JPH1066586A - β−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 組換えＤＮＡ技術を適用することにより、容
易に大量生産可能なβ−フラクトフラノシダーゼ活性を
有するポリペプチドを提供することを課題とする。 【解決手段】 微生物由来の遺伝子を発現させて得るこ
とができ、特定の部分アミノ酸配列を有するβ−フラク
トフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド、そのポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを適宜宿主に
導入してなる形質転換体、その形質転換体を培養する工
程と、産生した当該ポリペプチドを培養物から採取する
工程を含んでなるβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有
するポリペプチドの製造方法、さらには、当該ポリペプ
チドの存在下でフラクトフラノシル供与体とフラクトフ
ラノシル受容体を反応させる工程を含んでなるフラクト
フラノシル転移方法により解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は酵素活性を有する
ポリペプチド、詳細には、微生物由来の遺伝子を発現さ
せて得ることのできるβ−フラクトフラノシダーゼ活性
を有するポリペプチドに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】キシロシルフラクトシドやラクトスクロ
ースを始めとするフラクトフラノシル転移糖は、顕著な
抗う蝕作用とビフィズス菌増殖促進作用を有し、蔗糖に
代わる新しい甘味剤として、現在、食品分野や医薬品分
野で大いに注目されている。フラクトフラノシル転移糖
は、通常、蔗糖と澱粉糖や乳糖などを原料として用い、
これらにβ−フラクトフラノシダーゼを作用させて製造
される。斯界においては、これまでバチルス属やアルス
ロバクター属の微生物由来のβ−フラクトフラノシダー
ゼが頻用されてきたが、従来公知の微生物はいずれもβ
−フラクトフラノシダーゼ産生能が低く、フラクトフラ
ノシル転移糖を大規模に生産しようとすると、微生物を
大量に培養しなければならないという問題がある。

【０００３】ところで、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩
には目覚ましいものがある。今日では、全アミノ酸配列
が解明されていない酵素であっても、これをコードする
遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵
素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、こ
れを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換
体を培養すれば、比較的容易に所望量の酵素が取得でき
るようになった。斯かる状況に鑑み、β−フラクトフラ
ノシダーゼをコードする遺伝子を突き止め、その塩基配
列を解明するのが斯界の急務となっている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の第一の課題は、組換えＤＮＡ技術を適用するこ
とにより、容易に大量生産可能なβ−フラクトフラノシ
ダーゼ活性を有するポリペプチドを提供することにあ
る。

【０００５】また、この発明の第二の課題は、斯かるポ
リペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。

【０００６】加えて、この発明の第三の課題は、斯かる
ＤＮＡを導入した形質転換体を提供することにある。

【０００７】さらに加えて、この発明の第四の課題は、
斯かる形質転換体を用いるβ−フラクトフラノシダーゼ
活性を有するポリペプチドの製造方法を提供することに
ある。

【０００８】さらに加えて、この発明の第五の課題は、
斯かるポリペプチドを用いるフラクトフラノシル転移方
法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】これらの課題を解決すべ
く、本発明者が鋭意研究したところ、部分アミノ酸配列
として配列表における配列番号１及び２に示すアミノ酸
配列の一部又は全部を有するβ−フラクトフラノシダー
ゼ活性を有するポリペプチドは、微生物由来の遺伝子を
発現させることにより、所望量を容易に得られることが
判明した。

【００１０】すなわち、この発明は、前記第一の課題
を、微生物由来の遺伝子を発現させて得ることができ、
部分アミノ酸配列として配列表における配列番号１及び
２に示すアミノ酸配列の一部又は全部を有するβ−フラ
クトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドにより解
決するものである。

【００１１】また、この発明は、前記第二の課題を、当
該ポリペプチドをコードするＤＮＡにより解決するもの
である。

【００１２】加えて、この発明は、前記第三の課題を、
当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入してなる形
質転換体により解決するものである。

【００１３】さらに加えて、この発明は、前記第四の課
題を、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入して
なる形質転換体を培養する工程と、産生した該ポリペプ
チドを培養物から採取する工程を含んでなるβ−フラク
トフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法
により解決するものである。

【００１４】さらに加えて、この発明は前記第五の課題
を、当該ポリペプチドの存在下でフラクトフラノシル供
与体とフラクトフラノシル受容体を反応させる工程を含
んでなるフラクトフラノシル転移方法により解決するも
のである。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態につ
いて説明すると、この発明でいうポリペプチドとは、微
生物由来の遺伝子を発現させて得ることができ、部分ア
ミノ酸配列として配列表における配列番号１及び２に示
すアミノ酸配列の一部又は全部を含んでなるβ−フラク
トフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド全般を包含
するものとする。この発明のβ−フラクトフラノシダー
ゼ活性を有するポリペプチドは、通常、一部又は全部が
解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例とし
て、例えば、配列表における配列番号３に示すアミノ酸
配列を含んでなるものが挙げられる。斯かるポリペプチ
ドは、β−フラクトフラノシダーゼ活性に加えて、適宜
のフラクトフラノシル供与体とフラクトフラノシル受容
体間のフラクトフラノシル転移を触媒する作用を兼備
し、次のような理化学的性質を有している。 （１） 分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
すると、分子量約４４，０００乃至５４，０００ダルト
ンを示す。 （２） 至適ｐＨ ４０℃で１０分間反応させると、約５．５乃至６．０に
至適ｐＨを示す。 （３） 至適温度 ｐＨ６．０で１０分間反応させると、カルシウムイオン
非存在下で４５℃付近に、また、カルシウムイオン存在
下で５０℃付近に至適温度を示す。 （４） ｐＨ安定性 ４℃で２４時間インキュベートすると、ｐＨ約５．０乃
至８．０で安定である。 （５） 温度安定性 ｐＨ６．０で１時間インキュベートすると、４５℃付近
まで安定である。

【００１６】ところで、斯界においては、ポリペプチド
そのものの理化学的性質や宿主における発現効率を改善
する目的で、人為的に、ポリペプチドのアミノ酸配列に
おけるアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置
換したり、あるいは、Ｎ末端付近、Ｃ末端付近及び／又
は中間部のアミノ酸の１個又は２個以上を欠落させた
り、Ｎ末端及び／又はＣ末端に新たにアミノ酸を１個又
は２個以上を付加することがある。この発明のβ−フラ
クトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて
も、斯かるアミノ酸配列の変更は当然あり得ることであ
る。また、同じ遺伝子を用いる場合であっても、それを
導入する宿主の種類や形質転換体の培養条件によって
は、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾により、配列
番号１乃至３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端付近及
び／又はＣ末端付近のアミノ酸の１個又は２個以上が欠
落することがある。斯かる状況に鑑み、全体として配列
表における配列番号３に示すアミノ酸配列とは相違する
アミノ酸配列を有するポリペプチドであっても、それが
β−フラクトフラノシダーゼ活性を有し、かつ、部分ア
ミノ酸配列として配列表における配列番号１及び２に示
すアミノ酸配列の一部又は全部を含んでなるかぎり、当
然、この発明に包含されるものとする。

【００１７】この発明のβ−フラクトフラノシダーゼ活
性を有するポリペプチドは、微生物由来の遺伝子を発現
させることにより得ることができ、通常、宿主として、
例えば、大腸菌、放線菌、枯草菌、酵母などの微生物を
用い、斯かる宿主内でバチルス属の微生物由来の遺伝
子、例えば、バチルス・スピーシーズＶ２３０株由来の
遺伝子を発現させる。個々の遺伝子としては、例えば、
配列表における配列番号４に示す塩基配列、より具体的
には、配列番号５に示す塩基配列及びそれらの塩基配列
に相補的な塩基配列のＤＮＡを含んでなるもの、さらに
は、遺伝子の縮重を利用して、コードするアミノ酸配列
を変えることなく、それらの塩基配列における塩基の１
個又は２個以上を他の塩基で置換したＤＮＡを含んでな
るものが挙げられる。さらには、遺伝子が宿主内で当該
ポリペプチドの産生を発現し易くするために、当該ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡにおける塩基の１個又は２
個以上を他の塩基で適宜置換したり、適宜のエンハンサ
ーやプロモーターを連結し得ることは言うまでもない。

【００１８】この発明で用いる遺伝子は、それが上述の
ような塩基配列のＤＮＡを含んでなるかぎり、それが天
然に由来するものであるか、あるいは、人為的に合成さ
れたものであるかは問わない。天然の給源としては、例
えば、バチルス・スピーシーズＶ２３０株を始めとする
バチルス属の微生物が挙げられ、斯かる微生物の菌体か
らはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわ
ち、斯かる微生物を栄養培地に植菌し、好気的条件下で
約１日乃至３日間培養した後、培養物から菌体を採取
し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵
素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝
子を菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素に
プロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、
菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共
存させたり、凍結融解してもよい。斯くして得られる処
理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠
心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理など
の斯界における通常一般の方法を適用すれば目的とする
ＤＮＡが得られる。一方、ＤＮＡを人為的に合成するに
は、例えば、配列表における配列番号４及び５に示す塩
基配列に基づいて化学合成するか、配列番号３に示すア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律増殖可能な適宜ベ
クターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に
導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体
を採取し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを
採取すればよい。なお、バチルス・スピーシーズＶ２３
０株は岡山県の土壌から分離され、平成７年３月２４日
以降、茨城県つくば市にある国際寄託当局としての通商
産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所に寄託番
号『ＦＥＲＭ ＢＰ−５０５４』で寄託されている

【００１９】斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形
態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡ
と自律増殖可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手
できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容
易に調製することができる。斯かるベクターの例として
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１
９４、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、Ｙ
Ｅｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・
λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのフ
ァージベクターが挙げられる。このうち、この発明のＤ
ＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１
８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、λｇｔ
・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、また、枯草菌で
発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、
ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＹ３００
ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７
は、組換えＤＮＡを２種以上の宿主内で増殖させる場合
に有用である。

【００２０】ベクターへの挿入には、斯界において、通
常一般の方法が採用され、具体的には、先ず、ＤＮＡを
含む遺伝子と自律増殖可能なベクターとを制限酵素及び
／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片
とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切
断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわ
け、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅ
ｃｏ ＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ
Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを用いれ
ば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易とな
る。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に
応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外
でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られ
る組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体と
し、これを培養することにより無限に複製可能である。

【００２１】このようにして得られる組換えＤＮＡは、
大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主
微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合に
は、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で
培養すればよく、また、宿主が枯草菌の場合には、コン
ピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。
形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリ
ダイゼーション法を適用するか、適宜のフラクトフラノ
シル供与体とフラクトフラノシル受容体を含む栄養培地
で培養し、フラクトフラノシル転移物を生成するコロニ
ーを選別すればよい。

【００２２】斯くして得られる形質転換体は、栄養培地
で培養すると、菌体内外に当該ポリペプチドを産生す
る。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、
さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微
量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個
々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、
グルコース、果糖、蔗糖、トレハロースなどの糖質が、
また、窒素源としては、例えば、アンモニア若しくはア
ンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱
脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒
素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄
養培地に植菌し、栄養培地を温度２０乃至６５℃、ｐＨ
２乃至９に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下
で約１乃至６日間培養すれば、当該ポリペプチドを含む
培養物が得られる。この培養物は、酵素剤としてそのま
ま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応
じて、瀘過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌
体から分離し、超音波や細胞溶解酵素により菌体を破砕
した後、瀘過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを
菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には、
酵素を精製するための通常の方法が採用でき、例えば、
菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に遠心分離、塩
析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲル瀘過クロマトグラフィー、等電点クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種又は２種以上
を、適宜組合わせて適用すればよい。

【００２３】前述のとおり、この発明のβ−フラクトフ
ラノシダーゼ活性を有するポリペプチドは、フラクトフ
ラノシル供与体とフラクトフラノシル受容体間のフラク
トフラノシル転移を触媒するので、この発明のβ−フラ
クトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの存在下
で、適宜のフラクトフラノシル供与体とフラクトフラノ
シル受容体を反応させれば、種々の有用なフラクトフラ
ノシル転移物を得ることができる。フラクトフラノシル
供与体として、通常、蔗糖、ラフィノース及びエルロー
スなどの分子内にβ−フラクトフラノシド結合を有する
糖質が用いられ、また、フラクトフラノシル受容体とし
て分子内にβ−フラクトフラノシド結合を有しない、例
えば、キシロース、キシロオリゴ糖、ガラクトース、ガ
ラクトオリゴ糖、乳糖、マルトース、マルトオリゴ糖、
イソマルトース、イソマルトオリゴ糖などの還元性糖
質、トレハロース、ネオトレハロースなどの非還元性糖
質、ソルビトール、マルチトールなどの糖アルコール、
さらには、グリセロール、エチレングリコールなどのア
ルコールが用いられる。これらを適宜組合せて用いるこ
とにより、有用なフラクトフラノシル転移物であるキシ
ロシルフラクトシド、エルロース、イソマルトフラクト
シド、ラクトスクロース、フラクトシルトレハロースな
どが得られる。

【００２４】反応条件としては、通常、フラクトフラノ
シル受容体１重量部に対してフラクフラノシル供与体を
約０．１乃至１０重量部、望ましくは、約０．５乃至５
重量部用い、これらを水性媒体に濃度１０％（ｗ／ｗ）
以上、望ましくは、２０乃至６０％（ｗ／ｗ）になるよ
うに溶解し、温度を約６０℃以下、望ましくは、約５乃
至５５℃に、また、ｐＨを約３．５乃至８．０、望まし
くは、約４．５乃至６．５の範囲に設定して反応させ
る。ポリペプチドの量は反応の進行具合により適宜選択
すればよく、通常、フラクトフラノシル供与体固形分の
１ｇ当り約０．１乃至５０単位用いると、約０．１乃至
１００時間で反応が完結する。斯くして得られる反応物
は、固形分当り、フラクトフラノシル転移物を約５％以
上、通常、１０％以上含む。

【００２５】反応物は、常法にしたがって濾過、遠心分
離により不溶物を除去した後、活性炭やイオン交換樹脂
による精製工程を経た後、濃縮してシラップにするか、
必要とあらば、このシラップをさらに乾燥して粉末とす
る。フラクトフラノシル転移物の含量を高めるために
は、例えば、斯かるシラップをインベルターゼ欠損酵母
とともに培養して単糖類を除去するか、アルカリ溶液中
で加熱処理して還元性糖質を分解するか、あるいは、膜
濾過又はクロマトグラフィーにより夾雑物を分離すれば
よい。クロマトグラフィーを用いる方法としては、特開
昭５８−２３７９９号公報及び特開昭５８−７２５９８
号公報に開示された塩型強酸性カチオン交換樹脂を用い
るカラムクロマトグラフィーが有用であり、この方法を
適用するときには、所望量の高純度フラクトフラノシル
転移物が最少のコストと労力で得られる。カラムクロマ
トグラフィーの方式としては、公知の固定床方式、移動
床方式及び疑似移動床方式のいずれを適用してもよい。

【００２６】斯くして得られるフラクトフラノシル転移
物は、良好な呈味と甘味に加えて、適度の粘度と保湿作
用、さらには、顕著な抗う蝕作用、ビフィズス菌増殖促
進作用及びミネラル吸収促進作用を有する。したがっ
て、この発明によるフラクトフラノシル転移方法により
得られるフラクトフラノシル転移物は、斯かる性質・作
用を必要とする種々の飲食物、化粧品及び医薬品の甘味
付け並びに呈味及び物性の改善に有用である。

【００２７】以下、実施例に基づき、この発明の実施の
形態について説明する。なお、実施例で用いる手法自体
は公知であり、例えば、ジェー・サムブルックら『モレ
キュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュア
ル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・プレス発行などにも詳述されて
いる。

【００２８】

【実施例１】 〈ＤＮＡと形質転換体の調製〉

【００２９】

【実施例１−１】 〈精製β−フラクトフラノシダーゼの調製〉蔗糖１．０
％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母
エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二カリウム０．１％
（ｗ／ｖ）、燐酸一ナトリウム・２水塩０．０６％（ｗ
／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／
ｖ）、炭酸カルシウム０．３％（ｗ／ｖ）及び水からな
る液体培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容フラスコに１
００ｍｌずつとり、１２０℃で１５分間オートクレーブ
して滅菌し、冷却した後、バチルス・スピーシーズＶ２
３０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０５４）を接種し、３０℃
で２０時間回転振盪培養して種培養物を得た。

【００３０】１０ｌ容ジャーファーメンターに上記と同
一組成の新鮮な培地を約７ｌとり、同様にして滅菌し、
３０℃まで冷却した後、種培養物を１％（ｖ／ｖ）接種
し、３０℃で２０時間通気攪拌培養した。培養物を遠心
分離したところ、β−フラクトフラノシダーゼを３．６
単位／ｍｌ含む上清が６．３ｌ得られた。この上清に硫
酸アンモニウムを８０％飽和になるまで加え、４℃で一
夜静置した後、遠心分離してβ−フラクトフラノシダー
ゼを含む沈澱を採取した。

【００３１】この沈澱を５ｍＭ塩化カルシウムを含む１
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、新鮮な同一
緩衝液に対して一昼夜透析した後、遠心分離して上清２
１０ｍｌを採取した。この上清をあらかじめ５ｍＭ塩化
カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に
より平衡化しておいた東ソー製イオン交換クロマトグラ
フィー用ゲル『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０』３８０ｍ
ｌのカラムに負荷し、０Ｍから０．５Ｍまで上昇する塩
化ナトリウムの濃度勾配下にて１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）を通液し、塩化ナトリウム濃度０．１Ｍ付近
で溶出した画分を採取した。

【００３２】この画分を１Ｍ硫酸アンモニウムと５ｍＭ
塩化カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．
０）に対して透析した後、遠心分離して上清を回収し、
この上清をあらかじめ５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）により平衡化しておいた
東ソー製疎水性カラムクロマトグラフィー用ゲル『ブチ
ルトヨパール６５０』１００ｍｌのカラムに負荷し、１
Ｍから０Ｍに下降する硫酸アンモニウムの濃度勾配下に
て５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）を通液し、硫酸アンモニウム濃度０．１Ｍ付
近で溶出した画分を採取した。

【００３３】その後、この画分を５ｍＭ塩化カルシウム
を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析
し、遠心分離し、得られた上清をあらかじめ５ｍＭ塩化
カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に
より平衡化しておいた『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０』
１０ｍｌのカラムに負荷し、上記と同様にして分画した
ところ、比活性２０５単位／ｍｇ蛋白質の精製β−フラ
クトフラノシダーゼが１４ｍｇ得られた。この精製β−
フラクトフラノシダーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動したところ、β−フラクトフラノシダーゼ
活性を伴う蛋白質の実質的な単一バンドが観察された。

【００３４】なお、この発明において、β−フラクトフ
ラノシダーゼ活性は、次のようにして測定した活性値
（単位）で表示する。すなわち、基質としての蔗糖を５
ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
６．０）に０．１％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、こ
の水溶液５ｍｌに被検試料を０．２ｍｌ加え、４０℃で
１０分間反応させた後、ソモギー銅液０．２ｍｌを加え
て反応を停止させ、反応物の還元力をソモギー・ネルソ
ン法により測定する。対照として、あらかじめ１００℃
で１０分間加熱しておいて被検試料を上記と同様に処置
して対照とした。β−フラクトフラノシダーゼ活性の１
単位とは、上記条件下で反応させたときに、１分間に２
マイクロモルのグルコースに相当する還元力を生成する
酵素又はポリペプチドの量と定義する。

【００３５】

【実施例１−２】 〈Ｎ末端アミノ酸配列〉アプライド・バイオシステム製
気相プロテイン・シーケンサ『４７３Ａ型』を用い、常
法にしたがって分析したところ、実施例１−１の方法に
より得た精製β−フラクトフラノシダーゼは、Ｎ末端に
配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有して
いた。

【００３６】

【実施例１−３】 〈部分アミノ酸配列〉実施例１−１の方法により得た精
製β−フラクトフラノシダーゼを適量とり、１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時
間透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．
０）を加えて蛋白質濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。この
水溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼを２
０μｇ加え、３０℃で６０時間インキュベートして酵素
を部分加水分解した。加水分解物をあらかじめ０．１％
（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた
日本ミリポア・リミテッド製高速液体クロマトグラフィ
ー用カラム『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、
０％（ｖ／ｖ）から４０％（ｖ／ｖ）に上昇する水性ア
セトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／
ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液し
た。そして、通液開始から約７７分後に溶出した画分を
採取し、真空乾燥した後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセト
ニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に
溶解した。その後、実施例１−２と同様に分析したとこ
ろ、同画分に含まれるペプチド断片は配列表における配
列番号２に示すアミノ酸配列を有していた。

【００３７】

【実施例１−４】 〈染色体ＤＮＡの調製〉５００ｍｌ容フラスコに１％
（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキ
ス、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび水からな
る液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、１２
０℃で２０分間オートクレーブして滅菌し、冷却した
後、バチルス・スピーシーズＶ２３０株（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５０５４）を接種し、２７℃で２４時間回転振盪培
養した。

【００３８】培養物を遠心分離して菌体を分離し、適量
のＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチーム
を０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキ
ュベートし、−８０℃で１時間凍結した後、ＴＳＳ緩衝
液（ｐＨ９．０）を加え、６０℃に予温したＴＥＳ緩衝
液／フェノール混液を加え、冷却し、遠心分離して上清
を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、
染色体ＤＮＡを含む沈澱部を採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐ
Ｈ７．１）に溶解し、リボヌクレアーゼ７．５μｇとプ
ロテアーゼ１２５μｇをそれぞれ加え、３７℃で１時間
反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコ
ール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、抽出物に冷エ
タノールを加え、静置したところ、精製染色体ＤＮＡを
含む沈澱が得られた。この沈澱を濃度約１ｍｇ／ｍｌに
なるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８
０℃で凍結した。

【００３９】

【実施例１−５】 〈形質転換体ＢＢＦ４の調製〉実施例１−４の方法によ
り得た精製染色体ＤＮＡの溶液を１ｍｌとり、これに制
限酵素Ｓａｕ ３ＡＩを約３０単位加え、３７℃で２０
分間反応させて染色体ＤＮＡを部分的に切断した後、蔗
糖密度勾配超遠心法により約２，０００乃至５，０００
塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミ
ドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）を制
限酵素Ｂａｍ ＨＩにより切断し、そのベクター断片
０．１μｇとＤＮＡ断片１μｇを宝酒造製『ＤＮＡ Ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ』を用いて連結した。得られた
組換えＤＮＡに東洋紡績製コンピテントセル『Ｅｐｉｃ
ｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ
加え、氷冷下で３０分間静置した後、４２℃に加温し、
ＳＯＣブロスを加え、３７℃で１時間インキュベートし
て組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。

【００４０】斯くして得られた形質転換体を５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを５
０μｇ／ｍｌ含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌
し、３７℃で１８時間培養した後、培地上に形成された
約２，０００個のコロニーをアマシャム製ナイロン膜
『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｈ＋』上に固定した。別途、配列表に
おける配列番号３に示すアミノ酸配列の第５乃至１３番
目に相当するＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａで表される配列に基
づき、５´−ＧＡＹＴＡＹＡＡＲＧＡＲＧＡＹＴＡＹＧ
ＧＮＴＴＹＧＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌク
レオチドを化学合成し、同位体32Ｐで標識した後、これ
をプローブとしてナイロン膜上に固定した形質転換体の
コロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示したコ
ロニーを選別し、『ＢＢＦ４』と命名した。

【００４１】この形質転換体ＢＢＦ４をアンピシリン１
００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に
植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。遠心分離
により培養物から菌体を採取し、通常一般のアルカリ法
により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させ、これを常法に
より精製し、分析したところ、形質転換体ＢＢＦ４に含
まれる組換えＤＮＡ、すなわち、『ｐＢＢＦ４』は約
６，３００塩基対からなり、図１に示す制限酵素切断部
位を有していた。図１に見られるように、この組換えＤ
ＮＡ ｐＢＢＦ４においては、当該ポペプチドをコード
する１，３６５塩基対からなるＤＮＡが制限酵素Ｅｃｏ
ＲＶによる切断部位の下流に連結していた。

【００４２】

【実施例１−６】 〈塩基配列の決定〉実施例１−５の方法により得た組換
えＤＮＡ ｐＢＢＦ４を１μｇとり、これにシーケンシ
ング・プライマー０．０２μｇとアプライド・バイオシ
ステム製シーケンシング・キット『エー・ビー・アイ・
プリズム・レディー・リアクション・ターミネーター・
サイクル・シーケンシング・キット』のプレミックス液
９．５μｌをそれぞれ加えた後、さらに適量の水を加え
て全量を２０μｌとした。この混液に適量のミネラルオ
イルを重層した後、パーキン・エルマー製ＤＮＡサーマ
ルサイクラー『ＰＪ２０００型』により９６℃で３０秒
間、５０℃で１５秒間、さらに、６０℃で４分間この順
序で２５回繰り返し反応させ相補鎖ＤＮＡを含む反応物
を得た。その後、５％（ｗ／ｖ）セチルトリメチルアン
モニウムブロマイドを含む０．５Ｍ食塩水を２．５μｌ
加えて反応物を沈澱させ、通常一般のエタノール法によ
り精製し、真空乾燥した。得られた粉状物に５０ｍＭＥ
ＤＴＡ１μｌとホルムアミド５μｌを加えて溶解し、９
０℃で２分間インキュベートした後、急冷した。

【００４３】反応物をアプライド・バイオシステム製Ｄ
ＮＡシーケンシング・システム『３７３型』に装着した
６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上に適量とり、
電気泳動して反応物を分離し、解析したところ、相補鎖
ＤＮＡは配列表における配列番号５に示す塩基配列を含
んでいた。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は
配列表における配列番号３に示したとおりであり、その
アミノ酸配列と配列表における配列番号１及び２に示す
部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号２に示す
部分アミノ酸配列は配列番号３のアミノ酸配列における
第１乃至２１番目の配列に、また、配列番号１に示す部
分アミノ酸配列は配列番号３のアミノ酸配列における第
２０１乃至２１２番目の配列に一致した。このことは、
本例のポリペプチドが配列表における配列番号３に示す
アミノ酸配列を有するものであり、バチルス・スピシー
ズＶ２３０株においては、そのアミノ酸配列が配列表に
おける配列番号４、詳細には、配列番号５に示す塩基配
列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
なお、配列表における配列番号５に示す塩基配列におい
て、第３６１乃至４５６番目の塩基配列は、分泌型酵素
一般に認められるシグナルペプチド領域であると推定さ
れる。

【００４４】

【実施例２】 〈形質転換体を用いるポリペプチドの製造と理化学的性
質〉

【００４５】

【実施例２−１】 〈形質転換体によるポリペプチドの製造〉蔗糖１．０％
（ｗ／ｖ）、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エ
キス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二カリウム０．１％（ｗ
／ｖ）、燐酸一ナトリウム・２水塩０．０６％（ｗ／
ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／
ｖ）、炭酸カルシウム０．３％（ｗ／ｖ）及び水からな
る液体培地を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容フラスコにと
り、１２０℃で１５分間オートクレーブした滅菌し、冷
却し、ｐＨ７．０に調整した後、アンピシリンを５０μ
ｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実施例１−５の方法に
より得た形質転換体ＢＢＦ４を接種し、３７℃で２０時
間回転振盪培養して種培養物を得た。

【００４６】１０ｌ容ジャーファーメンターに上記と同
一組成の新鮮な液体培地を約７ｌとり、同様にして滅菌
し、３７℃まで冷却し、ｐＨ調整し、アンピシリンを加
えた後、種培養物を１％（ｖ／ｖ）接種し、２０時間通
気撹拌培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕
し、遠心分離により不溶物を除去し、上清に硫酸アンモ
ニウムを７０％飽和になるように加え、４℃で２４時間
静置した後、遠心分離により沈澱を採取した。この沈澱
を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液に対して４℃で２４時間透析した後、透析
内液中のβ−フラクトフラノシダーゼ活性を測定したと
ころ、培養物１ｌ当たり、約８単位のポリペプチドが産
生していた。その後、この粗ポリペプチドを実施例１−
１の方法により精製したところ、比活性２０５単位／ｍ
ｇ蛋白質のポリペプチドが培養物１ｌ当り約８ｍｇの収
量で得られた。

【００４７】対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株又
はバチルス・スピーシーズＶ２３０株をアンピシリン無
含有の上記と同一組成の液体培地を用いて、バチルス・
スピーシーズＶ２３０株の場合、培養温度を３０℃に設
定した以外は上記と同様に培養し、処理した。培養上清
の活性を測定したところ、バチルス・スピーシーズＶ２
３０株のβ−フラクトフラノシダーゼ産生は培養物１ｌ
当り３．６単位程度であり、これは形質転換体ＢＢＦ４
に比較して有意に低いものであった。なお、宿主に用い
た大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、β−フラクトフラノシ
ダーゼを全く産生しなかった。

【００４８】

【実施例２−２】 〈ポリペプチドの理化学的性質〉

【００４９】

【実施例２−２（ａ）】 〈作用〉基質として蔗糖、ラフィノース、エルロース、
スタキオース、ラクトスクロース、キシロシルフラクト
シド、マルトース、セロビオース、乳糖、イヌリン又は
レバンのいずれかを２％（ｗ／ｖ）含む水溶液に、実施
例２−１の方法により得たポリペプチドを基質固形分１
ｇ当り２単位ずつ加え、４０℃、ｐＨ５．５で２４時間
反応させた。

【００５０】それぞれの反応物を適量とり、メルク製シ
リカゲル薄層クロマトグラフィー用ゲル『キーゼルゲル
６０』にスポットし、室温下、１−ブタノール／ピリジ
ン／水混液（容量比７：３：１）により展開した後、乾
燥させた。そして、反応物がフラクトースを含む場合に
は、０．２％（ｗ／ｖ）ナフトレゾルシノールを含む
０．５Ｎ燐酸溶液を噴霧した後、１１０℃で５分間加熱
し、また、反応物がフラクトース以外の糖質を含む場合
には、２０％（ｗ／ｖ）硫酸／メタノール混液を噴霧
し、１１０℃で１０分間加熱して発色させた。その結
果、本例のポリペプチドは蔗糖、ラフィノース、エルロ
ース、スタキオース、ラクトスクロース及びキシロシル
フラクトシドにβ−フラクトフラノシダーゼ活性を発揮
してフラクトースを遊離するものの、マルトース、セロ
ビオース、乳糖、イヌリン及びレバンには実質的に作用
しないことが判明した。

【００５１】さらに、フラクトフラノシル受容体として
表１に示す単糖、オリゴ糖及びアルコールを用い、本例
のポリペプチドによるフラクトフラノシル転移の特異性
を調べた。すなわち、表１に示すいずれかのフラクトフ
ラノシル受容体とフラクトフラノシル供与体としての蔗
糖を重量比で等量混合し、これを１０％（ｗ／ｖ）にな
るように溶解した水溶液に実施例２−１の方法により得
たポリペプチドを蔗糖固形分１ｇ当り２単位ずつ加え、
４０℃、ｐＨ５．５で２４時間反応させた。そして、反
応物を上記と同様の薄層クロマトグラフィーにより分離
した後、０．２％（ｗ／ｖ）ナフトレゾルシノールを含
む０．５Ｎ燐酸溶液を噴霧し、１１０℃で５分間加熱し
て発色させてフラクトフラノシル転移物を検出した。結
果を表１に示す。

【００５２】

【表１】

【００５３】表１に示す結果から明らかなように、本例
のポリペプチドは、フラクトフラノシル供与体としての
蔗糖からＤ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、マルトー
ス、イソマルトース、セロビオース、マルトトリオー
ス、パノース、乳糖、メリビオース、トレハロースへの
フラクトフラノシル転移を触媒し、それぞれのフラクト
フラノシル受容体に対応するフラクトフラノシル転移物
を生成する。また、本例のポリペプチドは上記のような
糖質に対してのみならず、Ｄ−キシリトール、Ｄ−ソル
ビトール、マルチトールを始めとする糖アルコールや、
グリセロール、エチレングリコールなどのアルコールに
も作用し、それぞれに対応するフラクトフラノシル転移
物を生成する。

【００５４】

【実施例２−２（ｂ）】 〈分子量〉実施例２−１の方法により得たポリペプチド
をゲル濃度１０％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に供し、同時に泳動した分子量マーカ
ーの移動度と比較して分子量を測定したところ、分子量
は４４，０００乃至５４，０００ダルトンであった。な
お、分子量マーカーには、ウサギ筋肉フォスフォリラー
ゼＢ（９７，４００ダルトン）、ウシ血清アルブミン
（６６，２００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０
００ダルトン）、ウシカルボニックアンヒドラーゼ（３
１，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター
（２１，５００ダルトン）及び卵白リゾチーム（１４，
４００ダルトン）を用いた。

【００５５】

【実施例２−２（ｃ）】 〈至適ｐＨ〉常法により、ｐＨの相違する２０ｍＭ緩衝
液中、４０℃で１０分間インキュベートしたところ、図
２に示すように、本例のポリペプチドはｐＨ５．５乃至
６．０付近に至適ｐＨを示した。

【００５６】

【実験例２−２（ｄ）】 〈至適温度〉常法により、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
６．０）中で１０分間インキュベートしたところ、図３
に示すように、本例のポリペプチドは５ｍＭカルシウム
イオン存在下では５０℃付近に、また、カルシウムイオ
ンの非存在下では４５℃付近に至適温度を示した。

【００５７】

【実験例２−２（ｅ）】 〈ｐＨ安定性〉常法により、ｐＨの相違する１００ｍＭ
緩衝液中、４℃で２４時間インキュベートしたところ、
図４に示すように、本例のポリペプチドはｐＨ５．０乃
至８．０付近まで安定であった。

【００５８】

【実施例２−２（ｆ）】 〈熱安定性〉常法により、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
６．０）中で６０分間インキュベートしたところ、図５
に示すように、本例のポリペプチドは４５℃付近まで安
定であった。

【００５９】

【実施例３】 〈形質転換体によるポリペプチドの製造〉

【００６０】

【実施例３−１】 〈形質転換体ＢＢ５の作製〉実施例１−５の方法により
得た組換えＤＮＡ ｐＢＢＦ４を制限酵素ＰｓｔＩで切
断し、宝酒造製『ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ』
を用いて切断部を平滑化した後、常法にしたがってアガ
ロース電気泳動して当該ポリペプチドをコードする塩基
配列を含む約２，８００塩基対のＤＮＡ断片を得た。こ
のＤＮＡ断片とあらかじめ制限酵素Ｓｍａ Ｉで切断し
ておいた東洋紡績製プラスミドベクター『ｐＨＹ３００
ＰＬＫ』と宝酒造製『ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ』を用いて連結した。得られた組換えＤＮＡをシェー
ファーらが『プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンンシーズ・ユナイテッ
ド・ステイツ・オブ・アメリカ』、第７３巻、２，１５
１乃至２，１５５頁（１９７６年）に報告している方法
に準じてプロトプラスト化したバチルス・ズブチリスＩ
ＳＷ１２１４株に加え、さらに、関口らが『アグリカル
チュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー』、
第４６巻、１，６１７乃至１，６２１頁（１９８２年）
に報告している方法に準じて形質転換した。斯くして得
られた枯草菌を宿主とする形質転換体を『ＢＢＦ５』と
命名した。

【００６１】この形質転換体ＢＢＦ５をテトラサイクリ
ン１０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）
に植菌し、３０℃で２４時間回転振盪培養した後、組換
えＤＮＡを実施例１−４と同様にして抽出し、精製し、
分析したところ、形質転換体ＢＢＦ５に含まれる組換え
ＤＮＡ、すなわち、ｐＢＢＦ５は約７，７００塩基対か
らなり、図６に示すような制限酵素切断部位を有してい
た。

【００６２】

【実施例３−２】 〈形質転換体によるポリペプチドの製造〉蔗糖５．０％
（ｗ／ｖ）、ポリペプトン１．０％（ｗ／ｖ）、酵母エ
キス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二カリウム０．１％（ｗ
／ｖ）、燐酸一ナトリウム・２水塩０．０６％（ｗ／
ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／
ｖ）、炭酸カルシウム０．３％（ｗ／ｖ）及び水からな
る液体培地を５００ｍｌ容フラスコに１００ｍｌずつと
り、１２０℃で１５分間オートクレーブして滅菌し、冷
却し、ｐＨ７．０に調整した後、テトラサイクリンを１
０μｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実施例３−１の方
法により得た形質転換体ＢＢＦ５を接種し、３０℃で２
４時間回転振盪培養して種培養物を得た。

【００６３】３０ｌ容ファーメンターに上記と同一組成
の新鮮な液体培地を約１９ｌとり、同様に滅菌し、３０
℃まで冷却し、ｐＨ調整し、テトラサイクリンを加えた
後、種培養物１％（ｖ／ｖ）を接種し、２４時間通気攪
拌培養した。形質転換体ＢＢＦ５が産生したポリペプチ
ドの大部分は培養上清中に認められ、そのβ−フラクト
フラノシダーゼ活性は４５単位／ｍｌであった。培養液
をＭＦ膜により濾過し、その濾液をＵＦ膜により濃縮し
たところ、約８００単位／ｍｌのポリペプチド水溶液が
８２０ｍｌ得られた。

【００６４】その後、実施例１−１と同様にしてポリペ
プチドを精製した後、実施例２−２の方法により理化学
的性質を調べたところ、本例のポリペプチドは実施例２
−１のものと同様の理化学的性質を有していた。

【００６５】

【実施例４】 〈乳糖へのフラクラクトフラノシル転移〉フラクトフラ
ノシル供与体としての蔗糖とフラクトフラノシル受容体
としての乳糖をそれぞれ２０％（ｗ／ｗ）含む水溶液を
ｐＨ５．５に調整し、これに実施例２−１の方法により
得た粗ペプチドを蔗糖固形分１ｇ当り１単位加え、５５
℃で１６時間反応させた。反応物を９０℃で３０分間加
熱してポリペプチドを失活させた後、冷却し、常法にし
たがって活性炭で脱色し、濾過し、イオン交換樹脂によ
り脱塩して精製し、濃縮して、濃度７５％（ｗ／ｗ）の
シラップ状物を原料固形分当り９５％の収率で得た。

【００６６】固形分当りラクトスクロースを３７％含む
本品は、良好な呈味と甘味に加えて、適度の保湿性を有
しており、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌
増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして飲食物、化
粧品、医薬品に有利に配合使用できる。

【００６７】

【実施例５】 〈乳糖へのフラクトフラノシル転移〉フラクトフラノシ
ル供与体としての蔗糖を２２％（ｗ／ｗ）とフラクトフ
ラノシル受容体としての乳糖を１８％（ｗ／ｗ）含む水
溶液をｐＨ６．０に調整し、これに実施例３−１の方法
により得た粗ポリペプチドを蔗糖固形分１ｇ当り１単位
と、インベルターゼ欠損酵母を固形分当り湿重量で５％
（ｗ／ｗ）になるようにそれぞれ加え、１Ｎ水酸化ナト
リウム溶液によりｐＨを６乃至７に保ちながら３５℃で
２０時間反応させた。反応物を９０℃で３０分間加熱し
てポリペプチドを失活させ、冷却し、常法にしたがって
活性炭で脱色し、濾過し、イオン交換樹脂により脱塩・
精製し、濃縮した後、真空乾燥し、粉砕して粉状物を原
料固形分当り７０％の収率で得た。

【００６８】固形分当りラクトスクロースを６５％含む
本品は、良好な呈味と甘味に加えて、適度の保湿性を有
しており、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌
増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして飲食物、化
粧品、医薬品に有利に配合使用できる。

【００６９】

【実施例６】 〈マルトースへのフラクトフラノシル転移〉フラクトフ
ラノシル供与体としての蔗糖とフラクトフラノシル受容
体としてのマルトースをそれぞれ２０％（ｗ／ｗ）含む
水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実施例２−１の方
法により得たポリペプチドを蔗糖固形分１ｇ当り１単位
加え、５０℃で２４時間反応させた。反応物を９０℃で
３０分間加熱してポリペプチドを失活させ、冷却し、常
法にしたがって活性炭で脱色し、濾過し、イオン交換樹
脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度７５％（ｗ／ｗ）
のシラップ状物を原料固形分当り９５％の収率で得た。
このシラップ状物は、固形分当り、エルロースを約２８
％含んでいた。

【００７０】その後、このシラップ状物を４５％（ｗ／
ｗ）まで濃縮した後、エルロース含量を高めるべく、ダ
ウケミカル製アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂
『ダウエックス５０Ｗ×４（Ｃａ型）』を用いるカラム
クロマトグラフィーに供した。すなわち、同カチオン交
換樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製
円筒管４本にカラム状に充填し、円筒管を直列に連結し
てカラム全長を２０ｍとした後、カラム温度を４０℃に
保ちつつ、シラップ状物を樹脂に対して５％（ｖ／ｖ）
負荷し、４０℃の温水をＳＶ０．２の流速で流して分画
した。そして、エルロース高含有画分を採取し、常法に
したがって精製し、濃縮し、真空乾燥し、粉砕したとこ
ろ、固形分当りエルロースを８４％含む粉状物を原料固
形分当り２５％の収率で得た。

【００７１】本例のシラップ状物は良好な呈味と甘味に
加えて、適度の保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良
剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促
進剤などとして飲食物、化粧品、医薬品に有利に配合使
用できる。一方、本例の粉状物は還元性低く、呈味及び
甘味良好なうえに、適度な保湿性と低う蝕性をも有して
いるので、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌
増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして飲食物、化
粧品、医薬品に有利に配合使用できる。

【００７２】

【実施例７】 〈キシロースへのフラクトフラノシル転移〉フラクトフ
ラノシル供与体として蔗糖３０％（ｗ／ｗ）とフラクト
フラノシル受容体としてのキシロースを１５％（ｗ／
ｗ）含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実施例１
−２の方法により得た粗ポリペプチドを蔗糖固形分１ｇ
当り０．５単位加え、５０℃で４０時間反応させた。反
応物を９０℃で３０分間加熱してポリペプチドを失活さ
せた後、冷却し、常法にしたがって活性炭で脱色し、濾
過し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃
度７５％（ｗ／ｗ）のシラップ状物を原料固形分当り９
５％の収率で得た。

【００７３】固形分当りキシロシルフラクトシドを３５
％含む本品は、良好な呈味と甘味に加えて、適度な粘度
と保湿性、さらには、低う蝕性をも有しているので、甘
味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、
ミネラル吸収促進剤などとして飲食物、化粧品、医薬品
に有利に配合使用できる。

【００７４】

【実施例８】 〈キシロースへのフラクトフラノシル転移〉フラクトフ
ラノシル供与体としての蔗糖を３０％（ｗ／ｗ）とフラ
クトフラノシル受容体としてのキシロースを１５％（ｗ
／ｗ）含む水溶液をｐＨ６．０に調整し、これに実施例
３−１の方法により得た粗ポリペプチドを蔗糖固形分１
ｇ当り０．５単位加え、５０℃で４０時間反応させた。
反応物に水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１０以上に保ち
ながら１００℃で加熱した後、冷却し、常法にしたがっ
て活性炭で脱色し、濾過し、イオン交換樹脂により脱塩
・精製し、濃縮して濃度７５％（ｗ／ｗ）のシラップ状
物を原料固形分当り５５％の収率で得た。

【００７５】固形分当りキシロシルフラクトシドを６０
％含む本品は、良好な呈味と甘味に加えて、適度な粘度
と保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、
ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとし
て飲食物、化粧品、医薬品に有利に配合使用できる。

【００７６】

【実施例９】 〈トレハロースへのフラクトフラノシル転移〉フラクト
フラノシル供与体としてのラフィノースを１４％（ｗ／
ｗ）とフラクトフラノシル受容体としてのトレハロース
を１０％（ｗ／ｗ）含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、
これに実施例２−１の方法により得た粗ポリペプチドを
ラフィノース固形分１ｇ当り０．４単位加え、５０℃で
４０時間反応させた。反応物を９０℃で３０分間加熱し
てポリペプチドを失活させ、冷却し、常法にしたがって
活性炭で脱色し、濾過し、イオン交換樹脂により脱塩・
精製し、濃縮した後、真空乾燥し、粉砕して粉状物を原
料固形分当り９５％の収率で得た。

【００７７】固形分当りフラクトフラノシルトレハロー
スを２０％含む本品は、良好な呈味と甘味に加えて、適
度な粘度と保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良剤、
安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収剤など
として飲食物、化粧品、医薬品に有利に配合使用でき
る。

【００７８】

【発明の効果】以上説明したように、この発明は、組換
えＤＮＡ技術を適用することにより容易に大量生産可能
なβ−フラクトフラノシダーゼ活性ポリペプチドを提供
するものである。この発明のポリペプチドはアミノ酸配
列の一部又は全部が明らかにされたポリペプチドであ
り、食品、化粧品、医薬品への配合使用を前提とするフ
ラクトフラノシル転移物の製造に安心して使用し得るも
のである。斯くも有用なるポリペプチドは、形質転換体
を用いるこの発明の方法により、所望量を容易に製造す
ることができる。

【００７９】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する
発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のあ
る発明であると言える。

【００８０】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 Met Asn Ser Gly Asp Tyr Lys Glu Asp Tyr Gly Phe Ala His Ile Thr 1 5 10 15 Arg Ala Asp Met Leu 20

【００８１】配列番号：2 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【００８２】配列番号：3 配列の長さ：455 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Asn Ser Gly Asp Tyr Lys Glu Asp Tyr Gly Phe Ala His Ile Thr 1 5 10 15 Arg Ala Asp Met Leu Lys Ile Pro Gly Gln Gln Asn Ser Pro Gln Phe 20 25 30 Lys Val Pro Gln Phe Asn Ala Ser Ala Ile Lys Asn Ile Asp Ser Ala 35 40 45 Lys Gly Tyr Asp Lys Ser Gly Asn Leu Ile Asp Leu Asp Val Trp Asp 50 55 60 Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Ala Ala Asn Tyr His Gly 65 70 75 80 Tyr His Ile Val Ser Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asn Ser Asp Asp 85 90 95 Thr Pro Leu His Leu Phe Tyr Gln Lys Val Gly Asp Thr Ser Ile Asp 100 105 110 Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Glu Asp Met Asp Lys Phe Val 115 120 125 Pro Asn Asp Pro Tyr Leu Lys Tyr Gln Thr Gln Glu Trp Ser Gly Ser 130 135 140 Ala Thr Leu Thr Lys Asp Gly Gln Val Arg Leu Phe Tyr Thr Asp Tyr 145 150 155 160 Ser Gly Asn Pro Glu Asp Gly Gly Thr Gly Ala Gly Asn Gln Ile Ile 165 170 175 Ser Thr Ala Gln Val Asn Leu Ser Gln Pro Asp Ala Ala Thr Leu Lys 180 185 190 Val Asp Gly Val Ser Asp His Lys Ser Val Phe Asp Gly Gly Asp Gly 195 200 205 Thr Val Tyr Gln Asn Ile Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Lys Trp Ile 210 215 220 Ser Gly Asp Asn His Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys 225 230 235 240 Gly His Lys Tyr Leu Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Thr Asp Gly 245 250 255 Tyr Gln Gly Asp Gln Ser Phe Asn Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Gly Ser 260 265 270 Asp Val Phe Phe Gln Asn Glu Lys Asn Lys Leu Leu Gln Ser Pro Lys 275 280 285 Lys Gln Ile Ala Ser Leu Ala Asn Gly Ala Leu Gly Ile Val Glu Leu 290 295 300 Ala Asp Asp Tyr Thr Val Lys Ser Val Met Lys Pro Leu Val Ala Ser 305 310 315 320 Asn Thr Val Ala Asp Glu Val Glu Arg Ala Asn Ile Phe Lys Met Asn 325 330 335 Asn Lys Trp Tyr Leu Phe Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ser 340 345 350 Asp Gly Ile Asn Asp Lys Asp Val Tyr Met Leu Gly Pro Gly Gly Asp 355 360 365 Ser Leu Asn Gly Pro His Asn Pro Ile Asn Glu Thr Gly Leu Val Leu 370 375 380 Asn Met Asn Leu Asp Pro Ala Asp Leu Thr His Thr Tyr Ser His Cys 385 390 395 400 Gly Ile Pro His Pro Glu Gly Asn Asn Val Val Leu Thr Ser Tyr Met 405 410 415 Thr Asn Arg Gly Phe Tyr Pro Glu His His Ser His Leu Arg Asp Lys 420 425 430 Leu Gly Val Asn Ile Lys Gly Ser Asp Thr Ser Gly Gly Glu Asn Ser 435 440 445 Ser Gly Gln Gly Gln Phe Pro 450 455

【００８３】配列番号：4 配列の長さ：1365 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATG AAC AGC GGG GAC TAC AAG GAA GAC TAT GGT TTT GCC CAT ATT ACA 48 Met Asn Ser Gly Asp Tyr Lys Glu Asp Tyr Gly Phe Ala His Ile Thr 1 5 10 15 CGC GCT GAC ATG CTA AAA ATT CCA GGA CAA CAA AAC AGT CCT CAA TTT 96 Arg Ala Asp Met Leu Lys Ile Pro Gly Gln Gln Asn Ser Pro Gln Phe 20 25 30 AAA GTG CCT CAA TTC AAT GCA TCA GCA ATC AAA AAC ATT GAT TCG GCA 144 Lys Val Pro Gln Phe Asn Ala Ser Ala Ile Lys Asn Ile Asp Ser Ala 35 40 45 AAA GGG TAT GAT AAG TCA GGC AAC TTA ATA GAT TTA GAT GTA TGG GAT 192 Lys Gly Tyr Asp Lys Ser Gly Asn Leu Ile Asp Leu Asp Val Trp Asp 50 55 60 AGC TGG CCA CTG CAA AAC GCT GAT GGT ACT GCG GCA AAT TAT CAT GGA 240 Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Ala Ala Asn Tyr His Gly 65 70 75 80 TAT CAC ATC GTC TCC GCT TTA GCA GGT GAC CCA AAA AAC AGT GAT GAT 288 Tyr His Ile Val Ser Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asn Ser Asp Asp 85 90 95 ACT CCA CTT CAT TTA TTC TAT CAA AAA GTC GGT GAT ACA TCG ATT GAC 336 Thr Pro Leu His Leu Phe Tyr Gln Lys Val Gly Asp Thr Ser Ile Asp 100 105 110 AGC TGG AAA AAT GCT GGA AGA GTA TTT GAA GAT ATG GAT AAA TTT GTT 384 Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Glu Asp Met Asp Lys Phe Val 115 120 125 CCA AAT GAT CCG TAT CTT AAA TAT CAA ACA CAG GAG TGG TCA GGT TCT 432 Pro Asn Asp Pro Tyr Leu Lys Tyr Gln Thr Gln Glu Trp Ser Gly Ser 130 135 140 GCT ACT TTA ACC AAA GAT GGC CAA GTC CGT TTA TTC TAT ACA GAT TAC 480 Ala Thr Leu Thr Lys Asp Gly Gln Val Arg Leu Phe Tyr Thr Asp Tyr 145 150 155 160 TCA GGT AAT CCT GAA GAT GGT GGA ACC GGT GCT GGT AAC CAA ATC ATT 528 Ser Gly Asn Pro Glu Asp Gly Gly Thr Gly Ala Gly Asn Gln Ile Ile 165 170 175 TCA ACT GCT CAA GTA AAC TTA TCC CAG CCG GAT GCA GCT ACA CTT AAA 576 Ser Thr Ala Gln Val Asn Leu Ser Gln Pro Asp Ala Ala Thr Leu Lys 180 185 190 GTC GAT GGA GTA TCT GAT CAT AAA TCT GTC TTT GAT GGC GGA GAC GGT 624 Val Asp Gly Val Ser Asp His Lys Ser Val Phe Asp Gly Gly Asp Gly 195 200 205 ACA GTT TAT CAA AAT ATT CAG CAA TTT ATC GAT GAA GGC AAG TGG ATT 672 Thr Val Tyr Gln Asn Ile Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Lys Trp Ile 210 215 220 TCA GGT GAT AAC CAT ACT TTA AGA GAC CCT CAC TAT GTT GAA GAT AAG 720 Ser Gly Asp Asn His Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys 225 230 235 240 GGC CAT AAA TAT CTT GTC TTT GAA GCG AAT ACT GGA ACA ACA GAT GGT 768 Gly His Lys Tyr Leu Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Thr Asp Gly 245 250 255 TAT CAA GGC GAT CAG TCT TTC AAT AAT AAA GCT TAC TAT GGC GGA AGT 816 Tyr Gln Gly Asp Gln Ser Phe Asn Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Gly Ser 260 265 270 GAC GTC TTC TTC CAG AAT GAA AAA AAT AAA CTG CTT CAA AGT CCT AAA 864 Asp Val Phe Phe Gln Asn Glu Lys Asn Lys Leu Leu Gln Ser Pro Lys 275 280 285 AAA CAA ATT GCT TCT TTA GCG AAT GGT GCA TTA GGC ATT GTT GAA TTG 912 Lys Gln Ile Ala Ser Leu Ala Asn Gly Ala Leu Gly Ile Val Glu Leu 290 295 300 GCC GAT GAC TAT ACA GTG AAA AGT GTT ATG AAA CCA TTA GTC GCA TCA 960 Ala Asp Asp Tyr Thr Val Lys Ser Val Met Lys Pro Leu Val Ala Ser 305 310 315 320 AAC ACA GTA GCA GAT GAA GTC GAA CGC GCC AAT ATA TTT AAA ATG AAT 1008 Asn Thr Val Ala Asp Glu Val Glu Arg Ala Asn Ile Phe Lys Met Asn 325 330 335 AAT AAA TGG TAT CTA TTC ACG GAT TCA AGA GGA TCC AAA ATG ACG AGT 1056 Asn Lys Trp Tyr Leu Phe Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ser 340 345 350 GAT GGA ATT AAC GAC AAA GAT GTT TAT ATG CTA GGG CCC GGA GGC GAC 1104 Asp Gly Ile Asn Asp Lys Asp Val Tyr Met Leu Gly Pro Gly Gly Asp 355 360 365 TCC TTA AAT GGC CCA CAC AAC CCG ATA AAT GAA ACT GGA CTT GTA TTG 1152 Ser Leu Asn Gly Pro His Asn Pro Ile Asn Glu Thr Gly Leu Val Leu 370 375 380 AAC ATG AAT CTT GAC CCT GCT GAT CTC ACA CAC ACT TAC TCT CAT TGC 1200 Asn Met Asn Leu Asp Pro Ala Asp Leu Thr His Thr Tyr Ser His Cys 385 390 395 400 GGT ATC CCG CAC CCT GAA GGT AAT AAT GTG GTA CTC ACA AGT TAT ATG 1248 Gly Ile Pro His Pro Glu Gly Asn Asn Val Val Leu Thr Ser Tyr Met 405 410 415 ACG AAT AGA GGC TTC TAT CCA GAA CAT CAC TCT CAC CTG CGG GAC AAG 1296 Thr Asn Arg Gly Phe Tyr Pro Glu His His Ser His Leu Arg Asp Lys 420 425 430 CTT GGG GTT AAT ATT AAA GGG TCT GAC ACA TCT GGA GGA GAA AAT AGT 1344 Leu Gly Val Asn Ile Lys Gly Ser Asp Thr Ser Gly Gly Glu Asn Ser 435 440 445 TCC GGA CAA GGA CAA TTC CCA 1365 Ser Gly Gln Gly Gln Phe Pro 450 455

【００８４】配列番号：5 配列の長さ：2408 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 起源： 生物名：バチルス・スピーシーズ 株名：V230 (FERM BP-5054) 配列の特徴 特徴を表す記号：5´UTR 存在位置：1..360 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：signal peptide 存在位置：361..456 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：457..1821 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：3´UTR 存在位置：1822..2408 特徴を決定した方法：E 配列 CGGGGAAAAT ACTAGATTCC AATTGGCCAG ACTTCCCAGT TGGTGTAAGA GAAGAGTTCG 60 GACTGCCAAT GCAGCTGTGC GTAAGAAAAC AGCTTACTCA TGAGCAATTA CTAGAAGAAT 120 TTCAAAAGTC CTGGGATAAG GCCAAGTCCA CTTTGAAATA AACTTTTCAG CCTCTGTGTG 180 GGGGCTTTTT TGTTTTTATT TATTTCAACT GCAAGTGGTC CATCCCCTAT ATCAATTTAA 240 GACGAAATTC TAATCAATCC ATGCCATCCC CAATAAACTC GTCCTCCTCT ATACTTTTAA 300 TTAATAAGAA ACTATCAAGA GCTTTCTTAT CAAATTCATA CATATCCAAG GAGGGAGACG 360 ATG AAC TTC AAA AGA TTG GCG AAA AAA GCA GCT GCC GTA ACC TTC AGG 408 Met Asn Phe Lys Arg Leu Ala Lys Lys Ala Ala Ala Val Thr Phe Arg -30 -25 -20 ACT GCT ATA TTA GTA GGA GCG GAC GGA CCG CAT ATT TTT GCG CAG CAA 456 Thr Ala Ile Leu Val Gly Ala Asp Gly Pro His Ile Phe Ala Gln Gln -15 -10 -5 ATG AAC AGC GGG GAC TAC AAG GAA GAC TAT GGT TTT GCC CAT ATT ACA 504 Met Asn Ser Gly Asp Tyr Lys Glu Asp Tyr Gly Phe Ala His Ile Thr 1 5 10 15 CGC GCT GAC ATG CTA AAA ATT CCA GGA CAA CAA AAC AGT CCT CAA TTT 552 Arg Ala Asp Met Leu Lys Ile Pro Gly Gln Gln Asn Ser Pro Gln Phe 20 25 30 AAA GTG CCT CAA TTC AAT GCA TCA GCA ATC AAA AAC ATT GAT TCG GCA 600 Lys Val Pro Gln Phe Asn Ala Ser Ala Ile Lys Asn Ile Asp Ser Ala 35 40 45 AAA GGG TAT GAT AAG TCA GGC AAC TTA ATA GAT TTA GAT GTA TGG GAT 648 Lys Gly Tyr Asp Lys Ser Gly Asn Leu Ile Asp Leu Asp Val Trp Asp 50 55 60 AGC TGG CCA CTG CAA AAC GCT GAT GGT ACT GCG GCA AAT TAT CAT GGA 696 Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Ala Ala Asn Tyr His Gly 65 70 75 80 TAT CAC ATC GTC TCC GCT TTA GCA GGT GAC CCA AAA AAC AGT GAT GAT 744 Tyr His Ile Val Ser Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asn Ser Asp Asp 85 90 95 ACT CCA CTT CAT TTA TTC TAT CAA AAA GTC GGT GAT ACA TCG ATT GAC 792 Thr Pro Leu His Leu Phe Tyr Gln Lys Val Gly Asp Thr Ser Ile Asp 100 105 110 AGC TGG AAA AAT GCT GGA AGA GTA TTT GAA GAT ATG GAT AAA TTT GTT 840 Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Glu Asp Met Asp Lys Phe Val 115 120 125 CCA AAT GAT CCG TAT CTT AAA TAT CAA ACA CAG GAG TGG TCA GGT TCT 888 Pro Asn Asp Pro Tyr Leu Lys Tyr Gln Thr Gln Glu Trp Ser Gly Ser 130 135 140 GCT ACT TTA ACC AAA GAT GGC CAA GTC CGT TTA TTC TAT ACA GAT TAC 936 Ala Thr Leu Thr Lys Asp Gly Gln Val Arg Leu Phe Tyr Thr Asp Tyr 145 150 155 160 TCA GGT AAT CCT GAA GAT GGT GGA ACC GGT GCT GGT AAC CAA ATC ATT 984 Ser Gly Asn Pro Glu Asp Gly Gly Thr Gly Ala Gly Asn Gln Ile Ile 165 170 175 TCA ACT GCT CAA GTA AAC TTA TCC CAG CCG GAT GCA GCT ACA CTT AAA 1032 Ser Thr Ala Gln Val Asn Leu Ser Gln Pro Asp Ala Ala Thr Leu Lys 180 185 190 GTC GAT GGA GTA TCT GAT CAT AAA TCT GTC TTT GAT GGC GGA GAC GGT 1080 Val Asp Gly Val Ser Asp His Lys Ser Val Phe Asp Gly Gly Asp Gly 195 200 205 ACA GTT TAT CAA AAT ATT CAG CAA TTT ATC GAT GAA GGC AAG TGG ATT 1128 Thr Val Tyr Gln Asn Ile Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Lys Trp Ile 210 215 220 TCA GGT GAT AAC CAT ACT TTA AGA GAC CCT CAC TAT GTT GAA GAT AAG 1176 Ser Gly Asp Asn His Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys 225 230 235 240 GGC CAT AAA TAT CTT GTC TTT GAA GCG AAT ACT GGA ACA ACA GAT GGT 1224 Gly His Lys Tyr Leu Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Thr Asp Gly 245 250 255 TAT CAA GGC GAT CAG TCT TTC AAT AAT AAA GCT TAC TAT GGC GGA AGT 1272 Tyr Gln Gly Asp Gln Ser Phe Asn Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Gly Ser 260 265 270 GAC GTC TTC TTC CAG AAT GAA AAA AAT AAA CTG CTT CAA AGT CCT AAA 1320 Asp Val Phe Phe Gln Asn Glu Lys Asn Lys Leu Leu Gln Ser Pro Lys 275 280 285 AAA CAA ATT GCT TCT TTA GCG AAT GGT GCA TTA GGC ATT GTT GAA TTG 1368 Lys Gln Ile Ala Ser Leu Ala Asn Gly Ala Leu Gly Ile Val Glu Leu 290 295 300 GCC GAT GAC TAT ACA GTG AAA AGT GTT ATG AAA CCA TTA GTC GCA TCA 1416 Ala Asp Asp Tyr Thr Val Lys Ser Val Met Lys Pro Leu Val Ala Ser 305 310 315 320 AAC ACA GTA GCA GAT GAA GTC GAA CGC GCC AAT ATA TTT AAA ATG AAT 1464 Asn Thr Val Ala Asp Glu Val Glu Arg Ala Asn Ile Phe Lys Met Asn 325 330 335 AAT AAA TGG TAT CTA TTC ACG GAT TCA AGA GGA TCC AAA ATG ACG AGT 1512 Asn Lys Trp Tyr Leu Phe Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ser 340 345 350 GAT GGA ATT AAC GAC AAA GAT GTT TAT ATG CTA GGG CCC GGA GGC GAC 1560 Asp Gly Ile Asn Asp Lys Asp Val Tyr Met Leu Gly Pro Gly Gly Asp 355 360 365 TCC TTA AAT GGC CCA CAC AAC CCG ATA AAT GAA ACT GGA CTT GTA TTG 1608 Ser Leu Asn Gly Pro His Asn Pro Ile Asn Glu Thr Gly Leu Val Leu 370 375 380 AAC ATG AAT CTT GAC CCT GCT GAT CTC ACA CAC ACT TAC TCT CAT TGC 1656 Asn Met Asn Leu Asp Pro Ala Asp Leu Thr His Thr Tyr Ser His Cys 385 390 395 400 GGT ATC CCG CAC CCT GAA GGT AAT AAT GTG GTA CTC ACA AGT TAT ATG 1704 Gly Ile Pro His Pro Glu Gly Asn Asn Val Val Leu Thr Ser Tyr Met 405 410 415 ACG AAT AGA GGC TTC TAT CCA GAA CAT CAC TCT CAC CTG CGG GAC AAG 1752 Thr Asn Arg Gly Phe Tyr Pro Glu His His Ser His Leu Arg Asp Lys 420 425 430 CTT GGG GTT AAT ATT AAA GGG TCT GAC ACA TCT GGA GGA GAA AAT AGT 1800 Leu Gly Val Asn Ile Lys Gly Ser Asp Thr Ser Gly Gly Glu Asn Ser 435 440 445 TCC GGA CAA GGA CAA TTC CCA TA GCGATTATCT CCCAATAAAA AGAAATGTCA 1853 Ser Gly Gln Gly Gln Phe Pro 450 455 CTGGCAAGAT CCTACCTTTT CCCCAACCTT TTTTTTTAAA ATAAAGGGTT TTGTACCACC 1913 TTTAGAAGAA AAAAGAATCC TTGGCCCGGG CCAATTACCC ATTGCCGAAG GAGCTACCCA 1973 ATAAAAAAGA AATTTTCCCT TTTTAGGGGG GGAGTCCTTT TTTTCTATCT TGGGGTGGGG 2033 ATTGTTGGCC CCCACCAGGG GACCTTTATT AATTTATAGC ATGAATCTGG CGATTTTGCC 2093 TGGCCTACTT ATTATCCAAG CCGCCCAGCC AAAAATATTA AACCAAGGAA TCCTAAGAGT 2153 AGGCGGTACA GTTTACCAAC ACCTGCTGGA GGGGATGGAT ATCGCCCTCA ATACCACTTT 2213 TCTGTTCCCG ACAAATGGAA AAATGATCCG CAGAGGCCCA TCTTTTTTGG GGGAAGTATC 2273 ATTACTATTA CCTTTACAAC AAAGACTATC CAGATGGAAA TGGTACGGAA TGGCGGCATG 2333 CAACGTCCGA AGATTTATTG CATTGGACGG ACGAAGGGAT TGCCATCCCG AAGTATACCA 2393 ATAAAAATGG TGATC 2408

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明による組換えＤＮＡ ｐＧＧＦ４の制
限酵素切断地図である。

【図２】この発明による実施例のポリペプチドの至適ｐ
Ｈを示す図である。

【図３】この発明による実施例のポリペプチドの至適温
度を示す図である。

【図４】この発明による実施例のポリペプチドのｐＨ安
定性を示す図である。

【図５】この発明による実施例ポリペプチドの熱安定性
を示す図である。

【図６】この発明による組換えＤＮＡ ｐＢＢＦ５の制
限酵素切断地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｎ 9/24 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物由来の遺伝子を発現させて得るこ
   とができ、部分アミノ酸配列として配列表における配列
   番号１及び２に示すアミノ酸配列の一部又は全部を含ん
   でなるβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペ
   プチド。
2. 【請求項２】 適宜のフラクトフラノシル供与体とフラ
   クトフラノシル受容体間のフラクトフラノシル転移を触
   媒する作用を兼備した請求項１に記載のβ−フラクトフ
   ラノシダーゼ活性を有するポリペプチド。
3. 【請求項３】 下記の理化学的性質を有した請求項１又
   は２に記載のβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有する
   ポリペプチド。 （１） 分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
   すると、分子量約４４，０００乃至５４，０００ダルト
   ンを示す。 （２） 至適ｐＨ ４０℃で１０分間反応させると、約５．５乃至６．０に
   至適ｐＨを示す。 （３） 至適温度 ｐＨ６．０で１０分間反応させると、カルシウムイオン
   非存在下で４５℃付近に、また、カルシウムイオン存在
   下で５０℃付近に至適温度を示す。 （４） ｐＨ安定性 ４℃で２４時間インキュベートすると、ｐＨ約５．０乃
   至８．０で安定である。 （５） 温度安定性 ｐＨ６．０で１時間インキュベートすると、４５℃付近
   まで安定である。
4. 【請求項４】 配列表における配列番号３に示すアミノ
   酸配列又はそのアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を
   有した請求項１、２又は３に記載のβ−フラクトフラノ
   シダーゼ活性を有するポリペプチド。
5. 【請求項５】 宿主として微生物を用い、バチルス属の
   微生物由来の遺伝子を発現させて得ることのできる請求
   項１、２、３又は４に記載のβ−フラクトフラノシダー
   ゼ活性を有するポリペプチド。
6. 【請求項６】 請求項１乃至５に記載のβ−フラクトフ
   ラノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡ。
7. 【請求項７】 配列表における配列番号４に示す塩基配
   列若しくはその塩基配列に相同的な塩基配列又はそれら
   の塩基配列に相補的な塩基配列を有する請求項６に記載
   のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 配列表における配列番号５に示す塩基配
   列又はその塩基配列に相補的な塩基配列を有する請求項
   ６又は７に記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 バチルス属の微生物に由来する請求項
   ６、７又は８に記載のＤＮＡ。
10. 【請求項１０】自律複製可能なベクターをさらに含んで
    なる請求項６、７、８又は９に記載のＤＮＡ。
11. 【請求項１１】請求項１乃至５に記載のβ−フラクトフ
    ラノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤ
    ＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体。
12. 【請求項１２】宿主が、微生物である請求項１１に記載
    の形質転換体。
13. 【請求項１３】請求項１乃至５に記載のβ−フラクトフ
    ラノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤ
    ＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体を培養する
    工程と、産生した該ポリペプチドを培養物から採取する
    工程を含んでなるβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有
    するポリペプチドの製造方法。
14. 【請求項１４】培養物からβ−フラクトフラノシダーゼ
    活性を有するポリペプチドを遠心分離、塩析、透析、濾
    過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、
    ゲル瀘過クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィ
    ー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
    ー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動
    及び／又は等電点電気泳動により採取する請求項１３に
    記載のβ−フラクトフラノシダーゼ活性を有するポリペ
    プチドの製造方法。
15. 【請求項１５】請求項１乃至５に記載のβ−フラクトフ
    ラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの存在下でフラ
    クトフラノシル供与体とフラクトフラノシル受容体を反
    応させる工程を含んでなるフラクトフラノシル転移方
    法。
16. 【請求項１６】フラクトフラノシル供与体が、蔗糖、ラ
    フィノース又はエルロースである請求項１５に記載のフ
    ラクトフラノシル転移方法。
17. 【請求項１７】フラクトフラノシル受容体が、分子内に
    β−フラクトフラノシド結合を有しない糖質、糖アルコ
    ール又はアルコールである請求項１５又は１６に記載の
    フラクトフラノシル転移方法。
18. 【請求項１８】反応生成物が、キシロシルフラクトシ
    ド、エルロース、イソマルトシルフラクトシド、ラクト
    スクロース又はフラクトシルトレハロースである請求項
    １５、１６又は１７に記載のフラクトフラノシル転移方
    法。
19. 【請求項１９】フラクトフラノシル供与体１重量部に対
    してフラクトフラノシル受容体を０．１乃至１０重量部
    用い、ｐＨ３．５乃至８．０、温度６０℃以下で反応さ
    せる請求項１５、１６、１７又は１８に記載のフラクト
    フラノシル転移方法。