JP2838798B2 - イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途 - Google Patents
イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、イソアミラーゼ活性を有するポリペプチド
とそのポリペプチドとβ−アミラーゼとを用いて澱粉質
を加水分解し、マルトース高含有物を製造する方法に関
する。
とそのポリペプチドとβ−アミラーゼとを用いて澱粉質
を加水分解し、マルトース高含有物を製造する方法に関
する。
＜従来の技術＞ 澱粉やグリコーゲンのα−1.6グルコシド結合を加水
分解する酵素、すなわち、イソアミラーゼ（EC 3.2.1.
68）は、例えば、アプライド マイクロバイオロジー
（Applied Microbiology）、第16巻、第1439乃至1444頁
（1968年）および同誌第28巻、第336乃至339頁（1974
年）などにも記載されているように、シュードモナス
アミロデラモーサ（Pseudomonas amyloderamosa）から
産生され、エフイービーエス レターズ（FEBS Letter
s）、第57巻、第１乃至４頁（1975年）などに記載され
ているように、サイトファーガ（Cytophaga）属に属す
る一菌株から産生され、また、スターチ シュテルケ
（Starch/Strke）、第32巻、第132乃至136頁（1980
年）などに記載されているように、フラボバクテリウム
（Flavobacterium）属に属する一菌株から産生され、更
に、アプライド アンド エンバイアロメンタル マイ
クロバイオロジー（Applied and Enviromental Microbi
ology）、第44巻、第1253乃至1257頁（1982年）などに
記載されているようにリポマイセス コノネンコエ（Li
pomyces Kononenkoae）から産生されることが知られて
いる。
分解する酵素、すなわち、イソアミラーゼ（EC 3.2.1.
68）は、例えば、アプライド マイクロバイオロジー
（Applied Microbiology）、第16巻、第1439乃至1444頁
（1968年）および同誌第28巻、第336乃至339頁（1974
年）などにも記載されているように、シュードモナス
アミロデラモーサ（Pseudomonas amyloderamosa）から
産生され、エフイービーエス レターズ（FEBS Letter
s）、第57巻、第１乃至４頁（1975年）などに記載され
ているように、サイトファーガ（Cytophaga）属に属す
る一菌株から産生され、また、スターチ シュテルケ
（Starch/Strke）、第32巻、第132乃至136頁（1980
年）などに記載されているように、フラボバクテリウム
（Flavobacterium）属に属する一菌株から産生され、更
に、アプライド アンド エンバイアロメンタル マイ
クロバイオロジー（Applied and Enviromental Microbi
ology）、第44巻、第1253乃至1257頁（1982年）などに
記載されているようにリポマイセス コノネンコエ（Li
pomyces Kononenkoae）から産生されることが知られて
いる。
しかしながら、これらの記載から明らかなように、イ
ソアミラーゼは、一部の酵素的性質しか知られておら
ず、工業上、安定して供給し、安心して利用する上には
なお不充分であり、より解明されたイソアミラーゼの確
立が望まれている。
ソアミラーゼは、一部の酵素的性質しか知られておら
ず、工業上、安定して供給し、安心して利用する上には
なお不充分であり、より解明されたイソアミラーゼの確
立が望まれている。
＜発明が解決しようとする課題＞ 本発明者等は、より詳細に説明されたイソアミラー
ゼ、とりわけ、アミノ酸配列まで解明されたイソアミラ
ーゼ活性を有するポリペプチド（以下、本明細書では、
単に、ポリペプチドと略称する。）と、その用途につい
て鋭意研究した。
ゼ、とりわけ、アミノ酸配列まで解明されたイソアミラ
ーゼ活性を有するポリペプチド（以下、本明細書では、
単に、ポリペプチドと略称する。）と、その用途につい
て鋭意研究した。
その結果、ポリペプチドは、部分アミノ酸配列とし
て、 から選ばれる１種または２種の配列を有していることが
判明し、更に詳細には、前記の部分配列がＮ末端側から
近い順に、（ａ）および（ｂ）の部分配列を有している
ことが判明した。
て、 から選ばれる１種または２種の配列を有していることが
判明し、更に詳細には、前記の部分配列がＮ末端側から
近い順に、（ａ）および（ｂ）の部分配列を有している
ことが判明した。
そして、その特徴的性質としては、澱粉やグリコーゲ
ンに作用して、それらのα−1.6グリコシド結合を加水
分解する作用を有する。
ンに作用して、それらのα−1.6グリコシド結合を加水
分解する作用を有する。
以下、本発明の内容を詳述し、併せて、本発明の効果
を説明する。
を説明する。
本明細書の記載において、アミノ酸、ペプチド、その
他に関し、略号で表記する場合、それらは当該分野にお
ける慣用略号に基づくものである。それらの例を以下に
列記する。アミノ酸に関し、光学異性体があり得る場合
には、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
他に関し、略号で表記する場合、それらは当該分野にお
ける慣用略号に基づくものである。それらの例を以下に
列記する。アミノ酸に関し、光学異性体があり得る場合
には、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
DNA :デオキシリボ核酸 RNA :リボ核酸 Ａ :アデニン Ｔ :チミン Ｇ :グアニン Ｃ :シトシン d NTP:デオキシヌクレオチド三リン酸 ddNTP:ジデオキシヌクレオチド三リン酸 d CTP:デオキシシチジン三リン酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム Ala :アラニン Arg :アルギニン Asn :アスパラギン Asp :アスパラギン酸 Cys :システイン Gln :グルタミン Glu :グルタミン酸 Gly :グリシン His :ヒスチジン Ile :イソロイシン Leu :ロイシン Lys :リジン Met :メチオニン Phe :フェニルアラニン Pro :プロリン Ser :セリン Thr :スレオニン Trp :トリプトファン Tyr :チロシン Val :バリン 本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、イ
ソアミラーゼ産生菌からポリペプチド遺伝子をクローニ
ングした後、その塩基配列を解読して決定した。
ソアミラーゼ産生菌からポリペプチド遺伝子をクローニ
ングした後、その塩基配列を解読して決定した。
一方、ポリペプチドのＮ末端を含有する部分のアミノ
酸配列は、ポリペプチドを高純度に精製した後、気相プ
ロテイン シークエンサーを用いて調べた。
酸配列は、ポリペプチドを高純度に精製した後、気相プ
ロテイン シークエンサーを用いて調べた。
ポリペプチド遺伝子のクローニング ポリペプチド産生能を有する供与体微生物より、その
微生物のDNAを分離精製した後、例えば、超音波、制限
酵素などで切断し、得られたDNA断片と、同様にしてベ
クターを切断して得られたベクター断片とを、例えば、
DNAリガーゼなどにより結合させ、ポリペプチド遺伝子
を含む組換えDNAを形成する。
微生物のDNAを分離精製した後、例えば、超音波、制限
酵素などで切断し、得られたDNA断片と、同様にしてベ
クターを切断して得られたベクター断片とを、例えば、
DNAリガーゼなどにより結合させ、ポリペプチド遺伝子
を含む組換えDNAを形成する。
この際、供与体微生物としては、ポリペプチド産生能
を有する微生物、例えば、米国特許第3,560,345号明細
書に記載されているシュードモナス アミロデラモーサ
（Pseudomonas amyloderamosa）ATCC 21262、または、
これらの変異株などが有利に用いられる。
を有する微生物、例えば、米国特許第3,560,345号明細
書に記載されているシュードモナス アミロデラモーサ
（Pseudomonas amyloderamosa）ATCC 21262、または、
これらの変異株などが有利に用いられる。
供与体微生物由来のDNAは、供与体微生物を、例え
ば、液体培地で約１〜３日間通気撹拌培養し、得られる
培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させる
ことによって調製することができる。溶菌方法は、例え
ば、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵
素による処理や超音波処理などが用いられる。また、必
要によりプロテアーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸
ナトリウムなどの界面活性剤を併用することも、更に凍
結融解処理を施すことも自由である。
ば、液体培地で約１〜３日間通気撹拌培養し、得られる
培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させる
ことによって調製することができる。溶菌方法は、例え
ば、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵
素による処理や超音波処理などが用いられる。また、必
要によりプロテアーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸
ナトリウムなどの界面活性剤を併用することも、更に凍
結融解処理を施すことも自由である。
このようにして得られる溶菌物からDNAを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出、除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合せるこ
とによって行うことができる。
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出、除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合せるこ
とによって行うことができる。
DNAを切断する方法は、例えば、超音波処理、制限酵
素処理などにより行うことができるが、得られるDNA断
片とベクター断片との結合を容易にするためには、制限
酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する。例え
ば、Sau3A Ｉ、EcoR Ｉ、Hind III、BamH Ｉ、Sal
Ｉ、Xma Ｉ、Xba Ｉ、Sac Ｉ、Pst ＩなどのII型
制限酵素が適している。
素処理などにより行うことができるが、得られるDNA断
片とベクター断片との結合を容易にするためには、制限
酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する。例え
ば、Sau3A Ｉ、EcoR Ｉ、Hind III、BamH Ｉ、Sal
Ｉ、Xma Ｉ、Xba Ｉ、Sac Ｉ、Pst ＩなどのII型
制限酵素が適している。
ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖しうる
ファージ又はプラスミドが適している。
ファージ又はプラスミドが適している。
ファージとしては、例えば、エッシェリヒア コリ
（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、λ
gt・λｃ、λgt・λＢなどが、バチルス ズブチルス
（Bacillus subtilis）を宿主微生物とする場合には、
ρ11、φ１、φ105などが使用できる。
（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、λ
gt・λｃ、λgt・λＢなどが、バチルス ズブチルス
（Bacillus subtilis）を宿主微生物とする場合には、
ρ11、φ１、φ105などが使用できる。
また、プラスミドとしては、例えば、エッシェリヒア
コリを宿主微生物とする場合には、pBR322、pUC18な
どが、バチルス ズブチリスを宿主微生物とする場合に
は、pUB110、pTZ4（pTP4）、pC194などが使用でき、更
に、例えば、エッシェリヒア コリ、バチルス ズブチ
リスなどの二種以上の宿主微生物で自律的増殖の可能
な、例えば、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7などのベクター
を利用することも可能である。このようなベクターを、
先に述べたDNAと同様に制限酵素などで切断し、ベクタ
ー断片を得る。
コリを宿主微生物とする場合には、pBR322、pUC18な
どが、バチルス ズブチリスを宿主微生物とする場合に
は、pUB110、pTZ4（pTP4）、pC194などが使用でき、更
に、例えば、エッシェリヒア コリ、バチルス ズブチ
リスなどの二種以上の宿主微生物で自律的増殖の可能
な、例えば、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7などのベクター
を利用することも可能である。このようなベクターを、
先に述べたDNAと同様に制限酵素などで切断し、ベクタ
ー断片を得る。
DNA断片とベクター断片とを結合させる方法は、公知
のDNAリガーゼを用いる方法であればよく、例えば、DNA
断片とベクター断片とをアニーリングの後、生体外で適
当なDNAリガーゼの作用により組み換えDNAを作成する。
必要ならば、アニーリングの後、宿主微生物に導入し
て、生体内のDNAリガーゼを利用して組み換えDNAにする
こともできる。
のDNAリガーゼを用いる方法であればよく、例えば、DNA
断片とベクター断片とをアニーリングの後、生体外で適
当なDNAリガーゼの作用により組み換えDNAを作成する。
必要ならば、アニーリングの後、宿主微生物に導入し
て、生体内のDNAリガーゼを利用して組み換えDNAにする
こともできる。
宿主微生物としては、組み換えDNAが安定かつ自律的
増殖が可能なものであればよい。
増殖が可能なものであればよい。
宿主微生物に組み換えDNAを導入する方法は、公知の
方法、例えば、宿主微生物がエッシェリヒア属に属する
微生物の場合にはカルシウムイオン存在下で行ない、バ
チルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル法
又はプロトプラスト法などを採用することができる。
方法、例えば、宿主微生物がエッシェリヒア属に属する
微生物の場合にはカルシウムイオン存在下で行ない、バ
チルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル法
又はプロトプラスト法などを採用することができる。
組み換えDNAが導入され形質転換された形質転換微生
物の選択方法は、32Pでラベルしたオリゴヌレオチドを
用いてのコロニーハイブイダイゼーション法、または澱
粉を含む平板培地上で生育し、かつ、澱粉からアミロー
スを生成するものを選択する方法などを用いればよい。
物の選択方法は、32Pでラベルしたオリゴヌレオチドを
用いてのコロニーハイブイダイゼーション法、または澱
粉を含む平板培地上で生育し、かつ、澱粉からアミロー
スを生成するものを選択する方法などを用いればよい。
ポリペプチド遺伝子を含む組み換えDNAを制限酵素な
どにより切断してポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と
し、これと同様にプラスミドなどのベクターを切断して
得られるベクター断片とを結合させることも容易に実施
できることが判明した。
どにより切断してポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と
し、これと同様にプラスミドなどのベクターを切断して
得られるベクター断片とを結合させることも容易に実施
できることが判明した。
ポリペプチド遺伝子の塩基配列 ポリペプチドの遺伝子塩基配列は、ジーン（Gene）、
第19巻、第259乃至268頁（1982年）に示されているジデ
オキシチェーンターミネーター法で解読すればよい。
第19巻、第259乃至268頁（1982年）に示されているジデ
オキシチェーンターミネーター法で解読すればよい。
この方法は、クローニングにより得られたポリペプチ
ド遺伝子を含むDNA断片を、プラスミドpUC18などのプラ
スミドに制限酵素を利用して、そのクローニング部位に
挿入する。得られた組み換えプラスミドは、形質転換に
よってエッシェリヒア コリ JM83などに移入し、次い
で組み換えプラスミドを有する微生物を選択する。
ド遺伝子を含むDNA断片を、プラスミドpUC18などのプラ
スミドに制限酵素を利用して、そのクローニング部位に
挿入する。得られた組み換えプラスミドは、形質転換に
よってエッシェリヒア コリ JM83などに移入し、次い
で組み換えプラスミドを有する微生物を選択する。
この微生物を増殖させたものを用いて組み換えプラス
ミドを調製する。
ミドを調製する。
得られた組み換えプラスミドを合成プライマーとアニ
ーリングし、これにクレノウ（Klenow）断片を働かせて
プライマーを伸長させ相補DNAを生成させる。
ーリングし、これにクレノウ（Klenow）断片を働かせて
プライマーを伸長させ相補DNAを生成させる。
この反応物をポリアクリルアミドゲル電気泳動、次い
で、ラジオオートグラフィー法を行った後、ポリペプチ
ド遺伝子の塩基配列を決定する。
で、ラジオオートグラフィー法を行った後、ポリペプチ
ド遺伝子の塩基配列を決定する。
また、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペ
プチド遺伝子の塩基配列も、同様にして決定する。
プチド遺伝子の塩基配列も、同様にして決定する。
ポリペプチドのアミノ酸配列 ポリペプチドのアミノ酸配列は、塩基配列より決定す
る。
る。
また、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペ
プチドのアミノ酸配列も、同様にして決定する。
プチドのアミノ酸配列も、同様にして決定する。
ポリペプチドのＮ末端を含有する部分アミノ酸配列 ポリペプチド産生能を有するシュードモナス アミロ
デラモーサを栄養培地で培養してポリペプチドを産生さ
せる。培養終了後、遠心分離して上清を採取し、これを
硫安分画、イオン交換クロマドクラフィー、高速液体ク
ロマトグラフィーにより精製し高純度ポリペプチドとす
る。この試料を用いてザ ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（The Journal of Biological Ch
emistry）、第256巻、第7990乃至7997頁（1981年）の記
載に準じて、気相プロテイン シークエンサーにより分
解し、高速液体クロマトグラフィーで同定して、ポリペ
プチドのＮ末端を含有する部分アミノ酸配列を決定す
る。
デラモーサを栄養培地で培養してポリペプチドを産生さ
せる。培養終了後、遠心分離して上清を採取し、これを
硫安分画、イオン交換クロマドクラフィー、高速液体ク
ロマトグラフィーにより精製し高純度ポリペプチドとす
る。この試料を用いてザ ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（The Journal of Biological Ch
emistry）、第256巻、第7990乃至7997頁（1981年）の記
載に準じて、気相プロテイン シークエンサーにより分
解し、高速液体クロマトグラフィーで同定して、ポリペ
プチドのＮ末端を含有する部分アミノ酸配列を決定す
る。
形質転換微生物によるポリペプチドの調製 上述のようにして得られた形質転換微生物を栄養培地
で培養することにより多量のポリペプチドを安定して産
生しうることを見いだした。
で培養することにより多量のポリペプチドを安定して産
生しうることを見いだした。
栄養培地には、例えば、炭素源、窒素源、ミネラル、
更に必要ならば、アミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄
養素などを含有させればよい。
更に必要ならば、アミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄
養素などを含有させればよい。
この際、炭素源としては、澱粉、澱粉部分加水分解
物、グルコース、フラクトース、スクロース、マルトー
スなどの糖質が有利に用いられる。窒素源としては、ア
ンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩
などの無機窒素源、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、
コーンスティープリカー、肉エキスなどの有機窒素源が
適宜用いられる。
物、グルコース、フラクトース、スクロース、マルトー
スなどの糖質が有利に用いられる。窒素源としては、ア
ンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩
などの無機窒素源、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、
コーンスティープリカー、肉エキスなどの有機窒素源が
適宜用いられる。
培養方法は、例えば、液体培地をpH2〜８、温度25〜6
5℃の範囲に維持しつつ、通気撹拌などの好気的条件下
で約１〜６日培養し、ポリペプチドを生成蓄積せしめれ
ばよい。
5℃の範囲に維持しつつ、通気撹拌などの好気的条件下
で約１〜６日培養し、ポリペプチドを生成蓄積せしめれ
ばよい。
培養物中のポリペプチドは、そのまま採取し利用する
こともできるが、一般には常法に従って、濾過、遠心分
離などによりポリペプチド溶液と微生物菌体とに分離し
た後に利用される。
こともできるが、一般には常法に従って、濾過、遠心分
離などによりポリペプチド溶液と微生物菌体とに分離し
た後に利用される。
ポリペプチドが菌体中に存在する場合には、細胞を超
音波、界面活性剤、細胞壁溶解酵素などで処理し、次い
で濾過、遠心分離などしてポリペプチド溶液を採取す
る。
音波、界面活性剤、細胞壁溶解酵素などで処理し、次い
で濾過、遠心分離などしてポリペプチド溶液を採取す
る。
このようにして得られるポリペプチド溶液を、例え
ば、減圧濃縮、膜濃縮、澱粉吸着、溶出し、更に、硫
安、硫酸ソーダなどによる塩析、メタノール、エタノー
ル、アセトンなどにより分別沈澱法などを適宜組み合せ
て精製し、より高純度のポリペプチドを採取して利用す
ることも、更に、これらのペプチドを常法に従って、担
体結合法、架橋法、包括法などによって固定化して利用
することも有利に実施できる。
ば、減圧濃縮、膜濃縮、澱粉吸着、溶出し、更に、硫
安、硫酸ソーダなどによる塩析、メタノール、エタノー
ル、アセトンなどにより分別沈澱法などを適宜組み合せ
て精製し、より高純度のポリペプチドを採取して利用す
ることも、更に、これらのペプチドを常法に従って、担
体結合法、架橋法、包括法などによって固定化して利用
することも有利に実施できる。
本発明で利用するポリペプチドは、特定するアミノ酸
配列まで解明され、安心して利用しうるものであればよ
く、左記に述べた遺伝子組み換えによる形質転換微生物
からのもののみに限定されるものではない。
配列まで解明され、安心して利用しうるものであればよ
く、左記に述べた遺伝子組み換えによる形質転換微生物
からのもののみに限定されるものではない。
本発明のポリペプチドは、アミロペクチン、グリコー
ゲンのα−1,6グリコシド結合を加水分解する酵素とし
て有利に利用でき、例えば、澱粉、アミロペクチン、澱
粉部分加水分解物など澱粉質からのアミロースの製造に
有利に利用できる。
ゲンのα−1,6グリコシド結合を加水分解する酵素とし
て有利に利用でき、例えば、澱粉、アミロペクチン、澱
粉部分加水分解物など澱粉質からのアミロースの製造に
有利に利用できる。
また、これら澱粉質を基質とし、これに、ポリペプチ
ドとグルコアミラーゼを併用してグルコース高含有物の
製造、ポリペプチドとβ−アミラーゼとを併用してマル
トース高含有物の製造が容易となる。
ドとグルコアミラーゼを併用してグルコース高含有物の
製造、ポリペプチドとβ−アミラーゼとを併用してマル
トース高含有物の製造が容易となる。
マルトース高含有物の製造方法としては、 例えば、特公昭47−13089号公報、特公昭54−3938号
公報などに開示されている糊化又は液化澱粉にイソアミ
ラーゼとβ−アミラーゼとを作用させてマルトース高含
有物を採取する方法等がある。
公報などに開示されている糊化又は液化澱粉にイソアミ
ラーゼとβ−アミラーゼとを作用させてマルトース高含
有物を採取する方法等がある。
この際、このようにして得られるマルトース高含有物
に含まれるマルトトリオースなどの夾雑糖類に、例え
ば、特公昭56−28153号公報、特公昭57−3356号公報、
特公昭56−28154号公報などに開示されている酵素を作
用させてマルトースを生成するか、さらには、例えば、
特開昭58−23799号公報などに開示されている強酸性カ
チオン交換樹脂を用いるカラム分画法により夾雑糖類を
除去するなどの方法によりマルトース純度を更に高める
ことも好都合である。
に含まれるマルトトリオースなどの夾雑糖類に、例え
ば、特公昭56−28153号公報、特公昭57−3356号公報、
特公昭56−28154号公報などに開示されている酵素を作
用させてマルトースを生成するか、さらには、例えば、
特開昭58−23799号公報などに開示されている強酸性カ
チオン交換樹脂を用いるカラム分画法により夾雑糖類を
除去するなどの方法によりマルトース純度を更に高める
ことも好都合である。
次いで、これらのマルトース高含有物は、通常、濾過
し、活性炭による脱色およびＨ型、OH型イオン交換樹脂
による脱塩などの精製工程を経て、濃縮し、シラップ状
製品を、更に、マルトースの種晶を加えて助晶し粉末化
して、粉末状結晶製品とするか、または助晶した後、分
密してきわめて高純度の結晶製品とする。
し、活性炭による脱色およびＨ型、OH型イオン交換樹脂
による脱塩などの精製工程を経て、濃縮し、シラップ状
製品を、更に、マルトースの種晶を加えて助晶し粉末化
して、粉末状結晶製品とするか、または助晶した後、分
密してきわめて高純度の結晶製品とする。
このようにして得られたマルトースは、甘味度の低い
甘味料として、また、注射用、経管栄養補給用糖質とし
て食品、医薬品分野に広く利用される。
甘味料として、また、注射用、経管栄養補給用糖質とし
て食品、医薬品分野に広く利用される。
更に、マルトースは、例えば、特開昭57−134498号公
報に記載される方法により、水素添加してマルチトール
を製造し、これを、難吸収性の甘味料、健康食品、美容
食品などに利用することも好都合である。
報に記載される方法により、水素添加してマルチトール
を製造し、これを、難吸収性の甘味料、健康食品、美容
食品などに利用することも好都合である。
以下、実験で本発明を詳細に説明する。
実験１ シュードモナス アミロデラモーサ ポリペプチド遺伝
子のエッシエリヒア コリへのクローニング （１）シュードモナス アミロデラモーサのポリペプチ
ド遺伝子を含む染色体DNAの調製 シュードモナス アミロデラモーサSB−15（ATCC2126
2）をペプトン1W/V％、酵母エキス0.5W/V％と塩化ナト
リウム0.5W/V％を含む培地で30℃通気撹拌培養した。培
養液を遠心分離にて集菌し、得られた菌体を25W/V％ス
クロースを含むトリス緩衝液（pH8.0）に懸濁し、次に
リゾチームを0.15W/V％になる様に加え25℃で20分間保
持した。これにEDTAを62.5mMになる様に加え、さらに20
分間保持した後、SDSを0.0625W/V％になる様に加え57℃
に加温し菌体を完全に溶菌させた。
子のエッシエリヒア コリへのクローニング （１）シュードモナス アミロデラモーサのポリペプチ
ド遺伝子を含む染色体DNAの調製 シュードモナス アミロデラモーサSB−15（ATCC2126
2）をペプトン1W/V％、酵母エキス0.5W/V％と塩化ナト
リウム0.5W/V％を含む培地で30℃通気撹拌培養した。培
養液を遠心分離にて集菌し、得られた菌体を25W/V％ス
クロースを含むトリス緩衝液（pH8.0）に懸濁し、次に
リゾチームを0.15W/V％になる様に加え25℃で20分間保
持した。これにEDTAを62.5mMになる様に加え、さらに20
分間保持した後、SDSを0.0625W/V％になる様に加え57℃
に加温し菌体を完全に溶菌させた。
この溶菌液をリボヌクレアーゼ（ベーリンガーマンハ
イム社製造、商品名RNaseA）およびプロテアーゼ（ベー
リンガーマンハイム社製造、商品名Pronase Ｋ）で処
理し、次いで、クロロホルム・イソアミルアルコール混
液を加え、遠心分離して得られる上清に２倍容のエタノ
ールを加え、染色体DNAを回収し、SSC緩衝液（塩化ナト
リウム、クエン酸３ナトリウム含有）に溶解した。再
度、クロロホルム・イソアミルアルコール混液処理し、
エタノール沈澱、次いでイソプロパノール沈澱を行い精
製染色体DNAを得た。
イム社製造、商品名RNaseA）およびプロテアーゼ（ベー
リンガーマンハイム社製造、商品名Pronase Ｋ）で処
理し、次いで、クロロホルム・イソアミルアルコール混
液を加え、遠心分離して得られる上清に２倍容のエタノ
ールを加え、染色体DNAを回収し、SSC緩衝液（塩化ナト
リウム、クエン酸３ナトリウム含有）に溶解した。再
度、クロロホルム・イソアミルアルコール混液処理し、
エタノール沈澱、次いでイソプロパノール沈澱を行い精
製染色体DNAを得た。
（２）プラスミドpUC9の調製 プラスミドpUC9はゼイ メイヤーズ（J.Mevers）等の
方法［ジャーナル オブ バクテリオロジー（Journal
of Bacteriology）、第127巻、第1529乃至1537頁（1976
年）］に準じてエッシェリヒア コリから分離・調製し
た。
方法［ジャーナル オブ バクテリオロジー（Journal
of Bacteriology）、第127巻、第1529乃至1537頁（1976
年）］に準じてエッシェリヒア コリから分離・調製し
た。
（３）ポリペプチド遺伝子を含む組み換えDNAの作製 実験１−（１）で調製したポリペプチド遺伝子を含む
精製染色体DNAに対して制限酵素Sau3AI（宝酒造株式会
社製造）を作用させ染色体DNAを部分的に切断した後、
ショ糖密度勾配超遠心法で約３〜7Kbpの染色体DNA断片
を分離・取得した。
精製染色体DNAに対して制限酵素Sau3AI（宝酒造株式会
社製造）を作用させ染色体DNAを部分的に切断した後、
ショ糖密度勾配超遠心法で約３〜7Kbpの染色体DNA断片
を分離・取得した。
制限酵素BamH1（宝酒造株式会社製造）で完全に切断
したプラスミドベクターpUC9と前記の約３〜7Kbpの染色
体のDNA断片を混合しT4DNAリガーゼ（東洋紡績株式会社
製造）を添加して４℃で一夜反応させて組み換えDNAを
作製した。
したプラスミドベクターpUC9と前記の約３〜7Kbpの染色
体のDNA断片を混合しT4DNAリガーゼ（東洋紡績株式会社
製造）を添加して４℃で一夜反応させて組み換えDNAを
作製した。
（４）ポリペプチド遺伝子を含む組み換DNAの選択 宿主微生物としてエッシェリヒア コリJM83（ATCC35
607）を用いた。本微生物をYTブロス［トリプトン0.8W/
V％、酵母エキス0.5W/V％と塩化ナトリウム0.25W/V％を
含有］で37℃、75分間培養し、集菌した後、50mM塩化カ
ルシウム水溶液に懸濁し、氷水中で40分間静置し、遠心
分離にて集菌し、続いて塩化カルシウム水溶液に懸濁し
たものに、実験１−（３）で得た組み換えDNAを加え、
氷水中で60分間静置した。更に、42℃に加温してTYブロ
スを加え、37℃で90分間保ち、その後遠心分離にて集菌
し、塩化ナトリウム0.85W/V％に懸濁し、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド（５−
bromo−４−chloro−３−indoly−β−galactoside or
Ｘ−gal）を含有する培地に生育させ白色のコロニー
を形成した微生物を形質転換微生物として選択した。得
られた約１、100個のコロニーをニトロセルロース上に
固定した。ポリペプチドのＮ末端から11番目から16番目
のアミノ酸配列に対応する合成DNAすなわち （３番目の塩基はＡまたはＧ、６番目の塩基はＡまたは
Ｇ、９番目の塩基はＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃのいずれか、12番目
の塩基はＴまたはＣ、15番目の塩基はＴまたはＣであ
り、組み合わせて64通りの合成DNAの混合物となる。） を32Pで標識したプローブに30℃で強く会合した13菌株
を選んだ。
607）を用いた。本微生物をYTブロス［トリプトン0.8W/
V％、酵母エキス0.5W/V％と塩化ナトリウム0.25W/V％を
含有］で37℃、75分間培養し、集菌した後、50mM塩化カ
ルシウム水溶液に懸濁し、氷水中で40分間静置し、遠心
分離にて集菌し、続いて塩化カルシウム水溶液に懸濁し
たものに、実験１−（３）で得た組み換えDNAを加え、
氷水中で60分間静置した。更に、42℃に加温してTYブロ
スを加え、37℃で90分間保ち、その後遠心分離にて集菌
し、塩化ナトリウム0.85W/V％に懸濁し、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド（５−
bromo−４−chloro−３−indoly−β−galactoside or
Ｘ−gal）を含有する培地に生育させ白色のコロニー
を形成した微生物を形質転換微生物として選択した。得
られた約１、100個のコロニーをニトロセルロース上に
固定した。ポリペプチドのＮ末端から11番目から16番目
のアミノ酸配列に対応する合成DNAすなわち （３番目の塩基はＡまたはＧ、６番目の塩基はＡまたは
Ｇ、９番目の塩基はＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃのいずれか、12番目
の塩基はＴまたはＣ、15番目の塩基はＴまたはＣであ
り、組み合わせて64通りの合成DNAの混合物となる。） を32Pで標識したプローブに30℃で強く会合した13菌株
を選んだ。
得られた13菌株についてサザーン（Southern）の方法
〔ジャーナル オブ モリキュラー バイオロジー（Jo
urnal of Molecular Biology）、第98巻、第503乃至517
頁（1975年）〕により、Ｎ末端から15番目から19番目の
アミノ酸配列に対応する合成DNAプローブすなわち （３番目の塩基はＴまたはＣ、６番目の塩基はＡ、Ｇ、
Ｔ、Ｃのいずれか、９番目の塩基はＡまたはＧ、12番目
の塩基はＡ、Ｇ、Ｔのいずれかであり、組み合わせて48
通りの合成DNAの混合物となる。） とも会合する１菌株を選択した。
〔ジャーナル オブ モリキュラー バイオロジー（Jo
urnal of Molecular Biology）、第98巻、第503乃至517
頁（1975年）〕により、Ｎ末端から15番目から19番目の
アミノ酸配列に対応する合成DNAプローブすなわち （３番目の塩基はＴまたはＣ、６番目の塩基はＡ、Ｇ、
Ｔ、Ｃのいずれか、９番目の塩基はＡまたはＧ、12番目
の塩基はＡ、Ｇ、Ｔのいずれかであり、組み合わせて48
通りの合成DNAの混合物となる。） とも会合する１菌株を選択した。
本微生物の一菌株をエッシェリヒア コリIAM275と命
名し、これが保有する組み換えDNAをpIAM275と命名し
た。
名し、これが保有する組み換えDNAをpIAM275と命名し
た。
組み換えDNApIAM275についてシュードモナス アミロ
デラモーサ由来DNA部分の制限酵素切断地図を図に示
す。
デラモーサ由来DNA部分の制限酵素切断地図を図に示
す。
図に示したDNA部分は、5.5Kbpの大きさである。
実験２ シュードモナス アミロデラモーサ由来ポリペプチドの
Ｎ末端を含有した部分アミノ酸配列 （１）ポリペプチドの調製 シュードモナス アミロデラモーサSB−15（ATCC2126
2）をマルトース2W/V％、グルタミン酸ナトリウム0.4W/
V％、リン酸アンモニウム0.15W/V％、リン酸ニカリウム
0.1W/V％、硫酸マグネシウム・７水塩0.05W/V％塩化鉄
・６水塩、塩化マンガン及び塩化ナトリウム各々0.0001
W/V％を含有する培地（pH7.0）にて30℃、３日間通気撹
拌培養し、培地中にポリペプチドを産生させた。
Ｎ末端を含有した部分アミノ酸配列 （１）ポリペプチドの調製 シュードモナス アミロデラモーサSB−15（ATCC2126
2）をマルトース2W/V％、グルタミン酸ナトリウム0.4W/
V％、リン酸アンモニウム0.15W/V％、リン酸ニカリウム
0.1W/V％、硫酸マグネシウム・７水塩0.05W/V％塩化鉄
・６水塩、塩化マンガン及び塩化ナトリウム各々0.0001
W/V％を含有する培地（pH7.0）にて30℃、３日間通気撹
拌培養し、培地中にポリペプチドを産生させた。
遠心分離して上清を採取し、硫安塩析によりポリペプ
チド画分を得、次いで、陰イオン交換体カラムクロマト
グラフィー（米国ブラウン社製造、商品名DEAE−セルロ
ース）更に陽イオン交換体カラムクロマトグラフィー
（和光純薬工業株式会社製造、商品名CM−セルロース）
により精製して、高度に精製されたポリペプチドを採取
した。
チド画分を得、次いで、陰イオン交換体カラムクロマト
グラフィー（米国ブラウン社製造、商品名DEAE−セルロ
ース）更に陽イオン交換体カラムクロマトグラフィー
（和光純薬工業株式会社製造、商品名CM−セルロース）
により精製して、高度に精製されたポリペプチドを採取
した。
ケイ ウェーバー アンド エム オズボーン（K.We
ber and M.Osborn）、ザ ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリイ（The Journal of Biologic
al Chemistry）、第244巻、第4406頁（1969年）の記載
に準じて、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り本品の分子量を求めたところ、80,000±5,000であっ
た。
ber and M.Osborn）、ザ ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリイ（The Journal of Biologic
al Chemistry）、第244巻、第4406頁（1969年）の記載
に準じて、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り本品の分子量を求めたところ、80,000±5,000であっ
た。
スウェーデン、LKB社製、等電点電気泳動用ゲル、商
品名 PMRHOLINE PAGPLATE（pH3.5〜9.5）を用いて本
品の等電点を調べたところ、pI4.7±0.1であった。
品名 PMRHOLINE PAGPLATE（pH3.5〜9.5）を用いて本
品の等電点を調べたところ、pI4.7±0.1であった。
また、本品を0.1M酢酸緩衝液（pH3.5）中で30〜70℃
で10分間インキュベートする条件でその熱安定性を調べ
たところ、50℃までその活性はほぼ完全に残存し、55℃
条件下においても約70％残存していた。
で10分間インキュベートする条件でその熱安定性を調べ
たところ、50℃までその活性はほぼ完全に残存し、55℃
条件下においても約70％残存していた。
更に、本品のpH安定性、至適温度および至適pHについ
ても調べたところ、本品はpH3.5〜5.5の範囲に於いて安
定であり、その至適温度は50〜55℃、至適pHは3.5であ
った。
ても調べたところ、本品はpH3.5〜5.5の範囲に於いて安
定であり、その至適温度は50〜55℃、至適pHは3.5であ
った。
本品の比活性は59,000単位±5,000単位/mg蛋白質を示
した。
した。
本明細書でいうイソアミラーゼ活性１単位とは、1.0W
/V％可溶性モチゴメ澱粉5mlに0.5M酢酸緩衝液（pH3.5）
1mlを加え、次いで酵素液1mlを加え、40℃で一定時間反
応させた後1mlをとり、これに0.01Mヨード・ヨードカリ
溶液1mlを加え25mlに水で希釈し、15分後に液層1cmで61
0nmの吸光度を測定し、反応１時間に吸光度0.01増加さ
せる酵素量を１単位とした。
/V％可溶性モチゴメ澱粉5mlに0.5M酢酸緩衝液（pH3.5）
1mlを加え、次いで酵素液1mlを加え、40℃で一定時間反
応させた後1mlをとり、これに0.01Mヨード・ヨードカリ
溶液1mlを加え25mlに水で希釈し、15分後に液層1cmで61
0nmの吸光度を測定し、反応１時間に吸光度0.01増加さ
せる酵素量を１単位とした。
（２）Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列 実験２−（１）の方法で調製したポリペプチドを気相
プロティン シークエンサー（アプライド バイオシス
テム社製造、商品名 470A型）にかけ、次いで高速液体
クロマトグラフィーにより分析してＮ末端を含有する部
分アミノ酸配列を決定した。
プロティン シークエンサー（アプライド バイオシス
テム社製造、商品名 470A型）にかけ、次いで高速液体
クロマトグラフィーにより分析してＮ末端を含有する部
分アミノ酸配列を決定した。
結果は、Ala−Ile−Asn−Ser−Met−Ser−Leu−Gly−
Ala−Ser−Tyr−Asp−Ala−Gln−Gln−Ala−Asn−Ile−
Thr−Pheの配列を有していることが判明した。
Ala−Ser−Tyr−Asp−Ala−Gln−Gln−Ala−Asn−Ile−
Thr−Pheの配列を有していることが判明した。
実験３ シュードモナス アミロデラモーサ由来ポリペプチド遺
伝子の塩基配列及びポリペプチドのアミド酸配列 （１）プラスミドpUC18の調製 プロスミドpUC18はこれを導入したエッシェリヒア
コリJM83から実験１−（２）の方法に準じて調製した。
伝子の塩基配列及びポリペプチドのアミド酸配列 （１）プラスミドpUC18の調製 プロスミドpUC18はこれを導入したエッシェリヒア
コリJM83から実験１−（２）の方法に準じて調製した。
（２）ポリペプチド遺伝子を含む組み換えDNAの作製 実験１−（３）の方法に準じて組み換えDNAを作製し
た。即ち、実験１−（２）の方法で調製したポリペプチ
ド遺伝子を含むプラスミドに各種制限酵素を作用させて
切断し、ポリペプチド遺伝子を含む断片を得、また実験
３−（１）の方法で調製したプラスミドpUC18を同様に
各種制限酵素で切断しこれら両断片にT4DNAリガーゼを
作用させて組み換えDNAを作製した。
た。即ち、実験１−（２）の方法で調製したポリペプチ
ド遺伝子を含むプラスミドに各種制限酵素を作用させて
切断し、ポリペプチド遺伝子を含む断片を得、また実験
３−（１）の方法で調製したプラスミドpUC18を同様に
各種制限酵素で切断しこれら両断片にT4DNAリガーゼを
作用させて組み換えDNAを作製した。
（３）組み換えDNAのエッシェリヒア コリへの導入 エッシェリヒア コリ JM83に実験１−（４）の方法
に準じて組み換えDNAを移入し形質転換させた。
に準じて組み換えDNAを移入し形質転換させた。
（４）形質転換微生物からの組み換えDNAの調製 形質転換微生物を坑生物質アンピシリン50μg/mlを含
むＬ−ブロスで培養し、得られる菌体からアルカリ溶菌
法により組み換えDNAを調製した。
むＬ−ブロスで培養し、得られる菌体からアルカリ溶菌
法により組み換えDNAを調製した。
（５）組み換えDNAの塩基配列 ジデオキシ チェーン ターミネータ法に従って解読
した。
した。
即ち、実験３−（４）で調製した組み換えDNAと合成
プライマー（17塩基）を加え、60℃で20分間アニーリン
グした後、dNTP、ddNTP、［α−32P］αCTPおよびクレ
ノー断片を加え、37℃で30分間反応させ、プライマーを
５′側から３′方向へ伸長させて相補DNAを生成させ
た。これに過剰のdNTPを加えて、さらに37℃で30分間反
応させた後、ホルムアミド色素溶液を加えて、反応を停
止させた。次いで、３分間煮沸し、これを６％ポリアク
リルアミドゲルを用いて約25mAで電気泳動し、伸長した
相補DNAを分離した。電気泳動した後ゲルを固定し乾燥
させた。
プライマー（17塩基）を加え、60℃で20分間アニーリン
グした後、dNTP、ddNTP、［α−32P］αCTPおよびクレ
ノー断片を加え、37℃で30分間反応させ、プライマーを
５′側から３′方向へ伸長させて相補DNAを生成させ
た。これに過剰のdNTPを加えて、さらに37℃で30分間反
応させた後、ホルムアミド色素溶液を加えて、反応を停
止させた。次いで、３分間煮沸し、これを６％ポリアク
リルアミドゲルを用いて約25mAで電気泳動し、伸長した
相補DNAを分離した。電気泳動した後ゲルを固定し乾燥
させた。
本ゲルを用いてオートラジオグラフィーを行ないオー
トラジオグラム上に塩基断片のシークエンス解析を行っ
てポリペプチド遺伝子の塩基配列を決定した。
トラジオグラム上に塩基断片のシークエンス解析を行っ
てポリペプチド遺伝子の塩基配列を決定した。
その結果は第１−１表に示した。
またそれの５′側の上流に続くシグナルペプチド遺伝
子の塩基配列も同様にして調べた。
子の塩基配列も同様にして調べた。
その結果は第１−２表に示した。
（６）ポリペプチドのアミノ酸配列 第１−１表の塩基配列を用いて、ポリペプチドのアミ
ノ酸配列を決定し、その結果を第２−１表に示した。
ノ酸配列を決定し、その結果を第２−１表に示した。
またそれのＮ末端側の上流に続くシグナルペプチドの
アミノ酸配列を決定し、その結果を第２−２表に示し
た。
アミノ酸配列を決定し、その結果を第２−２表に示し
た。
以上の結果からシュードモナス アミロデラモーサ由
来ポリペプチドのアミノ酸配列は第２−１表の配列を有
していることが明らかになった。
来ポリペプチドのアミノ酸配列は第２−１表の配列を有
していることが明らかになった。
なお、このアミノ酸配列を澱粉枝切作用を有するプル
ラナーゼのそれと比較した。すなわち、ジャーナル オ
ブ バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）第1
69巻、第2301乃至2306頁（1987年）に記載されているプ
ルラナーゼのアミノ酸配列と比較してみた。
ラナーゼのそれと比較した。すなわち、ジャーナル オ
ブ バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）第1
69巻、第2301乃至2306頁（1987年）に記載されているプ
ルラナーゼのアミノ酸配列と比較してみた。
意外なことにグリコーゲン分解型枝切り酵素であり本
ポリペプチドのアミノ酸配列中にはプルラン分解型枝切
り酵素であるプルラナーゼと相同性を有する部分配列が
存在していることが判明した。
ポリペプチドのアミノ酸配列中にはプルラン分解型枝切
り酵素であるプルラナーゼと相同性を有する部分配列が
存在していることが判明した。
その結果を第３表に示した。
第３表の結果から明らかなように本ポリペプチドはプ
ルラナーゼのアミノ酸配列と近似した部分アミノ酸配列
を有しており、この部分アミノ配列が、両酵素の共通性
質であるα−1,6グルコシド結合に作用するに際して大
きく関与しているものと判断される。
ルラナーゼのアミノ酸配列と近似した部分アミノ酸配列
を有しており、この部分アミノ配列が、両酵素の共通性
質であるα−1,6グルコシド結合に作用するに際して大
きく関与しているものと判断される。
即ち、ポリペプチドの特定された部分アミノ酸配列と
して の配列を有していることが判明し、しかもこれら部分ア
ミノ酸配列はＮ末端から近い順に（ａ）および（ｂ）の
部分配列を有していることが判明した。
して の配列を有していることが判明し、しかもこれら部分ア
ミノ酸配列はＮ末端から近い順に（ａ）および（ｂ）の
部分配列を有していることが判明した。
実験４ 形質転換微生物によるポリペプチドの産生 シュードモナス アミロデラモーサ由来のポリペプチ
ド遺伝子を含む組み換えDNAを導入した形質転換微生物
エッシェリヒア コリ IAM275とその宿主微生物エッシ
ェリヒア コリ JM83ならびに供与体微生物シュードモ
ナス アミロデラモーサ SB−15（ATCC21262）の産生
するポリペプチド産生量をその活性で比較した。液体培
地は、マルトース2W/V％、グルタミン酸ナトリウム0.4W
/V％、コーンスティープリカー0.2W/V％、、ポリペプト
ン0.1W/V％、リン酸アンモニウム0.1W/V％、リン酸ニカ
リウム0.1W/V％、硫酸マグネシウム・７水塩0.05W/V％
および水からなりpH7.0に調整して120℃で20分間減菌
し、冷却して調製した。
ド遺伝子を含む組み換えDNAを導入した形質転換微生物
エッシェリヒア コリ IAM275とその宿主微生物エッシ
ェリヒア コリ JM83ならびに供与体微生物シュードモ
ナス アミロデラモーサ SB−15（ATCC21262）の産生
するポリペプチド産生量をその活性で比較した。液体培
地は、マルトース2W/V％、グルタミン酸ナトリウム0.4W
/V％、コーンスティープリカー0.2W/V％、、ポリペプト
ン0.1W/V％、リン酸アンモニウム0.1W/V％、リン酸ニカ
リウム0.1W/V％、硫酸マグネシウム・７水塩0.05W/V％
および水からなりpH7.0に調整して120℃で20分間減菌
し、冷却して調製した。
エッシェリヒア コリ IAM275の場合には、この培地
に抗生物質アンピシリンをml当り50μｇの割合で加えて
植菌しまた、エッシェリヒア コリ JM83の場合には抗
生物質を加えずに植菌しそれぞれ37℃、24時間通気撹拌
培養した。
に抗生物質アンピシリンをml当り50μｇの割合で加えて
植菌しまた、エッシェリヒア コリ JM83の場合には抗
生物質を加えずに植菌しそれぞれ37℃、24時間通気撹拌
培養した。
また、シュードモナス アミロデラモーサ SB−15
（ATCC21262）の場合には前記液体培地に抗生物質を加
えることなく28℃で24時間および96時間培養した。各培
養液を遠心分離し上清と菌体とに分離し、上清はそのま
ま活性測定し菌体は超音波処理して破壊した後活性測定
し培養液量に換算して活性を求めた。
（ATCC21262）の場合には前記液体培地に抗生物質を加
えることなく28℃で24時間および96時間培養した。各培
養液を遠心分離し上清と菌体とに分離し、上清はそのま
ま活性測定し菌体は超音波処理して破壊した後活性測定
し培養液量に換算して活性を求めた。
結果は第４表に示す。
第４表の結果から明らかなごとく、形質転換微生物か
らのポリペプチド産生量は向上しており工業的生産方法
として好都合である。
らのポリペプチド産生量は向上しており工業的生産方法
として好都合である。
以下、本発明の実施例と優れた効果を述べる。
実施例1.ポリペプチド マルトース2W/V％、グルタミン酸ナトリウム0.1W/V
％、コーンスティープリカー1.0W/V％、ポリペプトン0.
5W/V％、硝酸アンモニウム0.2W/V％、リン酸ニカリウム
0.2W/V％、硫酸マグネシウム・７水塩0.05W/V％および
水からなる液体培地を30容ジャーファメニターに15
入れpH7.0に調製し120℃で20分間減菌し冷却して調製し
た。この培地に抗生物質アンピシリンをml当り50μｇの
割合で加えた後、形質転換微生物エッシェリヒア コリ
IAM275の種培養液1v/V％植菌し、37℃で24時間通気撹
培養した。培養液のイソアミラーゼ活性は、ml当り約38
0単位であった。培養液からの菌体を超音波処理し、遠
心分離して得られる上清を実験２−（１）の方法に準じ
て精製し、高度に精製されたポリペプチド含有液を得
た。
％、コーンスティープリカー1.0W/V％、ポリペプトン0.
5W/V％、硝酸アンモニウム0.2W/V％、リン酸ニカリウム
0.2W/V％、硫酸マグネシウム・７水塩0.05W/V％および
水からなる液体培地を30容ジャーファメニターに15
入れpH7.0に調製し120℃で20分間減菌し冷却して調製し
た。この培地に抗生物質アンピシリンをml当り50μｇの
割合で加えた後、形質転換微生物エッシェリヒア コリ
IAM275の種培養液1v/V％植菌し、37℃で24時間通気撹
培養した。培養液のイソアミラーゼ活性は、ml当り約38
0単位であった。培養液からの菌体を超音波処理し、遠
心分離して得られる上清を実験２−（１）の方法に準じ
て精製し、高度に精製されたポリペプチド含有液を得
た。
本ポリペプチド含有液は澱粉質からのマルトース高含
有物の製造に有利に利用できる。
有物の製造に有利に利用できる。
実施例2.マルトース高含有物 コーンスターチ３重量部と水10重量部との懸濁液に、
市販の細菌液化型α−アミラーゼを加え、90℃に加熱糊
化した後、130℃に加熱して酵素反応を止め、DE約３の
液化液とし、この澱粉液を55℃に急冷して、これに実施
例１の方法で得たポリペプチド含有液を、澱粉グラム当
り100単位と、大豆由来のβ−アミラーゼを同じく30単
位とを加えpH5.0に保って36時間糖化し糖化液を活性炭
で脱色し、イオン交換樹脂で脱塩したのち濃縮し種晶を
加え助晶した後、５日間静置して固化し、これを切削し
て糖組成がグルコース2.6％、マルトース85.4％、マル
トトリオース7.4％、マルトテトラオース以上のデキス
トリン4.6％からなる粉末状のマルトース高含有物を、
原料澱粉固形物当り約97％の収率で得た。
市販の細菌液化型α−アミラーゼを加え、90℃に加熱糊
化した後、130℃に加熱して酵素反応を止め、DE約３の
液化液とし、この澱粉液を55℃に急冷して、これに実施
例１の方法で得たポリペプチド含有液を、澱粉グラム当
り100単位と、大豆由来のβ−アミラーゼを同じく30単
位とを加えpH5.0に保って36時間糖化し糖化液を活性炭
で脱色し、イオン交換樹脂で脱塩したのち濃縮し種晶を
加え助晶した後、５日間静置して固化し、これを切削し
て糖組成がグルコース2.6％、マルトース85.4％、マル
トトリオース7.4％、マルトテトラオース以上のデキス
トリン4.6％からなる粉末状のマルトース高含有物を、
原料澱粉固形物当り約97％の収率で得た。
本品は、低甘味性の甘味料として、各種飲食物の製造
に有利に利用できる。
に有利に利用できる。
＜発明の効果＞ 上記したことから明らかなように本発明は、ポリペプ
チドのアミノ酸配列を解明し、その解明されたポリペプ
チドを用いる澱粉質からのマルトース高含有物の製造方
法に関する。
チドのアミノ酸配列を解明し、その解明されたポリペプ
チドを用いる澱粉質からのマルトース高含有物の製造方
法に関する。
本発明は特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
用いることにより安心して澱粉を加水分解できることが
判明しその工業的意義は大きい。
用いることにより安心して澱粉を加水分解できることが
判明しその工業的意義は大きい。
その上ポリペプチドの給源として元来ポリペプチド産
生能を有するシュードモナス アミロデラモーサのみな
らず、その産生能を有するポリペプチド遺伝子を生体外
遺伝子組換え技術により導入した形質転換微生物も利用
しうることを解明したことはより広範囲な給源を確保す
るとともにポリペプチド産生量の向上を容易に達成する
こととなり、その工業的意義は大きい。
生能を有するシュードモナス アミロデラモーサのみな
らず、その産生能を有するポリペプチド遺伝子を生体外
遺伝子組換え技術により導入した形質転換微生物も利用
しうることを解明したことはより広範囲な給源を確保す
るとともにポリペプチド産生量の向上を容易に達成する
こととなり、その工業的意義は大きい。
図は、組換えDNA pIAM275についてシュードモナス ア
ミロデラモーサ由来DNA部分の制限酵素切断地図を示
す。
ミロデラモーサ由来DNA部分の制限酵素切断地図を示
す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:38）
Claims (12)
- 【請求項１】ポリペプチドが、部分アミノ酸配列とし
て、 の配列を有し、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により、分子量80,000±5,000、ポリアクリルアミド
ゲル等電点電気泳動法により、pI4.7±0.1を有すること
を特徴とするイソアミラーゼ活性を有するポリペプチ
ド。 - 【請求項２】ポリペプチドが、部分アミノ酸配列とし
て、 Ｎ末端側から近い順に、 の配列を有していることを特徴とする請求項１に記載の
イソアミラーゼ活性を有するポリペプチド。 - 【請求項３】ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部
分アミノ酸配列として、 の配列を有していることを特徴とする請求項１または２
に記載のイソアミラーゼ活性を有するポリペプチド。 - 【請求項４】ポリペプチドが、アミノ酸配列として、 の配列を有していることを特徴とする請求項１、２また
は３に記載のポリペプチド。 - 【請求項５】ポリペプチドが、イソアミラーゼ産生能を
有する微生物由来のポリペプチドであることを特徴とす
る請求項１、２、３または４に記載のイソアミラーゼ活
性を有するポリペプチド。 - 【請求項６】ポリペプチドが、シュードモナス アミロ
デラモーサ由来のポリペプチドであることを特徴とする
請求項１、２、３、４または５に記載のポリペプチド。 - 【請求項７】部分アミノ酸配列として、 の配列を有し、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により、分子量80,000±5,000、ポリアクリルアミド
ゲル等電点電気泳動法により、pI4.7±0.1を有し、且つ
イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドをβ−アミラ
ーゼとともに澱粉質に作用せしめ、得られるマルトース
高含有物を採取することを特徴とするマルトース高含有
物の製造方法。 - 【請求項８】ポリペプチドが、部分アミノ酸配列とし
て、 Ｎ末端側から近い順に、 の配列を有していることを特徴とする請求項７に記載の
マルトース高含有物の製造方法。 - 【請求項９】ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部
分アミノ酸配列として、 の配列を有していることを特徴とする請求項７または８
に記載のマルトース高含有物の製造方法。 - 【請求項１０】ポリペプチドが、アミノ酸配列として、 の配列を有していることを特徴とする請求項７、８また
は９に記載のマルトース高含有物の製造方法。 - 【請求項１１】ポリペプチドが、イソアミラーゼ産生能
を有する微生物由来のポリペプチドであることを特徴と
する請求項７、８、９または10に記載のマルトース高含
有物の製造方法。 - 【請求項１２】ポリペプチドが、シュードモナス アミ
ロデラモーサ由来のポリペプチドであることを特徴とす
る請求項７、８、９、10または11に記載のマルトース高
含有物の製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63024762A JP2838798B2 (ja) | 1988-02-04 | 1988-02-04 | イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途 |
| CA000589516A CA1336509C (en) | 1988-02-04 | 1989-01-30 | Polypeptide possessing isoamylase activity, and its uses |
| DE68928271T DE68928271T2 (de) | 1988-02-04 | 1989-02-03 | Polypeptid mit Isoamylase-Aktivität und seine Verwendung |
| EP89301088A EP0327391B1 (en) | 1988-02-04 | 1989-02-03 | Polypeptide possessing isoamylase activity, and its uses |
| US07/305,974 US5118622A (en) | 1988-02-04 | 1989-02-03 | Polypeptide possessing isoamylase activity, and its use in the hydrolysis of amylaceous substances |
| KR1019890001302A KR0133727B1 (ko) | 1988-02-04 | 1989-02-04 | 이소아밀라아제 활성을 지닌 폴리펩티드 및 그 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63024762A JP2838798B2 (ja) | 1988-02-04 | 1988-02-04 | イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01199577A JPH01199577A (ja) | 1989-08-10 |
| JP2838798B2 true JP2838798B2 (ja) | 1998-12-16 |
Family
ID=12147160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63024762A Expired - Lifetime JP2838798B2 (ja) | 1988-02-04 | 1988-02-04 | イソアミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5118622A (ja) |
| EP (1) | EP0327391B1 (ja) |
| JP (1) | JP2838798B2 (ja) |
| KR (1) | KR0133727B1 (ja) |
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| DE (1) | DE68928271T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3633648B2 (ja) * | 1993-07-20 | 2005-03-30 | 株式会社林原生物化学研究所 | マルトース・トレハロース変換酵素とその製造方法並びに用途 |
| EP0693558B1 (en) * | 1994-07-19 | 2002-12-04 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Trehalose and its production and use |
| MX2012002095A (es) * | 2009-08-21 | 2012-04-10 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad de isoamilasa y polinucleotidos que codifican los mismos. |
| CN114540323B (zh) * | 2022-02-21 | 2023-07-25 | 江南大学 | 一种具有4,3/6-α-葡萄糖基转移酶活性的GtfB酶 |
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|---|---|---|---|---|
| US3560345A (en) * | 1967-06-02 | 1971-02-02 | Hayashibara Co | Process for producing bacterial isoamylase |
| IT1050155B (it) * | 1967-06-30 | 1981-03-10 | Hayashibara Co | Procedimento per la produzione di maltosio di elevata purezza |
| FR2012831A1 (ja) * | 1968-07-12 | 1970-03-27 | Hayashibara Co | |
| DE2332396A1 (de) * | 1973-06-26 | 1975-01-23 | Marine Protein Int Corp | Wasserzirkulationssystem fuer die suesswasserfischzucht |
| US4032403A (en) * | 1974-07-17 | 1977-06-28 | Kabushiki-Kaisha Hayashibara Selbutsukagaku Kenkyujo | Process for the production of saccharified starch products wherein maltose is the predominant constituent |
| JPS5170833A (en) * | 1974-11-30 | 1976-06-18 | Hayashibara Biochem Lab | Denpuntokabutsuno seizohoho |
| JPS543938A (en) * | 1977-06-09 | 1979-01-12 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | High-frequency heating system |
| JPS5628154A (en) * | 1979-08-10 | 1981-03-19 | Ricoh Co Ltd | Roll paper feeding apparatus |
| JPS573356A (en) * | 1980-06-06 | 1982-01-08 | Jeol Ltd | Electron gun |
| JPS57134498A (en) * | 1981-02-12 | 1982-08-19 | Hayashibara Biochem Lab Inc | Anhydrous crystalline maltitol and its preparation and use |
| JPS5823799A (ja) * | 1981-08-03 | 1983-02-12 | 株式会社林原生物化学研究所 | 高純度マルト−スの製造方法 |
| EP0302838B1 (en) * | 1987-08-07 | 1994-06-29 | ENICHEM SYNTHESIS S.p.A. | Cloning of the gene coding the isoamylase enzyme and its use in the production of said enzyme |
-
1988
- 1988-02-04 JP JP63024762A patent/JP2838798B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-01-30 CA CA000589516A patent/CA1336509C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-02-03 EP EP89301088A patent/EP0327391B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-03 DE DE68928271T patent/DE68928271T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-02-03 US US07/305,974 patent/US5118622A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-04 KR KR1019890001302A patent/KR0133727B1/ko not_active IP Right Cessation
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| EP0327391A3 (en) | 1990-06-13 |
| EP0327391B1 (en) | 1997-08-27 |
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| CA1336509C (en) | 1995-08-01 |
| DE68928271T2 (de) | 1998-02-26 |
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| EP0327391A2 (en) | 1989-08-09 |
| KR890013059A (ko) | 1989-09-21 |
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