いる微生物を培養
する際に使用される培地としては、炭素源、窒素源、無
機塩類、ビタミン、その他の栄養源からなる合成培地ま
たは天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源とし
てはグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトー
ス、グリセロール、スターチ、廃糖密などの一般的に使
用されるものでよく、また誘導的な株の場合はトレハロ
ースを適宜用いてもよい。
する際に使用される培地としては、炭素源、窒素源、無
機塩類、ビタミン、その他の栄養源からなる合成培地ま
たは天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源とし
てはグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトー
ス、グリセロール、スターチ、廃糖密などの一般的に使
用されるものでよく、また誘導的な株の場合はトレハロ
ースを適宜用いてもよい。
【００１９】窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸二アンモニウ
ム、尿素等の無機窒素化合物あるいは酵母エキス、肉エ
キス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ
ー、大豆粕等の有機窒素源を使用することができる。さ
らに無機塩類として、例えば、カリウム塩、ナトリウム
塩、リン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩および微量の金属
塩を使用することができる。また、上記微生物の培養
は、担子菌の子実体の培養に使用される培養基材、例え
ば鋸屑、米糠、厩肥等を用いて行なうこともできる。他
に種々の界面活性剤を消泡剤として使用することもでき
る。
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸二アンモニウ
ム、尿素等の無機窒素化合物あるいは酵母エキス、肉エ
キス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ
ー、大豆粕等の有機窒素源を使用することができる。さ
らに無機塩類として、例えば、カリウム塩、ナトリウム
塩、リン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩および微量の金属
塩を使用することができる。また、上記微生物の培養
は、担子菌の子実体の培養に使用される培養基材、例え
ば鋸屑、米糠、厩肥等を用いて行なうこともできる。他
に種々の界面活性剤を消泡剤として使用することもでき
る。
【００２０】培養は、培養温度約２０から４０℃、好ま
しくは２５から３５℃、培地の初発ｐＨは４．５から
８．０、好ましくは５．０から７．０として、液体振と
う培養、ジャーファーメンターによる通気撹拌培養等に
より好気的に行なわれる。あるいは、静置培養、固体培
養等により行なわれる。
しくは２５から３５℃、培地の初発ｐＨは４．５から
８．０、好ましくは５．０から７．０として、液体振と
う培養、ジャーファーメンターによる通気撹拌培養等に
より好気的に行なわれる。あるいは、静置培養、固体培
養等により行なわれる。
【００２１】酵素源からのトレハロースホスホリラーゼ
の調製は以下のように行なう。酵素は主に菌体内にある
ので、まず培養物を遠心分離、あるいは濾過などの方法
で、菌体だけを分離するのが好ましい。菌体からのトレ
ハロースホスホリラーゼの分離精製は、培養終了後の培
養菌体を遠心分離し、緩衝液で菌体を洗浄した後、適当
量の緩衝液に懸濁し、菌体破砕をする。菌体破砕は、従
来から行なわれている超音波による菌体破砕、ワーリン
グブレンダーTM（ダイナミック社、ＵＳＡ）による菌体
破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させるダイノ
ミル破砕機等による菌体破砕、またはリゾチーム等の酵
素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破砕などによ
り行なうことができる。破砕した後不溶物を分離除去し
て得られる液を粗酵素液とする。粗酵素液はそのままト
レハロースまたはα−Ｄ−グルコース １−リン酸の製
造に用いることもできるが、さらに分離、精製して用い
ることもできる。
の調製は以下のように行なう。酵素は主に菌体内にある
ので、まず培養物を遠心分離、あるいは濾過などの方法
で、菌体だけを分離するのが好ましい。菌体からのトレ
ハロースホスホリラーゼの分離精製は、培養終了後の培
養菌体を遠心分離し、緩衝液で菌体を洗浄した後、適当
量の緩衝液に懸濁し、菌体破砕をする。菌体破砕は、従
来から行なわれている超音波による菌体破砕、ワーリン
グブレンダーTM（ダイナミック社、ＵＳＡ）による菌体
破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させるダイノ
ミル破砕機等による菌体破砕、またはリゾチーム等の酵
素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破砕などによ
り行なうことができる。破砕した後不溶物を分離除去し
て得られる液を粗酵素液とする。粗酵素液はそのままト
レハロースまたはα−Ｄ−グルコース １−リン酸の製
造に用いることもできるが、さらに分離、精製して用い
ることもできる。
【００２２】粗酵素液の分離、精製法としては、硫安沈
澱による塩析法、溶媒沈澱法、イオン交換樹脂による吸
着、透析膜による分離、限外濾過膜による濃縮、ハイド
ロキシアパタイトによる吸着、疎水性担体による分離、
アフィニテークロマトグラフィーによる分離等の一般的
な蛋白質の分離精製法を利用することができる。このよ
うにして得た精製酵素または粗酵素をそのまま用いても
よいが、公知の固定化手段、例えば担体結合法、架橋
法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固
定化酵素としてもよい。また、生菌体をポリアクリルア
ミド、κ−カラギナン、アルギン酸、光架橋性樹脂プレ
ポリマー等を利用する包括固定化法により固定化して生
体触媒として用いることもできる。
澱による塩析法、溶媒沈澱法、イオン交換樹脂による吸
着、透析膜による分離、限外濾過膜による濃縮、ハイド
ロキシアパタイトによる吸着、疎水性担体による分離、
アフィニテークロマトグラフィーによる分離等の一般的
な蛋白質の分離精製法を利用することができる。このよ
うにして得た精製酵素または粗酵素をそのまま用いても
よいが、公知の固定化手段、例えば担体結合法、架橋
法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固
定化酵素としてもよい。また、生菌体をポリアクリルア
ミド、κ−カラギナン、アルギン酸、光架橋性樹脂プレ
ポリマー等を利用する包括固定化法により固定化して生
体触媒として用いることもできる。
【００２３】酵素の活性は、以下により求めた。すなわ
ちトレハロース１０．８ g 、グルタチオン８６０ mg
、ＥＤＴＡ・２Ｎａ１７．２ mg を５７ mM リン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し全量を１００ ml
とした溶液１４００μｌ、２０mM ＮＡＤＰ＋水溶液１
００μｌ、２６ mM塩化マグネシウム水溶液１００μ
ｌ、１．３４ mM グルコース １，６−二リン酸水溶液
１００μｌ、ホスホグルコムターゼ３１単位／ml 水溶
液 １００μｌ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３
５単位／ml水溶液１００μｌ、および被検酵素液１００
μｌを混合し、３０℃で反応させて生成するＮＡＤＰＨ
量を波長３４０ nm の吸光度によって経時的に測定す
る。この条件下で１分間に１μmol のＮＡＤＰＨを生成
する酵素量を１単位とする。
ちトレハロース１０．８ g 、グルタチオン８６０ mg
、ＥＤＴＡ・２Ｎａ１７．２ mg を５７ mM リン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し全量を１００ ml
とした溶液１４００μｌ、２０mM ＮＡＤＰ＋水溶液１
００μｌ、２６ mM塩化マグネシウム水溶液１００μ
ｌ、１．３４ mM グルコース １，６−二リン酸水溶液
１００μｌ、ホスホグルコムターゼ３１単位／ml 水溶
液 １００μｌ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３
５単位／ml水溶液１００μｌ、および被検酵素液１００
μｌを混合し、３０℃で反応させて生成するＮＡＤＰＨ
量を波長３４０ nm の吸光度によって経時的に測定す
る。この条件下で１分間に１μmol のＮＡＤＰＨを生成
する酵素量を１単位とする。
【００２４】本発明によるトレハロースホスホリラーゼ
の完全に純化された酵素の比活性値は、約３．６単位／
mg 蛋白質を示す。また、ドデシル硫酸ナトリウムの存
在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法において単
一の蛋白バンドが観察される。
の完全に純化された酵素の比活性値は、約３．６単位／
mg 蛋白質を示す。また、ドデシル硫酸ナトリウムの存
在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法において単
一の蛋白バンドが観察される。
【００２５】本発明のトレハロースホスホリラーゼを利
用して、α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコ
ースからトレハロースを製造するためには、α−Ｄ−グ
ルコース １−リン酸５ mM から４ M、好ましくは５０
mM から３ M、Ｄ−グルコース５ mM から４ M、好ま
しくは５０ mM から３ M を本出願発明のトレハロース
ホスホリラーゼ存在下に、ｐＨ２から１０、好ましくは
ｐＨ４から９、反応温度を１０から８０℃、好ましくは
１５から５０℃で反応させれば良い。またトレハロース
ホスホリラーゼは基質Ｄ−グルコース１g に対して０．
０１単位以上、好ましくは１から１００単位用いる。酵
素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用量は経済
性を考慮して決定される。
用して、α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコ
ースからトレハロースを製造するためには、α−Ｄ−グ
ルコース １−リン酸５ mM から４ M、好ましくは５０
mM から３ M、Ｄ−グルコース５ mM から４ M、好ま
しくは５０ mM から３ M を本出願発明のトレハロース
ホスホリラーゼ存在下に、ｐＨ２から１０、好ましくは
ｐＨ４から９、反応温度を１０から８０℃、好ましくは
１５から５０℃で反応させれば良い。またトレハロース
ホスホリラーゼは基質Ｄ−グルコース１g に対して０．
０１単位以上、好ましくは１から１００単位用いる。酵
素の使用量に上限は存在せず、最適な酵素使用量は経済
性を考慮して決定される。
【００２６】また、本発明のトレハロースホスホリラー
ゼ酵素を利用して、トレハロースからα−Ｄ−グルコー
ス １−リン酸を製造するためには、トレハロースを５
mMから３ M、好ましくは５０mM から２ M、無機リン酸
およびその塩５mM から３ M、好ましくは５０mM から
２ Mを本出願発明のトレハロースホスホリラーゼ存在下
に、ｐＨ２から１０、好ましくはｐＨ４から９、反応温
度を１０から８０℃、好ましくは１５から５０℃で反応
させれば良い。またトレハロースホスホリラーゼは基質
トレハロース１g に対して０．０１単位以上、好ましく
は１から１００単位用いる。酵素の使用量に上限は存在
せず、最適な酵素使用量は経済性を考慮して決定され
る。
ゼ酵素を利用して、トレハロースからα−Ｄ−グルコー
ス １−リン酸を製造するためには、トレハロースを５
mMから３ M、好ましくは５０mM から２ M、無機リン酸
およびその塩５mM から３ M、好ましくは５０mM から
２ Mを本出願発明のトレハロースホスホリラーゼ存在下
に、ｐＨ２から１０、好ましくはｐＨ４から９、反応温
度を１０から８０℃、好ましくは１５から５０℃で反応
させれば良い。またトレハロースホスホリラーゼは基質
トレハロース１g に対して０．０１単位以上、好ましく
は１から１００単位用いる。酵素の使用量に上限は存在
せず、最適な酵素使用量は経済性を考慮して決定され
る。
【００２７】本発明の方法において使用する無機リン酸
および／またはその塩としては、オルトリン酸、リン酸
ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、リン酸二水素カリウム等の通常の無機リン酸及びそ
の塩等を使用することができ、好ましくはリン酸緩衝液
の形態で用いる。
および／またはその塩としては、オルトリン酸、リン酸
ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、リン酸二水素カリウム等の通常の無機リン酸及びそ
の塩等を使用することができ、好ましくはリン酸緩衝液
の形態で用いる。
【００２８】以下、本発明を実施例によってさらに具体
的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるも
のではない。
的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるも
のではない。
【００２９】
【実施例１】酵母エキス０．７５％、麦芽エキス０．２
％、リン酸１カリウム０．５％、硫酸マグネシウム０．
０５％、グルコース４％（ｐＨ５．５）の組成の培地１
００mlを３００ml三角フラスコに分注して滅菌（１２０
℃、２０分間）した。滅菌した培地（１００ml培地／３
００ml三角フラスコ、３本）にコリオルス ヒルスツス
(Coriolus hirsutus) 微工研菌寄第２７１１号を接種
し、２６℃、５日間振とう培養した。培養後遠心分離に
より菌糸体を集め、２０mMリン酸緩衝液を加え、ワーリ
ングブレンダーTM（ダイナミックス社、米国）で破砕
し、遠心分離により不溶物を除去し、粗酵素液２３０ml
を得た。この粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活
性、総活性は０．０７５単位／ml、１７単位であった。
％、リン酸１カリウム０．５％、硫酸マグネシウム０．
０５％、グルコース４％（ｐＨ５．５）の組成の培地１
００mlを３００ml三角フラスコに分注して滅菌（１２０
℃、２０分間）した。滅菌した培地（１００ml培地／３
００ml三角フラスコ、３本）にコリオルス ヒルスツス
(Coriolus hirsutus) 微工研菌寄第２７１１号を接種
し、２６℃、５日間振とう培養した。培養後遠心分離に
より菌糸体を集め、２０mMリン酸緩衝液を加え、ワーリ
ングブレンダーTM（ダイナミックス社、米国）で破砕
し、遠心分離により不溶物を除去し、粗酵素液２３０ml
を得た。この粗酵素液のトレハロースホスホリラーゼ活
性、総活性は０．０７５単位／ml、１７単位であった。
【００３０】
【実施例２】表２の菌株群から選ばれた各菌株を実施例
１のようにして調製した培地（各菌株あたり１００ml培
地／３００ml三角フラスコ、２本）に接種し、２６℃、
５日から２０日間振とう培養した。培養後実施例１と同
様に処理しこの培養物から粗酵素液を得た。それぞれの
菌株由来の粗酵素液の液量およびそのトレハロースホス
ホリラーゼ活性、総活性はそれぞれ表２に示す値であっ
た。
１のようにして調製した培地（各菌株あたり１００ml培
地／３００ml三角フラスコ、２本）に接種し、２６℃、
５日から２０日間振とう培養した。培養後実施例１と同
様に処理しこの培養物から粗酵素液を得た。それぞれの
菌株由来の粗酵素液の液量およびそのトレハロースホス
ホリラーゼ活性、総活性はそれぞれ表２に示す値であっ
た。
【００３１】 表２ 菌 株 液量 活性 総活性 ml Unit／ml Unit グリフォラ フロンドサ (Grifola frondosa) 微工研条寄第３５号 25 0.12 2.9 プレウロツス オストレアツス (Pleurotus ostreatus) 微工研菌寄第１７４６号 64 0.17 11 リオフィルム ウルマリウム (Lyophyllum ulmarium) 微工研菌寄第９８５号 16 0.009 0.14 レンチヌス エドデス (Lentinus edodes) 微工研条寄第９４７号 15 0.012 0.19 コリオルス コンソルス (Coriolus consors) 微工研菌寄第９８８号 53 0.008 0.43 シゾフィルム コムネ (Schizophyllum commune) 微工研菌寄第 １７４４号 114 0.047 5.4 パヌス ルディス (Panus rudis) 微工研条寄第４５８８号 76 0.033 2.5 クレピドツス バリアビリス (Crepidotus variabilis) 微工研菌寄第５１６１号 132 0.099 13 ナエマトロマ サブラテリチウム (Naematoloma sublateritium) 微工研菌寄第３０５１号 59 0.006 0.36 ロドフィルス クレペアツス (Rhodophyllus clypeatus) 微工研条寄第４５８９号 49 0.015 0.73 グロエオフィルム セピアリウム (Gloeophyllum sepiarium) 微工研条寄第２８号 24 0.008 0.19 ホメス ホメンタリウス (Fomes fomentarius) 微工研条寄第３０号 41 0.026 1.1 エルフビンギア アプラナタ (Elfvingia applanata) 微工研条寄第１８号 31 0.039 0.12 フォミトプシス ピニコラ (Fomitopsis pinicola) 微工研条寄第２６号 27 0.007 0.18 アルミラリエラ メレア (Armillariella mellea) 微工研条寄第２８１号 138 0.007 0.93 ランプテロミセス ジャポニクス (Lampteromyces japonicus) 微工研菌寄第９８４号 30 0.016 0.46 ファボルス アルクラリウス (Favolus arcularius) 微工研条寄第４５９０号 130 0.051 6.6 プレウロツス コルヌコピアエ (Pleurotus cornucopiae) ＩＦＯ ３０５２８ 87 0.035 3.0 ラエチポルス スルフレウス (Laetiporus sulphureus) ＩＦＯ ８４０６ 80 0.003 0.23 ラエチポルス ベルシスポルス (Laetiporus versisporus) ＩＦＯ ９０４３ 32 0.003 0.082 ポリポレルス ピシペス (Polyporellus picipes) ＩＦＯ ３０３５５ 69 0.004 0.29 オウデマンシエラ カナリ (Oudemansiella canarii) ＩＦＯ ３１２４６ 62 0.005 0.28 フォリオタ アディポサ (Pholita adiposa) ＩＦＯ ９７７９ 76 0.062 4.7
【００３２】
【実施例３】酵母エキス０．７５％、グルコース５．０
％（ｐＨ５．５）の組成の培地１００mlを３００ml三角
フラスコに分注して滅菌（１２０℃、２０分間）した。
表３の菌株群から選ばれた各菌株を滅菌した培地（各菌
株あたり１００ml培地／３００ml三角フラスコ、１本）
に接種し、２６℃、３日間振とう培養した。培養後遠心
分離により菌糸体を集め、２０mMリン酸緩衝液約２００
mlを加え、ワーリングブレンダーTM（ダイナミックス
社、米国）で破砕し、遠心分離により不溶物を除去し、
粗酵素液を得た。この粗酵素液を２０mMリン酸緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥトヨパールTM６５０Ｃ（トーソー社
製）２０mlを充填したカラムに通し、同じ緩衝液で洗浄
後、塩化カリウム濃度０から０．５M の直線濃度勾配溶
出（２０mMリン酸緩衝液、総容量４００ml) を行ない約
７mlづつ分画した。活性画分を合わせ酵素液とした。こ
のときのそれぞれの菌株由来の酵素液の液量およびその
トレハロースホスホリラーゼの活性、総活性、比活性を
表３に示す。
％（ｐＨ５．５）の組成の培地１００mlを３００ml三角
フラスコに分注して滅菌（１２０℃、２０分間）した。
表３の菌株群から選ばれた各菌株を滅菌した培地（各菌
株あたり１００ml培地／３００ml三角フラスコ、１本）
に接種し、２６℃、３日間振とう培養した。培養後遠心
分離により菌糸体を集め、２０mMリン酸緩衝液約２００
mlを加え、ワーリングブレンダーTM（ダイナミックス
社、米国）で破砕し、遠心分離により不溶物を除去し、
粗酵素液を得た。この粗酵素液を２０mMリン酸緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥトヨパールTM６５０Ｃ（トーソー社
製）２０mlを充填したカラムに通し、同じ緩衝液で洗浄
後、塩化カリウム濃度０から０．５M の直線濃度勾配溶
出（２０mMリン酸緩衝液、総容量４００ml) を行ない約
７mlづつ分画した。活性画分を合わせ酵素液とした。こ
のときのそれぞれの菌株由来の酵素液の液量およびその
トレハロースホスホリラーゼの活性、総活性、比活性を
表３に示す。
【００３３】 表３ 菌株 液量 活性 総活性 比活性 ml 単位／ml 単位 単位／mg蛋白質 コリオルス ベルシコロル (Coriolus versicolor) 微工研菌寄第２４１２号 73 0.084 6.1 0.14 コリオルス ヒルスツス (Coriolus hirsutus) 微工研菌寄第 ２７１１号 69 0.071 4.9 0.23 トリキャプツム ビフォルメ (Trichaptum biforme) 微工研菌寄第 ２７１２号 51 0.071 3.6 0.086 レンチテス ベツリナ (Lenzites betulina) 微工研条寄第 ２７号 35 0.11 3.9 0.35
【００３４】
【実施例４】シゾフィルム コムネ(Schizophyllum co
mmune)微工研菌寄第１７４４号を酵母エキス０．７５
％、麦芽エキス０．２％、グルコース５％（ｐＨ６．
２）の組成の培地１００リットルを用いて２００リット
ルのジャーファーメンターで培養を行なった。培養は、
温度２５℃、撹拌２９０rpm 、通気０．５VVM 、７０時
間行なった。培養後、培養液４００mlから、遠心分離に
より菌糸体を集めた。
mmune)微工研菌寄第１７４４号を酵母エキス０．７５
％、麦芽エキス０．２％、グルコース５％（ｐＨ６．
２）の組成の培地１００リットルを用いて２００リット
ルのジャーファーメンターで培養を行なった。培養は、
温度２５℃、撹拌２９０rpm 、通気０．５VVM 、７０時
間行なった。培養後、培養液４００mlから、遠心分離に
より菌糸体を集めた。
【００３５】菌糸体に２０ mM リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）約２００mlを加え、ワーリングブレンダーTM（ダイ
ナミックス社、米国）で破砕し、遠心分離により不溶物
を除去し、粗酵素液約２４０mlを得た。この粗酵素液を
２０mMリン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥトヨパールTM
６５０Ｃ（トーソー社製）２０mlを充填したカラムに通
し、同じ緩衝液で洗浄後、 塩化カリウム濃度０から０．
５M の直線濃度勾配溶出（２０mMリン酸緩衝液、総容量
４００ml）を行ない約７．５mlづつ分画し、活性画分８
０mlをえた。この画分のトレハロースホスホリラーゼ活
性、総活性、比活性はそれぞれ０．１３単位／ml、１
０．３単位、０．１５単位／mg蛋白であった。
０）約２００mlを加え、ワーリングブレンダーTM（ダイ
ナミックス社、米国）で破砕し、遠心分離により不溶物
を除去し、粗酵素液約２４０mlを得た。この粗酵素液を
２０mMリン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥトヨパールTM
６５０Ｃ（トーソー社製）２０mlを充填したカラムに通
し、同じ緩衝液で洗浄後、 塩化カリウム濃度０から０．
５M の直線濃度勾配溶出（２０mMリン酸緩衝液、総容量
４００ml）を行ない約７．５mlづつ分画し、活性画分８
０mlをえた。この画分のトレハロースホスホリラーゼ活
性、総活性、比活性はそれぞれ０．１３単位／ml、１
０．３単位、０．１５単位／mg蛋白であった。
【００３６】
【実施例５】マッシュルーム（アガリクス ビスポルス
(Agaricus bisporus) ）、まいたけ（グリフォラ フ
ロンドサ(Grifola frondosa))、まつたけ（トリコロマ
マツタケ (Tricholoma matsutake)）、ひらたけ（プ
レウロツス オストレアツス(Pleurotus ostreatu
s)）、ぶなしめじ（リオフィルム ウルマリウム (Lyop
hyllum ulmarium))、しいたけ（レンチヌス エドデス
(Lentinus edodes))から選ばれた各菌株の新鮮な子実
体それぞれ１００g に２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０、２０％グリセロール、１mMＥＤＴＡ、１mMジチオス
レイトールを含む。以下同じ）約１５０mlを加え、ワー
リングブレンダーTM（ダイナミックス社、米国）で破砕
し、遠心分離により不溶物を除去し上清液を得、これを
粗酵素液とした。
(Agaricus bisporus) ）、まいたけ（グリフォラ フ
ロンドサ(Grifola frondosa))、まつたけ（トリコロマ
マツタケ (Tricholoma matsutake)）、ひらたけ（プ
レウロツス オストレアツス(Pleurotus ostreatu
s)）、ぶなしめじ（リオフィルム ウルマリウム (Lyop
hyllum ulmarium))、しいたけ（レンチヌス エドデス
(Lentinus edodes))から選ばれた各菌株の新鮮な子実
体それぞれ１００g に２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０、２０％グリセロール、１mMＥＤＴＡ、１mMジチオス
レイトールを含む。以下同じ）約１５０mlを加え、ワー
リングブレンダーTM（ダイナミックス社、米国）で破砕
し、遠心分離により不溶物を除去し上清液を得、これを
粗酵素液とした。
【００３７】粗酵素液を、２０mMリン酸緩衝液で平衡化
したＱＡＥトヨパールTM（トーソー社製）２０mlを充填
したカラムに通し、同じ緩衝液で洗浄後、塩化カリウム
濃度０から０．５M の直線濃度勾配溶出（２０mMリン酸
緩衝液、総容量４００ml）を行なった。トレハロースホ
スホリラーゼ活性画分をホローファイバー限外濾過装置
を使用して濃縮し各酵素液を得た。それぞれの菌株由来
の酵素液の液量、およびそのトレハロースホスホリラー
ゼ活性、総活性、比活性を表４に示す。
したＱＡＥトヨパールTM（トーソー社製）２０mlを充填
したカラムに通し、同じ緩衝液で洗浄後、塩化カリウム
濃度０から０．５M の直線濃度勾配溶出（２０mMリン酸
緩衝液、総容量４００ml）を行なった。トレハロースホ
スホリラーゼ活性画分をホローファイバー限外濾過装置
を使用して濃縮し各酵素液を得た。それぞれの菌株由来
の酵素液の液量、およびそのトレハロースホスホリラー
ゼ活性、総活性、比活性を表４に示す。
【００３８】 表４ 液量 活性 総活性 比活性 ml Unit ／ml Unit U／mgProtein アガリクス ビスポルス 4.0 2.4 9.5 0.13 (Agaricus bisporus) グリフォラ フロンドサ 10 4.75 48 0.37 (Grifola frondosa) トリコロマ マツタケ 7.8 0.010 0.082 0.0034 (Trichloma matutake) プレウロロツス オストレアツス 5.3 5.1 27 0.45 (Pleurotus ostreatus) リオフィルム ウルマリウム 10 0.56 5.6 0.027 (Lyophyllum ulmarium) レンチヌス エドデス 6.7 0.04 0.27 0.0032 (Lentinus edodes)
【００３９】
【実施例６】新鮮なグリフォラ フロンドサ(Grifola
frondosa) 子実体３００g に２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０、２０％グリセロール、１mMＥＤＴＡ、１mMジチ
オスレイトールを含む。以下同じ）６００mlを加え、ワ
ーリングブレンダーTM（ダイナミックス社、米国）で破
砕し、遠心分離により不溶物を除去し、上清液７５８ml
を得、これを粗酵素液とした。この粗酵素液の総活性は
１８５単位、比活性０．０３８単位／mg蛋白質であっ
た。
frondosa) 子実体３００g に２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０、２０％グリセロール、１mMＥＤＴＡ、１mMジチ
オスレイトールを含む。以下同じ）６００mlを加え、ワ
ーリングブレンダーTM（ダイナミックス社、米国）で破
砕し、遠心分離により不溶物を除去し、上清液７５８ml
を得、これを粗酵素液とした。この粗酵素液の総活性は
１８５単位、比活性０．０３８単位／mg蛋白質であっ
た。
【００４０】この粗酵素液に、硫酸アンモニウムを４０
％飽和になるように加え、遠心分離により不溶物を除去
し、この上清にさらに６０％飽和濃度になるように硫酸
アンモニウムを加え、遠心分離により６０％飽和硫酸ア
ンモニウム沈澱画分を得た。沈澱物を小量の２０％硫酸
アンモニウムを含む２０mMリン酸緩衝液に溶かした後、
同じリン酸緩衝液で平衡化したブチルトヨパールTM６５
０Ｍ（トーソー社製）カラム（２２mmφ×２５０mm）に
通し、同じ緩衝液で洗浄後、硫酸アンンモニウム濃度２
０％から０％の直線濃度勾配溶出（２０mMリン酸緩衝
液、総容量８００ml）を行ない、１０g ずつ分画したと
ころ活性は画分６４から７８にあった。
％飽和になるように加え、遠心分離により不溶物を除去
し、この上清にさらに６０％飽和濃度になるように硫酸
アンモニウムを加え、遠心分離により６０％飽和硫酸ア
ンモニウム沈澱画分を得た。沈澱物を小量の２０％硫酸
アンモニウムを含む２０mMリン酸緩衝液に溶かした後、
同じリン酸緩衝液で平衡化したブチルトヨパールTM６５
０Ｍ（トーソー社製）カラム（２２mmφ×２５０mm）に
通し、同じ緩衝液で洗浄後、硫酸アンンモニウム濃度２
０％から０％の直線濃度勾配溶出（２０mMリン酸緩衝
液、総容量８００ml）を行ない、１０g ずつ分画したと
ころ活性は画分６４から７８にあった。
【００４１】この活性画分を濃縮後、２０mMリン酸緩衝
液で平衡化したトヨパールTMＨＷ−５５Ｓ（トーソー社
製）カラム（２５mmφ×７００mm）に通し、１０mlずつ
分画し活性画分１６から２０を得た。活性画分を２０mM
リン酸緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥトヨパールTM６５
０Ｃ（トーソー社製）カラム（２２mmφ×２５０mm）に
通し、塩化カリウム濃度０から０．３M の直線濃度勾配
溶出（２０mMリン酸緩衝液、総容量８００ml）を行な
い、１０ ml ずつ分画し活性画分２３から３４を得た。
この活性画分の酵素活性は０．９３単位／ml、総活性１
１１単位、比活性２．６４単位／mg蛋白質であった。
液で平衡化したトヨパールTMＨＷ−５５Ｓ（トーソー社
製）カラム（２５mmφ×７００mm）に通し、１０mlずつ
分画し活性画分１６から２０を得た。活性画分を２０mM
リン酸緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥトヨパールTM６５
０Ｃ（トーソー社製）カラム（２２mmφ×２５０mm）に
通し、塩化カリウム濃度０から０．３M の直線濃度勾配
溶出（２０mMリン酸緩衝液、総容量８００ml）を行な
い、１０ ml ずつ分画し活性画分２３から３４を得た。
この活性画分の酵素活性は０．９３単位／ml、総活性１
１１単位、比活性２．６４単位／mg蛋白質であった。
【００４２】この活性画分を２０mMリン酸緩衝液に対し
て透析した後、２０mMリン酸緩衝液で平衡化したＡＦ−
ブルートヨパールTM６５０ＭＬ（トーソー社製）カラム
（１０mm×１５０mm）に通し、塩化カリウム濃度０から
０．５M の直線濃度勾配溶出（２０mMリン酸緩衝液、総
容量４００ ml)を行ない、１０mlずつ分画し活性画分１
３から４０を得た。活性画分を２０ mM リン酸緩衝液で
平衡化したＴＳＫｇｅｌTMＧ３０００ＳＷ（７．５mmφ
×３００ mm 、流速０．５ml／分、トーソー社製）カラ
ムを用いて高速液体クロマトグラフィーにより精製を行
なった。
て透析した後、２０mMリン酸緩衝液で平衡化したＡＦ−
ブルートヨパールTM６５０ＭＬ（トーソー社製）カラム
（１０mm×１５０mm）に通し、塩化カリウム濃度０から
０．５M の直線濃度勾配溶出（２０mMリン酸緩衝液、総
容量４００ ml)を行ない、１０mlずつ分画し活性画分１
３から４０を得た。活性画分を２０ mM リン酸緩衝液で
平衡化したＴＳＫｇｅｌTMＧ３０００ＳＷ（７．５mmφ
×３００ mm 、流速０．５ml／分、トーソー社製）カラ
ムを用いて高速液体クロマトグラフィーにより精製を行
なった。
【００４３】ＵＶ２８０nmで検出すると１５．９分に１
本のピークが見られた。このピークが活性ピークであっ
た。この時の活性ピークの保持時間と蛋白質標品の保持
時間から分子量を見積もると、本酵素の分子量は、約１
２０，０００であった。この精製酵素の活性、総活性、
比活性はそれぞれ３．５７単位／ml、１８単位、５．６
３単位／mg蛋白質であった。こうして得られた酵素の純
度はドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって調べたところ、一本のバン
ドのみが観察され、純粋なトレハロースホスホリラーゼ
であることが確認された。その分子量は約６０，０００
であった。
本のピークが見られた。このピークが活性ピークであっ
た。この時の活性ピークの保持時間と蛋白質標品の保持
時間から分子量を見積もると、本酵素の分子量は、約１
２０，０００であった。この精製酵素の活性、総活性、
比活性はそれぞれ３．５７単位／ml、１８単位、５．６
３単位／mg蛋白質であった。こうして得られた酵素の純
度はドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって調べたところ、一本のバン
ドのみが観察され、純粋なトレハロースホスホリラーゼ
であることが確認された。その分子量は約６０，０００
であった。
【００４４】
【実施例７】実施例６により得られた精製酵素および実
施例６の方法に準じて調製した精製酵素を用いて本酵素
の基質特異性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度
安定性を調べた。α−Ｄ−グルコース １−リン酸、ト
レハロースの定量は以下の方法により行なった。
施例６の方法に準じて調製した精製酵素を用いて本酵素
の基質特異性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度
安定性を調べた。α−Ｄ−グルコース １−リン酸、ト
レハロースの定量は以下の方法により行なった。
【００４５】α−Ｄ−グルコース １−リン酸の定量
法：０．５M リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１２０μｌ、
１．０ M ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１５０μ
ｌ、１４．８mMＮＡＤＰ+ 水溶液５０μｌ、２６mM塩化
マグネシウム水溶液５０μｌ、１．３４mMα−Ｄ−グル
コース １，６−二リン酸水溶液５０μｌ、ホスホグル
コムターゼ３１単位／ml水溶液２５μｌ（０．７８単
位）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ml
水溶液２５μｌ（０．８８単位）、精製水９８０μｌ、
および被検液５０μｌを混合し、３０℃、３０分間反応
させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３４０nmで吸光度測
定しα−Ｄ−グルコース １−リン酸量とした。
法：０．５M リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１２０μｌ、
１．０ M ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１５０μ
ｌ、１４．８mMＮＡＤＰ+ 水溶液５０μｌ、２６mM塩化
マグネシウム水溶液５０μｌ、１．３４mMα−Ｄ−グル
コース １，６−二リン酸水溶液５０μｌ、ホスホグル
コムターゼ３１単位／ml水溶液２５μｌ（０．７８単
位）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ml
水溶液２５μｌ（０．８８単位）、精製水９８０μｌ、
および被検液５０μｌを混合し、３０℃、３０分間反応
させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３４０nmで吸光度測
定しα−Ｄ−グルコース １−リン酸量とした。
【００４６】トレハロースの定量法：反応液をポリアミ
ンカラム（ＹＭＣ ＰａｃｋTM Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ
II４．６mmφ×２５０mm、ＹＭＣ社製）、溶離液アセト
ニトリル：水＝７０：３０、流速１ml／分、カラム温度
３５℃、示差屈折計（セル温度３５℃）による高速液体
クロマトグラフィーにより測定しトレハロース濃度を求
めた。このＨＰＬＣ条件においてトレハロースの保持時
間は１５．７分であった。
ンカラム（ＹＭＣ ＰａｃｋTM Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ
II４．６mmφ×２５０mm、ＹＭＣ社製）、溶離液アセト
ニトリル：水＝７０：３０、流速１ml／分、カラム温度
３５℃、示差屈折計（セル温度３５℃）による高速液体
クロマトグラフィーにより測定しトレハロース濃度を求
めた。このＨＰＬＣ条件においてトレハロースの保持時
間は１５．７分であった。
【００４７】［基質特異性］ 加リン酸分解反応：本酵素を用いて各種糖類の加リン酸
分解反応を行なった。トレハロースからはα−Ｄ−グル
コース １−リン酸とＤ−グルコースが生成した。トレ
ハロース以外のパラチノース、マルトース、イソマルト
ース、スクロース、ラクトース、セロビオース、ネオト
レハロースの二糖は反応しなかった。
分解反応を行なった。トレハロースからはα−Ｄ−グル
コース １−リン酸とＤ−グルコースが生成した。トレ
ハロース以外のパラチノース、マルトース、イソマルト
ース、スクロース、ラクトース、セロビオース、ネオト
レハロースの二糖は反応しなかった。
【００４８】二糖合成反応：本酵素を用いて各種単糖と
α−Ｄ−グルコース １−リン酸による二糖合成反応を
行なった。Ｄ−グルコース以外のL −グルコース、Ｄ−
ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−
フラクトース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、
Ｄ−フコースは反応しなかった。また、本酵素を用いて
Ｄ−グルコースと各種糖リン酸による合成反応を行なっ
た。α−Ｄ−グルコース １−リン酸以外のβ−Ｄ−グ
ルコース １−リン酸、α−Ｄ−マンノース １−リン
酸、α−Ｄ−キシロース １−リン酸、α−Ｄ−ガラク
トース １−リン酸は反応しなかった。
α−Ｄ−グルコース １−リン酸による二糖合成反応を
行なった。Ｄ−グルコース以外のL −グルコース、Ｄ−
ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−
フラクトース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、
Ｄ−フコースは反応しなかった。また、本酵素を用いて
Ｄ−グルコースと各種糖リン酸による合成反応を行なっ
た。α−Ｄ−グルコース １−リン酸以外のβ−Ｄ−グ
ルコース １−リン酸、α−Ｄ−マンノース １−リン
酸、α−Ｄ−キシロース １−リン酸、α−Ｄ−ガラク
トース １−リン酸は反応しなかった。
【００４９】［至適ｐＨ］ 加リン酸分解反応：緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ４．
０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５から７．
０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０から８．２）、グ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５から９．
７）を用いた。各ｐＨにおいて３０℃、１時間反応を行
ない生成したα−Ｄ−グルコース １−リン酸量を上述
の方法により定量し酵素活性を求めた。この結果、本酵
素の至適ｐＨ範囲は５．５から７．５であった。最高の
酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ
化し図１を得た。
０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５から７．
０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０から８．２）、グ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５から９．
７）を用いた。各ｐＨにおいて３０℃、１時間反応を行
ない生成したα−Ｄ−グルコース １−リン酸量を上述
の方法により定量し酵素活性を求めた。この結果、本酵
素の至適ｐＨ範囲は５．５から７．５であった。最高の
酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ
化し図１を得た。
【００５０】トレハロース合成反応：緩衝液として酢酸
緩衝液（ｐＨ４．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ
５．５から７．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０か
ら８．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．５から１１．０）を用いた。各ｐＨにおいて３５
℃、３時間反応を行ない生成したトレハロース量を上述
の方法により定量し酵素活性を求めた。この結果、本酵
素の至適ｐＨ範囲はｐＨ６．５から７．５であった。最
高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グ
ラフ化し図２を得た。
緩衝液（ｐＨ４．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ
５．５から７．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０か
ら８．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．５から１１．０）を用いた。各ｐＨにおいて３５
℃、３時間反応を行ない生成したトレハロース量を上述
の方法により定量し酵素活性を求めた。この結果、本酵
素の至適ｐＨ範囲はｐＨ６．５から７．５であった。最
高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グ
ラフ化し図２を得た。
【００５１】［ｐＨ安定性］ 加リン酸分解反応：緩衝液として酢酸緩衝液（ｐＨ４．
０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５から７．
０）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５から９．０）、
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５から１
２．０）を用いた。トレハロースホスホリラーゼを各ｐ
Ｈに、４℃、２４時間放置した。放置後、３２．５℃、
１時間反応させ生成したα−Ｄ−グルコース １−リン
酸を上述の方法により定量することにより各種ｐＨにお
ける酵素活性を求めた。その結果、本酵素はｐＨ５．５
から９．５において安定であった。最高の酵素活性値を
１００％とした相対活性を算出し、グラフ化し図３を得
た。
０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５から７．
０）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５から９．０）、
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５から１
２．０）を用いた。トレハロースホスホリラーゼを各ｐ
Ｈに、４℃、２４時間放置した。放置後、３２．５℃、
１時間反応させ生成したα−Ｄ−グルコース １−リン
酸を上述の方法により定量することにより各種ｐＨにお
ける酵素活性を求めた。その結果、本酵素はｐＨ５．５
から９．５において安定であった。最高の酵素活性値を
１００％とした相対活性を算出し、グラフ化し図３を得
た。
【００５２】トレハロース合成反応：緩衝液として酢酸
緩衝液（ｐＨ４．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ
５．５から７．０）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５
から９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８．５から１２．０）を用いた。トレハロースホスホ
リラーゼを各ｐＨに、４℃、２４時間放置した。放置
後、３５℃、３時間反応させ生成したトレハロースを上
述のＨＰＬＣ法により定量し各ｐＨにおける酵素活性を
求めた。その結果、本酵素は、ｐＨ５．０から１０．５
において安定であった。最高の酵素活性値を１００％と
した相対活性を算出し、グラフ化し図４を得た。
緩衝液（ｐＨ４．０から５．５）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ
５．５から７．０）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５
から９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８．５から１２．０）を用いた。トレハロースホスホ
リラーゼを各ｐＨに、４℃、２４時間放置した。放置
後、３５℃、３時間反応させ生成したトレハロースを上
述のＨＰＬＣ法により定量し各ｐＨにおける酵素活性を
求めた。その結果、本酵素は、ｐＨ５．０から１０．５
において安定であった。最高の酵素活性値を１００％と
した相対活性を算出し、グラフ化し図４を得た。
【００５３】［至適温度］ 加リン酸分解反応：ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を用
い、温度０℃から５０℃の所望の温度で１時間反応さ
せ、加熱処理により酵素を失活させ、生成したα−Ｄ−
グルコース １−リン酸を上述の方法により定量し各温
度おける酵素活性を求めた。その結果、本酵素の至適反
応温度は２５℃から３７．５℃であった。最高の酵素活
性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化し図
５を得た。
い、温度０℃から５０℃の所望の温度で１時間反応さ
せ、加熱処理により酵素を失活させ、生成したα−Ｄ−
グルコース １−リン酸を上述の方法により定量し各温
度おける酵素活性を求めた。その結果、本酵素の至適反
応温度は２５℃から３７．５℃であった。最高の酵素活
性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化し図
５を得た。
【００５４】トレハロース合成反応：ＨＥＰＥＳ緩衝液
（ｐＨ７．０）を用い、温度２０℃から５０℃の所望の
温度で３時間反応させ、加熱処理により酵素を失活さ
せ、生成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法により定
量し酵素活性を求めた。その結果、本酵素の至適反応温
度は３０℃から４０℃であった。最高の酵素活性値を１
００％とした相対活性を算出し、グラフ化して図６を得
た。
（ｐＨ７．０）を用い、温度２０℃から５０℃の所望の
温度で３時間反応させ、加熱処理により酵素を失活さ
せ、生成したトレハロースを上述のＨＰＬＣ法により定
量し酵素活性を求めた。その結果、本酵素の至適反応温
度は３０℃から４０℃であった。最高の酵素活性値を１
００％とした相対活性を算出し、グラフ化して図６を得
た。
【００５５】［温度安定性］ 加リン酸分解反応：トレハロースホスホリラーゼを２０
mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、温度０℃から５０℃
の所望の温度に３０分間放置した。放置後、３２．５
℃、１時間反応させ、加熱処理により酵素を失活させ、
生成したα−Ｄ−グルコース １−リン酸を上述の方法
により定量し各温度における酵素活性を求めた。その結
果、本酵素は３５℃まで安定であった。最高の酵素活性
値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化して図
７を得た。
mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、温度０℃から５０℃
の所望の温度に３０分間放置した。放置後、３２．５
℃、１時間反応させ、加熱処理により酵素を失活させ、
生成したα−Ｄ−グルコース １−リン酸を上述の方法
により定量し各温度における酵素活性を求めた。その結
果、本酵素は３５℃まで安定であった。最高の酵素活性
値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化して図
７を得た。
【００５６】トレハロース合成反応 トレハロースホスホリラーゼを２０mMリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）中、温度０℃から５０℃の所望の温度に３０
分間放置した。放置後、３５℃、３時間反応させ、加熱
処理により酵素を失活させ、生成したトレハロースを上
述のＨＰＬＣ法により定量し酵素活性を求めた。その結
果、本酵素は３５℃まで安定であった。最高の酵素活性
値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化して図
８を得た。
Ｈ７．０）中、温度０℃から５０℃の所望の温度に３０
分間放置した。放置後、３５℃、３時間反応させ、加熱
処理により酵素を失活させ、生成したトレハロースを上
述のＨＰＬＣ法により定量し酵素活性を求めた。その結
果、本酵素は３５℃まで安定であった。最高の酵素活性
値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化して図
８を得た。
【００５７】
【実施例８】実施例４により得たシゾフィルム コムネ
(Schizophyllum commune)微工研菌寄第１７４４号のト
レハロースホスホリラーゼ酵素液をホローファイバー限
外濾過装置で濃縮し酵素液１２ ml を得た。この酵素液
の活性は０．８７単位／mlであった。この酵素液１０μ
ｌ、０．４ M Ｄ−グルコース水溶液１２５μｌ、０．
４M α−Ｄ−グルコース １−リン酸水溶液１２５μ
ｌ、０．５M ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、
および精製水１４０μｌを混合し、３０℃、２４時間エ
ッペンドルフチューブ中で反応させた。加熱処理により
酵素を失活させた後、反応液中のトレハロース量を実施
例７に記載の方法で測定したところ、トレハロースの濃
度は１１mMであった。この時のＤ−グルコースからのト
レハロースのモル収率は１１％であった。
(Schizophyllum commune)微工研菌寄第１７４４号のト
レハロースホスホリラーゼ酵素液をホローファイバー限
外濾過装置で濃縮し酵素液１２ ml を得た。この酵素液
の活性は０．８７単位／mlであった。この酵素液１０μ
ｌ、０．４ M Ｄ−グルコース水溶液１２５μｌ、０．
４M α−Ｄ−グルコース １−リン酸水溶液１２５μ
ｌ、０．５M ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、
および精製水１４０μｌを混合し、３０℃、２４時間エ
ッペンドルフチューブ中で反応させた。加熱処理により
酵素を失活させた後、反応液中のトレハロース量を実施
例７に記載の方法で測定したところ、トレハロースの濃
度は１１mMであった。この時のＤ−グルコースからのト
レハロースのモル収率は１１％であった。
【００５８】
【実施例９】実施例５により得たアガリクス ビスポル
ス (Agaricus bisporus) 、グリフォラ フロンドサ(G
rifola frondosa) 、プレウロツス オストレアツス(P
leurotus ostreatus)、リオフィルム ウルマリウム
(Lyophyllum ulmarium) 由来の各トレハロースホスホ
リラーゼ酵素液を用いて実施例８と同様にトレハロース
生成反応を行ない反応液中のトレハロース量を実施例７
に記載の方法で測定したところ、トレハロースの濃度は
それぞれ２４mM、３５mM、４８mM、７．４mMであった。
この時のＤ−グルコースからのトレハロースのモル収率
は、それぞれ２４％、３５％、４８％、７％であった。
ス (Agaricus bisporus) 、グリフォラ フロンドサ(G
rifola frondosa) 、プレウロツス オストレアツス(P
leurotus ostreatus)、リオフィルム ウルマリウム
(Lyophyllum ulmarium) 由来の各トレハロースホスホ
リラーゼ酵素液を用いて実施例８と同様にトレハロース
生成反応を行ない反応液中のトレハロース量を実施例７
に記載の方法で測定したところ、トレハロースの濃度は
それぞれ２４mM、３５mM、４８mM、７．４mMであった。
この時のＤ−グルコースからのトレハロースのモル収率
は、それぞれ２４％、３５％、４８％、７％であった。
【００５９】
【実施例１０】実施例６により得たグリフォラ フロン
ドサ(Grifola frondosa) 由来の精製トレハロースホス
ホリラーゼ３．５７単位／ml水溶液５６μｌ（０．２単
位）、１．０M ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１００
μｌ、１．０M Ｄ−グルコース水溶液１５０μｌ、０．
５M α−Ｄ−グルコース １−リン酸水溶液４００μ
ｌ、および精製水２９４μｌを混合し、３５℃、７２時
間エッペンドルフチューブ中で反応させた。加熱処理に
より酵素を失活させた後、反応液中のトレハロース量を
実施例７に記載の方法で測定したところ、トレハロース
の濃度は８０ mM であった。この時のＤ−グルコースか
らのトレハロースのモル収率は５３％であった。
ドサ(Grifola frondosa) 由来の精製トレハロースホス
ホリラーゼ３．５７単位／ml水溶液５６μｌ（０．２単
位）、１．０M ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１００
μｌ、１．０M Ｄ−グルコース水溶液１５０μｌ、０．
５M α−Ｄ−グルコース １−リン酸水溶液４００μ
ｌ、および精製水２９４μｌを混合し、３５℃、７２時
間エッペンドルフチューブ中で反応させた。加熱処理に
より酵素を失活させた後、反応液中のトレハロース量を
実施例７に記載の方法で測定したところ、トレハロース
の濃度は８０ mM であった。この時のＤ−グルコースか
らのトレハロースのモル収率は５３％であった。
【００６０】
【実施例１１】実施例６により得たグリフォラ フロン
ドサ(Grifola frondosa) 由来の精製トレハロースホス
ホリラーゼ３．５７単位／ml 水溶液２８μｌ（０．１
単位）、０．５M トレハロース水溶液２００μｌ、０．
４M リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２５０μｌ、０．５M
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）２００μｌ、および精製水
３２２μｌを混合し、３０℃、２４時間エッペンドルフ
チューブ中で反応させた。加熱処理により酵素を失活さ
せた後、反応液中のα−Ｄ−グルコース １−リン酸量
を実施例７に記載の方法で測定したところ、α−Ｄ−グ
ルコース １−リン酸の濃度は３２ mM であった。この
時のトレハロースからのα−Ｄ−グルコース １−リン
酸のモル収率は３２％であった。また、 反応液中のＤ−
グルコースをグルコース測定キッド（イアトクロムTM
Ｇｌｕ−ＬQ 、ヤトロン社製）により定量したところ、
Ｄ−グルコースの濃度は３１ mM であった。
ドサ(Grifola frondosa) 由来の精製トレハロースホス
ホリラーゼ３．５７単位／ml 水溶液２８μｌ（０．１
単位）、０．５M トレハロース水溶液２００μｌ、０．
４M リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２５０μｌ、０．５M
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）２００μｌ、および精製水
３２２μｌを混合し、３０℃、２４時間エッペンドルフ
チューブ中で反応させた。加熱処理により酵素を失活さ
せた後、反応液中のα−Ｄ−グルコース １−リン酸量
を実施例７に記載の方法で測定したところ、α−Ｄ−グ
ルコース １−リン酸の濃度は３２ mM であった。この
時のトレハロースからのα−Ｄ−グルコース １−リン
酸のモル収率は３２％であった。また、 反応液中のＤ−
グルコースをグルコース測定キッド（イアトクロムTM
Ｇｌｕ−ＬQ 、ヤトロン社製）により定量したところ、
Ｄ−グルコースの濃度は３１ mM であった。
【００６１】
【発明の効果】本発明により、温度安定性の優れたトレ
ハロースホスホリラーゼが提供される。また、新たにト
レハロースホスホリラーゼを生産することが見いだされ
たトレハロースホスホリラーゼ生産菌によって生産され
るトレハロースホスホリラーゼおよび／または温度安定
性に優れたトレハロースホスホリラーゼの製造法が提供
される。さらに、これらトレハロースホスホリラーゼを
利用したα−Ｄ−グルコース １−リン酸およびトレハ
ロースの製造法が提供される。
ハロースホスホリラーゼが提供される。また、新たにト
レハロースホスホリラーゼを生産することが見いだされ
たトレハロースホスホリラーゼ生産菌によって生産され
るトレハロースホスホリラーゼおよび／または温度安定
性に優れたトレハロースホスホリラーゼの製造法が提供
される。さらに、これらトレハロースホスホリラーゼを
利用したα−Ｄ−グルコース １−リン酸およびトレハ
ロースの製造法が提供される。
【図１】本発明トレハロースホスホリラーゼの加リン酸
分解反応の至適ｐＨ範囲を示すグラフである。
分解反応の至適ｐＨ範囲を示すグラフである。
【図２】本発明トレハロースホスホリラーゼのトレハロ
ース合成反応至適ｐＨ範囲を示すグラフである。
ース合成反応至適ｐＨ範囲を示すグラフである。
【図３】本発明トレハロースホスホリラーゼの加リン酸
分解反応のｐＨ安定性範囲を示すグラフである。
分解反応のｐＨ安定性範囲を示すグラフである。
【図４】本発明トレハロースホスホリラーゼのトレハロ
ース合成反応のｐＨ安定性範囲を示すグラフである。
ース合成反応のｐＨ安定性範囲を示すグラフである。
【図５】本発明トレハロースホスホリラーゼの加リン酸
分解反応の至適反応温度範囲を示すグラフである。
分解反応の至適反応温度範囲を示すグラフである。
【図６】本発明トレハロースホスホリラーゼのトレハロ
ース合成反応の至適反応温度範囲を示すグラフである。
ース合成反応の至適反応温度範囲を示すグラフである。
【図７】本発明トレハロースホスホリラーゼの加リン酸
分解反応の温度安定性範囲を示すグラフである。
分解反応の温度安定性範囲を示すグラフである。
【図８】本発明トレハロースホスホリラーゼのトレハロ
ース合成反応の温度安定性範囲を示すグラフである。
ース合成反応の温度安定性範囲を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 幸内 裕 東京都町田市能ケ谷町1480−２ Ａ−404
Claims (13)
- 【請求項１】 トレハロースと無機リン酸またはその塩
に作用してα−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グル
コースを生成し、以下の理化学的性質を有するトレハロ
ースホスホリラーゼ。 至適ｐＨ：ｐＨ５．５から７．５（３０℃）。 ｐＨ安定性：４℃で２４時間処理したときｐＨ５．５か
ら９．５の範囲で安定。 至適温度：２５から３７．５℃（ｐＨ６．０）。 温度安定性：ｐＨ７．０、３０分間処理したとき３５℃
以下で安定。 - 【請求項２】 α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−
グルコースに作用してトレハロースと無機リン酸を生成
し、以下の理化学的性質を有するトレハロースホスホリ
ラーゼ。 至適ｐＨ：ｐＨ６．５から７．５（３５℃） ｐＨ安定性：４℃で２４時間処理したときｐＨ５．０か
ら１０．５の範囲で安定。 至適温度：３０から４０℃（ｐＨ７．０） 温度安定性：ｐＨ７．０、３０分間処理したとき３５℃
以下で安定。 - 【請求項３】 以下の理化学的性質を有する請求項１記
載のトレハロースホスホリラーゼ。 分子量：ゲル濾過法により約１２０，０００ダルトン、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約６０，０００ダルトン - 【請求項４】 グリフォラ(Grifola) 属、プレウロツス
(Pleurotus) 属、リオフィルム(Lyophyllum)属、レンチ
ヌス(Lentinus)属、アガリクス(Agaricus)属、トラメテ
ス(Trametes)属、コリオルス(Coriolus)属、レンチテス
(Lenzites)属、シゾフィルム(Schizophyllum) 属、パヌ
ス(Panus) 属、クレピドツス(Crepidotus)属、ラエチポ
ルス(Laetiporus)属、ポリポレルス(Polyporellus)属、
ファボルス(Favolus) 属、トリキャプツム(Trichaptum)
属、オウデマンシエラ(Oudemansiella) 属、ナエマトロ
マ(Naematoloma) 属、ロドフィルス(Rhodophyllus)属、
グロエオフィルム(Gloeophyllum)属、ホメス(Fomes)
属、ガノデルマ(Ganoderma) 属、エルフビンギア(Elfvi
ngia) 属、フォミトプシス(Fomitopsis)属、アルミラリ
エラ(Armillariella) 属、ランプテロミセス(Lampterom
yces) 属、フォリオタ(Pholiota)属またはトリコロマ(T
richoloma)属の菌株によって生産されトレハロースと無
機リン酸またはその塩に作用して、α−Ｄ−グルコース
１−リン酸とＤ−グルコースを生成し、及びα−Ｄ−
グルコース １−リン酸とＤ−グルコースに作用してト
レハロースと無機リン酸を生成するトレハロースホスホ
リラーゼ。 - 【請求項５】 グリフォラ フロンドサ(Grifola fron
dosa) 、プレウロツス オストレアツス(Pleurotus os
treatus)、プレウロツス コルヌコピアエ(Pleurotus
cornucopiae)、リオフィルム ウルマリウム (Lyophyll
um ulmarium) 、レンチヌス エドデス (Lentinus ed
odes) 、アガリクス ビスポルス (Agaricus bisporu
s) 、コリオルス コンソルス (Coriolus consors)、
コリオルス ベルシコロル (Coriolus versicolor) 、
コリオルス ヒルスツス (Coriolus hirsutus) 、トラ
メテス ベルシコロル (Trametes versicolor) 、トラ
メテス ヒルスタ (Trametes hirsuta)、レンチテス
ベツリナ (Lenzites betulina) 、シゾフィルム コム
ネ(Schizophyllum commune)、パヌス ルディス(Panus
rudis)、クレピドツス バリアビリス (Crepidotus
variabilis) 、ラエチポルス スルフレウス (Laetipor
us sulphureus) 、ラエチポルス ベルシスポルス (La
etiporus versisporus)、ポリポレルス ピシペス (Po
lyporelluspicipes)、ファボルス アルクラリウス(Fav
olus arcularius) 、コリオルスパルガメヌス (Coriol
us pargamenus) 、トリキャプツム ビフォルメ (Tric
haptum biforme)、オウデマンシエラ カナリ(Oudeman
siella canarii)、ナエマトロマ サブラテリチウム(N
aematoloma sublateritium)、ロドフィルス クレペア
ツス(Rhodophyllus clepeatus)、グロエオフィルム セ
ピアリウム (Gloeophyllum sepiarium)、ホメス ホメ
ンタリウス(Fomes fomentarius)、ガノデルマ アプラ
ナツム(Ganoderma applanatum) 、エルフビンギア ア
プラナタ(Elfvingia applanata)、フォミトプシス ピ
ニコラ (Fomitopsis pinicola) 、アルミラリエラ メ
レア(Armillariella mellea) 、ランプテロミセス ジ
ャポニクス(Lampteromyces japonicus)、フォリオタ
アディポサ (Pholiota adiposa)またはトリコロマ マ
ツタケ (Tricholoma matsutake)の菌株によって生産さ
れトレハロースと無機リン酸またはその塩に作用して、
α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコースを生
成し、及びα−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グル
コースに作用してトレハロースと無機リン酸を生成する
トレハロースホスホリラーゼ。 - 【請求項６】 請求項４または５に記載の菌株の変異
株、もしくは遺伝子操作された誘導株により生産される
トレハロースホスホリラーゼ。 - 【請求項７】 請求項４または５に記載の菌株、あるい
はその変異株、もしくは遺伝子操作された誘導株により
生産されるトレハロースホスホリラーゼと免疫学的に同
じであるかまたは部分的に同一である免疫化学的性質を
有することを特徴とするトレハロースホスホリラーゼ。 - 【請求項８】 炭素源、および窒素源並びに無機塩を含
有する適当な栄養培地で請求項４に記載のトレハロース
ホスホリラーゼ生産株を培養し、トレハロースと無機リ
ン酸またはその塩に作用してα−Ｄ−グルコース １−
リン酸とＤ−グルコースを生成するかまたはα−Ｄ−グ
ルコース １−リン酸とＤ−グルコースに作用してトレ
ハロースと無機酸を生成するトリハロースホスホリラー
ゼを産生せしめ、次いで培養物からこのトレハロースホ
スホリラーゼを回収することからなるトレハロースホス
ホリラーゼの調製方法。 - 【請求項９】 炭素源、および窒素源並びに無機塩を含
有する適当な栄養培地で請求項５に記載のトレハロース
ホスホリラーゼ生産株を培養し、トレハロースと無機リ
ン酸またはその塩に作用してα−Ｄ−グルコース １−
リン酸とＤ−グルコースを生成するかまたはα−Ｄ−グ
ルコース １−リン酸とＤ−グルコースに作用してトレ
ハロースと無機酸を生成するトリハロースホスホリラー
ゼを産生せしめ、次いで培養物からこのトレハロースホ
スホリラーゼを回収することからなるトレハロースホス
ホリラーゼの調製方法。 - 【請求項１０】 炭素源、および窒素源並びに無機塩を
含有する適当な栄養培地で請求項６に記載のトレハロー
スホスホリラーゼを生産する菌株を培養し、トレハロー
スと無機リン酸またはその塩に作用してα−Ｄ−グルコ
ース １−リン酸とＤ−グルコースを生成するかまたは
α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコースに作
用してトレハロースと無機酸を生成するトリハロースホ
スホリラーゼを産生せしめ、次いで培養物からこのトレ
ハロースホスホリラーゼを回収することからなるトレハ
ロースホスホリラーゼの調製方法。 - 【請求項１１】 炭素源、および窒素源並びに無機塩を
含有する適当な栄養培地で請求項７に記載のトレハロー
スホスホリラーゼを生産する菌株を培養し、トレハロー
スと無機リン酸またはその塩に作用してα−Ｄ−グルコ
ース １−リン酸とＤ−グルコースを生成するかまたは
α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ−グルコースに作
用してトレハロースと無機酸を生成するトリハロースホ
スホリラーゼを産生せしめ、次いで培養物からこのトレ
ハロースホスホリラーゼを回収することからなるトレハ
ロースホスホリラーゼの調製方法。 - 【請求項１２】 α−Ｄ−グルコース １−リン酸とＤ
−グルコースに請求項１から７のいずれかに記載のトレ
ハロースホスホリラーゼを作用させてトレハロースと無
機リン酸を生成させこれを採取することからなるトレハ
ロースの製造法。 - 【請求項１３】 無機リン酸またはその塩の存在下にト
レハロースに請求項１から７のいずれかに記載されたト
レハロースホスホリラーゼを作用させてα−Ｄ−グルコ
ース １−リン酸を生成させこれを採取することからな
るα−Ｄ−グルコース １−リン酸の製造法。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP07646194A JP3563104B2 (ja) | 1994-03-23 | 1994-03-23 | トレハロースホスホリラーゼおよびその製造法 |
| EP95104065A EP0673999A3 (en) | 1994-03-23 | 1995-03-20 | Trehalose phosphorylase and its production. |
| US08/406,554 US5643775A (en) | 1994-03-23 | 1995-03-20 | Trehalose phosphorylase and preparation thereof |
| CA002145270A CA2145270A1 (en) | 1994-03-23 | 1995-03-22 | Trehalose phosphorylase and preparation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
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