JPH10327887A

JPH10327887A - 組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体とその産生物

Info

Publication number: JPH10327887A
Application number: JP10098147A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Inoue; 靖井上; Tetsuji Tomita; 哲司富田; Keiko Ishii; 圭子石井; Yoshie Ooshima; 良恵大島; Kunio Yamane; 國男山根
Original assignee: Showa Sangyo Co Ltd
Current assignee: Showa Sangyo Co Ltd
Priority date: 1997-03-31
Filing date: 1998-03-27
Publication date: 1998-12-15

Abstract

(57)【要約】【課題】組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼを
コードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該
組換えベクター含む形質転換体、該形質転換体を培養し
て組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼを製造する
方法、及び該酵素の利用法を提供すること。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからな
る遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の内、塩基
番号２７９から２５７３で表される塩基配列からなるＤ
ＮＡ。（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ下記の酵素化学的
性質を有する組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
をコードするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性トレハロー
スホスホリラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む
組換えベクターとその形質転換体、該形質転換体を用い
た組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼの製造方
法、及び該組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼを
用いたトレハロース又はβ−グルコース−１−リン酸の
製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トレハロースは、酵母、かび、細菌、昆
虫等に広く分布する二糖類で、他の二糖類に比べて安定
なことから蛋白質等の乾燥保護剤（特表昭６３ー５００
５６２）としての利用等が考えられている有用な糖質で
ある。

【０００３】従来、トレハロースを調製する方法として
は、酵母からの抽出法（特開平５ー２９２９８６）、細
菌による発酵法（特開平５ー２１１８８２）等が知られ
ている。しかし、これらの方法で調製したトレハロース
は、大量生産が操作的、設備的に困難である、不純物除
去工程が複雑である等の理由から製造コストが高くな
り、非常に高価であるため食品用途には利用することが
できなかった。

【０００４】一方、安価にトレハロースを調製する有効
な方法として酵素法が挙げられる。その一つとして、マ
ルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼ
を用いた同時反応法がある（特公昭６３ー６０９９
８）。この方法は２種類のホスホリラーゼがそれぞれマ
ルトースとトレハロースに作用して可逆的に加リン酸分
解しグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生じる
反応を利用したもので、安価な原料であるマルトースに
両酵素を同時に作用させるとトレハロースが生成するも
のである。

【０００５】これまでに知られているトレハロースホス
ホリラーゼとしては、トレハロースを加リン酸分解して
グルコースとα−グルコース−１−リン酸を生じるもの
とグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生じるも
のがある。

【０００６】前者の反応を行うものとしては、フラムリ
ナ・ベルティペス（Flammulina velutipes）（FEMS Mic
robiol.Lett.,55,147,1988）やグリフォラ・フロンドサ
（Grifola frondosa）（日本農芸化学会誌,68、580、199
4）、シゾフィラム（Schizophyllum）、アガリカス（Ag
aricus）、プレウロルス（Pleurotus）、リフィラム（L
yophllum）、レンチナス（Lentinus）、コリオラス（Co
riolus）、パナス（Panus）、クレツドツス（Crepidotu
s）、トリキャプタム（Trichaptum）、フォリオタ（Pho
liota）、ピクノポラス（Pycnoporus）、コリオラス（C
oriolus）、クリニペリス（Crinipellis）、ガノデルマ
（Ganoderm）、グレオフィラム（Gloeophyllum）、トリ
コローマ（Tricholoma）等のキノコ類が産生するもの
（特開平６ー１８９７７９、特開平７−９９９８８、特
開平７−２５５４７３、特開平８−８９２７３）、リゾ
パス・アジゴスポルス（Rhizopus azygosporus）などの
カビ類が生産するもの（特開平９−２８３７５）、酵母
ピヒア・ファーメンタンス（Pichia fermentans）が生
産するもの（Appl.Microbiol.Biotechnol.,43,1088-109
5,1995）が挙げられる。

【０００７】後者の反応を行うものとしては、緑藻ユー
グレナ・グラチリス（Euglena gracilis）（J.Biol.Che
m.、274、3223、1972）が産生するもの、放線菌カテラトス
ポラ・フェルジネラ（Catellatospora ferruginera）Ｋ
Ｙ２０３９（FEMS Microbiol.Lett.,55,147-150,199
5）、キネオスポリア・オウランリアカ（Kineosporia a
urantiaca）ＡＴＣＣ２９７２７等が生産するもの（特
開平７−５９５８４）、細菌ミクロコッカス・バリアン
ス（Micrococcus varians）が生産するもの（特開平７
−２８４３８９）、プレシオモナス（Plesiomonas）が
生産するもの（特開平８−１３１１５７）、アルスロバ
クター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、バチル
ス・サーキュランス（Bacillus circulans）、ブレビバ
クテリウム（Brevibacterium）、コリネバクテリウム・
ゼロシス（Corynebacterium xerosis）、フラボバクテ
リウム（Flavobacterium）、ミクロコッカス・ルテウス
（Micrococcus luteus）、セラチア（Seratia）、スト
レプトマイセス・フラボビレンス（Streptomyces flavo
virens）、キサントモナス・キャンペストリス（Xantho
monas campestris）が生産するもの（特開平８−２８０
３９５）が挙げられる。

【０００８】これらのトレハロースホスホリラーゼの
内、酵素化学的に酵素の特性が詳細に調べられているも
のは、ミクロコッカス・バリアンス（特開平７−２８４
３８９）及びプレシオモナス（特開平８−１３１１５
７）である。これらの酵素の熱安定性は、高いものでも
５０℃以下と低く、工業的製造条件で利用するのは困難
である。

【０００９】一般に、工業的に酵素反応で生産を行う場
合、雑菌汚染の低減の目的から反応温度は５５℃以上の
高温が一般的に採られている。反応温度の高温化は基質
と生産物の溶解度を上げて単位体積当たりの仕込量を多
くすることができ、且つ、酵素反応速度が早くなり反応
時間の短縮化ができる等の利点があるので、コスト的に
も有利である。このようなことから工業的に使用される
酵素は、一般的には熱安定性の優れたものが選ばれる。

【００１０】また、工業的に使用される酵素は、生産コ
ストを下げるためにより安価であることも求められる。
つまり、酵素生産微生物は酵素生産性が高いことを要求
される。

【００１１】この様な状況に鑑み、本発明者らは高温で
の酵素反応によるトレハロースの製造を行える高い熱安
定性を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼにつき
鋭意探索したところ、好熱性バチルス属細菌が生産する
トレハロースホスホリラーゼが５５℃以上の温度で使用
しても失活しないことを見出した（特開平８−１３１１
６６）。

【００１２】しかしながら、これらの微生物は酵素の生
産能力が十分でなく、トレハロースやβ−グルコース−
１−リン酸を大量に生産しようとすると、微生物を大量
に培養しなければならないという問題があった。この問
題を解決するためには従来は、微生物の酵素生産能を改
善する煩雑な育種操作を行っていた。具体的には、野生
株を紫外線、エックス線、薬品（ＮＴＧ（Ｎ−メチル−
Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エ
チルメタンスルホネート）等）等を用い人工的変異手段
で変異処理し、酵素生産性の向上した変異株を作製する
といったものである。

【００１３】また、トレハロースホスホリラーゼの生産
がトレハロースによって誘導される微生物が多く、酵素
生産培地の原料に高価なトレハロースを必要とする場合
がある。このため当然ながらトレハロースホスホリラー
ゼ生産コストが高くなり、トレハロース製造コストも高
くなる問題がある。この問題を解決する方法の一つとし
て、人工的変異によって酵素生産誘導が起こらなくなっ
た構成的変異株を作成する方法が考えられる。

【００１４】そこで、本発明者らも、トレハロースホス
ホリラーゼ活性をもつバチルス属細菌に対して変異処理
を行い、約１万株の変異株を調べたが、思惑とは異な
り、トレハロースによる酵素生産誘導が解除された構成
的変異株を得ることができなかった。このことは、トレ
ハロースホスホリラーゼの遺伝子とトレハロースによる
誘導に関連する遺伝子とが、何らかの関連を持って連動
している可能性を示唆すると考えられた。この問題を解
決するためには、偶然に頼る変異処理ではなく、遺伝子
を単離して塩基配列を解析する遺伝子工学的な方法を採
る必要があると考えられた。

【００１５】一方、現在は、全アミノ酸配列が解明され
ていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単
離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコード
するＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物
や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養す
ることにより、比較的容易に所望量の酵素が取得できる
ようになった。

【００１６】そこで、かかる状況に鑑み、上記耐熱性酵
素をコードする遺伝子を突き止め、その遺伝子配列を解
析することは重要な技術的課題である。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、組換え耐熱
性トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子、該
遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む
形質転換体、該形質転換体を培養して組換え耐熱性トレ
ハロースホスホリラーゼを製造する方法、及び該酵素の
利用法を提供することを目的とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、高い熱安
定性を有する耐熱性トレハロースホスホリラーゼを自然
界より探索した結果、目的とする新規な耐熱性トレハロ
ースホスホリラーゼを好熱性バチルス属細菌が産生する
ことを見出し、特に神奈川県の山中の土壌から分離した
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearot
hermophilus）ＳＫ−１が強い耐熱性トレハロースホス
ホリラーゼ産生能を示すことを発見し、通産省工業技術
院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターへ
寄託している（ＦＥＲＭＰ−１４５６７）。

【００１９】そして、更に研究を重ねた結果、本菌株の
耐熱性トレハロースホスホリラーゼ遺伝子を単離し、該
遺伝子から構造遺伝子を見つけ、遺伝子工学を利用し
て、組換え微生物を作製することによって酵素の生産性
が飛躍的に上昇し、不純物の少ない、高純度の組換え耐
熱性トレハロースホスホリラーゼが効率よく調製できる
ことを見出し、本発明を完成した。

【００２０】次に、この組換え微生物を培養することに
より、高純度の組換え耐熱性トレハロースホスホリラー
ゼを生産させ、これを利用してトレハロースを製造する
ことができることを見出した。

【００２１】すなわち、本発明は、以下のとおりであ
る。

【００２２】１）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡか
らなる遺伝子。

【００２３】（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配
列の内、塩基番号２７９から２５７３で表される塩基配
列からなるＤＮＡ。

【００２４】（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ下記
の酵素化学的性質を有する組換え耐熱性トレハロースホ
スホリラーゼをコードするＤＮＡ。

【００２５】（１）作用トレハロースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、
リン酸存在下でトレハロースに作用させると、等モルの
グルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グ
ルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると
等モルのトレハロースとリン酸を生成する。

【００２６】（２）基質特異性トレハロースに特異的に作用する。

【００２７】（３）至適温度トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃〜７
５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約５０
％以上を示す。

【００２８】（４）熱安定性１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６.
０）中で、６５℃、１５分間処理後９５％以上の活性を
有する。（５）至適ｐＨ６.５〜７.５。

【００２９】（６）ｐＨ安定性ｐＨ６．０〜８.０で安定。

【００３０】（７）失活１００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。

【００３１】（８）分子量ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した値は１１万
〜１５万。

【００３２】（９）等電点４.６〜５.２。

【００３３】（１０）阻害剤ＨｇＣｌ₂、ＺｎＳＯ₄で著しく活性が阻害される。

【００３４】なお、上記のＤＮＡとして、遺伝子コード
の縮重に基づき、配列表における配列番号１に示すアミ
ノ酸配列を変えることなく、配列表の配列番号１に示す
該当する塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他
の塩基で置き換えしたものは、当然、本発明に包含され
る。

【００３５】２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列
の内、塩基番号２７９から２５７３で表される塩基配列
からなるＤＮＡが好熱性バチルス属細菌由来のものであ
る上記１記載の遺伝子。

【００３６】３）好熱性バチルス属細菌由来のものが
バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４５６７）である上記１又は２に記載の遺伝
子。

【００３７】４）上記１、２又は３に記載の遺伝子を
含む組換えベクター。

【００３８】５）遺伝子がバチルス・ステアロサーモ
フィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭＰ−１４５６７）の染色
体由来である３.３ｋ塩基対のＤＮＡ断片である上記４
記載の組換えベクター。

【００３９】６）遺伝子がバチルス・ステアロサーモ
フィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭＰ−１４５６７）の耐熱
性トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子部分
である２,２９５塩基対のＤＮＡ断片である上記４記載
の組換えベクター。

【００４０】７）ベクターがプラスミドベクターｐＳ
ＴＰ１由来のものである上記４、５又は６記載の組換え
ベクター。

【００４１】８）上記４、５、６又は７に記載の組換
えベクターを含む形質転換体。

【００４２】９）形質転換体が大腸菌である上記８記
載の形質転換体。

【００４３】１０）上記８又は請求項９に記載の組換
え形質転換体を培養して、組換え耐熱性トレハロースホ
スホリラーゼを製造する方法。

【００４４】１１）上記１０に記載の耐熱性トレハロ
ースホスホリラーゼ及び耐熱性マルトースホスホリラー
ゼの存在下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸塩と
を、水性媒体中で、反応させることを特徴とするトレハ
ロース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造方法。

【００４５】１２）上記１１の反応が５５〜７０℃、
ｐＨ４．５〜８．０で行われる請求項１１記載のトレハ
ロース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造方法。

【００４６】本発明でいう「ストリンジェントな条件で
ハイブリダイズする」とは、実施例２−３におけるハイ
ブリダイズ溶液よりも構成成分濃度が高いか、ハイブリ
ダイゼーション温度が高いか、洗浄液の構成成分濃度が
高いか、洗浄液温度が高いかの場合をいう。

【００４７】一般に、二本鎖のＤＮＡは、熱やアルカリ
の処理により水素結合が解離して一本鎖となる（変
性）、また、変性したＤＮＡは徐々に温度を下げること
により、しだいにもとの二本鎖に復帰する（再生）。こ
の変性と再生は、ＤＮＡ二本鎖の塩基配列の相同性が高
いほど、変性が起こりにくく（高い温度が必要）、再生
し易い。

【００４８】そこで、今、異なる２種類の二本鎖ＤＮＡ
が試験管内に存在するとき、変性を行い、その後再生を
行うことにより、異種のＤＮＡ同士は、相同的配列に依
存して異種間の二本鎖を形成していく。

【００４９】このような２種のＤＮＡの間の二本鎖の会
合を、ハイブリッド形成といい、この方法により異なる
ＤＮＡの間の相同性を調べることをハイブリダイゼーシ
ョン法と呼んでいる。

【００５０】本発明は、このようなハイブリダイゼーシ
ョン法により、ＤＮＡの検索や同定等を行なうものであ
る。

【００５１】ところで、本発明のＤＮＡは、塩基配列
（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするという特性を有するものである。

【００５２】このことは、本発明において、ハイブリダ
イゼーション法により、ＤＮＡの検索や同定等を行なう
場合、ストリンジェントな条件下で行なえば、耐熱性ト
レハロースホスホリラーゼの構造遺伝子と相同性の高い
ＤＮＡはハイブリダイズするが、逆に、相同性の低いも
のはハイブリダイズしないので、その結果、純度が極め
て高い、該酵素由来のＤＮＡが効率よく得ることが可能
となる。

【００５３】したがって、本発明は、ハイブリダイゼー
ション法の操作条件の設定を工夫することにより、耐熱
性トレハロースホスホリラーゼから、高純度の組換え耐
熱性トレハロースホスホリラーゼのＤＮＡを効率よく得
ることができる。

【００５４】本発明のＤＮＡが、ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするという特性を有する原因につ
いては、学問的には解明していないが、多分、前記の耐
熱性トレハロースホスホリラーゼの（１）〜（１０）の
酵素化学的性質の内、特に（３）の「至適温度」及び
（４）の「熱安定性」という性質から来ているものと推
察される。

【００５５】本発明のＤＮＡを入手する微生物として
は、バチルス属に属し、耐熱性トレハロースホスホリラ
ーゼ産生能を有する微生物であればいずれの微生物でも
よい。特に、本発明者らが神奈川県の山中の土壌より分
離したバチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１株
（ＦＥＲＭＰ−１４５６７）もしくはその突然変異体
が好ましい。

【００５６】本発明は、耐熱性トレハロースホスホリラ
ーゼをコードする遺伝子を自律複製可能なベクターに組
み込んだ、複製可能な組換えベクター及び該組換えベク
ターを宿主に導入してなる形質転換体を包含する。

【００５７】自立複製可能なベクターとしては、ｐＢＲ
３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）、ｐＵＣ１
８、ｐＫＫ２２３ー３、ｐＣＲ２．１、ｐＬＥＸ、ｐＪ
Ｌ３、ｐＳＷ１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ４２０、ｐＨＹ
３００ＰＬＫ等のプラスミドベクターやλｇｔ１１、λ
ＺＡＰ等のファージベクターが挙げられるが、大腸菌で
発現させるには、ｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
II ＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＫＫ２２３ー３、及び
ｐＣＲ２．１が好適であり、枯草菌で発現させるには、
ｐＨＹ３００ＰＬＫが好適である。

【００５８】宿主としては、大腸菌、枯草菌、放線菌、
酵母等が挙げられる。

【００５９】また、本発明は、組換え耐熱性トレハロー
スホスホリラーゼをコードする遺伝子を含む組換えベク
ターを宿主に導入してなる形質転換体を培養し、培養物
から組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼを採取し
てなる、組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼの製
造方法を包含する。

【００６０】本発明の形質転換体の培養に用いる栄養培
地としては、炭素源、窒素源、無機物、及び必要に応じ
使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するもの
であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。

【００６１】炭素源としてはトレハロース、マルトー
ス、スクロース、グルコース、フラクトース、デンプ
ン、デキストリン、グリセリン等の炭化水素が用いられ
る。

【００６２】窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、グルタミン酸などのアミノ酸、尿素等の無機有機窒
素化合物が用いられる。窒素源としてはペプトン、ポリ
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリ
カ、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブ
ルベジタブルプロテイン等の窒素含有天然物も使用でき
る。

【００６３】無機物としてはリン酸二水素カリウム、リ
ン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、
硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム等が用いられる。その他にビオチ
ン、チアミン等の微量栄養素を必要に応じて使用する。

【００６４】培養法としては液体培養法（振とう培養法
もしくは通気攪拌培養法）がよく、工業的には通気攪拌
培養法が最も適している。培養温度とｐＨは、使用する
形質転換体の増殖に最も適した条件を選べばよい。培養
時間は培養条件によって変わってくるが、通常１５〜４
８時間程度であり、組換え耐熱性トレハロースホスホリ
ラーゼの生成が確認されたとき、好ましくは生成が最大
に達したときに培養を停止する。

【００６５】この様にして得られた培養物から本発明の
組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼを採取するに
は、まず、培養液中の菌体を物理的な手法で破砕する
か、有機溶剤やリゾチームのような酵素によって溶解し
た後、残渣を遠心分離法や濾過法等により除去する。こ
れを限外濾過、塩析、透析、溶剤沈澱等の処理を単独或
いは組み合わせに付すことにより工業用途の濃縮酵素液
が調製できる。

【００６６】更に、この濃縮酵素液をイオン交換クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点ク
ロマトグラフィー等の周知の単離・精製法の組合せに付
すことにより、精製標品を得ることができる。

【００６７】次に、本発明は、組換え耐熱性トレハロー
スホスホリラーゼと耐熱性マルトースホスホリラーゼの
存在下にマルトースとリン酸もしくはリン酸塩とを、水
溶媒中で反応させることにより、トレハロース又はβ−
グルコース−１−リン酸を製造する方法を包含する。

【００６８】このように、本発明は、新規な好熱性バチ
ルス属細菌、特にバチルス・ステアロサーモフィラスＳ
Ｋ−１（ＦＥＲＭＰ−１４５６７）由来の耐熱性トレ
ハロースホスホリラーゼ遺伝子を基に、遺伝子工学的手
法により、組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼを
得、これを用いて組換え微生物を作製したものであっ
て、これを培養すれば、酵素の生産性が飛躍的に上昇
し、不純物の少ない、高純度の組換え耐熱性トレハロー
スホスホリラーゼが調製できる点で極めて優れていると
言える。

【００６９】また、組換え耐熱性トレハロースホスホリ
ラーゼが工業的規模で大量に、効率よく生産できるよう
になった結果、これを利用することにより、有用なトレ
ハロースの製造が飛躍的に効率よく製造することができ
る点においても、非常に価値がある。

【００７０】以上、本発明は、本発明者らが先に見出し
た耐熱性トレハロースホスホリラーゼについて遺伝子学
的解明を行い、この解明を基に、そのＤＮＡの遺伝子学
的な特性を見つけ、遺伝子工学的な手法によって、高純
度でしかも耐熱性という極めて有用な特性を有する組換
え耐熱性トレハロースホスホリラーゼを効率よく製造で
きるＤＮＡを得た点に、格別の意義があることが分かる
であろう。

【００７１】以下、本発明について詳細に説明する。

【００７２】［１］耐熱性トレハロースホスホリラー
ゼの酵素化学的性質：本発明は、本発明者らによる、耐
熱性トレハロースホスホリラーゼの発見に基づくもので
あるが、この酵素は、好熱性バチルス属細菌、バチルス
・ステアロサーモフィラスＳＫ−１株から産生されたも
のであり、その酵素化学的特性を調べた結果（実施例
１）、その酵素化学的性質は、以下のとおりであった。

【００７３】なお、トレハロースホスホリラーゼ活性
は、以下のように測定した。

【００７４】酵素溶液０.４ｍｌと０.５Ｍリン酸カリウ
ム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６.０）０.０６ｍｌ、２Ｗ／
Ｖ％トレハロース０.６ｍｌ、蒸留水０.１４ｍｌを混合
し、６０℃、２０分反応後１０分間の煮沸によって反応
を停止させた。次に、この反応停止液から０.０２ｍｌ
を採取し、グルコース検査試薬（グルコースＣIIーテス
トワコー；和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で
２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光
度計を用いて反応液中のグルコース量測定した。遊離し
た生成したグルコースの量から１分間に１μｍｏｌのト
レハロースを加リン酸分解した酵素量を１単位とした。

【００７５】また、ホスホリラーゼであることを確認す
るために、反応終了後の反応液を陰イオン交換カラムで
分離後、示差屈折計を検出手段とする高速液体クロマト
グラフィーによりβ−グルコース−１−リン酸を定量し
た。

【００７６】（１）作用以下の式１で示すように、トレハロースを可逆的に加リ
ン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でトレハロース
に作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース
−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−
１−リン酸に作用させると等モルのトレハロースとリン
酸を生成する。

【化１】（２）基質特異性トレハロース、ネオトレハロース、マルトース、イソマ
ルトース、セロビオース、シュークロース、ｐ−ニトロ
フェノール−α−グルコシド、ｐ−ニトロフェノール−
β−グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行った
ところ、トレハロース以外にはグルコースの生成がほと
んど認められなかった（表１）。

【表１】（３）至適温度４０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６.
０）中で各種温度（４０〜９０℃）で反応させたとこ
ろ、トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃
〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約
５０％以上を示した（図１）。

【００７７】（４）熱安定性１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６.
０）中にてインキュベートし、残存活性を測定したとこ
ろ、６５℃で１５分間処理で、無処理の９５％以上の活
性を示した（図２）。

【００７８】（５）至適ｐＨ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４.０
〜７．７）と２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.７〜
９.０）を用いて６０℃で反応を行ったところ、至適ｐ
Ｈは６.５〜７.５であった（図３）。

【００７９】（６）ｐＨ安定性１００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４.
０〜８.０）と１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５
〜９.０）を用いて６０℃で２４時間インキュベート
し、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、ｐＨ６．０
〜８．０で安定であった（図４）。

【００８０】（７）失活１００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。

【００８１】（８）分子量Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシアバイオテ
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出保持時間から分子
量を求めた結果、本酵素の分子量は１１万〜１５万であ
った。

【００８２】（９）等電点等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移
動度から等電点は４.６〜５.２であった。

【００８３】（１０）阻害剤１ｍＭのＨｇＣｌ₂で９９％、ＺｎＳＯ₄で８０％の活性
阻害が見られた（表２）。

【表２】（１１）Ｎ末端アミノ酸配列常法により、アプライド・バイオシステムズ製気相プロ
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、この酵素は、Ｎ末端に配列番号２に示すア
ミノ酸配列を有していた。

【００８４】［２］耐熱性トレハロースホスホリラー
ゼのＤＮＡの配列解析本発明者らは、上記の（１１）のＮ末端アミノ酸配列に
基づき、バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１株
の染色体ＤＮＡから耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
をコードするＤＮＡを取得し、その配列の解析を行っ
た。

【００８５】まず、バチルス・ステアロサーモフィラス
ＳＫ−１株の菌体よりアクロモペプチダーゼとＳＤＳを
用いた凍結融解法により染色体ＤＮＡを調製した。この
染色体ＤＮＡをHindIII、BamHI、PstI、SalI、EcoRI等
の制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動により分
離し、ナイロン膜上にブロッティングした。一方、配列
番号２に示すトレハロースホスホリラーゼのＮ末端の８
から１３番目のアミノ酸配列に基づき、5'-CARYTNAAYAT
HGARAA-3'で表される配列のオリゴヌクレオチドＴＮ３
を合成し、放射性同位元素³²Ｐで標識し、これをプロー
ブとして前記ナイロン膜上のＤＮＡ断片とサザンハイブ
リダイゼーションを行った。その結果、HindIIIで切断
してできる断片中、約２.０ｋ塩基対の断片がハイブリ
ダイズすることが分かった。そこで、HindIIIで切断し
た染色体ＤＮＡからアガロースゲル電気泳動によって約
２.０ｋ塩基対のＤＮＡ断片を分画、抽出した。これを
プラスミドベクターｐＵＣ１１８のHindIII部位に挿入
し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換株からオ
リゴヌクレオチドＴＮ３とハイブリダイズする組換えプ
ラスミドを有するものを検索し、トレハロースホスホリ
ラーゼをコードするＤＮＡの５’端ＤＮＡ断片をクロー
ン化した。

【００８６】そして、この組換えプラスミド中の挿入さ
れた約２.０ｋ塩基対の断片の塩基配列を蛍光ラベルを
用いたダイプライマー法により決定した。

【００８７】次に、この解析したＤＮＡ断片の塩基配列
の３’側に制限酵素MspI認識配列が検出されたことか
ら、このMspI認識配列から下流の塩基配列と相同性を示
す、約２.０ｋ塩基対のMspIで切断した染色体ＤＮＡ断
片をインバースＰＣＲ法によって解析した。２種類のＤ
ＮＡ断片の塩基配列解析結果より、耐熱性トレハロース
ホスホリラーゼをコードする全塩基配列を決定すること
ができた。その配列を配列番号３に示す。

【００８８】［３］組換え耐熱性トレハロースホスホリ
ラーゼのＤＮＡの単離・同定とその製造：耐熱性トレハ
ロースホスホリラーゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片の
塩基配列が決定できたことから、該トレハロースホスホ
リラーゼをコードするＤＮＡ配列の開始コドン上流１３
２塩基目からの配列5'-TTGAAAACAAATCAGTTCAA-3'で表さ
れるオリオヌクレオチド５ＴＰ２と、終止コドン下流の
配列で配列表における配列番号４の塩基番号１６２から
の配列のアンチセンス配列５´-TCGTCGCGCTTCCACCGATT-
３´で表されるオリゴヌクレオチド３ＴＰ２をプライマ
ーとして、前記の染色体ＤＮＡをテンプレートとしたＰ
ＣＲを行い、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ構造遺
伝子を含む約３.３ｋ塩基対のＤＮＡ断片を調製した。
これをプラスミドベクターｐＣＲ２．１にライゲーショ
ンして、組換えプラスミドｐＳＴＰ１を作製し、大腸菌
ＩＮＶαＦ´（endA1,recA1,hsdR17(r^-k,m^+k),supE44,
λ-,thi-1,gyrA,relA1,φ80 lacZ△M15△(lacZYA-arg
F),deoR⁺,F´）株へ導入を行い、形質転換された大腸菌
ＳＴＰ１を得た。

【００８９】そして、上記の形質転換体中の組換えプラ
スミドｐＳＴＰ１に挿入された３.３ｋ塩基対のＤＮＡ
断片中の構造遺伝子周辺の塩基配列の解析を行った。そ
の結果は、配列番号１に示す通りであり、前記の耐熱性
トレハロースホスホリラーゼのＤＮＡ配列の配列番号３
の塩基番号２５７〜２７９６と一致することが確認され
た。

【００９０】そこで、形質転換大腸菌ＳＴＰ１をジャー
培養し、組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼ粗酵
素の調製を行った。培養は、容量５ｌのファーメンター
にポリペプトン１.６％、酵母エキス１％、ＮａＣｌ０.
５％、ＭｇＳＯ₄０.０５％を含有する培地（ｐＨ７．
０）約３ｌを入れて滅菌後、予め濾過滅菌したアンピシ
リン水溶液を１００ｍｇ／ｌになるように添加し、温度
を３５℃とした後、種培養液２Ｖ／Ｖ％を接種して、３
５℃、ｐＨ６．５〜７．５に保持しながら２４時間通気
攪拌培養した。

【００９１】培養終了後、培養液中の菌体破壊を行い、
これを除去した粗酵素液を調製した。粗酵素液のトレハ
ロースホスホリラーゼ活性は３,０００単位／ｍｌであ
った。

【００９２】更に、実施例３に示すとおり、この粗酵素
を精製し、組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼの
精製標品を得た。

【００９３】本発明の組換え型耐熱性トレハロースホス
ホリラーゼの性質は、以下の通りである。

【００９４】（１）作用前記の式１で示すように、トレハロースを可逆的に加リ
ン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でトレハロース
に作用させると、等モルのグルコースとβ−グルコース
−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グルコース−
１−リン酸に作用させると等モルのトレハロースとリン
酸を生成する。

【００９５】（２）基質特異性トレハロース、ネオトレハロース、マルトース、イソマ
ルトース、セロビオース、シュークロース、ｐ−ニトロ
フェノール−α−グルコシド、ｐ−ニトロフェノール−
β−グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行った
ところ、トレハロース以外にはグルコースの生成がほと
んど認められなかった。

【００９６】（３）至適温度４０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６.
０）中で各種温度（４０〜９０℃）で反応させたとこ
ろ、トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃
〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約
５０％以上を示した。

【００９７】（４）熱安定性１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６.
０）中にてインキュベートし、残存活性を測定したとこ
ろ、６５℃で１５分間処理で、無処理の９５％以上の活
性を示した。

【００９８】（５）至適ｐＨ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４.０
〜７．７）と２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.７〜
９.０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐＨは６.５
〜７.５であった。

【００９９】（６）ｐＨ安定性１００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４.
０〜８.０）と１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５
〜９.０）を用いて６０℃で２４時間インキュベート
し、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、ｐＨ６．０
〜８．０で安定であった。

【０１００】（７）失活１００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。

【０１０１】（８）分子量Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシアバイオテ
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出容量から分子量を
求めた結果、本酵素の分子量は１１万〜１５万であっ
た。

【０１０２】（９）等電点等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移
動度から等電点は４.６〜５.２であった。

【０１０３】（１０）阻害剤１ｍＭのＨｇＣｌ₂で９９％、ＺｎＳＯ₄で８０％の活性
阻害が見られた。

【０１０４】（１１）Ｎ末端アミノ酸配列常法により、アプライド・バイオシステムズ製気相プロ
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、精製酵素はＮ末端に配列番号２に示すアミ
ノ酸配列を有していた。

【０１０５】この組換え型耐熱性トレハロースホスホリ
ラーゼの酵素化学的特性は、バチルス・ステアロサーモ
フィラスＳＫ−１の由来の耐熱性トレハロースホスホリ
ラーゼの酵素学的性質と一致するものであった。

【０１０６】従って、前述の組換え型耐熱性トレハロー
スホスホリラーゼをコードするＤＮＡは、バチルス・ス
テアロサーモフィラスＳＫ−１の由来のものであると判
断した。

【０１０７】［４］トレハロース又はβ−グルコース
−１−リン酸の製造組換え型耐熱性トレハロースホスホリラーゼ及び耐熱性
マルトースホスホリラーゼの存在下に、マルトースとリ
ン酸もしくはリン酸塩とを、水性媒体中で、反応させ
て、トレハロース又はβ−グルコース−１−リン酸を製
造する方法について、以下述べる。

【０１０８】この反応に用いられる組換え型耐熱性トレ
ハロースホスホリラーゼとしては、ｐＨ６.０の緩衝
液、例えば１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液
（ｐＨ６.０）中で、５０〜７０℃のいずれかの温度
で、好ましくは５５〜７０℃のいずれかの温度で、特に
６５℃で１５分処理後に無処理の９５％以上の活性を有
するものが好適に用いられる。これらの酵素は、精製酵
素であっても、粗酵素であってもよい。また、さらにこ
れを酵素の常法により担体に固定した固定化酵素を用い
ることも可能である。

【０１０９】また、この反応に用いる耐熱性マルトース
ホスホリラーゼとしては、上記反応温度のいずれかで、
及び上記ｐＨ範囲のいずれかで、組換え型耐熱性トレハ
ロースホスホリラゼーの助力の下に、マルトースとリン
酸もしくはリン酸塩からトレハロースを生産し得るもの
で、マルターゼ等のトレハロースの製造に悪影響を及ぼ
す酵素を含まないものであればよい。

【０１１０】しかしながら、好適にはｐＨ６.０の緩衝
液、例えば１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６.０）中で、５
０〜６５℃のいずれかの温度で、好ましくは５５〜６５
℃のいずれかの温度で、特に６０℃で１５分処理後に無
処理の８０％以上の活性を有する耐熱性マルトースホス
ホリラーゼを用いることができる。かかる性質を有する
耐熱性マルトースホスホリラーゼの例として、本発明者
らによって見出されたバチルス・ｓｐ.ＲＫ−１（ＦＥ
ＲＭＰ−１５０４４）が産生する耐熱性マルトースホ
スホリラーゼを挙げることができる。

【０１１１】耐熱性マルトースホスホリラーゼは組換え
型耐熱性トレハロースホスホリラーゼと同様、精製酵素
であっても粗酵素であってもよい。

【０１１２】マルトースとしてはマルトースまたはマル
トース含有物（例えばマルトース高含有糖液）を用いる
ことができる。リン酸塩としてはリン酸三カリウム（も
しくはナトリウム）、リン酸水素二カリウム（もしくは
ナトリウム）、リン酸二水素カリウム（もしくはナトリ
ウム）等の水溶性リン酸塩を用いることができる。水性
媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液として
は酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク
酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液等を用いることができ
る。

【０１１３】酵素の使用量については特に制限はない
が、マルトース１ｇに対して各酵素とも、０．１〜５０
単位、好ましくは１〜２０単位使用するのが好適であ
る。また、組換え型耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
と耐熱性マルトースホスホラリーゼとの使用比率は特に
制限ないが、単位の比で前者：後者＝１：５〜５：１、
好ましくは１：２〜２：１が適当である。

【０１１４】リン酸及び／またはリン酸塩はマルトース
に対して、特に制限はないが、０．００１〜１倍モル、
好ましくは０．００５〜０．５倍モル使用するのが適当
である。尚、緩衝液がリン酸（塩）を含有する場合は系
中のリン酸及びリン酸塩の総量が上記範囲であればよ
い。

【０１１５】上記反応は温度、雑菌汚染をさらに避ける
とともに収率を挙げるため、好ましくは５５〜７０℃、
好ましくは５５〜６５℃、更に好ましくは６０〜６５℃
で行う。ｐＨは一般に４.５〜８.０、好ましくは５.０
〜６.０で行うのが適当である。上記条件で十分なトレ
ハロース生成が見られた時点で反応を終了するが、反応
は通常１〜１４４時間で終了する。

【０１１６】反応終了後、反応液の加熱による酵素の失
活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活
等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン
交換樹脂処理、エタノール晶出処理等の単離・精製手段
を適宜組み合わせてトレハロースを得ることができる。

【０１１７】また、本発明は、組換え型耐熱性トレハロ
ースホスホリラーゼの存在下にトレハロースとリン酸も
しくはリン酸塩とを、水溶媒中で反応させせて、β−グ
ルコース−１−リン酸を製造することもできる。

【０１１８】その場合、この反応に用いられる組換え型
耐熱性トレハロースホスホリラーゼ、トレハロース、水
溶媒は、トレハロース製造の場合と同様にして行うこと
ができる。酵素はマルトース１ｇに対して０．１〜５０
単位、好ましくは１〜２０単位が好適である。

【０１１９】反応温度、反応ｐＨ、反応時間はトレハロ
ース製造の場合と同様にして行うことができる。反応終
了後、イオン交換樹脂処理等の単離・精製手段を適宜組
み合わせてβ−グルコース−１−リン酸を得ることがで
きる。

【０１２０】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を実施
例により詳細に説明する。

【０１２１】トレハロースホスホリラーゼ活性は、以下
のように測定した。

【０１２２】適宜希釈した酵素溶液０.４ｍｌと０.５Ｍ
リン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ６.０）０.０６ｍｌ、２Ｗ
／Ｖ％トレハロース０.６ｍｌ、蒸留水０.１４ｍｌを混
合し、６０℃、２０分反応後１０分間の煮沸によって反
応を停止させた。次に、この反応停止液から０.０２ｍ
ｌを採取し、グルコース検査試薬グルコースＣIIーテス
トワコー（和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で
２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光
度計を用いて測定し、反応液中のグルコース量を定量し
た。生成したグルコースの量から１分間に１μｍｏｌの
トレハロースを加リン酸分解した酵素量を１単位とし
た。

【０１２３】

【実施例１】精製トレハロースホスホリラーゼの酵素
化学的特性［実施例１−１］精製酵素の調製バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫー１（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４５６７）による耐熱性トレハロースホスホリ
ラーゼの精製は以下のようにして行った。

【０１２４】（培養）酵母エキス１％、ポリペプトン２
％、トレハロース１％を含有する培地（ｐＨ７．０）１
００ｍｌを５００ｍｌバッフル付きマイヤーフラスコに
入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブ殺菌したもの
に、バチルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１を１白
金耳植菌し、５５℃にて１６時間振とう培養したものを
種培養液とした。

【０１２５】容量５ｌのファーメンターに種培養の場合
と同組成の培地約３ｌを入れて滅菌し、温度を５５℃と
した後、種培養液２Ｖ／Ｖ％を接種し、５５℃、ｐＨ
６．０〜７．０に保持しながら１８時間通気攪拌培養し
た。

【０１２６】（粗酵素調製）分離した培養液に硫安を４
０〜６０％の飽和溶液になるよう溶解し、生じたタンパ
ク質の沈澱を遠心分離によって回収して、１０ｍＭリン
酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６.０）に溶解後、
同じ緩衝液に対して透析を行い、濃縮後トレハロースホ
スホリラーゼ活性３５０単位／ｍｌの粗酵素液を１０ｍ
ｌ得た。

【０１２７】（イオン交換クロマトグラフィー）１０ｍ
Ｍリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６.０）によ
って平衡化したＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥトーヨーパール６
５０Ｍ（東ソー（株））を詰めたカラムに、粗酵素液を
添加し、５カラム容量の０〜０.４ＭＮａＣｌの上昇濃
度勾配によって溶出し、分画分取した。活性のある画分
は合わせて濃縮、脱塩後、更に、一連の同じクロマトグ
ラフィー操作を行い精製度を上げた。

【０１２８】（疎水クロマトグラフィー）４０％飽和と
なるように硫酸アンモニウムを溶解した１０ｍＭリン酸
カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡
化した、ＴＳＫｇｅｌＰｈｅｎｙｌトーヨーパール６５
０Ｍ（東ソー(株)）を詰めたカラムに、上記部分精製酵
素液を添加し、８カラム容量の４０％〜０％飽和硫酸ア
ンモニウム溶液の下降濃度勾配によって溶出し、分画分
取した。活性のある画分を合わせて濃縮、脱塩を行っ
た。

【０１２９】（吸着クロマトグラフィー）０．３ｍＭと
なるようにＣａＣｌ₂を溶解した１０ｍＭリン酸カリウ
ム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって平衡化し
た、ＰＥＮＴＡＸＧＨ−０８１０Ｍカラムに、上記部
分精製酵素液を添加し、１０カラム容量の１０〜３００
ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の
上昇濃度勾配によって溶出し、分画分取した。活性のあ
る画分を合わせて濃縮、脱塩を行った。

【０１３０】（ゲル濾過クロマトグラフィー）０.２Ｍ
ＮａＣｌを溶解した１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸
緩衝液（ｐＨ６.０）によって平衡化した、Ｓｕｐｅｒ
ｄｅｘ２００ｐｇカラム（ファルマシアバイオテク
(株)）に、上記部分精製酵素液を添加し、同じ緩衝液で
溶出し、分画分取した。活性のある画分を合わせて濃
縮、脱塩を行った。

【０１３１】（ネイティブポリアクリルアミドゲル電気
泳動）上記精製酵素をネイティブポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動し、ゲルをＣＢＢ染色してタンパク質のバン
ドを調べたところ一本のバンドしか検出されず、単一タ
ンパク質であることが確認できたので精製トレハロース
ホスホリラーゼ酵素液とした。

【０１３２】［実施例１−２］精製酵素の酵素化学的
特性実施例１−１で調製した精製トレハロースホスホリラー
ゼ液を用い、以下の酵素化学的特性を調べた。

【０１３３】（１）作用実施例１−１で調製した精製酵素液０.４ｍｌと０.５Ｍ
リン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ６.０）０.０６ｍｌ、２Ｗ
／Ｖ％トレハロース０.６ｍｌ、蒸留水０.１４ｍｌを混
合し、６０℃、６０分間トレハロース分解反応を行っ
た。反応後１０分間の煮沸によって反応を停止させ、こ
の反応停止液から０.０２ｍｌを採取し、グルコース検
査試薬グルコースＣIIーテストワコー（和光純薬工業
（株））を３ｍｌ加え、室温で２０分間反応させた後、
５０５ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定し、反
応液中のグルコース量を定量した。一方、反応停止液を
陰イオン交換カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ
ーで分離後、示差屈折計でβ−グルコース−１−リン酸
を検出し定量した。その結果、反応停止液中のグルコー
ス含量とβ−グルコース−１−リン酸含量は等しかっ
た。

【０１３４】また、精製酵素液０.４ｍｌと０.５Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ６.０）０.１２ｍｌ、０.５Ｍβ−グルコ
ース−１−リン酸・Ｎａ水溶液０.１２ｍｌ、０．５Ｍ
グルコース水溶液０.１２ｍｌ、蒸留水０.４４ｍｌを混
合し、６０℃、６０分反応後１０分間の煮沸によって反
応を停止させた。次に、この反応停止液から０.０２ｍ
ｌを採取し、グルコース検査試薬グルコースＣIIーテス
トワコー（和光純薬工業（株））を３ｍｌ加え、室温で
２０分間反応させた後、５０５ｎｍでの吸光度を分光光
度計を用いて測定し、反応液中のグルコース量を定量し
た。一方、反応停止液をＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｏ８０
カラム（東ソー（株））を用いた高速液体クロマトグラ
フィーで分離後、示差屈折計で反応液のトレハロースを
検出し定量した。

【０１３５】その結果、反応停止液中の消費グルコース
量と生成トレハロース量は等しかった。従って、精製酵
素の作用は、式（１）で示すように、トレハロースを可
逆的に加リン酸分解する。すなわち、リン酸存在下でト
レハロースに作用させると、等モルのグルコースとβ−
グルコース−１−リン酸を生成し、グルコースとβ−グ
ルコース−１−リン酸に作用させると等モルのトレハロ
ースとリン酸を生成すると結論した。

【０１３６】（２）基質特異性（１）のトレハロース分解反応の基質を以下のものに置
き換えて加リン酸分解反応を行ったところ、ネオトレハ
ロース、マルトース、イソマルトース、セロビオース、
シュークロース、ｐ−ニトロフェノール−α−グルコシ
ド、ｐ−ニトロフェノール−β−グルコシドを基質とし
て加リン酸分解反応を行ったところ、いずれもグルコー
スの生成が認められなかった（表１）。

【０１３７】（３）至適温度精製トレハロースホスホリラーゼ活性を各種温度（４０
〜９０℃）で行ったところ、トレハロース加リン酸分解
反応の至適温度は７０℃〜７５℃付近で、６０℃〜７５
℃の範囲で最高活性の約５０％以上を示した（図１）。

【０１３８】（４）熱安定性精製酵素液を各種温度（４０〜９０℃）に１５分間イン
キュベートした後、トレハロースホスホリラーゼ活性を
測定したところ、６５℃処理で、無処理の９５％以上の
活性を示した（図２）。

【０１３９】（５）至適ｐＨトレハロースホスホリラーゼ活性測定に用いる０.５Ｍ
リン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ６.０）の代わりに０.５Ｍ
リン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４.０〜７．
７）もしくは０.５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．７〜
９.０）を用いて反応を行ったところ、至適ｐＨは６.５
〜７.５であった（図３）。

【０１４０】（６）ｐＨ安定性精製トレハロースホスホリラーゼ酵素液を１００ｍＭリ
ン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４.０〜８.０）と
１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５〜９.０）と混
合し、６０℃で２４時間インキュベートした後、各ｐＨ
での残存活性を測定したところ、ｐＨ６．０〜８．０で
安定であった（図４）。

【０１４１】（７）失活精製トレハロースホスホリラーゼ酵素液を１００℃、１
０分間加熱した後、残存活性を測定したところ、活性は
１００％失活していた。

【０１４２】（８）分子量Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシアバイオテ
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出容量から分子量を
求めた結果、精製酵素の分子量は１１万〜１５万であっ
た。

【０１４３】（９）等電点等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移
動度から等電点は４.６〜５.２であった。

【０１４４】（１０）阻害剤精製トレハロースホスホリラーゼ酵素液に終濃度１ｍＭ
になるように阻害剤を添加した後、残存活性を測定した
ところ、ＨｇＣｌ₂で９９％、ＺｎＳＯ₄で８０％の活性
阻害が見られた（表２）。

【０１４５】（１１）Ｎ末端アミノ酸配列常法により、アプライド・バイオシステムズ製気相プロ
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、精製酵素はＮ末端に配列表における配列番
号２に示すアミノ酸配列を有していた。

【０１４６】

【実施例２】耐熱性トレハロースホスホリラーゼをコ
ードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ及び組換えＤＮＡ形
質転換大腸菌の調製［実施例２−１］染色体ＤＮＡの調製ポリペプトン２％、酵母エキス１％を含有する培地（ｐ
Ｈ７.０）５ｍｌを試験管に入れ、１２１℃、２０分間
オートクレーブ殺菌したものにバチルス・ステアロサー
モフィラスＳＫ−１株を植菌し、５５℃で１４時間振と
う培養した。これを種菌液とし、同じ培地１００ｍｌを
５００ｍｌバッフル付フラスコに入れ、１２１℃、２０
分間オートクレーブ殺菌したものに５％植菌し、５５℃
で６時間回転振とう培養した。遠心分離により培養液か
ら菌体を分離し、０.１ＭＥＤＴＡを含む０.１５ＭＮ
ａＣｌ溶液（ｐＨ８.０）に懸濁した。これにアクロモ
ペプチダーゼ（和光純薬(株)）を４ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに加え、３７℃で２０分間穏やかに振とうした後、−
８０℃で３０分間凍結した。解凍後、１％ＳＤＳと０.
１ＭＮａＣｌを含む０.１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
９.０）を加えて６０℃に加温した。冷却後、１ｍＭＥ
ＤＴＡを含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８.
０）（ＴＥ緩衝液）で飽和したフェノール溶液を加えて
除蛋白処理を行った。その後、冷エタノールを加え、生
成した粗染色体ＤＮＡを採取し、これを７０％、８０
％、９０％エタノールにそれぞれ５分間ずつ浸した後、
ＴＥ緩衝液に溶解した。これにＲＮaseＡ（シグマ）を
２０μg／ｍｌとなるように加え、３７℃で３０分間反
応させた。反応液を再度フェノール溶液による除蛋白処
理を行い、冷エタノールを加えて生成した染色体ＤＮＡ
を採取し、７０％、８０％、９０％エタノールにそれぞ
れ５分間ずつ浸した後、１ｍｇ／ｍｌとなるようにＴＥ
緩衝液に溶解し、染色体ＤＮＡ溶液とした。

【０１４７】［実施例２−２］トレハロースホスホリ
ラーゼをコードするＤＮＡの５’端ＤＮＡ断片の取得実施例２−１で調製した染色体ＤＮＡをHindIII、BamH
I、PstI、SalI、EcoRI等の各種制限酵素で切断し、アガ
ロースゲル電気泳動を行った。分離したＤＮＡ断片を常
法によりナイロン膜ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓ
ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＴｒａｎｓｆｅｒＭ
ｅｍｂｒａｎｅ（デュポン）に固定した。一方、配列表
における配列番号２に示すトレハロースホスホリラーゼ
のＮ末端の８から１３番目のアミノ酸配列のGln-Leu-As
n-Ile-Glu-Asnで表される配列に基づき、5'-CARYTNAAYA
THGARAA-3'で表される配列のオリゴヌクレオチドＴＮ３
を化学合成した。このオリゴヌクレオチドＴＮ３を放射
性同位体³²Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定したＤ
ＮＡ断片とSouthern,E.M.らの方法(J.Mol.Biol.,98:503
-517,1975)に従ってサザンハイブリダイゼーションを行
った。

【０１４８】このときのハイブリダイゼーションの条件
は、５ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストリ
ン、０.５ｍｇ／ｍｌサケ変性ＤＮＡからなる溶液中に
おいて４２℃で１６〜２０時間ハイブリダイズを行い、
その後２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳからなる溶液中にて５５
℃で３０分間のサイクルで３回ナイロン膜を洗浄した。

【０１４９】その結果、制限酵素HindIIIで切断した約
２.０ｋ塩基対のＤＮＡ断片がハイブリダイズした。そ
こでHindIIIで切断した染色体ＤＮＡを再度アガロース
ゲル電気泳動し、約２.０ｋ塩基対のＤＮＡ断片をＤＥ
８１ペーパー（ワットマン）を用いて抽出した。抽出し
たＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１１８のHind
III部位に挿入した。この組換えプラスミドをコンピテ
ントセルＥ.ｃｏｌｉＪＭ１０９（宝酒造(株)）１０
０μｌに加え、氷冷下に３０分静置後、４２℃で４５秒
間加温し、ＳＯＣ培地を加えて３７℃で１時間振とう培
養することにより、組換えプラスミドを導入した形質転
換大腸菌を得た。得られたそれぞれの形質転換体からア
ルカリ−ＳＤＳ法により組換えプラスミドを回収し、Hi
ndIIIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮ
Ａ断片を前述と同様にナイロン膜上に固定した。ナイロ
ン膜上に固定したＤＮＡは³²Ｐで標識したＴＮ３をプロ
ーブとして前述と同様の条件でサザンハイブリダイゼー
ションを行い、ハイブリダイズする組換えプラスミドを
選択し、２.０ｋ塩基対のHindIII断片をクローン化し
た。

【０１５０】この選択した組換えプラスミドをHindIII
で切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、挿入された
約２.０ｋ塩基対の染色体ＤＮＡ断片をＤＥ８１ペーパ
ーを用いて抽出した。抽出したＤＮＡ断片は超音波処理
によって０.５ｋから１.０ｋ塩基対の大きさに小断片化
した後、ＲＴＧｐＵＣ１８ SmaI／ＢＡＰ＋Ｌｉｇａ
ｓｅ（ファルマシア）を用いてプラスミドベクターｐＵ
Ｃ１８のSmaI部位に挿入した。そして、この組換えプラ
スミドをコンピテントセルＥ.ｃｏｌｉ１０９（宝
酒造(株)）を用いて大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得ら
れた大腸菌から組換えプラスミドを抽出し、このプラス
ミドをテンプレート、２種類の合成オリゴヌクレオチド
ＦＰ（5'-GTTTTCCCAGTCACGACG-3'）及びＲＰ（5'-GAATT
GTGAGCGGATAAC-3'）をプライマーとしてＰＣＲを行い、
ｐＵＣ１８に挿入したＤＮＡ断片の増幅を行った。反応
条件は、９３℃で２分間加熱した後、９５℃で１分、５
５℃で１分３０秒、７２℃で３分のサイクルを３０回繰
り返してから、最後に７２℃で１５分保温した。反応液
９０μｌにＰＥＧ溶液（２０％ポリエチレングリコー
ル、２．５ＭＮａＣｌ）を６０μｌ加えて混合し、氷
中に１５分間静置した。遠心分離により沈殿したＤＮＡ
断片を分離し、７０％エタノールで洗浄後、真空乾燥し
た。これを適量の蒸留水に溶解し、塩基配列決定用ＤＮ
Ａを調製した。このＤＮＡをテンプレートとし、ＰＲＩ
ＳＭＤｙｅＰｒｉｍｅｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎｋｉｔ
（パーキンエルマー）を用いたジデオキシ・チェーン・
ターミネーター法により、ＤＮＡ断片の蛍光ラベルを行
い、ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析して塩基配列を決定し
た。決定した全ての塩基配列をコンピューターソフトＧ
ＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエアー開発(株)）を用
いて解析し、２.０ｋ塩基対のＤＮＡ断片の塩基配列を
決定した。結果、この断片は、トレハロースホスホリラ
ーゼ遺伝子のプロモーター及び構造遺伝子の途中までを
含む１,９５６塩基対のＤＮＡ断片であることが判明し
た。

【０１５１】［実施例２−３］耐熱性トレハロースホ
スホリラーゼをコードするＤＮＡの３’端ＤＮＡ断片の
取得実施例２−２で決定した配列に制限酵素Msp Ｉ認識配列
が見られたことから、染色体ＤＮＡをMspＩで切断し、
アガロース電気泳動後、ナイロン膜上に固定した。次
に、実施例２−２でクローン化した２.０ｋ塩基対のHin
dIII切断ＤＮＡ断片を更にMspＩで切断し、約０．２ｋ
塩基対のＤＮＡ断片を調製し、これをＲａｎｄａｍＰ
ｒｉｍｅｒＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（宝酒
造（株））を用いたランダムプライマーＤＮＡラベリン
グ法により放射性同位体³²Ｐで標識し、前記ナイロン膜
上に固定したＤＮＡ断片とサザンハイブリダイセーショ
ンを行った。

【０１５２】このときのハイブリダイゼーションの条件
は、５ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストリ
ン、０.５ｍｇ／ｍｌサケ変性ＤＮＡからなる溶液中に
おいて６５℃で１６〜２０時間ハイブリダイズを行い、
その後２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳからなる溶液中にて６５
℃で３０分間のサイクルで３回ナイロン膜を洗浄した。
結果、２.０ｋ塩基対のＤＮＡ断片がハイブリダイズし
た。

【０１５３】そこで、実施例２−２で決定した配列のMs
pI認識配列以降の塩基配列を基に、5'-TGTGCTTTGCCATCA
CGTTCGTGTA-3'及び5'-ATTTGCGCTGGGCAGCCAAAGCTGT-3'で
表されるオリゴヌクレオチドＴＬ及びＴＲを化学合成
し、一方、実施例２−１で調製した染色体ＤＮＡを制限
酵素MspIで切断した後、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫ
ｉｔ（宝酒造(株)）を用いてライゲーションを行い、こ
のＤＮＡをテンプレート、ＴＬ及びＴＲをプライマーと
してＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（パーキンエルマー）を用いてインバースＰＣＲを行っ
た。反応条件は、９５℃で３分間加熱後、９５℃で３０
秒間、６５℃で８分間のサイクルを３２回繰り返してか
ら、最後に７２℃で１２分間保温した。反応液をアガロ
ースゲル電気泳動したところ、約２.０ｋ塩基対のＤＮ
Ａ断片が検出されたので、アガロースゲルよりこのＤＮ
Ａ断片をＤＥ８１ペーパー（ワットマン）を用いて抽出
した。抽出したＤＮＡ断片は超音波処理によって０.５
から１.０ｋ塩基対の大きさに小断片化した後、ＲＴＧ
ｐＵＣ１８ SmaI／ＢＡＰ＋Ｌｉｇａｓｅ（ファルマ
シア）を用いてプラスミドベクターｐＵＣ１８のSmaI部
位に挿入した。そして、この組換えプラスミドをコンピ
テントセルＥ.ｃｏｌｉＪＭ１０９（宝酒造(株)）
を用いて大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた形質転
換大腸菌から組換えプラスミドを抽出し、このプラスミ
ドをテンプレート、オリゴヌクレオチドＦＰ及びＲＰを
プライマーとしてＰＣＲを行った。反応液から増幅した
ＤＮＡ断片を精製し、塩基配列決定用ＤＮＡを調製し
た。そして、このＤＮＡ断片をテンプレートとしてＰＲ
ＩＳＭＤｙｅＰｒｉｍｅｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ
（パーキンエルマー）を用いた蛍光ラベル反応を行い、
ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析して塩基配列を決定した。決
定した全ての塩基配列をコンピューターソフトＧＥＮＥ
ＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエアー開発(株)）を用いて解
析し、トレハロースホスホリラーゼをコードするＤＮＡ
の３’端を含む９１９塩基対とその下流に存在する３４
０塩基対の配列を決定した。９１９塩基対の配列と実施
例２ー２で決定した配列と合わせることによって耐熱性
トレハロースホスホリラーゼをコードするＤＮＡの配列
が決定できた。決定したトレハロースホスホリラーゼを
コードする塩基配列を配列表における配列番号３に示
す。また、終始コドンから下流にある３４０塩基対の配
列を配列表における配列番号４に示す。

【０１５４】［実施例２−４］組換えプラスミドｐＳ
ＴＰ１と形質転換大腸菌ＳＴＰ１の調製実施例２−３で決定した塩基配列より、トレハロースホ
スホリラーゼをコードするＤＮＡ配列の開始コドン上流
１３２塩基目からの配列5'-TTGAAAACAAATCAGTTCAA-3'で
表されるオリゴヌクレオチド５ＴＰ２と、終止コドン下
流の配列で配列表における配列番号４の塩基番号１６２
からの配列のアンチセンス配列5'-TCGTCGCGCTTCCACCGAT
T-3'で表されるオリゴヌクレオチド３ＴＰ２を化学合成
した。実施例２−１で調製した染色体ＤＮＡをテンプレ
ートとし、５ＴＰ２と３ＴＰ２をプライマーとしてＰＣ
Ｒを行い、３.３ｋ塩基対のＤＮＡ断片を得た。

【０１５５】この３.３ｋ塩基対のＤＮＡ断片を、Ｏｒ
ｉｇｉｎａｌＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Invitroge
n）を用いて、プラスミドベクターｐＣＲ２．１にライ
ゲーション後、大腸菌ＩＮＶαＦ’（endA1,recA1,hsdR
17(r^-k,m^+k),supE44,λ-,thi-1,gyrA,relA1,φ80 lacZ
△M15△(lacZYA-argF),deoR⁺,F'）株への導入を行い、
３.３ｋ塩基対のＤＮＡ断片が組み込まれた組換えプラ
スミドｐＳＴＰ１（図５）を有する形質転換大腸菌ＳＴ
Ｐ１を得た。

【０１５６】上記の形質転換大腸菌ＳＴＰ１をEscheric
hia coli STP1と命名し（受託番号：ＦＥＲＭＰ−１
６１６２）、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成
９年３月２７日に寄託した。

【０１５７】そして、形質転換大腸菌ＳＴＰ１を培養
し、培養液から組換えプラスミドｐＳＴＰ１を抽出し、
挿入した約３.３ｋ塩基対のＤＮＡ断片の５’側から２
６８６塩基までの配列の解析を行った。その塩基配列
を、配列表の配列番号１に示す。

【０１５８】この配列は、実施例２−３で決定した耐熱
性トレハロースホスホリラーゼのＤＮＡ配列の配列番号
３の塩基番号２５７〜２７９６と一致することが判明
し、組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼをコード
していることが確認できた。

【０１５９】

【実施例３】形質転換大腸菌ＳＴＰ１が生産する組換
え耐熱性トレハロースホスホリラーゼの酵素化学的特性［実施例３−１］組換え耐熱性トレハロースホスホリ
ラーゼの精製バクトトリプトン１.６％、酵母エキス１.０％、ＮａＣ
ｌ０.５％を含有する培地（ｐＨ７.０）１００ｍｌを５
００ｍｌ三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オー
トクレーブ殺菌した後、濾過滅菌した１０ｍｇ／ｍｌア
ンピシリン水溶液０.５ｍｌを添加したものに、実施例
２で得られた形質転換大腸菌ＳＴＰ１を１白金耳植菌
し、３７℃で１６時間回転振とう培養したものを種培養
液とした。

【０１６０】容量５ｌのファーメンターに種培養と同組
成の培地（ｐＨ７．０）約３ｌを入れて滅菌後、予め濾
過滅菌したアンピシリン水溶液を１００ｍｇ／ｌになる
ように添加し、温度を３５℃とした後、種培養液２Ｖ／
Ｖ％を接種して、３５℃、ｐＨ６．５〜７．５に保持し
ながら２４時間通気攪拌培養した。

【０１６１】培養終了後、培養液を連続的に超音波処理
して菌体の破壊を行った。これを遠心分離し菌体残渣を
除去した培養液上清を得た。この上清を限外濾過によっ
て約１００ｍｌまで濃縮した後、１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ６.０）を３ｌ加えて、再度１００ｍｌまで濃縮
し、粗酵素液を得た。粗酵素液のトレハロースホスホリ
ラーゼ活性は３,０００単位／ｍｌであった。

【０１６２】次に、この粗酵素液を実施例１−１と同様
にして精製を行い、ネイティブポリアクリルアミドゲル
電気泳動で単一タンパク質であることを確認した。

【０１６３】［実施例３−２］組換え耐熱性トレハロ
ースホスホリラーゼの酵素化学的特性実施例３−１の精製した組換え耐熱性トレハロースホス
ホリラーゼの酵素化学的特性は実施例１−２と同様にし
て調べた。以下に結果を示す。

【０１６４】（１）作用トレハロースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、
リン酸存在下でトレハロースに作用させると、等モルの
グルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グ
ルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると
等モルのトレハロースとリン酸を生成する。

【０１６５】（２）基質特異性トレハロース、ネオトレハロース、マルトース、イソマ
ルトース、セロビオース、シュークロース、ｐーニトロ
フェノール-α-グルコシド、ｐーニトロフェノール-β-
グルコシドを基質として加リン酸分解反応を行ったとこ
ろ、トレハロース以外にはグルコースの生成が認められ
なかった。

【０１６６】（３）至適温度４０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６.
０）中で各種温度（４０〜９０℃）で反応させたとこ
ろ、トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃
〜７５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約
５０％以上を示した。

【０１６７】（４）熱安定性１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６.
０）中にてインキュベートし、残存活性を測定したとこ
ろ、６５℃で１５分間処理で、無処理の９５％以上の活
性を示した。

【０１６８】（５）至適ｐＨ２５ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４.０
〜７．７）と２５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７.７
〜９.０）を用いて６０℃で反応を行ったところ、至適
ｐＨは６.５〜７.５であった。

【０１６９】（６）ｐＨ安定性１００ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ４.
０〜８.０）と１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７.
５〜９.０）を用いて６０℃で２４時間インキュベート
し、各ｐＨでの残存活性を測定したところ、ｐＨ６．０
〜８．０で安定であった。

【０１７０】（７）失活１００℃、１０分間の加熱で１００％失活した。

【０１７１】（８）分子量Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシアバイオテ
ク（株））を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによ
り、各種標準タンパク質との相対溶出容量から分子量を
求めた結果、本酵素の分子量は１１万〜１５万であっ
た。

【０１７２】（９）等電点等電点電気泳動により、各種標準タンパク質との相対移
動度から等電点は４.６〜５.２であった。

【０１７３】（１０）阻害剤１ｍＭのＨｇＣｌ₂で９９％、ＺｎＳＯ₄で８０％の活性
阻害が見られた。

【０１７４】（１１）Ｎ末端アミノ酸配列常法により、アプライド・バイオシステムズ製気相プロ
テインシーケンサー「４７７Ａ型」を使用して分析を行
ったところ、精製酵素はＮ末端に配列表における配列番
号２に示すアミノ酸配列を有していた。

【０１７５】この結果から、組換え耐熱性トレハロース
ホスホリラーゼは、耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
と同じ酵素化学的性質を有することが確認された。

【０１７６】

【実施例４】組換え耐熱性トレハロースホスホリラー
ゼを用いたトレハロースの製造［実施例４−１］耐熱性マルトースホスホリラーゼの
調製酵母エキス１％、ポリペプトン２％、マルトース１％を
含有する培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌバ
ッフル付きマイヤーフラスコに入れ、１２１℃、２０分
間オートクレーブ殺菌したものに、バチルスｓｐ.ＲＫ
−１（ＦＥＲＭＰ−１５０４４）を１白金耳植菌し、５
５℃にて１６時間振とう培養したものを種培養液とし
た。

【０１７７】容量５ｌのファーメンターに酵母エキス１
％、ポリペプトン２％、マルトース１％を含有する培地
（ｐＨ７．０）約３ｌを入れて滅菌し、温度を５５℃と
した後、種培養液２Ｖ／Ｖ％を接種し、５５℃、ｐＨ
６．０〜７．０に保持しながら４０時間通気攪拌培養し
た。

【０１７８】培養終了後、培養物を遠心分離により菌体
を分離し、上清に硫安を８０％飽和に溶解し、析出した
タンパク質を遠心分離によって集めた。これを１０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ６.０）に溶解後、同じ緩衝液に対し
て透析を行い、濃縮後約２００単位／ｍｌ粗酵素液を２
０ｍｌ得た。

【０１７９】［実施例４−２］マルトースからトレハ
ロースの生成反応実施例４−１で調製した耐熱性マルトースホスホリラー
ゼ粗酵素液と実施例３−１で調製した組換え型トレハロ
ースホスホリラーゼ粗酵素液を用いて、基質のマルトー
スに作用させトレハロースへ変換させた。

【０１８０】反応液はマルトース濃度３０Ｗ／Ｗ％、リ
ン酸濃度１０ｍＭ、粗酵素各１０単位／ｇとなるように
添加し、酢酸緩衝液でｐＨ５.０に調製した。反応は６
０℃で４８時間行った。反応の停止は１０分間１００℃
に加熱して行った。反応終了後、各反応液をＴＳＫｇｅ
ｌＡｍｉｄｏ８０カラム（東ソー（株））、溶離液ア
セトニトリル／水（７６／２４）、流速０.８ｍｌ／ｍ
ｉｎ、カラム温度８０℃、示差屈折計Ｓｈｏｄｅｘ（昭
和電工（株））を検出手段とする高速液体クロマトグラ
フィーにより反応液の糖組成を定量した。また、β−グ
ルコース−１−リン酸は反応液を陰イオン交換カラムを
用いた高速液体クロマトグラフィーにより定量した。

【０１８１】結果、基質マルトースの６５％がトレハロ
ースに変換された。

【０１８２】

【実施例５】トレハロース含有糖液、及びその粉末の
製造コーンスターチにα−アミラーゼを作用させた澱粉液化
液に枝切り酵素プロモザイム（ノボノルディクスバイオ
インダストリー）とβ−アミラーゼ（長瀬産業（株））
を作用させて調製したマルトース高含有糖液（固形分３
０Ｗ／Ｗ%、固形分当たりのマルトース純度８０％）
に、実施例４−１で調製した組換え型トレハロースホス
ホリラーゼ粗酵素液と実施例４−２で調製したバチルス
ｓｐ.ＲＫ−１（ＦＥＲＭＰ−１５０４４）の耐熱性
マルトースホスホリラーゼ粗酵素液をそれぞれ固形分１
ｇ当たり１０単位になるように加え、さらに、リン酸濃
度１０ｍＭになるようにリン酸カリウムを加えて、６０
℃、ｐＨ５．０で４８時間反応させ、次いで１００℃で
１０分間加熱して酵素を失活させた。

【０１８３】この反応液を活性炭で脱色し、イオン交換
樹脂で脱塩した後、濃度約７５％まで濃縮し、トレハロ
ース含有糖液を得た。この糖液を実施例４−３と同様に
高速液体クロマトグラフィーによって分析した結果、固
形分当たりの割合はグルコース２．８％、トレハロース
６３．２％、マルトース２０．５％、マルトトリオース
５．１％、その他マルトオリゴ糖８．４％であった。

【０１８４】また、前記反応液に固形分１ｇ当たり１単
位になるようにグルコアミラーゼ（生化学工業（株））
を加え、５５℃で８時間反応させ、次いで１００℃で１
０分間加熱して酵素を失活させた。この反応液を活性炭
で脱色し、イオン交換樹脂で脱塩した後、濃度約５０％
まで濃縮し、ナトリウム型イオン交換カラムで分離を行
い、トレハロース画分を分取した。この分取した糖液を
濃縮し、固形分７５％で固形分当たり９５％のトレハロ
ースを含有するトレハロース高含有糖液を得た。

【０１８５】さらに、このトレハロース高含有糖液を濃
縮後乾燥することにより粉末トレハロースを得た。

【０１８６】以上の結果から、組換え耐熱性トレハロー
スホスホリラーゼを利用して、トレハロースを製造する
ことが出来ることが確認された。

【０１８７】

【発明の効果】本発明は、本発明者らが見出した、好熱
性バチルス属細菌、特にバチルスステアロサーモフィラ
スＳＫ−１（ＦＥＲＭＰ−１４５６７）由来の耐熱性
トレハロースホスホリラーゼ遺伝子を基に、遺伝子工学
的手法により、組換え耐熱性トレハロースホスホリラー
ゼを得、これを用いて組換え微生物を作製したものであ
って、これを培養すれば、酵素の生産性が飛躍的に上昇
し、不純物の少ない、高純度組換え耐熱性トレハロース
ホスホリラーゼを効率よく製造できるＤＮＡを得た点で
極めて優れている。

【０１８８】また、このように、組換え耐熱性トレハロ
ースホスホリラーゼが工業的規模で大量に、効率よく生
産できるようになった結果、これを利用することによ
り、有用なトレハロースの製造が飛躍的に効率よく製造
することができる点においても、非常に価値がある。

【０１８９】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２６８６配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：バチルス・ステアロサーモフィラス株名：ＳＫ−１配列の特徴特徴を示す記号：５’ＵＴＲ存在位置：１．．２７８特徴を決定した方法：Ｅ特徴を示す記号：ＣＤＳ存在位置：２７９．．２５７３特徴を決定した方法：Ｅ特徴を示す記号：３’ＵＴＲ存在位置：２５７４．．２６８６特徴を決定した方法：Ｅ配列 TTCCGAAAGA TTTTACTGTA CCATATGATT GGATGGTAAA CTATACTCTT CTTTATCATT 60 CGAAAAAATG TAAGCCCATT CAAAATGATA GTTTGATGAC TCTAGTTTGT AAAAAATCAT 120 AAAGGAGTTC TTTTTTGGGC TCAAGGTTGA AAACAAATCA GTTCAATCAT ATGCTGCTAT 180 CGTTCTGACA CTTTTGATTG TGCTGATTTT CCAGATATAA ATCGTATCAG AATCAACATC 240 CGTCAGAGTA AAAGAATAAT GAAACAGGAG TGTCTTAC ATG TCT TGG TCA ATT AGC 296 Met Ser Trp Ser Ile Ser 1 5 TCC AAT CAG CTT AAT ATT GAA AAC TTG TTA AAT GAA GAA AGT CTC TTT 344 Ser Asn Gln Leu Asn Ile Glu Asn Leu Leu Asn Glu Glu Ser Leu Phe 10 15 20 TTC ACT GGT AAT GGG TAT ATT GGT GTA CGT GGA AAT TTC GAA GAA AAA 392 Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Ile Gly Val Arg Gly Asn Phe Glu Glu Lys 25 30 35 TAT TAT GAT GGT GCT TCG TCA ATT CGC GGT ACA TAT ATC AAT GCA TTC 440 Tyr Tyr Asp Gly Ala Ser Ser Ile Arg Gly Thr Tyr Ile Asn Ala Phe 40 45 50 CAC GAT ATA ACT GAT ATT AAC TAC GGT GAA AAA TTA TAT GCA TTC CCT 488 His Asp Ile Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Glu Lys Leu Tyr Ala Phe Pro 55 60 65 70 GAA ACG CAA CAG AAG TTA GTG AAT GTC ATT GAT GCG CAA ACT GTT CAA 536 Glu Thr Gln Gln Lys Leu Val Asn Val Ile Asp Ala Gln Thr Val Gln 75 80 85 ATA TAC TTT GGA GAA GAA GAA GAA AGG TTT TCG CTT TTT GAA GGA GAA 584 Ile Tyr Phe Gly Glu Glu Glu Glu Arg Phe Ser Leu Phe Glu Gly Glu 90 95 100 GTC ATT CAA TAT GAA CGG CAT CTC CAT ATG GAC AAA GGC TTT TCA GAA 632 Val Ile Gln Tyr Glu Arg His Leu His Met Asp Lys Gly Phe Ser Glu 105 110 115 CGT GTG ATT CAT TGG CGT TCT CCT GGA GGA AAA GAA GTC AAA CTC AAG 680 Arg Val Ile His Trp Arg Ser Pro Gly Gly Lys Glu Val Lys Leu Lys 120 125 130 TTT AAA AGG TTA ACT TCA TTC ATT TAT AAA GAA CTT TTC ATA CAG GAA 728 Phe Lys Arg Leu Thr Ser Phe Ile Tyr Lys Glu Leu Phe Ile Gln Glu 135 140 145 150 ATT ACA ATT GAA CCC GTT AAT TTT TTT GGG AAA ACG AAG GTG GTT TCC 776 Ile Thr Ile Glu Pro Val Asn Phe Phe Gly Lys Thr Lys Val Val Ser 155 160 165 ACA GTT AAC GGA GAT GTC TCA AAT TTT GTT GAT CCA AGT GAT CCA CGG 824 Thr Val Asn Gly Asp Val Ser Asn Phe Val Asp Pro Ser Asp Pro Arg 170 175 180 GTC GGT TCA GGA CAT GCG AAG CTC TTG ACA GTC TCG GAT ACG GTT ATT 872 Val Gly Ser Gly His Ala Lys Leu Leu Thr Val Ser Asp Thr Val Ile 185 190 195 GAA GGG GAT TTT GTT AGT ATA GAA ACA AAA ACG AAA CGG TCA AAT CTT 920 Glu Gly Asp Phe Val Ser Ile Glu Thr Lys Thr Lys Arg Ser Asn Leu 200 205 210 TAT GCC GCT TGT ACA TCA ACA TGC AGA CTA AAC ATT GAT TTT CAG CGA 968 Tyr Ala Ala Cys Thr Ser Thr Cys Arg Leu Asn Ile Asp Phe Gln Arg 215 220 225 230 GAA TAT GTT AAA AAT GAG AAG TCG GTT GAA ACT GTA CTC ACT TTT GAA 1016 Glu Tyr Val Lys Asn Glu Lys Ser Val Glu Thr Val Leu Thr Phe Glu 235 240 245 TTA ACA GAA AAA GCG ATC ATG ACT AAA ATA AAT ATA TAT ACA GAT ACG 1064 Leu Thr Glu Lys Ala Ile Met Thr Lys Ile Asn Ile Tyr Thr Asp Thr 250 255 260 CTT CGA CAT GGA GAT CGT CCA CTT CGG ACT GGT CTT GAT CTA TGT CAG 1112 Leu Arg His Gly Asp Arg Pro Leu Arg Thr Gly Leu Asp Leu Cys Gln 265 270 275 AAA TTA TCA TGT TTG ACG TTT AAT GAC CTT AAA GAA CAG CAA AAG CAC 1160 Lys Leu Ser Cys Leu Thr Phe Asn Asp Leu Lys Glu Gln Gln Lys His 280 285 290 TAT TTA GAT AAG TTT TGG CTT TAC GCA GAT GTA GAA ATA TCT GGA GAT 1208 Tyr Leu Asp Lys Phe Trp Leu Tyr Ala Asp Val Glu Ile Ser Gly Asp 295 300 305 310 CAG GCG CTC CAA GAA GGG ATA CGC TTT AAC TTA TTT CAT TTG CTA CAA 1256 Gln Ala Leu Gln Glu Gly Ile Arg Phe Asn Leu Phe His Leu Leu Gln 315 320 325 TCA GCA GGG CGC GAT CGT TTT TCA AAT ATA GCT GCA AAA GGT TTG TCA 1304 Ser Ala Gly Arg Asp Arg Phe Ser Asn Ile Ala Ala Lys Gly Leu Ser 330 335 340 GGC GAA GGG TAT GAA GGG CAT TAT TTT TGG GAT ACC GAA ATA TAT ATG 1352 Gly Glu Gly Tyr Glu Gly His Tyr Phe Trp Asp Thr Glu Ile Tyr Met 345 350 355 GTG CCA GTT TTC TTG ATG ACG AAT CCT GAG TTA GCA AAG CAA TTG CTC 1400 Val Pro Val Phe Leu Met Thr Asn Pro Glu Leu Ala Lys Gln Leu Leu 360 365 370 ATT TAT CGA TAT TCA ATC CTA GAT AAA GCA CGT GAA AGA GCA AGG GAA 1448 Ile Tyr Arg Tyr Ser Ile Leu Asp Lys Ala Arg Glu Arg Ala Arg Glu 375 380 385 390 ATG GGC CAT AGA AAA GGC GCT TTA TTT CCA TGG CGA ACA ATA TCA GGA 1496 Met Gly His Arg Lys Gly Ala Leu Phe Pro Trp Arg Thr Ile Ser Gly 395 400 405 GGA GAA TGT TCT TCT TAT TTT CCA GCT GGA ACA GCT CAG TAC CAT ATT 1544 Gly Glu Cys Ser Ser Tyr Phe Pro Ala Gly Thr Ala Gln Tyr His Ile 410 415 420 AGT GCA GAT ATC GCT TAT AGT TAC GTT CAA TAT TAC TTA GTT ACG AAA 1592 Ser Ala Asp Ile Ala Tyr Ser Tyr Val Gln Tyr Tyr Leu Val Thr Lys 425 430 435 GAT TTG GAT TTC CTA AAA TCT TAT GGA GCT GAA CTG TTA ATT GAA ACA 1640 Asp Leu Asp Phe Leu Lys Ser Tyr Gly Ala Glu Leu Leu Ile Glu Thr 440 445 450 GCT CGT CTC TGG ATG GAT ACC GGA CAT TAT CAT GAA GGA AAA TTT AAA 1688 Ala Arg Leu Trp Met Asp Thr Gly His Tyr His Glu Gly Lys Phe Lys 455 460 465 470 ATT GAT GCT GTA ACG GGG CCT GAC GAG TAT ACG TGT ATT GTG AAC AAT 1736 Ile Asp Ala Val Thr Gly Pro Asp Glu Tyr Thr Cys Ile Val Asn Asn 475 480 485 AAC TAT TAC ACG AAC GTG ATG GCA AAG CAC AAT TTG CGC TGG GCA GCC 1784 Asn Tyr Tyr Thr Asn Val Met Ala Lys His Asn Leu Arg Trp Ala Ala 490 495 500 AAA AGT GTC GCT GAA TTA GAA AAA CAT GCA CCT GAT ACA TTA GCA TCA 1832 Lys Ser Val Ala Glu Leu Glu Lys His Ala Pro Asp Thr Leu Ala Ser 505 510 515 TTA AAA GCA AAG CTT GAA ATT ACT GAC GAG GAA ATA GCA GAA TGG ATA 1880 Leu Lys Ala Lys Leu Glu Ile Thr Asp Glu Glu Ile Ala Glu Trp Ile 520 525 530 AAA GCA GCT GAA GCT ATG TAT TTG CCT TAT GAT CCA ACA CTT AAT ATT 1928 Lys Ala Ala Glu Ala Met Tyr Leu Pro Tyr Asp Pro Thr Leu Asn Ile 535 540 545 550 AAC CCG CAG GAT GAC ACA TTT TTG CAG AAA CAA GTT TGG GAT TTC GAT 1976 Asn Pro Gln Asp Asp Thr Phe Leu Gln Lys Gln Val Trp Asp Phe Asp 555 560 565 AAT ACG CCG AAA GAA CAT TAC CCG CTT CTC TTG CAT TAT CAT CCG TTG 2024 Asn Thr Pro Lys Glu His Tyr Pro Leu Leu Leu His Tyr His Pro Leu 570 575 580 ACT TTA TAT CGC TAC CAA GTA TGT AAG CAG GCC GAT ACA GTA CTG GCT 2072 Thr Leu Tyr Arg Tyr Gln Val Cys Lys Gln Ala Asp Thr Val Leu Ala 585 590 595 CAT TTT TTA TTA GAG GAT GAA CAA GAT GGA TCT GTG ATT CGA GAT TCT 2120 His Phe Leu Leu Glu Asp Glu Gln Asp Gly Ser Val Ile Arg Asp Ser 600 605 610 TAT CAT TAT TAT GAA AAA ATC ACT ACT CAC GAT TCT TCC CTA TCT TCA 2168 Tyr His Tyr Tyr Glu Lys Ile Thr Thr His Asp Ser Ser Leu Ser Ser 615 620 625 630 TGT GTG TTT AGT ATT ATG GCT GCA AAA ATT GGC GAA TTA GAC AAG GCT 2216 Cys Val Phe Ser Ile Met Ala Ala Lys Ile Gly Glu Leu Asp Lys Ala 635 640 645 TAT GAA TAT TTT ATT GAA ACA GCT CGT TTA GAT TTA GAT AAT ACA CAT 2264 Tyr Glu Tyr Phe Ile Glu Thr Ala Arg Leu Asp Leu Asp Asn Thr His 650 655 660 GGT AAT ACG AAA GAC GGT CTC CAT ATG GCG AAT ATG GGA GGA ACG TGG 2312 Gly Asn Thr Lys Asp Gly Leu His Met Ala Asn Met Gly Gly Thr Trp 665 670 675 ATG GCG ATT GTT TAT GGA TTT GCT GGC CTT CGG ATC AAA GAA AGC GGG 2360 Met Ala Ile Val Tyr Gly Phe Ala Gly Leu Arg Ile Lys Glu Ser Gly 680 685 690 TTG TCA TTA GCG CCA GTG ATT CCA AAA CAA TGG CAG TCA TAT AGA TTT 2408 Leu Ser Leu Ala Pro Val Ile Pro Lys Gln Trp Gln Ser Tyr Arg Phe 695 700 705 710 TCG ATT CAA TAT TTA GGT AGA CAC ATT TCA GTC TCC GTT GAT ACA AAA 2456 Ser Ile Gln Tyr Leu Gly Arg His Ile Ser Val Ser Val Asp Thr Lys 715 720 725 GGG ACG AAA GTG AAT CTT TTG AAT GGA GAG GAA CTA ACT ATC AAA CTT 2504 Gly Thr Lys Val Asn Leu Leu Asn Gly Glu Glu Leu Thr Ile Lys Leu 730 735 740 TAT GGT AAA AAG CAT CAA TTA ACA AAA GAT GAA CCT CTT GAA ATA ACA 2552 Tyr Gly Lys Lys His Gln Leu Thr Lys Asp Glu Pro Leu Glu Ile Thr 745 750 755 TTT AAT AAC GGG CGT GTT GAT TAACCAATAA AAACCAGTTA CCATTGGCCT 2603 Phe Asn Asn Gly Arg Val Asp 760 765 ATTCATGGCT TTTCTGCCGA AGTCGGAAAA GCTTGGTCTT TAACTGGCTA TATAGACTTA 2663 TTGCCATGCT ACTACGTCTT TAT 2686 配列番号２配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：Ｎ末端フラグメント配列 Ser Trp Ser Ile Ser Ser Asn Gln Leu Asn Ile Glu Asn Leu Leu Asn 1 5 10 15 Glu Glu Ser Leu 20 配列番号３配列の長さ：２７９６配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：バチルス・ステアロサーモフィラス株名：ＳＫ−１配列 CAATTAGATA ATTGAAAATC AGAGGAGATG CAAGGGGATT CCTTTCTTGA TGGAAATCGG 60 TGAGAATCGG AGCGGCAAGC AGTTTTGCCC GTTCCATCGC GATGTGTCCA TTCCGAAAGA 120 TTTTACTGTA CCATATGATT GGATGGTAAA CTATACTCTT CTTTATCATT CGAAAAAATG 180 TAAGCCCATT CAAAATGATA GTTTGATGAC TCTAGTTTGT AAAAAATCAT AAAGGAGTTC 240 TTTTTTGGGC TCAAGGTTGA AAACAAATCA GTTCAATCAT ATGCTGCTAT CGTTCTGACA 300 CTTTTGATTG TGCTGATTTT CCAGATATAA ATCGTATCAG AATCAACATC CGTCAGAGTA 360 AAAGAATAAT GAAACAGGAG TGTCTTACAT GTCTTGGTCA ATTAGCTCCA ATCAGCTTAA 420 TATTGAAAAC TTGTTAAATG AAGAAAGTCT CTTTTTCACT GGTAATGGGT ATATTGGTGT 480 ACGTGGAAAT TTCGAAGAAA AATATTATGA TGGTGCTTCG TCAATTCGCG GTACATATAT 540 CAATGCATTC CACGATATAA CTGATATTAA CTACGGTGAA AAATTATATG CATTCCCTGA 600 AACGCAACAG AAGTTAGTGA ATGTCATTGA TGCGCAAACT GTTCAAATAT ACTTTGGAGA 660 AGAAGAAGAA AGGTTTTCGC TTTTTGAAGG AGAAGTCATT CAATATGAAC GGCATCTCCA 720 TATGGACAAA GGCTTTTCAG AACGTGTGAT TCATTGGCGT TCTCCTGGAG GAAAAGAAGT 780 CAAACTCAAG TTTAAAAGGT TAACTTCATT CATTTATAAA GAACTTTTCA TACAGGAAAT 840 TACAATTGAA CCCGTTAATT TTTTTGGGAA AACGAAGGTG GTTTCCACAG TTAACGGAGA 900 TGTCTCAAAT TTTGTTGATC CAAGTGATCC ACGGGTCGGT TCAGGACATG CGAAGCTCTT 960 GACAGTCTCG GATACGGTTA TTGAAGGGGA TTTTGTTAGT ATAGAAACAA AAACGAAACG 1020 GTCAAATCTT TATGCCGCTT GTACATCAAC ATGCAGACTA AACATTGATT TTCAGCGAGA 1080 ATATGTTAAA AATGAGAAGT CGGTTGAAAC TGTACTCACT TTTGAATTAA CAGAAAAAGC 1140 GATCATGACT AAAATAAATA TATATACAGA TACGCTTCGA CATGGAGATC GTCCACTTCG 1200 GACTGGTCTT GATCTATGTC AGAAATTATC ATGTTTGACG TTTAATGACC TTAAAGAACA 1260 GCAAAAGCAC TATTTAGATA AGTTTTGGCT TTACGCAGAT GTAGAAATAT CTGGAGATCA 1320 GGCGCTCCAA GAAGGGATAC GCTTTAACTT ATTTCATTTG CTACAATCAG CAGGGCGCGA 1380 TCGTTTTTCA AATATAGCTG CAAAAGGTTT GTCAGGCGAA GGGTATGAAG GGCATTATTT 1440 TTGGGATACC GAAATATATA TGGTGCCAGT TTTCTTGATG ACGAATCCTG AGTTAGCAAA 1500 GCAATTGCTC ATTTATCGAT ATTCAATCCT AGATAAAGCA CGTGAAAGAG CAAGGGAAAT 1560 GGGCCATAGA AAAGGCGCTT TATTTCCATG GCGAACAATA TCAGGAGGAG AATGTTCTTC 1620 TTATTTTCCA GCTGGAACAG CTCAGTACCA TATTAGTGCA GATATCGCTT ATAGTTACGT 1680 TCAATATTAC TTAGTTACGA AAGATTTGGA TTTCCTAAAA TCTTATGGAG CTGAACTGTT 1740 AATTGAAACA GCTCGTCTCT GGATGGATAC CGGACATTAT CATGAAGGAA AATTTAAAAT 1800 TGATGCTGTA ACGGGGCCTG ACGAGTATAC GTGTATTGTG AACAATAACT ATTACACGAA 1860 CGTGATGGCA AAGCACAATT TGCGCTGGGC AGCCAAAAGT GTCGCTGAAT TAGAAAAACA 1920 TGCACCTGAT ACATTAGCAT CATTAAAAGC AAAGCTTGAA ATTACTGACG AGGAAATAGC 1980 AGAATGGATA AAAGCAGCTG AAGCTATGTA TTTGCCTTAT GATCCAACAC TTAATATTAA 2040 CCCGCAGGAT GACACATTTT TGCAGAAACA AGTTTGGGAT TTCGATAATA CGCCGAAAGA 2100 ACATTACCCG CTTCTCTTGC ATTATCATCC GTTGACTTTA TATCGCTACC AAGTATGTAA 2160 GCAGGCCGAT ACAGTACTGG CTCATTTTTT ATTAGAGGAT GAACAAGATG GATCTGTGAT 2220 TCGAGATTCT TATCATTATT ATGAAAAAAT CACTACTCAC GATTCTTCCC TATCTTCATG 2280 TGTGTTTAGT ATTATGGCTG CAAAAATTGG CGAATTAGAC AAGGCTTATG AATATTTTAT 2340 TGAAACAGCT CGTTTAGATT TAGATAATAC ACATGGTAAT ACGAAAGACG GTCTCCATAT 2400 GGCGAATATG GGAGGAACGT GGATGGCGAT TGTTTATGGA TTTGCTGGCC TTCGGATCAA 2460 AGAAAGCGGG TTGTCATTAG CGCCAGTGAT TCCAAAACAA TGGCAGTCAT ATAGATTTTC 2520 GATTCAATAT TTAGGTAGAC ACATTTCAGT CTCCGTTGAT ACAAAAGGGA CGAAAGTGAA 2580 TCTTTTGAAT GGAGAGGAAC TAACTATCAA ACTTTATGGT AAAAAGCATC AATTAACAAA 2640 AGATGAACCT CTTGAAATAA CATTTAATAA CGGGCGTGTT GATTAACCAA TAAAAACCAG 2700 TTACCATTGG CCTATTCATG GCTTTTCTGC CGAAGTCGGA AAAGCTTGGT CTTTAACTGG 2760 CTATATAGAC TTATTGCCAT GCTACTACGT CTTTAT 2796 配列番号４配列の長さ：３４０配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：バチルス・ステアロサーモフィラス株名：ＳＫ−１配列 TTGCTTGGTG GAGGAAAAAC GGCTGTCATC GAAATGGCCG CTGCCTCAGG ACTACATCTT 60 GTTCCGAAAG AAAAACGAAA TCCACTGATC ACCACAACGA GAGGAACAGG GGAATTGATT 120 CGAGCGGCTC TTGATGTGGG AGTCGAGCAT ATTATTATCG GAATCGGTGG AAGCGCGACG 180 AACGATGGTG GAGCGGGAAT GGTTCAAGCG CTAGGCGGCC GACTTCTTGA TCGACATGGG 240 AATGAGATTG CGTATGGCGG TGGAAGTTTA TCACAATTAG CAACGATTGA TCTTTCCTAT 300 TTAGACCCGA GGTTAAAGAA CGTAAAAATC GAAGTCGCTT 340

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼの
至適温度

【図２】本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼの
熱安定性

【図３】本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼの
至適ｐＨ

【図４】本発明の耐熱性トレハロースホスホリラーゼの
ｐＨ安定性

【図５】本発明のプラスミドベクターｐＳＴＰ１構造

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 19/12 Ｃ１２Ｐ 19/12 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者大島良恵千葉県船橋市日の出２−20−２昭和産業株式会社総合研究所内 (72)発明者山根國男茨城県土浦市常名4016−44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからな
る遺伝子。（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の内、塩基
番号２７９から２５７３で表される塩基配列からなるＤ
ＮＡ。（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ下記の酵素化学的
性質を有する組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼ
をコードするＤＮＡ。（１）作用トレハロースを可逆的に加リン酸分解する。すなわち、
リン酸存在下でトレハロースに作用させると、等モルの
グルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成し、グ
ルコースとβ−グルコース−１−リン酸に作用させると
等モルのトレハロースとリン酸を生成する。（２）基質特異性トレハロースに特異的に作用する。（３）至適温度トレハロース加リン酸分解反応の至適温度は７０℃〜７
５℃付近で、６０℃〜７５℃の範囲で最高活性の約５０
％以上を示す。（４）熱安定性１０ｍＭリン酸カリウム・クエン酸緩衝液（ｐＨ６.
０）中で、６５℃、１５分間処理後に無処理の９５％以
上の活性を有する。（５）至適ｐＨ６.５〜７.５。（６）ｐＨ安定性ｐＨ６．０〜８.０で安定。（７）失活１００℃、１０分間の加熱で１００％失活する。（８）分子量ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した値は１１万
〜１５万。（９）等電点４.６〜５.２。（１０）阻害剤ＨｇＣｌ₂、ＺｎＳＯ₄で著しく活性が阻害される。
【請求項２】配列表の配列番号１に記載の塩基配列の
内、塩基番号２７９〜２５７３で表される塩基配列から
なるＤＮＡが好熱性バチルス属細菌由来のものである請
求項１記載の遺伝子。
【請求項３】好熱性バチルス属細菌由来のものがバチ
ルス・ステアロサーモフィラスＳＫ−１（ＦＥＲＭＰ
−１４５６７）である請求項１又は請求項２に記載の遺
伝子。
【請求項４】請求項１、２又は３に記載の遺伝子を含
む組換えベクター。
【請求項５】遺伝子がバチルス・ステアロサーモフィ
ラスＳＫ−１（ＦＥＲＭＰ−１４５６７）の染色体由
来の３.３ｋ塩基対のＤＮＡ断片である請求項４記載の
組換えベクター。
【請求項６】遺伝子がバチルス・ステアロサーモフィ
ラスＳＫ−１（ＦＥＲＭＰ−１４５６７）の耐熱性ト
レハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子部分であ
る２２９５塩基対のＤＮＡ断片である請求項４記載の組
換えベクター。
【請求項７】ベクターがプラスミドベクターｐＳＴＰ
１由来のものである請求項４、５又は６記載の組換えベ
クター。
【請求項８】請求項４、５、６又は７に記載の組換え
ベクターを含む形質転換体。
【請求項９】形質転換体が大腸菌である請求項８記載
の形質転換体。
【請求項１０】請求項８又は請求項９に記載の組換え
形質転換体を培養して、組換え耐熱性トレハロースホス
ホリラーゼを製造する方法。
【請求項１１】請求項１０に記載の組換え耐熱性トレ
ハロースホスホリラーゼ及び耐熱性マルトースホスホリ
ラーゼの存在下に、マルトースとリン酸もしくはリン酸
塩とを、水性媒体中で、反応させることを特徴とするト
レハロース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造方
法。
【請求項１２】請求項１１の反応が５５〜７０℃、ｐ
Ｈ４．５〜８．０で行われる請求項１１記載のトレハロ
ース又はβ−グルコース−１−リン酸の製造方法。