KR100427529B1

KR100427529B1 - 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 재조합형 열안정성 효소

Info

Publication number: KR100427529B1
Application number: KR1019950033682A
Authority: KR
Inventors: 쓰사키게이질; 구보타미치오; 스기모토도시유키
Original assignee: 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 1994-10-01
Filing date: 1995-10-02
Publication date: 2004-09-22
Also published as: IL115443A0; ATE234928T1; EP0704531A2; KR960014149A; JP3810457B2; JPH08149980A; EP0704531A3; AU3297595A; US6087146A; DE69529953T2; US6165768A; TW575665B; AU692298B2; TW493000B; US5773282A; DK0704531T3; DE69529953D1; ES2197182T3; EP0704531B1

Abstract

말토오스를 트레할로오스로 변환하고 pH 7.0 에서 60 분간 유지하더라도 약 80℃ 의 온도까지 안정한 재조합형 열안정성 효소, 이 효소의 제조방법, 이 효소를 코우드 하는 DNA, 이 DNA 를 함유한 재조합 DNA, 형질전환체 및 이 효소를 사용하는 말토오스의 효소적 변환방법을 제공한다.

Description

말토오스를 트레할로오스로 변환하는 재조합형 열안정성 효소

본 발명은 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 신규한 재조합형 열안정성 효소에 관한 것이다.

트레할로오스는 글루코오스 2 분자가 이들의 환원성 그룹으로 연결된 이당류인데, 박테리아, 진균류, 조류 (藻類), 곤충류 등에 극히 소량으로 존재하고 있다. 트레할로오스는 분자내에 환원성 잔기가 전혀 없으므로 아미노산 등의 존재하에 가열하더라도 불필요한 갈변 반응을 일으키지 않기 때문에 불필요한 착색이나 열화 (劣化) 를 일으킬 우려가 없이 유리하게 식품의 감미부여가 가능하다. 그러나, 트레할로오스는 종래의 방법으로서는 필요한 양으로 쉽사리 제조할 수 없으며 실제로 식품의 감미부여에 사용되는 일이 드물다.

종래의 방법은 대개 두가지로 나누어 지는데, 즉 그 한가지는 미생물의 세포를 사용하는 방법이고 다른 한가지는 당류에 효소를 작용시키는 다중 효소계를 이용하는 방법이다. 전자의 방법은 일본국 특허 공개 제 154,485/75 호에 개시되어 있는 바와 같이 박테리아, 효모 등의 미생물을 영양 배지중에서 생장시켜 수득한 배양액으로 부터 트레할로오스를 채취하는 방법이다. 후자의 방법은 일본국 특허 공개 제 216,695/83 호에 게시되어 있는 바와 같이 기질인 말토오스를 준비하고, 말토오스-포스포필라아제와 트레할로오스-포스포릴라아제를 사용하는 다중효소계를 말토오스에 작용시켜 생성된 트레할로오스를 반응계로 부터 회수하는 방법이다. 전자의 방법에서는 비교적 용이하게 미생물을 생장시킬 수 있겠으나 수득한 배양물은 건조 고형물 기준 (d.s.b.) 으로 트레할로오스를 많아야 15 w/w % 정도 함유하고 있다는 문제가 있었다. 후자의 방법에서는 트레할로오스를 비교적 용이하게 분리할 수는 있지만 효소반응 그 자체가 두가지의 상이한 효소의 평형 반응이고 평형점이 항시 글루코오스 포스페이트 생성쪽으로 기울어지기 때문에 효소를 기질에 대해 상당히 높은 농도로 작용시켜 트레할로오스 수율을 증가시킨다는 것은 이론적으로 어렵다.

이러한 사정을 고려하여 본 발명자들은 말토오스를 직접 트레할로오스로 변환하는 효소에 대해 예의 검색한 결과, 일본국 특허 출원 제 199,971/93 호 명세서에 개시된 바와 같이 피멜로박터속 (Pimelobacter屬) 과 슈우도모나스속 (Pseudomonas 屬) 등의 미생물에 속하는 미생물들이 말토오스에 작용하여 트레할로오스를 생성하는 아주 신규한 효소를 생산한다는 것을 발견하였다. 이것은 대량으로 저렴하게 입수할 수 있는 말토오스를 원료로 하여 트레할로오스를 제조할 수 있다는 것을 의미하며, 이러한 효소를 이용함으로써 상기 목적을 모두 완전히 해결할 수 있다.

이들 미생물 유래의 모든 효소를 최적온도가 약 20∼40℃ 이어서 이들의 열안정성으로서는 트레할로오스 제조에 다소 불충분하다는 것을 발견하였다. 또한, 이 분야에서 인식되고 있는 것은 전분과 전분물질을 일반적으로 55℃ 이상의 온도에서 당화 반응시켜야 한다는 점이다. 즉, 당화 반응을 55℃ 미만에서 시키면 세균오염이 증대되어 반응 혼합물의 pH 를 저하시키고 사용된 효소를 실활시켜 비교적 다량의 미반응 기질이 잔존하게 된다. 당화 반응을 열안정성이 불량한 효소를 사용하여 실시할 경우에는 pH 변화에 세심한 주의를 해야 하며, 일단 pH 가 저하되면 반응 혼합물에 알칼리를 첨가하여 pH 를 올려주어야 한다.

이러한 사정을 고려하여 본 발명자들은 이러한 활성을 가진 열안정성 효소에 대해 계속 연구를 한 결과, 더어무스 아쿠아티쿠스종 (Thermus aquaticus 種) 의 미생물 등의 더어무스속 (屬) 미생물 (ATCC 33923) 로 부터 생성된 효소는 55℃ 이상의 온도에서 반응시키더라도 실질적으로 실활함이 없이 말토오스를 트레할로오스로 효과적으로 변환한다는 것을 발견하였다. 그러나 이들 효소는 효소 생성 활성이 불충분하여 트레할로오스의 공업적 규모의 제조시에는 이러한 미생물을 상당히 대규모로 배양해야 된다는 문제점을 가지고 있다.

재조합 DNA 기술은 근년에 와서 현저한 발전을 하고 있다. 현재 이 효소를 코우드하는 유전자를 일단 분리하여 그 염기 배열을 해명할 수 있다면 이 효소를 코우드하는 DNA 를 가진 재조합 DNA 를 제조하여 이것을 미생물 또는 식물과 동물의 세포속에 도입한 다음 생성된 형질 전환체를 배양함으로써 전(全) 아미노산 배열이 밝혀지지 아니한 효소까지도 필요한 양으로 쉽사리 제조할 수 있다. 이러한 사정하에 시급히 요망되고 있는 것은 위에 나온 열안정성 효소를 코우드하는 유전자를 발견하여 그 염기 배열을 해독하는 것이다.

본 발명은 한가지 목적은 말토오스에 작용하여 트레할로오스를 생성하는 재조합형 열안정성 효소를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합형 효소를 코우드하는 DNA 를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 DNA 를 가진 복제 가능한 재조합 DNA 를 제공함에 있다.

본 발명의 추가적인 목적은 이러한 재조합 DNA 를 도입한 형질 전환체를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 추가적인 목적은 이러한 형질 전환체를 사용한 재조합형 효소의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합형 효소에 의하여 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 제 1 목적은 재조합형 효소에 의하여 달성된다.

본 발명의 제 2 목적은 이러한 재합형 효소를 코우드하는 DNA 에 의하여 달성된다.

본 발명의 제 3 목적은 DNA 와 자체 복제 가능한 벡터를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA 에 의하여 달성된다.

본 발명의 제 4 목적은 복제 가능한 재조합 DNA 를 적당한 숙주에 도입하여 얻는 형질 전환체에 의하여 달성된다.

본 발명의 제 5 목적은 형질 전환체를 영양 배지에서 배양하여 재조합형 효소를 생성시키고, 생성된 재조합형 효소를 수득한 배양물로 부터 채취함으로써 달성된다.

본 발명의 제 6 목적은 말토오스에 재조합형 효소를 작용시켜 트레할로오스를 생성시키는 공정단계를 포함하는 말토오스의 효소적 변환방법에 의해 달성된다.

본 발명에 의한 재조합형 효소는 55℃ 이상의 온도에서 반응시킬 경우에도 실질적으로 실활됨이 없이 말토오스에 작용하여 트레할로오스를 생성한다.

본 발명의 DNA 는 자체 복제 가능한 벡터에 도입하여 복제가 가능한 재조합 DNA 를 생성시킨 다음, 본래 재조합형 효소를 생성할 수는 없지만 용이하게 증식시킬 수 있는 적당한 숙주속에 도입하여 형질 전환체를 생성함으로써 본 발명의 재조합형 효소의 생산을 발현한다.

본 발명의 재조합 DNA 는 본래 재조합형 효소를 생산하지 않지만 용이하게 증식시킬 수 있는 적당한 숙주에 DNA 를 도입하여 형질 전환체를 생성시키고, 이 형질 전환체를 영양 배지에서 배양함으로써 재조합형 효소의 생산을 발현한다.

이 형질 전환체는 본 발명에 따라 배양시 필요한 양의 재조합형 효소를 생성한다.

본 발명의 효소적 변환방법에 의하여 말토오스를 트레할로오스, 글루코오스 및/또는 말토올리고당을 함유하는 당 조성물로 변환한다.

본 발명은 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 절대적으로 신규한 열안정성 효소의 발견에 근거하여 된 것이다. 이러한 효소는 더어무스 아쿠아티쿠스(ATCC 33923) 의 배양물로 부터 얻을 수 있는데, 본 발명자들은 칼럼 크로마토그래피를 포함한 각종 방법을 주로 사용하여 효소를 분리한 다음 그 성질과 성상에 대해 조사를 한 결과, 그 실체는 아래의 물리화학적 성질을 가진 폴리펩티드인 것을 해명하였다.

(1) 작용

말토오스에 작용하면 트레할로오스를, 트레할로오스에 작용하면 말토오스를 생성함 ;

(2) 분자량 (MW)

소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 (SDS-PAGE) 에 의하여 약 100,000∼110,000 달톤 ;

(3) 등전점 (pI)

등전점 전기 영동법에 의하여 약 3.8~4.8 ;

(4) 최적 온도

pH 7.0 에서 60 분 유지하여 약 65℃ ;

(5) 최적 pH

60℃ 에서 60 분 유지하여 약 6.0~6.7 ;

(6) 열적 안정성

pH 7.0 에서 60 분 유지하더라도 약 80℃ 까지 안정함 ;

(7) pH 안정성

60℃ 에서 60분 유지하더라도 pH 5.5~9.5 에서 안정함.

아래에 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 가 생산하는 열안정성 효소의 물리화학적 성질을 해명하기 위해 실시한 실험에 대해 설명한다.

실험 1 : 효소의 정제

실험 1-1 : 효소의 제조

500 mℓ 삼각 플라스크에 폴리펩톤 0.5 w/v.%, 효모 추출물 0.1 w/v %, 질산 나트륨 0.07 w/v %, 인산 수소 2 나트륨 0.01 w/v %, 황산 마그네슘 7 수화물 0.02 w/v %, 염화 칼슘 0.01 w/v % 및 물을 함유한 액체 배지 (pH 7.5) 100 mℓ씩을 각각 넣고 이들 플라스크를 120℃ 에서 20 분간 오토클레이브 처리하여 멸균시켰다. 플라스크를 냉각하고 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 종배양액을 각 플라스크내에 접종한 다음 200 rpm 의 회전진탕 조건하에 60℃ 에서 24시간 배양하여 배양물을 얻었다. 이어서, 신선한 동일한 액체 배지 20 리터씩을 30 리터 자아 퍼멘터 (jar fermenter) 에 넣고 멸균시키고 60℃ 로 냉각한 다음 위에서 얻은 종배양액 1 v/v % 을 각각의 퍼어멘터에다 접종하고 수득물을 통기, 교반 조건하에 pH 6.0∼8.0 및 60℃에서 약 20 시간 배양하였다.

배양종료후 배양물의 효소활성을 측정한 결과, 약 0.35 단위/mℓ 의 효소가 함유되어 있었다. 배양물의 일부를 원심분리하고 상청액중의 효소활성을 측정한 결과, 약 0.02 단위/mℓ의 효소를 함유하고 있있다. 분리한 균체를 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 에 현탁시켜 원래의 채취한 액량과 동일한 전체 액량으로 한 후 현탁액의 효소활성을 측정한 결과, 약 0.33 단위/mℓ의 효소를 함유하고 있었다.

명세서중에서 효소활성은 다음의 방법으로 측정한 값으로 나타낸 것이다.

즉, 말토오스를 20 w/v % 함유한 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 1 mℓ을 시험관에 넣고 적당한 농도로 희석한 효소액 1 mℓ을 가한 다음 60℃ 에서 60 분간 배양하여 효소 반응시킨 다음, 100℃ 에서 10 분간 가열하여 효소 반응을 정지시킨다. 이어서, 반응 혼합물의 일부를 50 mM 인산 완충액(pH 7.5) 으로 11 배로 희석하고 그 중 0.4 mℓ을 취하여 시험관에 넣고, 여기에 트레할라아제를 1 단위/mℓ 함유한 용액을 0.1 mℓ가하여 45℃ 에서 120 분간 인큐베이트한 후 반응물중의 글루코오스 함량을 글루코오스 옥시다아제법으로 정량하였다. 한편, 100℃ 에서 10 분간 가열하여 실활시킨 효소액과 트레할라아제액을 사용하는 계 (系) 를 만들어 상기와 마찬가지로 처리한 것을 대조 (control) 로 하였다. 상기와 같이 하여 정량은 글루코오스 함량으로부터 트레할로오스의 생성량을 추정할 수 있다. 이 효소 1 단위는 상기 조건하에서 1 분당 1 μmol 의 트레할로오스를 생성하는 효소량으로정의한다.

실험 1-2 : 효소의 정제

실험 1-1 에서 제조한 배양물을 원심분리하여 수득한 습균체 (wet cell) 약 0.28 kg 을 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에 현탁시키고 통상의 방법에 따라 파쇄한 후 원심분리하여 조 (粗) 효소액 약 1.8 리터를 얻었다. 이 조효소액에 황산 암모늄을 70 w/v % 포화로 되게 가하고 4℃ 에서 하룻밤 방치하여 염석한 후 원심분리하여 상청액을 얻었다. 이 상청액에 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 을 가하여 혼합하고 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 에 대해 24시간 투석하였다. 투석내액을 원심분리하여 얻은 상청액 (1,560 mℓ) 을 미리 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 평형화시켜 둔 이온 교환 수지 " DEAE-TOYOPEARL" (일본국의 Tosoh 사 판매) 530 mℓ가 충전된 칼럼에 부하하고 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에서의 0 M로 부터 0.4 M 로 상승하는 염화 나트륨의 직선 농도 기울기의 완충액을 칼럼에 통액하였다. 용출액으로 부터 목적으로 하는 효소 활성을 가진 획분을 채취하고 한데 모아 1 M 황산 암모늄을 함유한 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 에 대해 10 시간 투석한 후 원심분리하여 상청액을 얻었다. 이 상청액을 미리 1 M 황산 암모늄을 함유한 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0)으로 평형화시켜둔 소수 (疎水) 크로마토그래피용 겔 " BUTYL-TOYOPEARL" (일본국의 Tosho 사 판매) 380 mℓ가 충전된 칼럼에 부하하고 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에서의 1 M 로 부터 0 M 로 저하하는 황산 암모늄의 직선 농도 기울기의 완충액을 칼럼에 통액하였다. 0.2 M 황산 암모늄에서 용출하는 목적으로 하는 효소활성을 가진 획분을 채취하고 한데모아, 0.2 M 염화 나트륨을 함유한 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 대해 16 시간 투석하였다. 이 투석액을 원심분리하여 불용물을 제거하고 0.2 M 염화 나트륨을 함유한 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 미리 평형화시켜둔, 겔 여과용 수지 " TOYOPEARLHW-55S " (일본국의 Tosoh사 판매) 380 mℓ가 충전된 칼럼에 통액한 다음, 1 M 염화 나트륨을 함유한 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 을 칼럼에 통액하였다. 효소활성을 가진 획분을 용출액으로 부터 회수하여, 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 평형화시켜둔 " MONO Q HR5/5 " 가 충전된 칼럼에 부하한 후, 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에서의 0.1 M로 부터 0.35 M 로 상승하는 염화 나트륨의 직선 농도 기울기의 완충액을 칼럼에 통액하여 효소활성을 가진 획분을 채취하였다. 이와 같이하여 수득한 정제효소의 비활성은 약 135 단위/mg 단백질이었고 수득량은 배양물 1 리터당 약 330 단위이었다.

이 정제효소를 7.5 w/v % 폴리아크릴아미드 겔에서 전기 영동한 결과, 효소활성을 가진 단일의 단백질 밴드가 나타났는데, 이것은 이 정제효소가 극히 고순도인 것을 뜻한다.

실험 2 : 효소의 물리화학적 성질

실험 2-1 : 작용

기질로서 말토오스 또는 트레할로오스를 5 w/v % 함유하는 수용액에 실험 1-2에서 제조한 정제효소들 기질 1 g 당 2 단위 가하고 60℃, pH 7.0 에서 24 시간 인큐베이트하였다. 이 반응 혼합물의 당조성을 분석하고자 반응 혼합물을 진공건조하여 피리딘에 용해하고 통상의 방법으로 트리메틸실릴화한 후 가스 크로마토그래피 처리하였다. 이 분석에 사용된 장치와 조건은 다음과 같다.

장치 : 일본국 Shimadzu 제작소 판매의 가스 크로마토그래프 " GC-16A ",

칼럼 : 스테인레스강제 칼럼 (내경 3 mm, 길이 2 m)에 충전한 2 %

" SILICONE OV-17/CHROMOSOLB W " (일본국 GL Science 사 판매),

검출기 : 수소염 이온화 방식,

캐리어 가스 : 질소 가스 (유량 : 40 mℓ/분),

칼럼 온도 : 160∼320℃ (승온 속도 7.5℃/분).

아래의 표 1 에 반응 혼합물의 당조성이 나와 있다.

표 1

표 1 에서 알 수 있는 바와 같이 정제효소는 말토오스를 기질로 하여 작용 시켰을 때 트레할로오스 약 70 w/w % 와 글루코오스 약 4 w/w % 를 생성한 반면, 트레할로오스를 기질로 하여 작용시켰을 때 말토오스 약 21 w/w % 와 글루코오스 약 3 w/w % 를 생성하였다. 이들 사실은 정제효소가 말토오스를 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스를 말토오스로 변환시키는 활성이 있으며, 더욱이 말토오스 분자중의 α-1,4 결합과 트레할로오스 분자중의 α,α-1,1 결합을 가수분해하는 활성이 있음을 시사하고 있다. 이러한 효소작용은 아직 보고된 바 없으며 아주 신규한 효소작용 메카니즘을 가지고 있는 것이라 추정된다.

실험 2-2 : 분자량

문헌 [U. K. Laemmli, Nature, Vol.227, pp.680~685 (1970)] 에 보고된 방법에 따라 정제효소를 소디움 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 (SDS-PAGE) 으로 전기 영동 처리하여 약 100,000∼110,000 달톤에 해당되는 위치에서 단 하나의 단백질 밴드를 얻었다. 이 실험에 사용된 마아커 (marker) 단백질은 미오신 (MW = 200,000 달톤), β-갈락토시다아제 (MW = 116,250 달톤), 포스포릴라아제 B (MW = 97,400 달톤), 혈청 알부민 (MW = 66,200 달톤) 및 오브알부민(MW = 45,000 달톤) 이었다.

실험 2-3 : 등전점

정제효소를 스웨덴국의 Pharmacia LKB Technology 사 판매의 폴리아미드 겔 " AMPHOLINE " 2 w/v % 에서 등전점 전기 영동법으로 측정한 결과, 그 등전점은 약 3.8~4.8 이었다.

실험 2-4 : 최적 온도

통상의 방법으로 정제효소를 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에서 60 분간 항온처리했을 때의 최적 온도는 제 1 도에 있는 바와 같이 약 65℃ 이었다.

실험 2-5 : 최적 pH

통상의 방법으로 정제효소를 10 mM 아세트산 완충액, 인산 완충액 또는 탄산 나트륨-탄산 수소 나트륨 완충액의 각기 상이한 pH 에서 60℃ 에서 60 분간 항온처리하여 실험했을 때의 최적 pH 는 제 2 도에 있는 바와 같이 약 6.0~6.7 이었다.

실험 2-6 : 열적 안정성

통상의 방법으로 정제효소를 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에서 60 분간 항온처리하여 실험했을 때 제 3 도에 있는 바와 같이 약 80℃ 까지 안정하였다.

실험 2-7 : pH 안정성

통상의 방법으로 정제효소를 50 mM 아세트산 완충액, 인산 완충액 또는 탄산 나트륨-탄산 수소 나트륨 완충액의 상이한 pH 에서 60℃ 에서 60 시간 항온처리하여 실험했을 때 제 4 도에 있는 바와 같이 pH 5.5~9.5 부근까지 안정하였다.

실험 2-8 : N 말단을 가진 아미노산 배열

정제효소의 N 말단을 가진 아미노산 배열을 기상 단백질 시퀀서 " MODEL 470A " (미합중국의 Perkin Elmer 사 판매) 로 분석한 결과, 이 효소는 배열 번호 1 (SEQ ID NO:1) 에 있는 바와 같은 아미노산 배열을 가지고 있음이 확인되었다.

실험 2-9 : 부분 아미노산 배열

실험 1-2 에서 얻은 정제효소 적당량을 취하여 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 9.0)에 대해 4℃ 에서 18 시간 투석한 다음 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0) 과 혼합하여 효소 1 mℓ 당 약 1 mg 의 농도의 용액으로 하였다. 이 용액을 100℃ 에서 5 분간 인큐베이트하여 효소를 변성시킨 다음 수득한 용액중 약 1 mℓ을 시험관에넣고 40 ㎍ 의 리실 멘도펩티다아제와 혼합하고 30℃ 에서 44 시간 항온처리하여 효소를 부분적으로 가수분해하였다. 수득한 가수분해물을 0.1 v/v % 트리플루오로아세테이트로 미리 평형화시켜둔 역상 고속 액체 크로마토그래피용 칼럼 " μBONDAPAK C18 " (일본국의 Japan-Millipore 사 판매) 에 가한 다음 아세토니트릴의 농도를 0 v/v % 에서 부터 70 v/v % 로 증가시키면서 아세토니트릴 함유의 0.1 v/v % 트리플루오로아세테이트를 1.0 mℓ/min 의 유속으로 상기 칼럼에 공급하였다. 공급개시후 약 58~60 분에서 용출하는 펩티드 단편을 가진 획분을 회수하여 진공 건조한 다음 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 0.5 mℓ 중에 용해하고, 여기에 TPCK 처리된 트립신 5 ㎍ 을 가하여 37℃ 에서 16 시간 유지하여 가수분해하였다. 동결하여 효소 반응을 정지시킨 가수분해물을 " μBONDASPERE C18 " 이 충전된 칼럼에 공급한 다음, 수성 아세토니트릴의 농도를 15 v/v % 에서 부터 55 v/v % 로 증가시키면서 수성 아세토니트릴 함유 0.1 v/v % 트리플루오로아세테이트를 1.0 mℓ/min 의 유속으로 칼럼에 공급하였다. 공급개시후 약 42 분에서 용출하는 펩티드 단편을 함유한 획분을 회수하여 한데 모아 감압 건조하고 50 v/v % 수성 아세토니트릴 함유의 0.1 v/v % 트리플루오로아세테이트에 용해하였다. 실험 2-8 에서와 마찬가지로 이것을 분석한 결과 이 펩티드 단편은 배열번호 2 (SEQ ID NO:2) 에 있는아미노산 배열을 가지고 있음을 확인하였다.

이러한 물리화학적 성질을 가진 효소는 아직까지 알려진 바가 없으므로 이것은 신규 물질이라고 추정할 수 있다.

본 발명자들은 실험 2-8 및 2-9 에서 확인된 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오티드를 프로우브 (probe) 로 사용하여 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 염색체 DNA 를 예의 검색한 결과, 배열번호 4 (SEQ ID NO:4) 에 있는 염기배열을 가진 약 3,600 염기쌍으로 된 DNA 단편을 수득하였다. 그리고, 그 염기배열을 해독한 결과 이 미생물 유래의 열안정성 효소는 936 아미노산으로 구성되어 있고 배열번호 3 (SEQ ID NO:3) 에 있는 바와 같은 아미노산 배열을 가지고 있음이 확인되었다.

배열번호 3 및 4 (SEQ ID NO:3 및 4) 에 나와 있는 아미노산 배열과 염기배열을 확인하는데 사용된 순차적인 실험단계들 요약하면 아래와 같다.

(1) 공여체 미생물의 배양액으로 부터 열안정성 효소를 분리하여 고도로 정제한 다음 N 말단 아미노산 배열을 결정하였다. 이 정제효소를 프로테아제로 부분 가수분해하고 가수분해물로 부터 펩티드 단편을 분리하여 그 아미노산 배열을 결정하였다.

(2) 별도로 공여체 미생물의 세포로 부터 염색체 DNA 를 분리하여 정제한 다음 제한효소로 부분 소화하여 약 4,000~8,000 염기쌍으로 된 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 제한효소로 미리 절단해둔 플라스미드 벡터에다 DNA 리가아제로 연결하여 재조합 DNA 를 얻었다.

(3) 이 재조합 DNA 를 에쉐리히아 콜리 (Escherichia coli) 종 (種) 의 미생물에 도입하여 형질 전환체를 얻고, 위에 나온 부분 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오티드를 프로우브로 사용하는 콜로니 하이브리다이제이션법으로 상기 형질 전환체로 부터 이 열안정성 효소를 코우드 하는 DNA 를 가진 목적의 형질 전환체를 선택하였다.

(4) 형질 전환체로 부터 재조합 DNA 를 얻어 프라이머로 어니일링한 다음 DNA 폴리머라아제를 작용시켜 프라이머를 연장시키고, 수득한 상보 (相補) 체인 DNA 의 염기배열을 디데옥시 체인 종결법으로 결정하였다. 그리고, 그 결정된 염기배열을 토대로 하여 추정할 수 있는 아미노산 배열과 위에 나온 아미노산 배열을 비교해 본 결과, 염기배열이 이 효소를 코우드한다는 것을 확인하였다.

다음의 실험 3 및 4 에서 상기 (2) 항 내지 (4) 항을 상세히 설명하는데, 이들 실험에 사용된 수법 그 자체는 이 기술분야에서 공지의 것인데, 예컨대 문헌[J.Sumbruck et al. in " Molecular Cloning A Laboratory Manual ", 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989)] 에도 상세히 기재되어 있다.

실험 3 : 열안정성 효소를 코우드하는 DNA 를 함유하는 재조합 DNA 및 형질 전환체의 제조

실험 3-1 : 염색체 DNA 의 제조

더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 종배양액을 영양 육즙 배지 (nutrient broth medium) (pH 7.0) 에 식균하고 60℃ 에서 24 시간 동안 회전 진탕기에서 배양하였다. 세포를 배양액으로 부터 원심분리하여 제거하여 TES 완충액(pH 8.0) 중에 현탁시킨 다음 리소자임을 0.05 w/v % 가하여 혼합한 후 37℃에서 30 분간 배양하였다. 수득물을 -80℃ 에서 1 시간 동결시키고 TSS 완충액 (pH 9.0) 을 가하여 혼합하고 60℃ 로 가열한 다음, TES 완충액과 페놀의 혼합액과 혼합하여 수득한 용액을 얼음으로 급냉한 후 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 이 상청액에 2 배 체적의 차거운 에탄올을 가하고 침전한 미정제 염색체 DNA 를 회수하여 SSC 완충액 (pH 7.1) 중에 현탁시켜 리보뉴클레아제 7.5 ㎍ 과 프로테아제 125 ㎍ 을 가해 혼합한 다음 37℃ 에서 1 시간 배양하였다. 이어서, 이 반응액에 클로로포름과 이소아밀 알코올의 혼합액을 가하여 목적으로 하는 염색체 DNA 를 추출하고 차거운 에탄올과 혼합한 다음 염색체 DNA 함유 침강물을 채취하였다. 여기서 얻은 정제 염색체 DNA 를 SSC 완충액 (pH 7.1) 에 용해하여 약 1 mg/mℓ의 농도로 한 다음 이 용액을 -80℃ 에서 동결시켰다.

실험 3-2 : 재조합 DNA pBTM22 와 형질 전환체 BTM22 의 제조

실험 3-1 에서 제조한 정제 염색체 DNA 약 1 mℓ 을 시험관에 넣고 제한효소인 Sau 3AI 약 10 단위를 가해 혼합하여 37℃ 에서 약 20 분간 효소반응시켜 염색체 DNA 를 부분 분해한 다음 수크로오스 밀도 기울기 초원심 분리법에 의해 약 4,000~8,000 염기쌍으로 된 DNA 단편을 회수하였다. 별도로 플라스미드 벡터 (미합중국 Stragene Cloning Systems 판매) 인 블루우스크립트 II SK(+) 1 ㎍ 을 시험관에 넣고 제한효소인 Bam HI 을 작용시켜 플라스미드 벡터를 완전히 소화시킨 후 DNA 단편 10 ㎍ 및 T4 DNA 리가아제 2 단위와 혼합하여 4℃ 에서 하룻밤 방치함으로써 DNA 단편을 벡터 단편에다 결찰시켰다. 수득한 재조합 DNA 에 " Epicurian ColiXLI-Blue (미합중국의 Stratagene Cloning Systems 사 판매의 컴피턴트 셀) 30 ㎕ 을 가하고 얼음 냉각 조건하에서 30 분간 방치한 다음 42℃ 로 가열하고 나서 SOC 육즙을 가해 혼합하여 37℃ 에서 1 시간 항온처리함으로써 재조합 DNA 를 대장균속에 도입하였다.

수득한 형질 전환체를 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토시드 50 ㎍/mℓ 함유의 한천판 (pH 7.0) 에 식균하고 37℃ 에서 18 시간 배양한 다음 한천판 위에 나일론 필름을 얹어 이 위에 한천판에 생성된 약 6,000 콜로니를 고정시켰다. 배열번호 1 (SEQ ID NO:1) 에 있는 아미노산 배열, Trp-Tyr-Lys-Asp-Ala-Val 에 근거하여 5' -TGGTAYAARGAYGCNGT-3' 의 염기배열로 나타내어지는 프로우브 1 의 염기배열을 화학적으로 합성하여³²P 로 표지한 다음 나일론 필름위에 고정된 형질 전환체의콜로니로 하이브리다이제이션 한 후 프로우브 1 과 강력한 하이브리다이제이션을 나타낸 5 종류의 형질 전환체를 선택하였다.

이 5 종류의 형질 전환체로 부터 통상적인 방법으로 목적으로 하는 재조합 DNA 를 선택하고 배열번호 2 (SEQ ID NO:2) 의 아미노산 배열, 즉 Asn-Met-Trp-Pro-Glu-Glu 에 근거하여 화학적으로 합성한 5.' -AAYATGTGGCCNGARGA-3' 의 염기 배열로 나타내어지는 프로우브 2 를 동위체 3²P 로 표지후 문헌 [E. M. Southern in Journal of Molecular Biology, Vol.98, pp.503∼517 (1975)] 에 기재된 방법에 따라 재조합 DNA 를 하이브리다이제이션하여 프로우브 2 와 강력히 하이브리다이제이션된 재조합 DNA를 선택하였다. 이렇게 해서 선택한 재조합 DNA 와 형질 전환체를 각각 pBTM22 및 BTM22 로 명명하였다.

형질 전환체 BTM22 를 앰피실린 100 ㎍/mℓ을 함유하는 L-육즙 (pH 7.0) 에 접종하고 37℃ 에서 24 시간 동안 회전 진탕기에서 배양한 다음 원심분리에 의해 배양액으로 부터 세포를 채취하여 종래의 알칼리법으로 처리하여 세포로 부터 재조합 DNA 를 추출하였다. 수득물을 통상의 방법으로 정제하고 분석한 결과, 재조합 DNA pBTM22 는 약 10,300 염기쌍으로 구성되어 있고 제 5 도에 있는 바와 같이 이 열안정성 효소를 코우드하는 약 2,900 염기쌍으로 된 DNA 를 함유한 단편이 제한효소 Hind III 에 의한 절단부위에 근접한 하류쪽에 위치하고 있음이 확인되었다.

실험 3-3 : 형질 전환체 BTM22 에 의한 재조합 효소의 제조

500 mℓ 용량의 플라스크에 2.0 w/v % 글루코오스, 0.5 w/v % 펩톤, 0.1 w/v% 효모 추출물, 0.1 w/v % 인산 수소 2 칼륨, 0.06 w/v % 인산 2 수소 나트륨, 0.05 w/v % 황산 마그네슘 7 수화물, 0.5 w/v % 탄산 칼슘 및 물로 된 액상영양 배지 (pH 7.0) 를 100 mℓ 씩을 넣고 각 플라스크를 115℃ 에서 30 분간 가열하여 멸균하고 냉각한 후 앰피실린 50 ㎍/mℓ을 가한 다음 실험 3-2 에서 수득한 형질 전환체 BTM22 를 접종하여 37℃ 에서 24 시간 회전 진탕기에서 형질 전환체를 배양하였다.

수득한 배양액을 초음파 파쇄기로 처리하여 세포를 파쇄하고, 수득한 현탁액을 원심분리하여 불용성물질을 제거하였다. 수득한 상청액에 대해 효소활성을 측정한 결과, 이 배양액 1 리터는 약 800 단위의 재조합형 효소를 함유하고 있었다.

대조로서 대장균 XLI-블루우 또는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 종배양액을 앰피실린 무함유의 신선한 동일 액상 배지에 접종하고, 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 배양의 경우에는 이것을 65℃ 의 배양온도에서 위와 마찬가지로 배양하여 처리하였다. 수득물의 활성을 분석한 결과, 더어무스 아쿠아티쿠스 배양액 1 리터에는 약 350 단위의 효소를 함유하고 있었는데, 그 수율은 형질 전환체 BTM22 보다 유의 (有意) 하게 저하되어 있었다. 숙주로 사용된 대장균 XLI-블루우는 열안정성 효소를 생성하지 않았다.

이어서, 형질 전환체 BTM22 에 의해 생성된 효소를 실험 1 및 2 와 마찬가지로 정제하여 그 물리화학적인 성질과 성상을 조사한 결과, 이것은 실질적으로 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATTCC 33923) 의 열안정성 효소와 동일한 물리화학적 성질을 가지고 있었는데, 즉 SDS-PAGE 에서 약 100,000~110,000 달톤의 분자량과 등전점전기 영동에서 약 3.8∼4.8 의 등전점을 가지고 있고, 80℃ 에서 60 분간 수중 (pH 7.0) 에서 유지하더라도 실질적으로 실활하지 않음이 확인되었다. 또한, 이 결과로 부터 본 발명의 열안정성 효소는 재조합 DNA 기술로 제조할 수 있으며, 따라서 그 수율은 상당히 증가함을 알 수 있다.

실험 4 : 상보체인 DNA 제조 및 그 염기배열과 아미노산 배열의 결정

실험 3-2 의 방법으로 제조한 재조합 DNA pBTM22 2 ㎍ 을 시험관에 넣고 2 M 수산화 나트륨 수용액과 혼합하여 변성시킨 다음 적당량의 차거운 에탄올과 혼합하고 수득한 템프레이트 (template) DNA 함유 침강물을 채취하여 감압건조 하였다. 이 템플레이트 DNA 에 아래의 5'-GTAAAACGACGACGGCCAGT-3' 의 염기 배열로 나타내어지는 화학합성된 프라이머 50 pmole/mℓ와 20 mM 염화 마그네슘 및 20 mM 염화 나트륨 함유의 40 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 10 ㎕ 을 가하고 이 혼합물을 65℃ 에서 2 분간 항온처리하여 어니일링시킨 후, 이 혼합물에 dATP, dGTP 및 dTTP 를 각각 7.5 μM 함유하는 수용액 2 ㎕ 와, [α-³²P]dCTP (2 m Ci/mℓ) 0.5 ㎕ 와, 0.1 M 디티오트레이톨 1 ㎕ 및 1.5 단위/mℓ T7 DNA 폴리머라아제 2 ㎕ 을 혼합한 다음 25℃ 에서 5 분간 항온처리하여 5' 말단으로 부터 3' 말단까지 프라이머를 연장시킴으로써 상보체인 DNA 를 생성시켰다.

상보체인 DNA 를 함유하는 반응 생성물을 4 부분으로 나누어 각각에다 dNTP 80 μM 과 ddATP, ddCTP, ddGTP 또는 ddTTP 8 μM 을 함유하는 50 mM 염화 나트륨 수용액을 2.5 ㎕ 가하고, 수득한 혼합물을 37℃ 에서 5 분간 항온처리한 다음 20mM EDTA, 0.05 w/v % 브로모페놀 블루우 및 0.05 w/v % 크실렌 시아놀을 함유하는 98 v/v % 포름아미드 수용액 4 ㎕ 을 가하여 반응을 정지시켰다. 이 반응 혼합물을 끊는 수욕 (water-bath) 중에서 3 분간 가열한 후, 그 중의 소량을 6 w/v % 폴리아크릴아미드 겔에 가하여 약 2000 볼트의 일정 전압으로 겔을 활성화시켜 전기 영동 처리함으로써 DNA 단편을 분리한 다음 통상의 방법으로 겔을 고정시키고 건조하고 나서 자동방사선 사진법으로 처리하였다.

방사선 사진에서 분리된 DNA 단편을 분석한 결과 상보체인 DNA 에는 SEQ ID NO:5 에 있는 바와 같은 약 3,600 염기쌍으로 구성된 염기배열을 가지고 있음이 밝혀졌다. 이 염기배열로 부터 추정할 수 있는 아미노산 배열은 SEQ ID NO:5 에 나와 있는 바와 같은데, 이 아미노산 배열을 배열번호 1 및 2 (SEQ ID NO:1 및 2) 의 N 말단 아미노산 배열 또는 부분 아미노산 배열과 비교한 결과, 배열번호 1 (SEQ ID NO:1) 의 아미노산 배열은 배열번호 5 (SEQ ID NO:5) 의 1∼20 위치에 있는 아미노산 배열에 상응하였으며, 배열번호 2 (SEQ ID NO:2) 의 아미노산 배열은 배열번호 5 (SEQ ID NO:5) 의 236~250 위치에서의 아미노산 배열에 상응한 것임이 확인되었다. 이 결과로 부터 본 발명의 재조합형 효소는 배열번호 3 (SEQ ID NO:3) 의 아미노산 배열을 가지고 있고 더어무스 아쿠아티쿠스(ATCC 33923) 유래의 DNA의 아미노산 배열은 배열번호 4 (SEQ ID NO:4) 에 있는 염기배열에 의해 코우드되는 것임을알 수 있다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명자들은 장기간에 걸친 연구의 결과로서 말토오스를 트레할로오스로 변환하고 트레할로오스를 말토오스로 변환하는 본 발명의 열안정성 효소를 발견하였으며, 이 효소는 종래의 효소와는 다른 독특한 물리화학적 성질을 가지고 있다. 본 발명은 재조합 DNA 기술을 응용함으로써 이 재조합형 효소를 제조하는데 목적이 있다. 이하, 아래의 실시예를 참조하면서 본 발명의 재조합형 효소와 그 제조방법 및 용도에 대해 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 말하는 재조합형 효소는 일반적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조되며, 말토오스를 트레할로오스로 변환하고 트레할로오스를 말토오스로 변환하는 효소들을 포함한다. 통상적으로, 본 발명의 재조합형 DNA 는 해명된 아미노산 배열을 가지고 있으며, 그 예로서 배열번호 3 (SEQ ID NO:3) 의 아미노산 배열 또는 이 아미노산 배열에 대해 상동적 (相同的) 인 아미노산 배열을 들 수 있다. 배열번호3 (SEQ IND NO:3) 의 아미노산 배열에 상동적인 아미노산 배열을 가진 변이체는 배열번호 3 (SEQ IN NO:3) 에 있는 아미노산 하나 이상을 효소의 고유의 활성을 변화시킴이 없이 다른 아미노산으로 치환하여 얻을 수 있다. 동일한 DNA 를 사용하고 DNA 가 도입되는 숙주와 형질 전환체를 배양하는데 사용되는 영양 배지의 성분과 조성, 이들의 배양 온도 및 pH 에 따라 좌우된다 하더라도 배열번호 3(SEQ ID NO:3) 의 아미노산 배열의 N 말단 및/또는 C 말단에 인접하여 위치한 아미노산 하나 이상을 결실해 있으나 DNA 에 의해 코우드된 효소 본래의 효소활성을 가지거나 DNA 발현후에 숙주의 세포내 효소의 수식에 의해 N 말단에 대해 새로 부가된 아미노산 하나 이상을 가진 개질된 효소를 생산할 수도 있다. 이러한 변이체도 이들이 소요의 성질을 가지고 있는 한 본 발명의 재조합형 효소에 포함된다.

본 발명에 의한 재조합형 효소는 특정의 DNA 를 함유한 형질 전환체의 배양물로 부터 얻을 수가 있다. 본 발명에서 사용하는 형질 전환체는 배열번호 4 (SEQ ID NO:4) 의 염기배열 또는 이것과 상동적인 염기배열 또는 이들 염기배열에 대해 상보적인 염기배열을 적당한 숙주에 도입함으로써 얻을 수 있다. 위에 나온 염기배열중의 염기 하나 이상을 이들이 코우드하는 아미노산 배열을 바꾸지 않고서도 유전자 축중 (degeneracy) 을 이용하여 다른 염기로 치환하여도 좋다. 물론 효소 또는 이들의 변이체를 코우드하는 염기배열중의 염기 하나 이상을 다른 염기로 쉽사리 치환하여 DNA 가 실제로 숙주에서 효소 생산을 발현하도록 할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 DNA 는 그것이 전술한 배열을 가지고 있는 한 그것이 천연에서 유래하는 것이거나 인위적으로 합성된 것이가는 관계없이 본 발명에서 사용할 수 있다. 본 발명에 의한 DNA 의 천연의 공급원의 예로서는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 속 (屬) 의 미생물을 들 수 있는데, 이 미생물로부터는 본 발명에서 사용되는 DNA를 함유한 유전자를 얻을 수 있다. 이들 미생물을 영양배지에서 식균하여 호기성 조건하에 약 1~3 일간 배양한 다음 수득한 세포를 배양액으로 부터 회수하여 초음파 처리하거나 리소자임 또는 β-글루카나아제 등의 세포벽 용해 효소로 처리하여 본 발명의 DNA 를 함유한 유전자를 추출한다. 이 경우에 있어서 프로테아제 등의 단백질 가수분해 효소를 세포벽 용해효소와 병용할 수 있으며 초음파 파쇄로 세포를 처리할 경우에 있어서는 이들을 소디움 도데실 술페이트 (SDS) 등의 계면활성제 존재하에 처리하거나 동결, 해동법으로 처리하여도 좋다. 목적으로하는 DNA 는 수득물을 페놀 추출법, 알코올 침강법, 원심분리법, 프로테아제 처리법 및/또는 리보뉴클레아제 처리법 등, 이 기술분야에서 통상적으로 이용되고 있는 방법으로 처리하여 제조한다. 본 발명의 DNA 를 인공적으로 합성하자면 배열번호 3 (SEQ ID NO : 3) 에 있는 염기 배열을 이용하여 화학적으로 합성하거나, 배열번호 4 (SEQ ID NO : 4) 에 있는 아미노산 배열을 코우드하는 DNA 를 적당한 자체 복제가능한 벡터에 삽입하여 재조합 DNA 를 얻고, 이 재조합 DNA 를 적당한 숙주에 도입하여 형질 전환체를 얻은 다음 이 형질전환체를 배양하고, 수득한 배양액으로 부터 증식된 세포를 분리하고 이 세포로 부터 재조합 DNA 를 함유한 플라스미드를 채취함으로써 플라스미드 형태로 수득할 수 있다.

이러한 재조합 DNA 는 예컨대 재조합 DNA 형태로 숙주에 도입된다. 재조합 DNA 는 일반적으로 위에 나온 DNA 와 자체 복제가능한 벡터를 함유하게 되는데,DNA 가 입수가능하면 통상 일반적인 방법으로 비교적 용이하게 제조할 수 있다. 이러한 벡터의 예로서는 pBR322, pUC18, 블루우스크립트 (Bluescript) II SK(+), pKK223-3, pUB110, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, TEp7, pBS7 등의 플라스미드 벡터와, λgt·λC, λgt·λB, ρII, φ1, φ105 등의 파아지 (phage) 벡터가 있는데, 이들 플라스미드 벡터와 파아지 벡터 중에서 pBR322, pUC18, 블루우스크립트 II SK(+), pKK223-3, λgt·λC 및 λgt·λB 는 본 발명의 DNA 를 대장균 (Escherichia coli) 에서 발현시킬 필요가 있을때 만족스럽게 사용할 수 있는 반면 pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1 및 φ105는 바실루스속 미생물에서 DNA 를 발현시킬때 만족스럽게 사용할 수 있다. 플라스미드 벡터 pHV14, TRp7, TEp7 및 pBS7 는 재조합 DNA 를 두가지 이상의 숙주에서 생장시킬 경우에 유리하게 사용된다.

본 발명에서 본 발명의 DNA 를 이러한 벡터속에 삽입할때 이용하는 방법은 이 기술분야에서 일반적으로 통용되고 있는 종래의 방법이어도 좋다. 본 발명의 DNA 를 가진 유전자와 자체복제 가능한 벡터를 제한효소 및/또는 초음파 분쇄기로 먼저 분해한 다음 수득한 DNA 단편과 벡터 단편을 결찰 (ligation) 시킨다. DNA 단편과 벡터 단편을 결찰시키자면 필요에 따라 이들을 어니일링한 다음 생체내 또는 시험관내에서 DNA 리가아제를 작용시킨다. 이렇게 해서 수득한 재조합 DNA 는 적당한 숙주속에 도입하여 수득한 형질전환체를 배양함으로써 실질적으로 아무런 제한없이 복제가 가능하다.

본 발명에 의한 재조합 DNA 를 대장균과 바실루스속, 악티노마이세스속 및 효모를 비롯한 적당한 숙주 미생물속에 도입할 수 있다. 숙주로서 대장균을 사용할경우에 있어서 재조합 DNA 와 칼슘 이온 존재하에 숙주를 배양할 수 있고, 바실루스속 미생물을 이용할 경우에는 컴피턴트 셀법 (competent cell method) 과 콜로니 하이브리다이제이션법 (colony hybridization method) 을 이용할 수 있다. 필요로 하는 형질전환체를 콜로니 하이브다이제이션법으로 클로닝 하거나 또는 말토오스 혹은 트레할로오스를 함유한 영양배지에서 형질 전환체를 배양한 다음 트레할로오스 또는 말토오스를 생성하는 형질전환체를 선택함으로써 클로닝 할 수 있다. 이렇게 해서 수득한 형질 전환체는 영양배지에서 배양하면 목적으로 하는 효소를 세포내외에서 생성한다. 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미네랄이 보충된 액상 배지, 필요에 따라서는 소량의 아미노산 및/또는 비타민류가 보충된 액상배지를 본 발명에서 사용할 수 있다. 탄소원의 예로서는 전분, 전분 가수 분해물, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스 등의 당류가 있고, 질소원의 예로서는 암모니아, 암모늄염, 우레아, 질산염, 펩톤, 효모 추출물, 탈지대두, 옥수수 침출액, 육(肉) 추출물 등의 질소함유 무기물 및 유기물이 있다. 목적으로 하는 효소를 함유하는 배양액은 형질 전환체를 영양배지에서 접종하고 통기교반하면서 호기성 조건하에 20∼50℃ 및 pH 2∼9 에서 약 1 - 6 일 동안 배양함으로써 제조할 수 있다. 이러한 배양액은 그대로 조 (粗) 효소제로 사용할 수 있는데, 통상적으로는 사용하기 전에 초음파 파쇄기 및/또는 세포벽 용해효소로 파쇄한 다음 여과 및/또는 원심 분리에 의해 세포와 세포 파쇄물로 부터 효소를 분리하여 이 효소를 정제하여 사용한다. 본 발명에서의 효소 정제법으로는 일반적으로 종래의 방법이 포함된다. 배양액으로 부터 세포와 세포 파쇄물을 제거하고 농축, 염석, 투석, 분별침강, 겔 여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등의 방법중에서 한가지 이상의 방법으로 처리한다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명의 재조합형 열안정성 효소는 55℃ 이상의 온도에서 작용하더라도 말토오스로 부터 트레할로오스를, 또는 트레할로오스로부터 말토오스를 생성하는 명확한 활성을 나타내며, 이러한 활성은 종래의 효소에서 발견된바가 없다. 트레할로오스는 온화하고도 고품위의 감미를 가지며, 그리고 분자중에 환원성기를 가지지 않으므로 착색이나 변질의 우려가 없이 음식물을 감미부여할 수 있는 큰 잇점이 있다. 본 발명의 재조합형 열안정성 효소의 이러한 성질을 이용하여 종래 환원성으로 인해 이 분야에서 사용할 수 없었던 말토오스를 환원성이 없고 취급이 용이하며 유용한 트레할로오스로 변환 시킬 수 있게 된다.

본 발명의 효소변환 방법에 대해 더욱 상세히 설명하면, 본 발명에서 말하는 " 말토오스 " 라 함은 통상적으로 말토오스를 함유한 당조성물을 의미하며, 본 발명의 재조합형 열안정성 효소가 작용하여 트레할로오스를 생성할 수 있는 한 어떠한 원료 또는 제조방법이라도 사용할 수 있다. 트레할로오스를 대량으로 효율적으로 제조하자면 말토오스 함량이 많은 당조성물을 사용하는 것이 바람직한데, 통상, 약 70 w/w % 이상, 바람직하게는 약 80 w/w % 이상의 것이 사용된다. 이러한 당조성물은 이 분야에 있어서 통상 일반적인 방법으로 제조할 수 있는데, 예컨대 일본국의 특허공고 제 11,437/81 호 공보와 특허공고 제 17,078/81 호 공보에 개시되어 있는 호화전분 또는 액화전분에 β-아밀라아제를 작용시키고, 생성된 말토오스를 분별침전법 또는 투석법으로 분리하는 방법, 또는 일본국의 특허공고 제 13,089/72호 공보와 특허공고 제 3,938/79 호 공보에 개시되어 있는 호화전분 또는 액화전분에 이소아밀라아제 또는 풀룰라나아제 등의 전분지절 효소와 더불어 β-아밀라아제를 작용시키는 방법을 채용할 수 있다.

본 발명에 의한 효소적 변환방법에 있어서 본 발명의 재조합형 열안정성 효소의 유효량을 말토오스를 함유하는 수성매체중에 공존시켜 이 혼합물을 일정온도와 pH에서 유지시키면서 필요로 하는 양의 트레할로오스가 생성할 때까지 효소반응 시킨다. 효소반응은 건조 고형분 기준으로 약 0.1 w/w % 이하의 비교적 낮은 기질농도에서도 진행하지만, 건조 고형분 기준으로 약 2 w/w % 이상의 고농도, 바람직하게는 약 5 ∼ 50 w/w % 의 기질농도를 사용하면 본 발명에 의한 효소적 변환방법을 공업적 생산 규모로 실시할 수 있다. 반응온도와 pH 는 재조합형 효소를 실활하지 않고 말토오스를 효과적으로 생성하는 범위내로 설정하는데, 즉 약 55℃ 이상의 온도, 바람직하게는 약 56~63℃ 및 pH 약 5~10, 바람직하게는 pH 약 6~7 의 범위로 설정한다. 재조합형 효소의 양과 반응시간은 효소반응 조건에 따라 적절히 설정한다. 본 발명의 효소적 변환방법에 의해 말토오스를 트레할로오스로 효과적으로 변환시키는데, 그 변환율은 약 50 % 이상까지 도달하는 경우도 있다.

본 발명의 효소적 변환방법으로 수득한 반응 혼합물을 그대로 사용할 수 있으나, 통상적으로는 정제한 후 사용한다. 예컨대, 여과와 원심분리에 의해 반응 혼합물로 부터 불용물을 제거하고 수득한 용액을 활성탄으로 탈색한후 이온 교환 수지로 탈염, 정제한 다음 농축하여 시럽상 제품을 얻는다. 용도에 따라서는 이 시럽상 제품을 진공건조하고 분무건조하여 고형제품을 얻는다. 실질적으로 트레할로오스만으로 된 제품을 제조하자면 시럽상 제품을 이온 교환수지, 활성탄 또는 실리카 겔 등을 사용하는 크로마토그래피, 효모에 의한 발효, 알칼리에 의한 환원성 당질의 분해 제거 등의 방법중에서 한가지 이상의 방법으로 처리한다.

비교적 다량의 반응혼합물을 처리하는 방법으로서는 일본국의 특허공개 제 23,799/83 호 공보 및 같은 특허공개 제 72,598/83 호 공보에 개시되어 있는 고정상 방식, 이동상 방식 또는 의사 (擬似) 이동상 방식 등의 이온교환 칼럼 크로마토그래피가 있는데, 이들 방법에서는 대량 제조가 곤란하였던 트레할로오스 고함유 제품을 효과적으로 대량으로 제조할 수 있다. 이렇게 하여 수득되는 트레할로오스 및 트레할로오스를 함유한 당조성물은 당 감미제의 환원성을 기피하는 여러가지 제품에 폭넓은 용도를 가지고 있다. 따라서 예컨대 음식물 일반, 화장품 및 의약품 등의 감미제, 정미 개선제, 품질 개선제, 안정제, 충전제, 부형제 및 보조제로서 만족스럽게 사용할 수 있다.

이하, 몇가지 실시예에 따라 본 발명에 의한 재조합형 열안정성 효소의 제조 방법과 말토오스의 효소적 변환방법을 구체적으로 설명한다.

실시예 A-1 : 재조합형 효소의 제조

500 mℓ용량의 삼각 플라스크에 2.0 w/v % 글루코오스, 0.5 w/v % 펩톤, 0.1 w/v % 효모엑스, 0.1 w/v % 인산수소 2 칼륨, 0.06 w/v % 인산 2 수소 나트륨, 0.05 w/v % 황산 마그네슘 7 수화물, 0.5 w/v % 탄산 칼슘 및 물로 된 영양배지를 100 mℓ씩 취하고, 각 플라스크를 115℃ 에서 30 분간 가열하여 멸균한 다음 냉각하고 암피실린 50 ㎍/mℓ 을 가한후 실험 1-2 에서 제조한 형질전환체 BTM22 를 접종하고 회전진탕 조건하에서 37℃ 에서 24 시간 배양하여 종배양액을 얻었다. 이어서 30 리터 용량의 자아 퍼어멘터에 상기와 동일조성의 신선한 영양 배지를 18 리터씩 취하고 위와 마찬가지로 멸균후 암피실린을 50 ㎍/mℓ 가하여 위에서 얻은 종배양액을 1 v/v % 의 접종한 다음 pH 6~8 로 유지하면서 37℃에서 24 시간 통기교반 조건하에 배양하였다. 수득한 배양물을 초음파 처리하여 균체를 파쇄하고 원심분리에 의해 불용물을 제거후 상청액중의 효소 활성을 측정한 결과, 배양물 1 리터 당으로 환산하여 약 800 단위의 재조합형 효소가 함유되어 있었다. 이 상청액을 실험 1-1 의 방법으로 분석한 결과, 이 배양물에서 비활성이 약 135 단위/mg 단백질인 재조합형 효소를 약 152 단위/mℓ 함유한 수용액을 약 5 mℓ 얻었다.

실시예 A-2 : 재조합형 열안정성 효소의 제조

실시예 A-2 (a) : 형질전환체 BTM23 의 제조

실시예 3-2 의 방법으로 제조한 재조합 DNA pBTM22 를 제한효소 Hind III으로 절단하여 배열번호 4 (SEQ ID NO : 4) 의 107 ∼ 2,889 에 위치한 염기 배열을 가진 약 8,100 염기쌍으로 구성되어 있는 DNA 단편을 얻었다.

으로 나타내어지는 염기배열을 가진 8 가지 올리고뉴클레오티드를 적당량 혼합하고 이 혼합물을 100℃, 65℃, 37℃ 및 20℃ 에서 각각 20 분간씩 연속하여 인큐베이트해서 올리고뉴클레오티드를 어니일링하였다. 배열번호 6 (SEQ ID : NO : 6) 의 염기 배열과, 배열번호 3 (SEQ ID NO : 3) 에 나온 위치 1 ∼ 36 의 아미노산 배열을 바꾸지 않고 배열번호 4 (SEQ ID NO : 4) 의 위치 1 에 있는 구아닌 (G) 이 아데닌 (A) 으로 치환된 배열번호 4 (SEQ ID NO : 4) 의 위치 1~110 의 염기들로 구성된 양쪽 말단에 4 개의 염기의 5' 돌출 말단을 가진 141 염기쌍의 이중가닥 DNA 에다 상기한 DNA 단편을 부가하고, 이 혼합물을 T4 DNA 리가아제 존재하에 4℃ 에서 하룻밤 방치하여 어니일링함으로써 배열번호 6 (SEQ IN NO : 6)의 염기배열과 배열번호 3 (SEQ ID NO : 3)에서 1 ~ 963 에 위치한 구아닌 (G) 이 아데닌 (A) 으로 치환된 배열번호 3 (SEQ ID NO : 3) 의 위치 1 ∼ 2,889 의 염기로 구성된 염기배열을 가진 1차 재조합 DNA 를 얻었다.

실험 3-2 의 방법으로 제조한 재조합 DNA pBTM22 를 제한효소 Bam HI 으로 절단하여 배열번호 4 (SEQ ID NO : 4) 의 1,008 ~ 2,889 에 위치한 염기배열을 가진 약 2,400 염기쌍으로 구성된 DNA 단편을 얻은 다음, Bam HI 로 절단시켜둔 파아지 벡터 " M13tv19 RF DNA " (일본국 Takara Shuzo 사 판매) 로 연결하여 2 차 재조합 DNA 를 얻었다.

배열번호 5 (SEQ ID NO : 5) 에서 3,448 에 위치한 염기인 티민 (T) 을 구아닌 (G) 으로 치환한 배열번호 5 (SEQ ID NO : 5) 의 3,438 ~ 3,458 에 위치한 염기배열에 상응한 5' -CGGTAGCCCTGCAGCCCCGGG-3' 으로 나타내어지는 염기배열을 가진 올리고뉴클레오티드를 통상의 방법으로 화학합성 하였다.

합성된 올리고 뉴클레오티드와 " MUTAN-G " (일본국 Takara Shuzo 사 판매의 부위 특이성 돌연변이계) 를 사용함으로써 2 차 재조합 DNA 에 함유된 배열번호 5 (SEQ ID NO : 5) 의 337 ∼ 963 염기에 위치한 아미노산 배열을 바꾸지 않고 배열번호 5 (SEQ ID NO : 5) 의 3,448 에 위치한 염기인 티민 (T) 을 구아닌 (G)으로 치환한 배열번호 4 (SEQ ID NO : 4)의 염기 1,008 ~ 2,889 에 위치한 염기 배열을 가진 3차 재조합 DNA 를 얻었다. 부위 특이성 돌연변이 방법은 "MUTAN-G"에 첨부된 메뉴얼에 따랐다.

제한효소 Eco RI 및 Bgl II 로 절단하여 얻은 배열번호 4 (SEQ ID NO : 4) 의 첫번째 염기인 구아닌 (G) 이 아데닌 (A) 으로 치환된 배열번호 4 (SEQ ID NO : 4)의 1 ∼ 1,358 염기로 된 염기배열을 가진 약 1,390 염기쌍으로 구성되어 있는 DNA 단편과, 3 차 재조합 DNA 를 제한효소 Bgl II 및 Pst I 으로 절단하여 얻은 배열번호 4 (SEQ ID NO : 4) 에 나온 1,359 ~ 2,889 의 염기배열을 가진 약 1,550 염기쌍으로 된 DNA 단편을 " pKK223-3 " (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 판매의 플라스미드 벡터) 에다 T4 DNA 리가아제로 연결하여 배열번호 4 (SEQ ID NO : 4) 의 염기배열을 가진 재조합 DNA pBTM23 을 얻었다.

이렇게 하여 수득한 재조합 DNA pBTM23 을 문헌 [J. Sambrook in " Molecular Cloning, A Laboratory Manual ", 2nd edition, pp. 1.74~1.81 (1989),Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA] 에 기재된 방법에 따라 미리 컴피턴트 셀로 만들어 둔 대장균 LE 392 (ATCC 33572) 에 도입하여 본 발명의 효소를 해독하는 DNA 를 함유한 본 발명의 형질전환체 BTM23 을 얻었다. 이 형질전환체를 실험 3-2 의 방법으로 배양하고, 증식된 세포를 배양물로 부터 회수하여 용균함으로써 재조합 DNA 를 추출한 다음, 정제하고 분석한 결과, 재조합 DNA pBTM23 은 약 7,500 염기쌍으로 되어 있고, 제 6 도에 있는 바와 같이 제한 효소 Nco I 의 하류쪽에 연결된 2,889 염기쌍을 가진 DNA 단편을 가지고 있음이 확인되었다.

실시예 A-2 (b) : 형질전환체를 사용한 재조합형 열안정성 효소의 제조

1 w/v % 말토오스, 3 w/v % 폴리펩톤, 1 w/v % " MEAST PIG " (일본국 Asahi Breweries 사제), 0.1 w/v % 인산 2 수소 나트륨 2 수화물, 200 ㎍/mℓ 암피실린 나트륨 및 물로 된 액체 배지 (pH 7.0) 를 사용한 외에는 실시예 A-1 의 경우와 마찬가지로 형질 전환체 BTM23 을 배양하였다. 수득한 배양물에 알부민 유래의 리소자임 (일본국의 生化學 공업주식회사 판매) 과 계면활성제 " TRITON X-100 " 을 가하여 각각 농도 0.1 mg/mℓ 및 1 mg/mℓ로 한후 교반하면서 37℃에서 16 시간 인큐베이트하여 세포로 부터 재조합형 열안정성 효소를 추출하였다. 이 현탁액을 60℃ 에서 1 시간 가열하여 대장균에서 유래하는 협잡 효소를 실활한 다음, 혼합물을 원심분리하여 불순물을 제거한후 상청액중의 효소활성을 측정한 결과, 배양물 1 리터중에는 재조합형 열안정성 효소를 약 120,000 단위 함유하고 있었다. 상청액을 실험 1 의 방법으로 정제하여 비활성이 약 135 단위/mℓ 단백질인 재조합형 열안정성효소 약 1,400 단위/mℓ을 함유하는 수용액을 약 177 mℓ얻었다.

정제 효소의 성질과 성상을 실험 2 의 방법으로 조사한 결과, 소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE) 에 의한 분자량은 약 100,000 ∼ 110,000 달톤이었고 등전점 전기 영동법에 의한 등전점은 약 3.8 ~ 4.8 이었으며 수용액 (pH 7.0) 중에서 80℃ 에서 60 분간 유지하더라도 실활하지 않음을 판명하였다. 이들 물리화학적인 성질은 공여체 미생물인 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 성질과 실질적으로 동일하다.

실시예 B-1 : 재조합형 효소에 의한 트레할로오스 시럽의 제조

감자전분을 농도 10 w/w % 되도록 물속에 현탁하고, 이 현탁액을 pH 5.5 로 조정후 일본국 Nagase 생화학공업사 판매의 α-아밀라아제제 (劑) " SPITASE HS " 를 전분 1 g 당 2 단위 가하고 95℃ 에서 가열하여 전분을 호화 및 액화 하였다. 액화액을 120℃ 에서 20 분간 오토클레이브하여 효소를 실활시키고 50℃로 급냉한 후 pH를 5.0 으로 조정하여 전분 1 g 당 일본국의 林原 생물 화학 연구소 판매의 이소아밀라아제제 (劑) 를 500 단위, 그리고 일본국의 Nagase 생화학공업사 판매의 β-아밀라아제제 (劑)를 20 단위 가하고 50℃에서 24시간 반응시켜 공형분당 말토오스를 약 92 w/w % 함유하는 당액을 얻었다.

이 당액을 100℃에서 20분간 가열하여 효소를 실활시키고 60℃로 냉각한 후 pH 를 6.5 으로 조정한 다음 실시예 A-1 의 방법으로 제조한 재조합형 효소를 전분고형분 1 g 당 1 단위 가하고 96 시간 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 100℃ 에서 10 분간 가열하여 효소를 실활시키고 냉각하여 여과후 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 이온교환수지로 탈염, 정제하여 농축함으로써 농도 약 70 w/w % 의 시럽을 원료 전분 고형물당 약 95% 의 수율로 얻었다.

트레할로오스를 고형물당 약 68 w/w % 함유하는 이 제품은 환원력이 DE (dextrose equivalent) 18.4 로서 비교적 낮고, 더욱이 온화한 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으므로 감미제, 정미(呈味) 개량제, 안정제, 충전제, 보조제 또는 부형제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-2 : 재조합형 DNA 에 의한 트레할로오스 분말의 제조

실시예 B-1 의 방법으로 제조한 반응 혼합물을 pH 5.0 으로 조정하고, 여기에 일본국의 Nagase 생화학공업사 판매의 글루코아밀라아제제 (劑) " GLUCOZYME" 을 전분 고형분 1 g 당 10 단위 가하여 50℃ 에서 24 시간 효소 반응시켰다. 이와 같이 하여 수득한 반응 혼합물을 가열하여 잔존 효소를 실활시키고 통상의 방법으로 탈색, 탈염, 정제한후 일본국의 동경유기화학공업사 판매의 Na⁺형 양이온 교환수지 " XT-1016 " (가교도 4 %) 을 사용하는 이온교환 칼럼 크로마토그래피 처리하여 트레할로오스 함량을 높였다. 더욱 구체적으로는 물에 현탁시킨 이온교환 수지를 내경 5.4 cm 의 자켓부 스테인레스강제 칼럼 4 개에 충전한 후 이 칼럼을 직열로 연결하여 칼럼 전체 길이를 20 m 로 하였다. 칼럼내 온도들 60℃ 로 유지하면서 상기 반응 혼합물을 칼럼에 약 5 v/v % 부하한 다음 60℃ 의 온수를 SV (공간속도) 0.15 로 공급하여 분획함으로써 트레할로오스 고함유 획분을 채취하였다. 이 획분을 통상의 방법으로 농축하고 진공 건조한 다음 분쇄하여 트레할로오스 분말을 원료 고형물당 약 50 % 의 수율로 얻었다.

트레할로오스를 고형분당 약 97 w/w % 함유하는 이 제품은 환원력이 비교적 낮고, 온화한 감미를 가지고 있으므로 감미제, 정미 개량제, 안정제, 충전제, 보조제 또는 부형제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-3 : 재조합형 효소에 의한 결정성 트레할로오스 분말의 제조

실시예 B-2 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 획분을 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 이온교환 수지로 탈염하여 농도 약 70 w/w % 용액으로 농축하였다. 이 농축물을 결정화기에 넣고 교반하면서 서서히 냉각하여 결정율 약 45% 인 매스키트 (massecuite) 를 얻었다. 이어서 약 85℃ 의 온풍을 분무 건조탑 상부로 부터 아래쪽을 향해 송풍하면서 매스키트를 건조탑 상부에 설치된 노즐로 부터 약 150 kg/cm²의 가압하에 분무건조탑의 아래쪽을 향해 분무하는 한편, 분무건조탑 저부에 설치된 금망 컨베이어 위에 포집한 결정성 분말을, 컨베이어 하부로 부터 약 45℃ 의 온풍을 송풍하면서 분무건조탑 밖으로 서서히 반출하였다. 그 후, 결정분말을 숙성탑에 보내서 온풍 기류중에서 10 시간 숙성하여 결정화와 건조를 완료하였다. 이와 같이 하여 트레할로오스 함수 결정의 분말을 원료 고형분당 약 90 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 실질적으로 흡습성을 나타내지 않고 취급도 용이하므로 감미제, 정미개량제, 품질 개량제, 안정제, 충전제, 보조제 또는 부형제등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-4 : 재조합형 효소에 의한 무수 결정성 트레할로오스 분말의 제조

실시예 B-2 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 획분을 실시예 B-3 과 마찬가지로 정제한후 증발가마에 넣고 감압하에 끊여 수분함량 약 3.0 w/w % 의 시럽을 얻었다. 이 시럽을 결정화기에 넣고 종정 (種晶) 으로서 무수결정 트레할로오스를 고형분당 약 1 w/w % 가하고 교반하면서 120℃ 에서 결정화한 다음 알루미늄제 용기에 옮겨 100℃ 에서 6 시간 숙성하여 블록을 형성하였다. 수득한 블록을 절삭기로 분쇄하고 유동층 건조하여 수분 약 0.3 w/w % 의 무수 결정 트레할로오스 분말을 원료 고형물당 약 85 % 의 수율로 얻었다.

강력한 탈수작용을 가진 이 제품은 음식물, 화장품, 의약품 혹은 그 제조원료 또는 가공 중간물의 탈수제로서, 더욱이는 온화한 감미를 가진 백색 분말 감미제로서 음식물, 화장품, 의약품을 비롯한 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-5 : 재조합형 효소에 의한 트레할로오스 분말의 제조

" MALTOSE HHH" (일본국 林原 생물화학 연구소 판매의 고순도 말토오스) 를 농도 40 w/w % 되게 물에 용해하고 57℃ 로 가열한후 pH 6.5 로 조정하고, 여기에 실시예 A-2 의 방법으로 제조한 재조합형 열안정성 효소를 말토오스 g 당 2 단위 혼합한 다음, 48 시간 효소반응 시켰다. 이 반응 혼합물을 100℃에서 10 분 가열하여 잔존하는 효소를 실활하고 통상의 방법으로 냉각, 여과, 활성탄에 의한 탈색, 이온교환 수지에 의한 탈염, 정제후 진공건조하여 분쇄함으로써 건조 고형물 기준으로 트레할로오스를 약 73 w/w % 함유하는 분말 제품을 원료인 말토오스에 대해건조 고형을 기준으로 약 90 % 의 수율로 얻었다.

이 제품은 DE (dextrose equivalent) 가 19 로서 말토오스의 DE 의 약 30 %이지만 말토오스와 동일한 점도를 가지며 온화한 감미와 적당한 보습성을 가지고 있으므로, 감미제, 품질개량제, 안정제, 충전제, 보조제 및 부형제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 말토오스 또는 트레할로오스에 작용할 경우 각각 트레할로오스 또는 말토오스를 생성하는 신규의 열안정성 효소의 발견에 근거한 것이다. 본 발명은 재조합 DNA 기술에 의해 이러한 효소를 대규모로, 효율적으로 생산하는 길을 개척하는 것이다. 본 발명의 재조합형 열안정성 효소를 사용하는 효소적 변환방법에 의하여 말토오스는 극히 높은 수율로 트레할로오스와 글루코오스 및/또는 말토오스를 함유한 당조성물로 변환된다.

트레할로오스는 온화하고도 고품위의 감미를 가지며 분자중에 환원성기를 가지지 아니하므로 착색과 변질의 우려없이 일반 음식물을 감미부여할 수 있다. 더욱이 본 발명의 재조합형 효소는 전 (全) 아미노산 배열이 밝혀진 효소이고 식품등에 배합사용을 전제로 하는 트레할로오스의 제조시에 안심하고 사용할 수 있는 것이다.

따라서 본 발명은 상기한 바와 같은 현저한 작용효과를 발휘하므로 이 분야에 있어서 공헌하는 바가 실로 다대한 발명이라 할 수가 있다.

제 1 도는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 로 부터 생성된 효소의 최적 온도를 나타내는 그래프.

제 2 도는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 로 부터 생성된 효소의 최적 pH 를 나타내는 그래프.

제 3 도는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 로 부터 생성된 효소의 열적 안정성을 나타내는 그래프.

제 4 도는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 로 부터 생성된 효소의 pH 안정성을 나타내는 그래프.

제 5 도는 본 발명에 의한 재조합 DNA pBTM22 의 구조를 나타내는 도면.

제 6 도는 본 발명에 의한 재조합 DNA pBTM23 의 구조를 나타내는 도면.

Claims

(가) 아래의 SEQ ID NO: 3에 있는 아미노산 배열 및 이 아미노산 배열에 대해 상동적인 아미노산 배열로 된 군으로부터 선택되는 아미노산 배열을 가지고,

(나) 아래의 (1) 내지 (7)의 물리화학적 성질을 가지며,

(다) 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 작용을 가진 재조합형 효소.

물리화학적 성질

(1) 작용

말토오스에 작용하면 트레할로오스를, 트레할로오스에 작용하면 말토오스를 생성함;

(2) 분자량 (MW)

소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)에 의하여 100,000 ∼ 110,000 달톤 ;

(3) 등전점 (pI)

등전점 전기 영동법에 의하여 3.8 ∼ 4.8 ;

(4) 최적온도

pH 7.0 에서 60 분 유지하여 65℃ ;

(5) 최적 pH

60℃ 에서 60 분 유지하여 6.0 ∼ 6.7 ;

(6) 열적안정성

pH 7.0 에서 60 분 유지하더라도 80℃ 까지 안정함 ;

(7) pH 안정성

60℃ 에서 60 분 유지하더라도 pH 5.5 ∼ 9.5 에서 안정함.
제 1 항에 기재된 재조합형 효소를 코우드 하는 DNA.
제 2 항에 있어서, 아래의 SEQ ID NO : 4 에 있는 염기배열, 이 염기배열에 대해 상동적인 염기배열 및 이들 염기배열에 대해 상보적인 염기 배열로 된 군으로부터 선택되는 염기배열을 가진 DNA.
제 3 항에 있어서, 유전자 코우드의 축중에 따라, SEQ ID NO : 3 의 아미노산 배열을 바꾸지 않고 SEQ ID NO : 4 에서의 염기 1 개 또는 그 이상을 다른 염기로 치환한 DNA.
제 2 항에 있어서, 아래의 SEQ ID NO : 5 의 염기배열을 가진 DNA.
제 2항에 있어서, 더어무스 속(屬)의 미생물에서 유래하는 DNA.
제 1 항에 기재된 효소를 코우드하는 DNA와 자체 복제가능한 벡터를 함유하는 복제가능한 재조합 DNA.
제 7 항에 있어서, DNA 가 SEQ ID NO : 4 에 있는 염기배열, 이 염기배열에 대해 상동적인 염기배열 및 이들 염기배열에 대해 상보적인 염기 배열로 된 군으로부터 선택되는 염기배열을 가진 복제가능한 재조합 DNA.
제 8 항에 있어서, DNA 가 유전자 축중에 따라, SEQ ID NO : 3 의 아미노산 배열을 바꾸지 않고 SEQ ID NO : 4 에서의 염기 1 개 또는 그 이상을 다른 염기로 치환하여 얻는 것인 복제가능한 재조합 DNA.
제 7 항에 있어서, DNA 가 SEQ ID NO : 5 의 염기배열을 가진 복제 가능한 재조합 DNA.
제 7항에 있어서, 더어무스 속의 미생물에서 유래하는 복제가능한 재조합 DNA.
제 7 항에 있어서, 자체 복제가능한 벡터가 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+) 또는 pKK223-3인 복제가능한 재조합 DNA.
제 1 항에 기재된 효소를 코우드하는 DNA와 자체 복제 가능한 벡터를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA를, 대장균 종(種), 바실루스 속(屬), 악티노마이세스 속(屬) 및 효모로 된 군으로부터 선택되는 숙주 미생물에 도입하여 제조되는 형질 전환체.
제 13 항에 있어서, DNA 가 SEQ ID NO : 4 에 있는 염기배열, 이 염기배열에 대해 상동적인 염기배열 및 이들 염기배열에 대해 상보적인 염기배열로 된 군으로부터 선택되는 염기배열을 가진 것인 형질전환체.
제 14 항에 있어서, DNA가 유전자 코우드의 축중에 따라, SEQ ID NO : 3 의 아미노산 배열을 바꾸지 않고 SEQ ID NO : 4 의 염기배열에서의 염기 1 개 또는 그 이상을 다른 염기로 치환하여 얻는 것인 형질전환체.
제 13 항에 있어서, DNA가 SEQ ID NO : 5 의 염기배열을 가진 형질전환체.
제 13 항에 있어서, DNA가 더어무스속의 미생물에서 유래하는 형질전환체.
제 13 항에 있어서, 자체 복제가능한 벡터가 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+) 또는 pKK223-3 인 형질전환체.
(가) 제 1 항에 기재된 재조합형 효소를 코우드하는 DNA와 자체 복제 가능한 벡터를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA를, 대장균 종(種), 바실루스 속(屬), 악티노마이세스 속(屬) 및 효모로 된 군으로부터 선택되는 숙주 미생물에 도입하여 제조된 형질 전환체를 영양배지에서 배양하여 효소를 생성시키고,

(나) 생성된 효소를 배양물로부터 채취하는 재조합형 효소의 제조방법.
제 19 항에 있어서, DNA가 SEQ ID NO : 4 에 있는 염기배열, 이 염기 배열에대해 상동적인 염기배열 및 이들 염기배열에 대해 상보적인 염기배열로 된 군으로부터 선택되는 염기배열을 가지는 제조방법.
제 20 항에 있어서, DNA가 유전자 코우드의 축중에 따라, SEQ ID NO : 3 의 아미노산 배열을 바꾸지 않고 SEQ ID NO : 4 의 염기배열에서의 염기 1 개 또는 그 이상을 다른 염기로 치환하여 얻는 것인 제조방법.
제 19 항에 있어서, DNA가 SEQ ID NO : 5 의 염기배열을 가진 제조방법.
제 19 항에 있어서, DNA가 더어무스속의 미생물에서 유래하는 제조방법.
제 19 항에 있어서, 자체 복제가능한 벡터가 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+) 또는 pKK223-3 인 제조방법.
제 19 항에 있어서, 영양배지에서 생성된 재조합형 효소를 원심분리, 여과, 농축, 염석, 투석, 분별침전, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동으로 된 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 방법에 의해 회수하는 제조방법.
말토오스에 제 1 항에 기재된 재조합형 효소를 작용시켜 트레할로오스를 생성시키는 공정을 포함하는 말토오스의 효소적 변환방법.
제 26 항에 있어서, 말토오스를 50 w/w % 까지 함유하는 수성 매체 중에 유효량의 재조합형 효소를 공존시키고, 수득한 혼합물을 55℃ 이상의 온도 및 pH 5∼10에서 효소반응시키는 말토오스의 효소적 변환방법.
제 26 항에 있어서, 수득한 반응 혼합물은 건조 고형물 기준으로 트레할로오스를 약 50 w/w % 이상 함유하는 말토오스의 효소적 변환방법.
(가) 호화 전분 혹은 액화 전분에 β-아밀라아제를 작용시켜 말토오스 함유 당질 혼합물을 얻고,

(나) 상기 (가) 단계에서 얻은 상기 당질 혼합물에 제1항의 효소를 작용시켜 트레할로오스를 생성시키고,

(다) 이 트레할로오스를 채취하는 것을 포함하는 트레할로오스의 제조방법.
제29항에 있어서, 상기 (다) 단계는, 수득한 혼합물에 효모를 작용시켜 발효시키거나, 또는 알칼리 처리하여 당질을 분해시키고 불순물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
제29항에 있어서, 상기 (다) 단계는, 수득한 혼합물을 이온교환 수지에 의한칼럼 크로마토그래피 처리를 하여 불순물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
제29항에 있어서, 상기 (다) 단계는, 수득한 혼합물 중의 상기 트레할로오스를 결정화하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
제29항에 있어서, (가) 단계는 호화 전분 또는 액화 전분에 전분 지절 효소와 더불어 작용시키는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.