KR100387303B1

KR100387303B1 - 비환원성 당질로부터 트레할로오스를 유리하는 재조합 열안정성 효소

Info

Publication number: KR100387303B1
Application number: KR1019950021518A
Authority: KR
Inventors: 미쓰즈미히도시; 구보라미찌오; 스기모도도시유끼
Original assignee: 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 1994-07-21
Filing date: 1995-07-21
Publication date: 2003-08-21
Also published as: ATE171726T1; CA2154333C; US6346394B1; EP0697461A1; CA2154333A1; JP3557289B2; DE69505075T2; DK0697461T3; ES2123212T3; AU2713195A; US6027918A; TW418255B; JPH08336388A; DE69505075D1; US5856146A; AU690285B2; IL114643A0; EP0697461B1

Abstract

말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리하는 분자량 약 54,000∼64,000 달톤이고 등전점 (pI) 이 약 5.6∼6.6 인 재조합 열안정성 효소를 제공한다. 이 효소는 열안정성이 만족스러울 정도로 높은데, 즉 수용액 (pH 7.0) 중에서 85℃ 에서 60 분간 유지하더라도 실질적으로 실활하지 않으므로 트레할로오스의 공업적인 규모의 고수율의 제조가 가능하도록 한다.

배 열 표

(1) SEQ ID NO:1 의 정보 :

(i) 배열의 특징 :

(A) 길이 : 556 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(D) 토폴로지 : 선형

(ii) 분자 타입 : 펩티드

(xi) 배열 : SEQ ID NO:1 :

(2) SEQ ID NO:2 의 정보 :

(i) 배열의 특징 :

(A) 길이 : 1668 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(xi) 배열 : SEQ ID NO:2 :

(3) SEQ ID NO:3 의 정보 :

(i) 배열의 특징 :

(A) 길이 : 30 아미노산

(B) 타입 : 아미노산

(D) 토폴로지 : 선형

(ii) 분자 타입 : 펩티드

(v) 단편 타입 : N 말단 단편

(xi) 배열 : SEQ ID NO: 3 :

(4) SEQ ID NO:4 의 정보 :

(i) 배열의 특징 :

(A) 길이 : 19 아미노산

(B) 타입 : 아미노산

(D) 토폴로지 : 선형

(ii) 분자 타입 : 펩티드

(v) 단편 타입 : 내부 단편

(xi) 배열 : SEQ ID NO:4 :

(5) SEQ ID NO:5 의 정보 :

(i) 배열의 특징 :

(A) 길이 : 1668 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(C) 가닥의 수 : 이중가닥

(D) 토폴로지 : 선형

(ii) 분자 타입 : genomic DNA

(vi) 기원 :

(A) 미생물 : Sulfolobus acidocaldarius

(B) 개체 분리물 : ATCC 33909

(xi) 배열 : SEQ ID NO:5 :

(6) SEQ ID NO:6 의 정보 :

(i) 배열의 특징 :

(A) 길이 : 34 염기쌍

(B)타입 : 핵산

(C) 가닥의 수 : 이중 가닥

(D) 토폴로지 : 선형

(ii) 분자 타입 : 올리고뉴클레오티드

(xi) 배열 : SEQ ID NO:6 :

(7) SEQ ID NO:7 의 정보 :

(i) 배열의 특징 :

(A) 길이 : 9 염기쌍 및 4 단일 염기

(B) 타입 : 헥산

(D) 토폴로지 : 선형

(ii) 분자 타dlq : 합성 DNA

(xi) 배열 : SEQ ID NO:7 :

Description

비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리하는 재조합 열안정성 효소

본 발명은 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리하는 재조합 열안정성 효소에 관한 것이다.

트레할로오스는 환원성 그룹이 함께 결합되어 있는 글루코오스 두 분자로 구성된 이당 (disaccharide) 으로서 진균, 해조류, 곤충 등에 극히 소량 존재하고 있다. 트레할로오스는 분자내에 환원성 그룹이 없어서 아미노산 등의 존재하에 가열하더라도 불필요할 같변반응를 일으키지 않으므로 불필요한 착색이나 열화(劣化) 를 일으킨 우려가 없이 음식물의 감미부여에 유리하게 사용할 수 있다.

그러나, 트레할로오스는 종래의 제조 방법으로 필요한 양으로 쉽사리 제조할 수 없기 때문에 음식물의 감미 여부에 사용하기가 극히 어려웠다.

종래의 제조 방법은 두가지로 대별되는데, 즉 그 한가지는 미생물의 균체를 이용하는 방법이고, 다른 한가지는 몇가지 효소를 기질에 작용시키는 복합효소계를 이용하는 방법이다. 전자의 방법은 일본국 특히 공개 제 154,485/75 호에 개시되어 있는 것으로서 박테리아, 효모 등의 미생물을 영양 배지에서 생육시켜 주로 증식된 균체로 부터 트레할로오스를 채취하는 방법이다. 후자의 방법은 일본국 특허 공개 제 216,695/83 호에 개시되어 있는 것으로서 기질인 말토오스를 만들어 이 말토오스에 말토오스-포스포릴라아제와 트레할로오스-포스포릴라아제를 사용하는 복합효소계를 작용시켜 생성된 트레할로오스를 반응계로 부터 회수하는 방법이다. 전자의 방법은 미생물의 생육이 용이하나 미생물중의 함량이 고형물 기준 (d.s.b.) 으로 많아야 15 w/w ％ 라는 결점이 있다. 후자의 방법은 트레할로오스를 용이하게 분리할 수 있으나 효소반응 그 자체가 두가지 상이한 종류의 효소 사이의 평형반응이고 그 평형점도 항시 글루코오스 포스페이트 생성쪽으로 치우쳐 있기 때문에 상당히 고농도 포스포릴라아제를 기질에 작용시켜 트레할로오스 수율을 증대시키기가 이론적으로 곤난하다.

이러한 사정을 고려하여 본 발명자들은 전분당으로 부터 트레할로오스 구조를 가진 당질을 생성하는 효소를 예의 검색하여 은 결과, 리조븀속 (Rhizobium屬) 과 아르드로박터속 (Arthrobacter屬) 에 속하는 미생물이 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분당으로 부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하는 아주 신규한 효소를 생성한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이 효소를 일본국 특허 출원 제 349,216/93 호에 개시한 바 있다. 거의 동시에 본 발명자들은 이들 비환원성 당질은 리조븀속과 아르드로박터속의 동일한 미생물로부터 생성된 기타 효소에 의해 거의 정량적으로 가수분해되어 트레할로오스와 글루코오스 및/또는 말토올리고당을 생성한다는 것도 발전하였다.

위에 나온 미생물로 부터 생산된 효소는 최적 온도가 약 40℃ 이고 실제로 트레할로오스 제조에 사용했을 경우 열적 안정성에 있어서 몇가지 난점이 있음이 확인 되었다. 이 기술분야에서 인식되어 있는 점으로서는 박테리아 오염이 55℃ 이하에서 일어나고 반응 혼합물의 pH 를 저하시키며 사용된 효소들실활시키고, 따라서, 비교적 다량의 기질이 미반응인체로 잔존하게 되므로 전분 또는 전분당의 당화 온도는 55℃ 이상이 되어야 한다는 것이다.열안정서어이 불량한 효소를 사용하더라도 pH 조절에 세심한 주의들 해야하고, pH 를 극히 낮은 수준까지 저하하면 반응 혼합물에 알칼리를 첨가하여 pH 수준을 될 수 있는 한 신속히 증가 시켜야 한다.

이러한 사정을 고려하여 본 발명자들은 활성이 만족스러운 열안정성 효소를 검색한 결과, 술폴로부스 아시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius) (ATCC 33909) 를 비롯한 술폴로부스속 (屬) 에 속하는 미생물로 부터 생산된 효소는 55℃이상의 온도에서 배양하더라도 실질적으로 실활되지 않고, 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 효율적으로 유리한다는 것을 발견하였다. 그러나, 이들 미생물은 효소 생산성이 불충분하므로 이들 비환원성 당질로 부터 공업적으로 트레할로오스를 생산하기 위해서는 비교적 대량으로 배양할 필요가 있다.

근래, 재조합 DNA 기술은 현저한 발전을 하고 있다. 현재, 총 아미노산 배열이 확인되지 아니한 효소이더라도 효소를 코우드하는유전자를분리하여 그 염기 배열을 해독할 수 있다면 이 효소를 코우드하는 DNA 를 함유한 재조합 DNA 를 제조하여 이것을 미생물 또는 동식물의 세포속에 도입하고, 수득한 형질 전환체를 배양함으로써 쉽사리 제조할 수 있다. 이러한 상황하에서 열안정성 효소를 코우드하는 유전자를 발견하여 그 염기 배열을 해독하는 것이 급선무이다.

본 발명의 한가지 목적은 재조합 DNA 기술을 이용하여 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리하는 재조합 열안정성 효소를 제공함에 있다.

본 발명의 또 한가지 목적은 재조합 열안정성 효소를 코우드하는 DNA를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 DNA 를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA 를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 DNA 를 도입하는 형질 전환체를 제공함에 있다.

본 발명의 추가적인 다른 목적은 형질 전환체를 사용하여 재조합 열안정성 효소를 제조하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 발단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리하는 효소적 변환 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 첫번째 목적은 아래의 물리화학적 성질을 가진 재조합 열안정성 효소에 의해 달성된다.

(1) 작용

말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리함.

(2) 분자량

소디움 도데실 술폐이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 (SDS-PAGE) 으로 약 54,000∼64,000 달톤

(3) 등전점 (pI)

등전점 전기 영동법으로 약 5.6∼6.6

(4) 열안정성

수용액 (pH 7.0) 중에서 85℃ 에서 60 분간 유지하더라도 실질적으로 실활하지 않음.

본 발명의 두번에 목적은 재조합 열안정성 효소를 코우드하는 DNA 에 의해 달성된다.

본 발명의 세번째 목적은 자체 복제 가능한 벡터와 재조합 열안정성 효소를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA 에 의해 달성된다.

본 발명의 네번째 목적은 복제 가능한 재조합 DNA를 적당한 숙주에 도입하여 제조되는 형질 전환체에 의해 달성된다.

본 발명의 다섯번째 목적은 영양 배지에서 형질 전환체를 배양하고, 생성된 재조합 열안정성 효소를 배양물로 부터 채취하는 재조합 열안정성 효소의 제조 방법에 의해 달성된다.

본 발명의 여섯번째 목적은 비환원성 당질에 재조합 열안정성 효소를 작용시켜 트레할로오스를 유리시킴을 특징으로 하는 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질의 효소적 변환 방법에 의해 달성된다.

본 발명의 재조합 열안정성 효소는 55℃ 를 초과하는 온도에서 반응시키더라도 실질적인 실활의 우려도 없이 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리한다.

본 발명의 DNA 는, DNA 를 적당한 자체 복제 가능한 벡터에 도입하여 복제 가능한 재조합 DNA를 생성시키고, 복제 가능한 재조합 DNA를, 본 발명의 효소를 자체 생산하지는 않으나 용이하게 증식할 수 있는 적당한 숙주에 도입함으로써 본 발명의 효소의 생산을 발현한다.

본 발명의 재조합 DNA 는, 본 발명의 효소를 생산하지는 않으나 용이하게 증식 할 수 있는 적당한 숙주에 이것을 도입함으로써 본 발명의 효소의 생산을 발현한다.

본 발명의 형질 전환체는 배양시 본 발명의 효소를 생산한다.

본 발명의 방법에 의해 형질 전환체를 배양하면 소요량의 본 발명의 효소를 용이하게 생산한다.

본 발명의 효소적 변환 방법에 의하여 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며, 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 당질을 트레할로오스와 글루코오스 및/또는 말토올리고당을 함유하는 당 조성물로 변환시킨다.

본 발명은 발단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리하는 신규의 효소의 발견에 근거하여 된 것이다. 이러한 효소는 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 종 (種)의 미생물의 배양물로 부터 얻는다. 본 발명자들은 칼럼 크로마토그래피를 주로 한 각종 정제 방법을 병용하여 이 효소를 분리하여 그 성질과 성상에 대해 조사한 결과, 그 실체는 아래의 물리화학적 성질을 가진 폴리펩티드하는 것이 판명되었다.

(1) 작용

(2) 분자량

소디움 도데실 술페이드 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 (SDS-PAGE) 으로 약 54,000∼64,000 달톤

(3) 등전점 (pI)

등전점 전기 영동법으로 약 5.6∼6.6

(4) 최적 은도

pH 6.0 에서 30 분간 유지할 경우 약 75℃ 의 최적 온도를 나타냄.

(5) 최적 pH

60℃ 에서 30 분간 유지할 경우 약 5.5∼6.0 의 최적 pH 를 나타냄.

(6) 열안정성

pH 7.0 에서 60 분간 유지하더라도 약 85℃ 까지 안정함.

(7) pH 안정성

25℃ 에서 16 시간 동안 유지할 경우 pH 약 5.5∼9.5 까지 안정함.

술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 339O9) 유래의 열안정성 효소의 물리화학적 성질을 구명하기 위한 아래의 실험에 대해 설명한다.

실험 1 : 정제 효소의 제조.

500 ㎖ 용량의 플라스크에 폴리펩톤 0.1 w/v ％, 효모 엑스 0.1 w/v ％, 황산암모늄 0.2 w/v％, 인산 2 수소 칼륨 0.05 w/v％, 황산 마그네슘 7 수화물 0.02 w/v ％, 염화 칼륨 0.02 w/v ％ 및 물로 된 액체 배지를 100 ㎖ 넣고 120℃ 에서 20 분간 오토클레이브하여 멸균하였다. 플라스크를 냉각한 후 플라스크 내의 각 액체 배지에 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 의 종배양액을 접종한 다음 130 rpm의 회전진탕 조건하에 75℃ 에서 24 시간 배양하여 1 차 종배양액을 얻었다. 동일한 액체 배지 약 5 리터를 10 리터 용량의 퍼어멘터(fermenter) 에 넣고 위와 마찬가지로 멸균하여 75℃ 로 냉각한 다음 pH 3.0 으로 조정한 후 퍼어맨터내의 멸균된 액체 배지에다 1 차 종배양액을 1 v/v ％ 접종하고 500 ㎖/분의 통기 조건하에 75℃ 에서 24 시간 미생물을 배양하였다. 이어서, 300 리터 용량의 퍼어멘터에 동일한 액체 배지 약 250 리터를 넣고 위와 마찬가지로 멸균하고 75℃ 로 냉각하며 pH 3.0 으로 조정한 다음 멸균된 액체 배지에 2 차 종배양액 1 v/v ％을 접종하고 100 리터/분의 통기 조건하에 75℃ 에서 42 시간 미생물을 배양하였다.

수득한 배양액 약 170 리터를 SF 멤브레인으로 여과하고, 여액를 원심분리 하여 습균체를 얻었다. 습균체 약 258 g 을 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 300 ㎖ 중에 현탁하고 균체를 초음파 파쇄하였다. 이렇게 하여 수득한 균체 파쇄물을 10,000 rpm 에서 30 분간 원심분리하여 약 300 ㎖ 의 상청액을 얻어 포화도 70 w/v ％ 가 되도록 황산 암모늄을 혼합한 다음 4℃ 에서 24 시간 방치한 후 10,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 침전물을 채취하고 적당량의 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.5) 에 용해한 후 동일한 완충액에 대해 24시간 투석하였다. 이어서, 투석액을 10,000 rpm 에서 30 분간 원심분리하여 효소 활성을 가진 상청액 약 300 ㎖ 을 얻었다.

이 상청액을 " DEAE-TOYOPEARL " (일본국의 Tosoh 사제의 이온 교환 칼럼 크로마토그래피용 겔) 약 360 ㎖ 이 충전된 칼럼에 공급하고 10 mM Tris-HCI 완충액 (pH 8.5) 중에서의 0 M 로 부터 0.3 M 범위의 선형 기울기의 완충액을 공급하였다. 약 0.1 M 염화 나트륨 농도에서 용출한 효소 활성 획분을 회수하여 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM Tris-HCI 완충액 (pH 8.5) 에 대해 10 시간 투석하였다. 투석액을 원심분리하여 불용물을 제거하고 1 M 황산암모늄을 함유하는 10 mM Tris-HCI완충액 (pH 8.5) 으로 미리 평형화시켜 둔 " BUTYL- TOYOPEARL 650 " (일본국 Tosoh 사 판매의 소수 크로마토그래피용 겔) 350 ㎖ 충전 칼럼을 통과시키고 10 mM Tris-HCI 완충액 (pH 8.5) 중에서의 황산 암모늄 1 M 로 부터 0 M 까지의 범위의 선형 기울기의 완충액을 통과시켰다.

황산 암모늄 농도 0.2 M 부근에서용출한 효소 활성 획분을 채취하여 0.2 M 염화나트륨을 함유하는 10 mM Tris-HCI 완충액 (pH 8.5) 에 대해 16 시간 투석하고 원심분리하여 불용물을 제거하였다. 수득한 상청액을 0.2 M 염화 나트륨을 함유하는 10 mM Tris-HCI 완충액 (pH 8.5) 으로 미리 평형화시켜 둔 " TOYOPEARLHW-55 " (미합중국 Sepracor 사 판매의 겔 크로마토그래피용 겔) 350 ㎖ 충전 칼럼을 통과시켰다. 용출액으로 부터 효소 활성 획분을 채취하여 10 mM Tris-HCI 완충액 (pH 8.5) 에 대해 16 시간 투석하였다. 투석액을 원심분리하여 불용물을 제거하고 상청액을 10 mM Tris-HCI 완충액 (pH 8.5) 으로 미리 평형화시켜 둔 " SUPERROSE 12 HR 10/3O " (스웨덴국의 Pharmacia LKB 사제) 약 10 ㎖ 충전칼럼에 부하하고, 10mM Tris-HCI 완충액 (pH 8.5)으로 용출하였다. 염화 나트륨 농도 0.IM 부근에서용출된 효소 활성 획분을 채취하여 다음의 실험에 사용하였다. 이렇게 하여 수득한 정제 효소의 비활성은 약 378 단위/mg 단백질이었고, 그 수득량은 배양액 1 리터당 약 0,86 단위이었다.

정제 단백질을 통상의 방법으로 7.5 w/v ％ 폴리아크릴아미드 겔로 전기 영동 처리하여 효소 활성을 가진 실질적으로 단일의 단백질 밴드를 얻었다. 이것은 정제 단백질이 극히 순수함을 나타내는 것이다.

명세서를 통하여 본 발명의 열안정성 효소의 활성을 다음의 시험으로 측정한 값으로 나타낸다. 즉, 기질로서 α-말토트리오실트레할로오스 1.25 w/v ％ 를 함유하는 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 4 ㎖ 을 시험관에 넣고 여기에 적당히 회석된 효소액 l ㎖ 을 가하여 60℃ 에서 30 분간 유지함으로써 효소반응시켰다. 이어서, 반응액 1 ㎖ 을 소모기 (Somogyi) 구리용액 2 ㎖ 와 혼합하여 효소반응을 정지시킨 다음 소모기-넬슨법 (Somogyi-Nelson method) 으로 환원력를 측정하였다. 대조로서 100℃ 에서 30 분간 가열하여 효소를 실활시킨 효소액를 사용하는 계를 만들어 위와 마찬가지로 처리하였다. 열안전성 효소의 활성 1 단위는 위에 나온 바와 동일한 조건하에 1 분당 글루코오스 1 μmol 의 환원력을 증가시키는 효소의 양으로 정의하였다.

실험 2 : 열안정성 효소의 물리화학적 성질

실험 2-1 : 작용

α-글루코실트레할로오스, α-말토실트레할로오스, α-밀토트리오실트레할로오스, α-말토테트라오실트레할로오스 또는 α-말토펜타오실트레할로오스를 기질로 하여 각각 50 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) 중에 용해하여 20 w/v ％ 용액으로 한 다음, 여기에 실험 1 에서 제조한 정제 열안정성 효소를 기질 1 g 당 (d.s.b.) 2 단위 가하고 60℃ 에서 48 시간 동안 효소반응시켰다. 반응 혼합물을 통상의 방법으로 탈염하여 얻은 용액를 " WAKOBEAD WB-T-330 " 칼럼(일본국의 和光공업 주식회사 판매의 HPLC 용 칼럼) 을 사용한 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로 당조성을 분석하였다. HPLC 는 주위 온도에서 실시하였고 물을 용리제로 사용하여 "MODEL RI-8012 " [일본국의 Tosoh 사 판매의 시차 (示差) 굴절계] 로 용출액을 모니터링하면서 칼럼에 0.5 ㎖/분의 유속으로 공급하였다. 대조로서 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 및 말토헵타오스를 기질로 사용하는 5 가지 계 (系) 를 각각 만들어 위와 마찬가지로 처리하였다. 그 결과는 표 1 에 나와 있다.

표 1

표 1 의 결과로 부터 알 수 있는 바와 같이 정제 효소는 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질로 부터 거의 정량적으로 트레할로오스와 글루코오스 또는 말토을리고당을 유리하지만 글루코오스 중합도 3 이상의 말코올리고당에는 실질적으로 작용하지 않는다. 이들 사실로 부터 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도 3 이상인 비환원성 당질에 대해서는 정제 효소가 특이하게 작용하고 트레할로오스 잔기와 글리코실 잔기 사이의 글리코시드 결합을 특이하게 가수분해한다는 것을 알 수 있다. 이러한 효소는 아직까지 보고된 바 없으며 신규의 효소 경로를 가진 것으로 추정된다.

실험 2-2 : 분자량

문헌 [U.K. Laemmli in Nature, Vol.227, pp.680∼685 (1970)] 에 보고된 방법에 따라 실험 1 에서의 정제 효소를 SDS-PAGE 로 전기 영동하여 약 54,000∼ 64,000 달톤에 상응한 위치에서 효소 활성을 가진 단일의 단백질 밴드를 얻었다. 이 실험에 사용된 마아커 (marker) 단백질은 미오신 (MW=200,000 달톤), β-갈락 토시다아제 (MW=116,250 달톤), 포스포릴라아제 B (MW=97,400 달톤), 혈청 알부민 (MW=66,200 달톤) 및 오브알부민 (MW=45,000 달톤) 이었다.

실험 2-3 : 등전점

실험 1 에서의 정제 효소를 2 w/v ％ 앰폴라인 (ampholine) 함유 폴리아크릴 아미드 겔에서등전점전기 영동 처리했을 때 등전점은 약 5.5∼6.6 이었다.

실험 2-4 : 최적 온도

제 1 도에 있는 바와 같이 실험 1 의 정제 효소의 최적 온도는 통상적인 방법으로 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 중에서 각기 상이한 온도에서 30 분간 유지했을 때 약 75℃ 이었다.

실험 2-5 : 최적 pH

제 2 도에 있는 바와 같이 실험 1 의 정제 효소의 최적 pH 는 통상적인 방법으로 각기 상이한 pH 의 매킬베인 (Mcllvaine) 완충액중에서 60℃ 에서 30 분간 유지했을 때 약 5.5∼6.0 이었다.

실험 2-6 : 열적 안정성

제 3 도에 있는 바와 같이 실험 1 의 정제 효소는 통상적인 방법으로 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에서 60 분간 유지했을 때 약 85℃ 까지 안정하였다.

실험 2-7 : pH 안정성

제 4 도에 있는 바와 같이 실행 1 의 정제 효소는 통상적인 방법으로 pH 가 각기 상이한 50 mM 탄산 나트륨/탄산 수소 나트륨 또는 매킬베인 완충액중에서 25℃ 에서 16 시간 유지했을 때 약 5.5∼9.5 범위의 pH 에서 안정하였다.

실험 2-8 : N 말단 아미노산 배열

실험 1 의 정제 효소의 N 말단 아미노산 배열을 기상 (氣相) 단백질 시퀀서인 " MODEL 473A " (미합중국의 Perkin-Elmer 사 판매) 로 분석한 결과, 배열표 (SEQ ID NO:3) 의 아미노산 배열을 가지고 있음이 확인되었다.

실험 2-9 : 부분 아미노산 배열

실험 1 의 정제 효소 적당량을 달아 10 nM Tris-HCl 완층액 (pH 9.0) 에 대해 4℃ 에서 18 시간 투석하고, 여기에 10 mM Tris-HCl (pH 9.0) 을 가하여 효소 1mM 당 약 1 mg 의 농도로 하였다. 이 용액 l ㎖ 를 용기에 넣고 리실 엔도 펩티다아제 10 ㎍ 을 혼합하여 30℃에서 64 시간 배양하며 효소를 부분 가수분해하였다. 수득한 가수분해물을 아세토니트릴 수용액을 8 v/v ％ 함유하는 트리플루오로아세테이트 0.1 v/v ％ 으로 미리 평형화시켜 둔 " BONDAPAK C18 "(일본국의 Japan Millipore 사 판매의 HPLC 용 칼럼) 에 가한 다음 아세토니트릴 수용액의 농도를 8 v/v ％ 로 부터 48 v/v ％ 까지 증가시키면서 0.9 ㎖/분의 유속으로 트리플루오로아세테이트 0.1 v/v ％를 칼럼에 가하고, 통액 개시후 약 57 분에서 용출한 펩티드 단편을 함유한 획분을 회수하였다. 이들 획분을 모아 진공 건조하고 아세토니트릴 수용액 50 v/v ％ 을 함유하는 트리폴루오로아세테이트 0.1 v/v ％ 에 용해하였다. 실험 2-8 과 마찬가지로 펩티드 단편을 분석한 결과, 배열표 (SEQ ID NO:4) 의 아미노산 배열을 가지고 있음이 확인되었다. 이들 물리화학적 성질을 가진 효소는 알려진 바 없는 신규 효소이다.

배열표 (SEQ ID NO:3 및 4) 에 있는 부분 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오티드를 프로우브 (probe) 로 사용하여 술폴로부스아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 의 염색체 DNA 를 스크리닝한 결과, 배열표 (SEQ ID NO:2) 의 약 1,700 염기쌍으로 구성된 5' 말단으로 부터의 염기 배열을 가진 DNA 단편을 얻었다. 열안정성 효소의 염기 배열을 해독한 결과,이 열안정성 효소는 556개의 아미노산으로 되어 있고배열표 (SEQ ID NO:1) 의 N 말단으로부터의 부분 아미노산 배열을 가지고 있음이 확인되었다.

배열표 (SEQ ID NO:1 및 2) 의 아미노산 배열과 염기 배열을 확인하는데 사용된 실험 순서를 요약하면 아래와 같다.

(1) 공여체 미생물의 배양물로 부터 열안정성 효소를 분리하여 고도로 정제한 다음 그 N-말단 아미노산 배열을 결정하였다. 정제 효소를 프로테아제로 부분 가수분해하고 펩티드 단편을 분리하여 아미노산 배열을 결정하였다.

(2) 공여체 미생물로 부터 염색체 DNA 를 분리하고 정제하여 제한 효소로 부분 소화하여 약 2,000∼6,000 염기쌍으로 된 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 제한효소로 미리 절단시켜 둔 플라스미드 벡터에 DNA 리가아제로 연결하여 재조합 DNA를 얻었다.

(3) 수득한 재조합 DNA 를 대장균 (Escherichia coli) 에 도입하며 형질 전환체를 얻어, 이 형질 전환체로 부터 목적의 효소를 코우드하는 DNA 를 함유한 목적의 형질 전환체를, 위에 나온 부분 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오티드를 프로우브로 하여 콜로니 하이브리다이제이션법으로 선택하였다.

(4) 재조합 DNA 를 형질 전환체로 부터 회수하여 프라이머로 어니일링한 다음 DNA 폴리머라아제를 작용시켜 프라이머를 확장한 후 디데옥시 체인 터미네이션법으로 상보쇄 (complementary chain) DNA 의 염기 배열을 결정하였다. 염기 배열로 부터 추정되는 아미노산 배열과 위에 나온 아미노산 배열을 비교한 결과, 염기 배열은 효소를 코우드하고 있음이 확인되었다.

다음의 실험 3 및 4 는 위의 단계 (2)∼(4) 를 구체적으로 설명하는 것이다.

여기에 사용된 방법은 공지된 것인데, 예컨대 문헌 [J. Sumbruck et al. in" Moleular Cloning A Laboratory Manual ", 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989)] 에 기재된 방법이다.

실험 3 : 열안정성 효소를 코우드하는 DNA 함유의 재조합 DNA의 제조 및 이로 부터 제조한 형질 전환체

실험 3-1 : 염색체 DNA 제조

500 ㎖ 용량의 플라스크에 폴리펩톤 0.1 w/v ％, 효모 엑스 0.1 w/v ％, 황산 암모늄 0.2 w/v ％, 인산 2 수소 칼륨 0.05 w/v ％, 황산 마그네슘 7 수화물 0.02 w/v ％, 염화 칼륨 0.02 w/v ％ 및 물로 된 액체 배지를약100 ㎖ 씩 넣고 120℃ 에서 20분간 오토클레이브하여 멸균하였다. 플라스크를 냉각한 후황산을가해 pH 3.0 으로 조정하였다. 각 플라스크에 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 의 종배양액을 접종한 다음 130 rpm 의 회전 진탕 조건하에 75℃ 에서 24 시간 배양하여 종배양액을 얻었다. 동일한 액체 영양 배지 약 5 리터를 10 리터 용량의 퍼어멘터에 넣고 위와 마찬가지로 멸균하여 75℃ 로 냉각한 다음 pH 3.0 으로 조정한 후 종배양액을 1 v/v ％ 접종하고 500 ㎖/분의 통기 조건하에 75℃ 에서 24 시간 배양하였다.

수득한 균체를 원심분리하여 회수하고 TES 완충액 (pH 8.0) 에 현탁하고, 여기에 리소자임 0.05 w/v ％을 가하여 37℃ 에서 30 분간 배양하였다.

수득물을 -80℃ 에서 1 시간 동결하고 여기에 TES 완충액 (pH 9.0) 을 가하고 60℃ 로 가열한 후 TES 완충액과 페놀의 혼합액을 가하여 얼음으로 급냉한 다음 원심분리하여 상청액을 얻었다. 이 상청액에 2배 체적의 냉 (冷) 에탄올을 가하여조 () 염색체 DNA 를 침전시킨 후 회수하여 SSC 완충에 (pH 7.1) 에 용해하고 리보뉴클레아제 7.5 ㎍ 과 프로테아제 l25 ㎍ 을 가하여 37℃ 에서 1 시간 배양하였다. 이어서, 클로로포름과 이소아밀알코올의 혼합액을 반응액에 가하여 목적의 염색체 DNA 를 추출하였다. 수득한 추출물을 냉에탄올과 혼합한 다음 석출할 염색체 DNA 함유 침전물을 회수하였다. 이렇게 정제된 염색체 DNA 를 SSC 완충액 (pH 7.1) 에 용해하여 농도 약 1 mg/㎖ 로 한 후 이 용액을 -80℃ 에서 동결하였다.

실험 3-2 : 재조합 DNA pSUl8 및 형질 전환체 SUl8 의 제조

실험 3-1 의 정제 염색체 DNA 1 ㎖ 을 용기에 넣고 제한 효소 Sau 3AI 약 35 단위를 가하고 37℃ 에서 20 분간 효소반응시켜 염색체 DNA를 부분 소화한 다음 수크로오스 밀도-기울기 초원심 분리법으로 약 2,000 ∼ 6,000 염기쌍으로 된 DNA 단편을 회수하였다. Bluescript II SK(+) (미합중국 Stratagene Cloning System 사 판매의 프라스미드 벡터) 1 ㎍ 을 제한 효소 Bam HI 로 처리하여 플라스미드 벡터를 완전히 분해한 다음 DNA 단편 10 ㎍ 과 T4 DNA 리가아제 2 단위를 가하였다. 이 혼합물을 4℃ 에서 하룻밤 방치하며 DNA 단편을 플라스미드 벡터에 연결하였다. 수록한 재조합 DNA 에 " Epicurian coli XLI-Blue " (일본국의 Toyobo 사 판매의 컴피턴트 셀) 30 ㎕ 을 가하고 얼음 냉각하에 30 분간 방치한 후 42℃ 로 가열하고 SOC 브로스 (broth) 를 가하여 혼합한 다음 37℃ 에서 1시간 배양하여 재조합 DNA들 대장균에 도입하였다.

수득한 형질 전환체를 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-1-β-같락토시드 50 ㎍/㎖ 을 함유한 한천판 (pH 7.0) 에 접종하고 37℃ 에서 18 시간 배양한 다음 나일론막을 한천판 위에 놓고 한천판 위에 형성된 약 7,000 콜로니를 나일론막 위에 고정하였다. 배열표 (SEQ ID NO:3) 의 아미노산 배열중 Phe-Lys-Leu-Trp-Ala-Pro 아미노산 배열에 근거하여 5' -TTYAARYTNTGGGCNCC-3' 의 염기배열로 나타내어지는 프로우브 1 을 화학적으로 합성하여³²P 로 표지한 후 나일론막 위에 고정된 형질 전환체의콜로니에 하이브리다이즈시켜 강력하게하이브리다이즈된12 종류의 형질 전환체를 선택하였다.

목적으로 하는 재조합 DNA 를12 종류의형질 전환체로 부터 통상의 방법으로 선택하여배열표 (SEQ ID NO:4) 의 아미노산 배열 Gln-Trp-Val-Asp-Asp-Phe-His 에 따라 화학적으로 합성한 염기 배열 5' -CARTGGGTNGAYGAYTTYCA-3' 을 가진 프로우브2 를 ³² P 로 표지한 다음 문헌 [E. M. Southern in Journal of Molecular Biology, Vol.98, pp.503∼517 (1975)] 에 기재된 방법에 준하여 상기 재조합 DNA에 하이브리다이즈시켜 강력하게 하이브리다이즈된재조합 DNA 를 선택하였다. 이렇게 수득한 재조합 DNA 와 형질 전환체를 각각 " pSUl8 " 및 " SU18 "로 명명하였다.

형질 전환체 SUl8 을 앰피실린 100 ㎍/㎖ 을 함유하는 L-육즙 (pH 7.0) 에 접종하고 회전 진탕기에서 37℃ 에서 24 시간 배양하였다. 배양 완료후 원심분리 하여 배양물로 부터 균체를 채취하고 일반적인 알칼리법으로 처리하여세포밖으로재조합 DNA 를 추출하였다. 수득한 추출물을 통상의 방법으로 정제하고 분석하여 재조합 DNA pSUl8 은 약 6,000 개 염기쌍으로 구성되어 있고, 제한 효소 Ssp I 의분열 부위의 아래쪽에 약 1,700 염기쌍으로 되어 있으며 효소를 코우드하는 DNA 를 가지고 있음을 확인하였다.

실험 3-3 : 형질 전환체 SU18 에 의한 재조합 열안정성 효소의 제조

폴리펩톤 0.1 w/v ％, 효모엑스 0.1 w/v ％, 황산 암모늄 0.2 w/v ％, 인산 2 수소 칼륨 0.05 w/v ％, 황산 마그네슘 7 수화물 0.02 w/v ％, 염화 칼륨 0.02 w/v ％ 및 물로 된 액체 배지 (pH 7.0) 약 100 ㎖ 씩을 500 ㎖ 용량의 플라스크에 넣고 120℃ 에서 20 분간 오토클레이브하여 각 플라스크를 멸균하여 냉각한 후, 여기에 앰피실린 50 ㎍/㎖ 을 가하고 실험 3-2 의 형질 전환체 SU18 의 종배양액을 접종한 다음 130 rpm의 회전 진탕 조건하에 형질 전환체를 37℃ 에서 24시간 배양하여 종배양액을 얻었다. 10 리터 용량의 피어멘터에 동일한 액체 배지 약 5 리터를 넣고 위와 마찬가지로 멸균하여 37℃ 로 냉각하고, 여기에 앰피실린 50 ㎍/㎖ 을 가하여 종배양액 1 v/v ％ 을 접종한 다음 500 ㎖/분의 통기 조건하에 37℃에서 24시간 배양하였다. 수득한 배양물을 통상의 방법으로 초음파 처리하여 균체를 파쇄하였다. 수득한 상청액을 원심 분리하여 불용물을 제거한 다음 효소 활성 획분을 분석한 결과, 배양물 1 리터 중에는 약 30 단위의 재조합 열안정성 효소를 함유하고 있었다.

대조로서 대장균 XLI-Blue 균주 또는 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 의 종배양물을 앰피실린 무함유의 동일한 액체배지에 접종하였다. 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 의 배양에 있어서 영양 배지의 초기 pH 와 배양 온도를 각각 3.0 및 75℃ 로 한 것 외에는 위와 마찬가지로 배양하여 처리하였다.효소 활성의 분석에서 약 1 리터의 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 의 배양물로 부터 약 2 단위의 열안정성 효소를 얻었는데 이 수율은 형질 전환체 SU18 의 경우 보다유의 (有意) 하게낮았다. 숙주로 사용된 대장균 XLI-Blue 균주는 열안정성 효소를 생성하지 않았다.

이어서, 형질 전환체 SU18 에 의해 생성된 재조합 열안정성 효소를 실험 1 및 2 와 마찬가지로 정제하여 성질과 성상을 조사한 결과, 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 유래의 열안정성 효소와 실질적으로 동일한 물리화학적 성질을 가지고 있음이 판명되었는데, 그 이유는 (가) 재조합 열안정성 효소는 SDS-PAGE 에 의한 분자량이 약 54,000∼64,000 달톤이고,등전점 전기영동법에 의한 등전점이 약 5.6∼6.6 이며(나) 수용액 (pH 7.0) 중에서 85℃ 에서 60 분간 유지할 경우라도 실질적으로 실활되지 않기 때문이다.

이들 결과로 부터 본 발명의 열안정성 효소는 재조합 DNA 기술에 의해 현저히 향상된 수율로 제조할 수 있다는 것을 알 수 있다.

실험 4 : 상보쇄 DNA 제조 및 염기 배열과 아미노산 배열의 결정

실험 3-2 의 재조합 DNA pSUl8 2 ㎍ 을 2 M 수산화 나트륨 수용액을 가하여변성시킨후,여기에 적당량의 냉에탄올을 가한 다음 템플레이트 DNA 를 함유한 침강물을 채취하여 진공 건조시켰다. 이 템플레이트 DNA 에 염기 배열 5' -GTAAAACGACGGCCAGT-3' 를 가진 화학적으로 합성한 프라이머 50 pmole/㎖ 및 20 mM 염화 마그네슘과 염화 나트륨을 함유한 40 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 10 ㎕ 을 가하고 65℃ 에서 2분간 유지하여 어니일링시켰다. 수득한 혼합물을 dATP, dGTP 및dTTP 를 각각 7.5 μM함유한 수용액 2㎕,[α-³²P]dCTP (2 mCi/㎖)를 0.5 ㎕, 0.1 M 디티오트레이롤 1 ㎕ 및 1.5 단위/㎖ T7 DNA 폴리머라아제2 ㎕ 와혼합한 다음 25℃ 에서 5 분간 배양하여 5' 말단으로 부터 3' 말단까지 프라이머를 연장시킴으로써 상보쇄 DNA 를 얻었다.

상보쇄 DNA 를 함유한 반응 생성물을 4 등분하여 각각에 dNTP 80 μM 및 ddATP, ddCTP, ddGTP 또는 ddTTP 8 μM 을 함유한 50 mM 염화 나트륨 수용액 2.5 ㎕ 을 가하고 37℃ 에서 5 분간 유지한 다음 20 mM EDTA, 0.05 w/v ％ 브로모폐늘 블루우 및 0.05 w/v ％ 크실렌 시아놀 함유의 98 v/v ％ 포름아미드 수용액 4 ㎕ 을 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 용기에 넣고 비등수욕중에서 3 분간 가열한 다음 폴리아크릴아미드 6 w/v ％ 를 함유 하는 겔 위에 가하고 약 2,000 볼트의 정전압으로 겔을 활성화시켜 전기 영동함으로써 DNA 단편을 분리한 후 통상의 방법으로 겔을 고정하고 건조하여 오토라디오그래피 처리하였다.

라디오그램에서 분리된 DNA 단편을 분석한 결과, 상보쇄 DNA 는 배열표 (SEQ ID NO:5) 의약 1,700염기쌍으로 구성된 염기 배열을 가지고 있음이 확인되었다. 염기 배열로 부터 추정할 수 있는 아미노산 배열은 배열표 (SEQ ID NO:5) 에 나와 있는데, 이것을 부분 아미노산 배열 (배열표 SEQ ID NO:3 및 4) 과 비교한 결과, 배열표 (SEQ ID NO:3) 의 부분 아미노산 배열은 배열표 (SEQ ID NO:5) 의 1∼30 에 위치한 배열에 상응하며, 배열표 (SEQ ID NO:4) 의 배열은 배열표 (SEQ ID NO:5) 의 301∼319 에 위치한 배열에 상응함이 확인하였다. 이들 결과로 부터 본 발명의 재조합 열안정성 효소는 배열표 (SEQ ID NO:1) 의 N 말단으로 부터의 아미노산 배열을 가지며, 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 유래의 DNA 의 경우 아미노산 배열은 배열표 (SEQ ID NO:2) 의 5' 말단으로 부터의 염기 배열에 의해 코우드됨을 알 수 있다.

위에서 설명한 바와 같이 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리하는 열안정성 효소는 장기간에 걸친 본 발명자들의 연구 결과 발견된 것이다. 열안정성 효소는 기타의 공지의 효소와는 다른 물리화학적 성질을 가지고 있다. 본 발명은 재조합 DNA 기술을 이용하여 열안정성 효소를 제조하는 것이다. 본 발명의 재조합 열안정설 효소와 그 제조 방법 및 용도에 대해서는 아래에 나오는 실시예를 참조하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에서 언급되는 재조합 열안정성 효소는 재조합 DNA 기술로 제조되며 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지고 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리할 수 있는 일반적인 열안정성 효소를 뜻한다.

일반적으로 본 발명의 재조합 열안정성 효소는 확인된 아미노산 배열을 가지며, 예컨대 배열표 (SEQ ID NO:1) 에 있는 N 말단으로 부터의 아미노산 배열 및 이것과 상동적인 배열을 들 수 있다. 배열표 (SEQ ID NO:1) 의 배열과 상동적인 아미노산 배열을 가진 변이체는 고유의 물리화학적 성질을 바꾸지 않고 배열표 (SEQ ID NO:1) 의아미노산 하나 이상을 다른 아미노산으로치환함으로써 얻을 수 있다. 동일한 DNA 를 사용하고 DNA 가 도입되는 숙주에 따라 달라진다 하더라도 형질 전환체 배양용 영양 배지의 성분과 배양 온도 및 pH 에 따라 배열표 (SEQ ID NO:1) 의아미노산 하나 이상이 결실되어 있지만 고유의 물리화학적 성질을 가진 변형된 효소를 제조할 수도 있고, 또는 숙주의 세포내 효소의 변형의 결과로 해서 DNA 발현후 N 말단에 새로 아미노산 하나 이상이 부가된 것을 제조할 수도 있다. 이러한 변이체는 소요의 물리화학적 성질을 가진 것이면 본 발명에서 사용할 수 있다.

재조합 열안정성 효소는 특정의 DNA 를 함유한 형질 전환체의 배양물로 부터 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 이러한 형질 전환체의 예는 배열표 (SEQ ID NO:2) 의 5' 말단으로 부터의 염기 배열이나 이것과 상동적인 염기 배열 또는 이들에 대해 상보적인 염기 배열을 가진 DNA 를 숙주에 도입하여 제조할 수 있다.

이들 염기 배열은 이들에 의해 코우드되는 아미노산 배열을 바꾸지 않고서도 유전 코우드의 축중에의해 이들의 염기 하나 이상을 치환함으로써 변형시절 수 있다. 물론 재조합 열안정성 효소 또는 이들의 변이체를 치환하여 DNA 가 숙주속에서 목적의 열안정성 효소를 발현하도록 할 수가 있다.

본 발명에서 사용하는 DNA 로서는 위에 나은 염기 배열을 가진 것이면 천연에서 유래하는 것들과 인공적으로 합성한 것들을 사용할 수 있다. 본 발명의 DNA 의 천연 공급원의 예로서는 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 등의 술폴로부스 속에 속하는 미생물이 있는데, 이들로 부터 본 발명의 DNA 를 함유한 유전자를 얻을 수 있다. 위에 나온 미생물을 영양 배지에 접종하고 호기적 조건에서 1∼3 일 정도 배양하여 배양물로 부터 균체를 채취한 다음 초음파처리하거나 리소자임 또는 β-글루카나아제 등의 세포벽 융해 효소로 처리하여 본 발명의 DNA 를 함유한 유전자를 추출한다. 이 경우에 있어서 프로테아제 등의 단백질 분해 효소를세포벽 용해 효소와 함께 사용할 수 있고, 초음파 파쇄장치로 균체를 처리할 경우 소디움 도데실 술페이트 (SDS) 등외 계면 활성제 존재하에 처리하거나 동결 융해법으로 처리한다. 목적의 DNA는 수득물을 페놀추출법, 알코올 침전법, 원심분리법, 프로태아제 처리 및/또는 리보뉴클레아제 처리 등 이 분야에서 일반적으로 사용되는 방법으로 처리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 DNA 를 인공적으로 합성하자면 배열표 (SEQ ID NO:2) 의 염기 배열을 이용하여 화학적으로 합성하거나 배열표 (SEQ ID NO:1) 의 아미노산 배열을 코우드하는 DNA 를 적당한 자체 복제 가능한 벡터에 삽입하여 재조합 DNA 를 얻어, 이것을 적당한 숙주에 도입하여 형질 전환체를 얻은 다음, 이 형질 전환체를 배양하여 배양물로 부터 증식된 균체를 분리한 후 균체로 부터 목적의 DNA 를 함유한 플라스미드를 채취함으로써 플라스미드 형태로 얻을 수 있다.

일반적으로 DNA 를 재조합 DNA 형태로 숙주속에 도입한다. 일반적으로 재조합 DNA 에는 위에 나온 DNA 와 자체 복제 가능한 벡터를 가지고 있는데, 원료인 DNA 를 입수할 수 있으면 일반적인 재조합 DNA 기술에 의해 비교적 용이하게 제조할 수 있다. 이러한 벡터의 예로서는 pBR322, pUCl8, Bluescript II SK(+), pUB110, pTZ4, pC194, pHVl4, TRp7, TEp7, pBS7 등의 플라스미드 벡터와, λgt· λC, λgt·λB, ρ11, Φ1, Φ105 등의 파아지 벡터가 있다. 이들 플라스미드 벡터와 파아지 벡터중에서 pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), λgt·λC 및 λgt·λB 는 본 발명의 DNA 를 대장균에서 발현시킬 때 만족스럽게 되는 반면, pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, Φ1 및 Φ105 는 바실루스속 미생물에서 DNA 를 발현시킬 때 만족스럽게 사용된다. 폴라스미드 벡터pHVl4, TRp7, TEp7 및 pBS7은 재조합 DNA 를 두가지 이상의 숙주속에서 생장시킬 때 유리하게 사용된다.

본 발명에서 본 발명의 DNA 를 이러한 벡터에 삽입하는데 사용되는 방법은 이 기술분야에서 보통 사용되고 있는 것들이어도 좋다. 본 발명의DNA 를 함유한 유전자와 자체 복제 가능한 벡터를 먼저 제한 효소 및/또는 초음파로 분해한 다음 수득한 DNA 단편과 벡터 단편을 연결한다. DNA 와 벡터를 분해 하자면뉴클레오티드에 특이적으로 작용하는 제한효소, 특히 타입 II 제한 효소, 보다 구체적으로는 Sau 3AI, Eco RI, Hind III, Bam HI, Sal I, Xba I, Sac I, Pst I 등에 의해 DNA 단편과벡터단편을 용이하게 연결할 수 있다. 벡터 단편으로 DNA 단편을 연결하자면 필요한 경우 이들을어니일링 한후생체내또는 시험관내에서DNA 리가아제를 작용시킨다. 수득한 재조합 DNA 는 적당한 숙주속에 도입하여 형질 전환체를 생성시키고 이것을 배양함으로써 실질적인 제한없이 복제 가능하다.

수득한 재조합 DNA 를 대장균을 비롯한 바실루스속 미생물 및 악티노마이세스, 효모등의 적당한 숙주 미생물에도입할 수 있다. 대장균을 숙주로 사용할 경우 재조합 DNA 와 칼슘 이온 존재하에 숙주들 배양함으로써 DNA 를 도입할 수 있고, 바실루스속 미생물을 숙주로 사용할 경우에는 컴피턴트 셀법과 콜로니 하이브리다이제이션법를 사용할 수 있다. 콜로니 하이브리다이제이션법에 의하거나 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분당을 함유하는 영양 배지에서 형질 전환체를 배양하고 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리하는 목적의 형질 전환체를 선택함으로써 소요의 형질 전환체를 클로닝할 수 있다.

세포내 또는 세포외에서 수득한 형질 전환체는 영양 배지에서 배양하면 목적의 효소들 생성한다. 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미네랄, 필요에 따라 소량의 아미노산, 비타민이 보충된 액체 배지를 본 발명에서 사용한다. 탄소원의 예는 미가공 전분, 전분 가수분해물, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스 및 트레할로오스 등의 당질이 있다. 질소원의 예는 암모니아 및 그 염, 우레아, 질산염, 펩톤, 효모 엑스, 탈지 대두, 코온 스티프리커 및 육 (肉) 엑스 등의 질소 함유 무기물 및 유기물이 있다. 목적의 효소를 함유한 배양물은 형질 전환체를 영양 배지에 접종하여 20∼65℃ 및 pH 2∼9 에서 약 1∼6 일 동안 통기 교반 방법으로 호기적 조건하에 배양함으로써 제조할 수 있다. 이 배양물을 그대로 조효소로 사용할 수 있으나 통상적으로 사용하기 전에 배양물중의 균체를 초음파 및/또는 세포벽 용해 효소로 파쇄한 후 균체로 부터 열안정성 효소를 여과 및/또는 원심분리법으로 분리하여 효소를 정제한다. 효소 정제 방법은 일반적으로 공지의 방법을 포함한다. 배양물로 부터 잔존 균체와 균체 파쇄물을 제거하고 농축, 염석, 투석, 분리 침강, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기 영동법 및 등전점 전기 영동법 등의 방법중에서 한가지 이상의 방법으로 처리한다.

위에 나온 바와 같이 본 발명의 재조합 열안정성 효소는 55℃ 이상의 온도에서 작용시키더라도 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리하는 특징을 가지고 있다. 수득한 트레할로오스는 만족스립고 온화한 고품질의 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있고, 분자내에 환원성 잔기가 없으므로 불필요한 착색이나 열화의 우려도 없이 음식물의 감미 부여에 사용할 수 있다. 이러한 특징으로 해서 환원성으로 인해 쓸모없었던 각종 전분당을 취급이 용이하고 유용하며 환원성이 없거나 극히 감소된 환원성을 가진 당질로 변환시킬 수 있다.

변환 방법에 대해 상세히 설명한다. 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도 3 이상인 비환원성 당질, 예컨대 α-글루코실트레할로오스, α-말토실트레할로오스, α-말토트리오실트레할로오스, α-말토테트라오실트레할로오스 및 α-말토펜타오실트레할로오스를 본 출원인의 일본국 특허 출원 제 349,2l6/93 호와 일본국 특허 출원 정리번호 제 10046601 호 (발명의 명칭 : 열안정성의 비환원성 당질 생성 효소 및 그 제조 방법과 용도 ; 본 출원인의 1994 년 6 월 24 일자 출원)에 개시된 비환원성 당질 생성 효소를 아밀로펙틴, 아밀로오스 등의 전분당 또는 전분을 산 및/또는 아밀라아제로 처리하여 제조되는 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분당에 작용시켜 제조할 수 있다. 비환원성 당질 생성 효소의 기질로 사용되는 이들 환원성 당질은 통상적으로 글루코오스 중합도 3 이상의 말토올리고당, 예컨대 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 및 말토헵타오스 중에서 한가지 이상을 포함한다. 문헌 [" Handbook of Amylases amd Related Enzymes ", lst edition (1988), edited by The Amylases Research Society of Japan, published by Pergamon Press plc, Oxford, England] 에 기재된 바와 같이 α-아밀라아제, 말토테트하오스 생성 아밀라아제, 말토펜타오스 생성 아밀라아제 및 말토헥사오스 생성 아밀라아제는 본 발명에서 사용되는 환원성 전분당 제조에 특히 유용하며, 이들 아밀라아제 중에서 어느 한가지를 사용하면 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분당 고함유의 전분당의 혼합물을 고수율로 용이하게 제조할 수 있다. 필요하다면 풀룰라나아제와 이소아밀라아제 등의 전분 지절 효소와 아밀라아제의 병용에 의해 본 발명의 재조합 열안정성 효소의 기질로 사용되는 환원성 전분당의 수율을 높일 수 있다. 환원성 전분당 1 종 이상을 50 w/w ％ 이하 함유하는 수용액중에 비환원성 당질 생성 효소를 공존시키고 통상적으로 이 혼합액을 40∼85℃ 및 pH 약 4∼8 에서 비환원성 당질이 생성할 때까지 배양함으로써 비환원성 당질을 제조할 수 있다.

본 발명에 의한 효소적 변환 방법에 있어서, 본 발명의 재조합 열안정성 효소를 기질인 위에 나온 비환원성 당질 한가지 이상을 함유하는 수용액중에 공존시킨 다음 소요량의 트레할로오스가 생성될 때까지 일정 온도와 pH 에서 효소반응시킨다. 효소반응은 기질 농도 약 0.1 w/w ％ (d.s.b.) 에서도 진행하지만 공업적 규모의 생산에서 본 발명의 변환 방법을 사용할 경우 2 w/w ％ 이상, 바람직하게는 5∼50 w/w ％ 의 농도를 만족하계 사용할 수 있다. 효소반응의 온도와 pH 는 재조합 열안정성 효소를 실활하지 않고 효소가 기질에 효과적으로 작용할 수 있는 범위내, 즉 55℃ 이상 ∼ 85℃ 이하, 바람직하게는 약 56∼70℃ 의 범위와 pH 4∼7, 바람직하게는 약 5∼6 의 범위내로 설정한다. 본 발명의 재조합 열안정성 효소에 적합한 양과 반응 시간은 효소반응 조건에 따라 선택한다. 따라서, 본 발명의 재조합 열안정성 효소는 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 당질을 트레할로오스와 글루코오스 및/또는 말토올리고당으로 효과적으로 변환시키는데, 예컨대 변환율은 α-말토트리오실 트레할로오스에 효소를 작용시킬 경우 약 99 ％ 까지 증가한다. 비환원성 당질 생성 효소와 본 발명의 열안정성 효소를 병용하여 아밀라아제 한가지를 전분 가수 분해물에 작용시키면 트레할로오스와 글루코오스 및/또는 말코올리고당 더불어 비환원성 당질이 생성된다. 따라서, 트레할로오스 고함유 당질 조성물이 비교적 고수율로 효율적으로 생성된다.

본 발명의 변환반응으로 수득한 반응 혼합물을 그대로 사용할 수 있으나, 통상적으로 이들을 정제하여 사용한다. 즉, 반응 혼합물로 부터 불용물을 여과 및 원심분리에 의해 제거하고 수득한 용액을 활성탄으로 탈색하여 이온 교환 수지로 탈염, 정제한 후 농축하여 시럽상 제품을 얻는다. 용도에 따라 시럽상 제품을 진공 건조하여 분무 건조함으로써 고상물을 얻는다. 실질적으로 비환원성 당질로 구성된 제품을 얻자면 시럽상 제품을 당질 분리를 위해 이온 교환 수지, 활성탄 및 실리카 겔 등을 사용하는 크로마토그래피, 알코올 및/또는 아세톤을 사용하는 분별 침감, 막 여과, 효모에 의한 발효 및 알칼리에 의한 환원당의 제거, 분해 등의 방법중 한가지 이상의 방법으로 처리한다. 비교적 대량의 반응 혼합물을 처리하는 방법으로서는, 예컨대 일본국 특허 공개 제 23,799/83 호 공보 및 제 72,598/83 호 공보에 개시되어 있는 고정상 또는 의사 () 이동상 이온 교환 크로마토그래피가 있는데, 이러한 방법에 의해 공업적 규모로 고수율로 비환원성 당질 고함유 제품을 제조한다.

트레할로오스와 이것을 함유하는 조성물은 당질 감미료의 환원성에 의해 쉽사리 손상되는 각종 제품에 널리 적용된다. 예컨대 이들은 감미료, 정미 (呈味) 개량제, 품질 개량제, 안정제, 증량제, 부형제, 보조제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등에 유리하게 사용할 수 있다.

다음의 실시예에서 본 발명의 재조합 열안정성 효소의 제조 방법 및 비환원성 당질의 효소적 변환 방법을 상세히 설명한다.

실시예 A-1 : 재조합 열안정성 효소의 제조

500 ㎖ 용량의 플라스크에 폴리펩톤 1 w/w ％, 효모 엑스 0.5 w/v ％, 염화 나트륨 0.5 w/v ％ 및 물로 된 액체 배지 (pH7.0) 를 약 100 ㎖ 씩 넣고 각각의 플라스크에 대해 120℃ 에서 20 분간 오프클레이브하며 멸균한 후, 여기에 앰피실린 50 ㎍/㎖ 을 가한 다음 냉각하여 실험 3-2 의 방법으로 제조한 형질 전환체 SUl8 을 접종하고, 형질 전환체 배양물을 37℃ 에서 24 시간 동안 회전 진탕 조건 (130 rpm) 하에 배양하여 종배양액를 얻었다. 30 리터 용량의 퍼어멘터에 동일한 액체 배지 약 18 리터를 가하고 위와 마찬가지로 멸균한 후 37℃ 로 냉각하고, 여기에 앰피실린 50 ㎍/㎖ 을 첨가하여 혼합하고 종배양액 1 v/v ％ 을 접종한 다음 통기 교반 조건하에 37℃ 에서 24 시간 배양하였다.

배양물을 초음파 처리하여 균체를 파쇄하고 수득한 현탁액을 원심분리하여 불용물을 제거한 다음 상청엑의 효소 활성을 측정한 결과, 배양액 1 리터에는 본 발명의 재조합 열안정성 효소 약 350 단위를 함유하고 있었다. 배양 상청액을 실험 1 의 방법으로 정제하여 비활성이 약 720 단위/mg 단백질인 본 발명의 재조합 열안정성 효소를 약 230 단위/㎖ 함유한 수용액을 약 12 ㎖ 얻었다.

실시예 A-2 (가) : 형질 전환체 제조

실험 3-2 의 방법으로 얻은 재조합 DNA pSU18 를 제한 효소 Ssp I 및 Ban III 으로 분해하여 배열표 (SEQ ID NO:2) 의 염기 22∼740 까지의 염기 배열의 약 720 염기쌍으로 구성된 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 제한 효소 Ssp I 및 Ban III 으로 분해시켜 둔 Bluescript II SK(+) (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology 사 판매의 플라스미드 벡터) 와 혼합하며 T4 DNA 리가아제 존재하에 4℃ 에서 하룻밤 방치하여 연결시켜 1 차 재조합 DNA 를 얻었다.

통상의 방법으로 화학적으로 합성하여 5'-CTGCAGTTTTTTAATAAAATCAGGAGGA-3', 5' - AAAAATATGTTTTCGTTCGGTGGAAAT-3', 5' -ATTTCCACCGAACGAAAA-3', 5' -CATATTTTTTCCTCCTGA-3' 및 5' -TTTTATTAAAAAACTGCAG-3' 로 나타내어지는 염기 배열을 가진 5 가지 올리고뉴클레오티드를 적당한 비율로 혼합하고 100℃, 65℃, 37℃ 및 20℃ 에서 각각 20 분 동안 연속적으로 인큐베이트하여 이들을 어니일링 하였다. 수득한 염기 배열 (SEQ ID NO:6) 과 배열표 (SEQ ID NO:6) 의 염기 1∼21 의 55 염기쌍으로 된 이중 가닥 DNA를 제한 효소 Ssp I 로 분해시킨 1 차 재조합 DNA 로 위와 마찬가지로 연결하여 배열표 (SEQ ID NO:6) 의 염기 배열과 배열표 (SEQ ID NO:2) 의 염기 1∼740 의 염기 배열을 가진 2 차 재조합 DNA 를 얻었다.

실험 3-2 의 방법으로 얻은 재조합 DNA pSUl8 을 제한 효소 Ban III 과 Bst XI 로 분해하여 배열표 (SEQ ID NO:2) 의 염기 741∼1,668 의 염기 배열의 약 1,600 염기쌍으로 된 DNA 단편을 얻어 이것을 제한 효소 Ban III 과 Bst XI 로 분해시켜둔 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+) 로 연결하여 3 차 재조합 DNA 를얻었다.

통상적인 방법으로 화학적으로 합성한 것으로서 5' -AACAGAGGTGTTGGG-3', 5' -GTATATCAATTAGAATGAAGCTTGAGCT-3', 5' -CAAGCTTCATTCTA-3' 및 5' -ATTGATATACCCCAACACCTCTGTT-3' 로 나타내어지는 염기 배열을 가진 다섯가지의 올리고뉴클레오티드를 적당한 비율로 혼합하고 위와 마찬가지로 어니일링하였다. 배열표(SEQ ID NO:2) 의 염기 1,639∼1,668 의 40 염기쌍으로 된 배열표 (SEQ ID NO:7) 의 염기 배열을 가진 이중가닥 DNA 를 얻어 이것을 제한 효소 Hpa I 와 Sac I 으로 분해시켜 둔 3 차 재조합 DNA 에 연결하여 배열표 (SEQ ID NO:7) 의 염기 배열과 배열표 (SEQ ID NO:2) 의 염기 741∼1,668 의 염기 배열을 가진 4 차 재조합 DNA 를 얻었다.

제한 효소 Pst I 와 Ban III 으로 2 차 재조합 DNA 를 분해하여 얻은 배열표 (SEQ ID NO:2) 의 염기 1∼740 의 염기 배열을 가진 약 770 염기쌍으로 된 DNA 단편과 제한 효소 Ban III 과 Hind III 으로 4 차 재조합 DNA 를 분해하여 얻은 배열표 (SEQ ID NO:2) 의 염기 741∼1,668 의 염기 배열을 가진 약 930 염기쌍으로 DNA 단편을 제한 효소 Pst I 와 Hind III 으로 분해시켜 둔 pKK223-3 에다 T4 DNA 리가아제로 연결하여 배열표 (SEQ ID NO:2) 의 염기 배열을 가진 본 발명의 재조합 DNA pSUl9 을 얻었다.

실험 3-2 의 방법에 따라 재조합 DNA pSU19 를 BMH71-18 (일본국의 Takara Shuzo 사 판매의 컴피턴트 셀) 에 도입하여 본 발명의 재조합 열안정성 효소를 코우드하는 DNA 를 가진 형질 전환체 SUl9 를 얻었다. 형질 전환체 SU19 를 실험 3-2의 방법으로 배양하고 증식된 균체를 배양물로 부터 회수하였다. 균체로 부터 재조합 DNA 를 추출하여 분석한 결과, 이것은 약 6,300 염기쌍으로 되어 있고, 제 6 도에 있는 바와 같이 제한 효소 Ssp I 의 분해 부위 아래쪽에 위치한 1,668 염기쌍으로 되어 있는 DNA 를 가지고 있다.

실시예 A-2 (나) : 형질 전환체로 부터 재조합 열안정성 효소의 제조

말토오스 2 w/v ％, N-Z-SOY PEPTONE (미합중국외 Sigma Chemicals 사 판매) 4 w/v ％, 효모 엑스 2 w/v ％, 인산 2 수소 나트륨 0.5 w/v ％, 앰피실린 50 ㎍/㎖ 및 물로 된 액체 영양 배지 (pH 7.0) 를 사용한 것 외에는 실시예 A-1 의 방법과 마찬가지로 실시예 A-2 (가) 의 형질 전환체 SU19 을 배양하였다. 수득한 배양물을 초음파 처리하여 균체를 파쇄하고 균체 현탁액을 원심분리하며 불용성 물질을 제거한 다음 상청액중의 재조합 열안정성 효소의 활성을 분석한 결과, 배양액 1 리터중에는 약 800,000 단위의 목적의 재조합 열안정성 효소를 함유하고 있었다. 상청액을 실험 1 의 방법으로 정제하여 비활성이 약 720 단위/㎎ 단백질인 재조합 열안정성 효소 약 3,200 단위/㎖ 을 함유한 수용액을 약 1,850 ㎖ 얻었다.

정제 효소의 성질과 성상을 실험 2 의 방법으로 분석한 결과, SDS-PAGE 에 의한 분자량은 약 54,000∼64,000 달톤이었고, 등전점 전기 영동법에 의한 등전점 (pI) 은 약 5.6∼6.6 이었으며, 수용액 (pH 7.0) 중에서 85℃ 에서 60 분간 유지하더라도 실질적으로 실활되지 않았음이 판명되었다. 이를 물리화학적인 성질은 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 의 공여체 미생물 유래의 열안정성 효소와 실질적으로 동일하였다.

실시예 B-1 (가) : 트레할로오스 함유 시럽상 제품으로의 변환

500 ㎖ 용량의 플라스크에 폴리펩톤 0.1 w/v ％, 효모 엑스 0.1 w/v ％, 황산 암모늄 0.2 w/v ％, 인산 2 수소 칼륨 0.05 w/v ％, 황산 마그네슘 7 수화물 0.02 w/v ％, 염화 칼륨 0.02 w/v ％ 및 물로 된 액체 배지를 100 ㎖ 씩 넣고 120℃ 에서 20 분간 오토클레이브하여 멸균한 다음 플라스크를 냉각한 후 황산을 가하여 pH 3.0 으로 조정하였다. 각 플라스크에 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 의 종배양액을 접종한 다음 130 rpm의 회전 진탕 조건하에 75℃ 에서 24 시간 배양하여 1차 종배양액을 얻었다. 동일한 액체 배지 약 5 리터를 10 리터 용량의 퍼어멘터 (fermenter) 에 넣고 위와 마찬가지로 멸균하여 75℃ 로 냉각한 다음 pH 3.0 으로 조정한 후 종배양액을 1 v/v ％ 접종하고 500 ㎖/분의 통기 조건하에 75℃ 에서 24 시간 미생물을 배양하여 2 차 종배양액을 얻었다. 이어서, 300 리터 용량의 퍼어멘터에 동일한 액체 배지 약 250 리터를 넣고 위와 마찬가지로 멸균하고 75℃ 로 냉각하여 100 리터/분의 통기 조건하에 42 시간 배양하였다.

수득한 배양액 약 170 리터를 SF 멤브레인으로 여과하고, 여액을 원심분리하여 습균체를 얻었다. 습균체 약 258 g 을 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 300 ㎖ 중에 현탁하고 균체를 초음파 파쇄하였다. 이렇게 하여 수득한 균체 파쇄물을 10,000 rpm 에서 30 분간 원심분리하여 약 300 ㎖ 의 상청액을 얻어 포화도 70 w/v ％ 가 되도록 황산 암모늄을 혼합한 다음 4℃ 에서 24 시간 방치한 후 10,000 rpm 에서 30 분간 원심분리하였다. 침전물을 채취하고 적당량의 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.5) 에 용해한 후 동일한 완충액에 대해 24 시간 투석하였다. 이어서, 투석액을10,000 rpm 에서 30 분간 원심분리하여 효소 활성을 가진 상청액 약 300 ㎖ 을 얻었다.

이 상청액을 10 mM Tris-HCI 완충액 (pH 8.5) 으로 미리 평형화시켜 둔 " DEAE-TOYOPEARL " (일본국의 Tosoh 사제의 이온 교환 칼럼 크로마토그래피용 겔) 약 360 ㎖ 이 충전된 칼럼에 공급하고 10 mM Tris-HCI 완충액 (pH 8.5) 중에서의 0 M 로부터 0.3 M 범위의 선형 기울기의 완충액을 공급하였다. 약 0.1 M 염화 나트륨 농도에서 용출한 효소 활성 획분을 회수하여 1 M 황산암모늄을 함유하는 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.5) 에 대해 10 시간 투석하였다. 투석액을 10,000 rpm 에서 30 분간 원심분리하여 불용물을 제거하고 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.5) 으로 미리 평형화시켜 둔 " BUTYL-TOYOPEARL 650 " (일본국 Tosoh 사 판매의 소수 크로마토그래피용 겔)약 350 ㎖충전 칼럼속을 통과시키고 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.5)중에서의 1 M 로 부터 0 M 까지의 황산 암모늄의 선형 기울기의 완충액을 통과시켰다.

약 0.8 M 황산 암모늄 농도에서 용출한 효소 활성 획분을 채취하여 0.2 M 염화 나트륨을 함유하는 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.5) 에 대해 16 시간 투석하고 10,000 rpm 에서 30분간 원심분리하여 불용물을 제거하였다. 수득한 상청액을 0.2 M 염화 나트륨을 함유하는 10 mM Tris-HCl완충액 (pH 8.5) 으로 미리 평형화시켜 둔 " TOYOPEARL HW-55 " (일본국 Tosoh 사 판매의 겔 크로마토그래피용 겔) 약 350 ㎖ 충전 칼럼을 통과시켰다. 용출액으로부터 효소 활성 획분을 체취하여 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.5) 에 대해 16 시간 투석하였다. 투식액을 원심분리하며 불을을을 제거하고 상청액을 " MOMO Q " (스웨덴국의 Pharmacia LKB 사 판매의 이온 교환 크로마토그래피용 겔) 을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피 처리한 다음 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) 에서의 염화 나트를 0 M 내지 0.2 M 범위의 선형 기울기 완충액을 칼럼속으로 통과시켰다. 0.1 M 염화 나트륨 농도에서 용출한 획분을 채취하여 트레할로오스 제조에 사용하였다. 이렇게 하여 수득한 정제 비환원성 당질 생성 효소의 비활성은 약 81 단위/mg 단백질이었고, 그 수득량은 배양액 1 리터당 약 0.24 단위이었다.

명세서를 통하며 비환원성 당질 생성 효소의 활성을 다음의 시험으로 측정한 값으로 나타낸다. 즉, 기질로서 말토펜타오스 1.25 w/v ％ 를 함유하는 50 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) 4 ㎖ 을 시험관에 넣고 여기에 적당히 희석된 효소액 1 ㎖ 을 가하여 60℃ 에서 60 분간 유지함으로써 효소반응시킨 다음 100℃ 에서 30 분간 가열하여 효소반응을 정지시켰다. 이어서, 반응액 1 ㎖ 을 탈염수로 10 배로 희석하여 소모기-넬슨법 (Somogyi-Nelson method) 으로 환원력을 측정한다. 대조로서 100℃ 에서 30 분간 가열하여 효소를 실활시킨 효소액를 사용하는 계 (系) 를 만들어 의와 마찬가지로 처리하였다. 비환원성 당질 생성 효소의 활성 1 단위는 위에 나온 바와 동일한 조건하에 1 분당 말토펜타오스 1 μmol의 환원력을 감소시키는 효소의 양으로 정의한다.

실시예 B-1 (나) : 트레할로오스 함유 시럽상 제품으로의 변환

옥수수 전분을 물에 현탁하여 15 w/w ％ 현탁액으로 한 다음, 여기에 탄산 칼슘 0.1 w/w ％ 을 가하고 pH 6.0 으로 조정후전분 고형물당" TERMAMYL 6OL" (덴마크국의 Novo Nordisk Bioindustri A/S 판매의 α-아밀라아제)을 0.2 w/w ％ 가하고 95℃ 에서15 시간 효소반응시켜 전분을 호화 및 액화하였다. 반응액을 120℃ 에서 30 분간 오토클레이브하여 잔존 효소를 실활하고 58℃ 로 냉각후 pH 5.5 로 조정하고 전분 고형물 1 g 당 각각 이소아밀라아제 3,000 단위, 실시예 B-1 (가) 의 방법으로 얻은 재조합 열안정성 효소 3.0 단위 및 실시예 A-1 의 방법으로 얻은 재조합 열안정성 효소 5.0 단위를 가하여 혼합한 다음 64 시간 동안 효소반응시켰다. 수득한 반응액을 97℃ 에서 30 분간 가열하여 잔존 효소를 실활하고, 냉각하여 여과한 후 여액을 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 이온 교환 수지로 탈염하여 정제한 다음 농축하여 농도 약 60 w/w ％ 의 시럽을 원료 전분에 대해 고형물 기준으로 약 90 ％ 의 수율로 얻었다.

이 시럽은 DE (dextrose equivalent) 는 비교적 낮고 트레할로오스 7.1 w/w ％, 글루코실트레할로오스 2.9 w/w ％, 말토실트레할로오스 1.0 w/w ％, 글루코오스 4.9 w/w ％, 말토오스 10.5 w/w ％, 말토트리오스 8.2 w/w ％ 및 말토테트라오스와 고급 말토올리고당 1.5 w/w ％ 을 함유하고 있었다. 이 제품은 온화한 중간 정도의 감미와 적당한 점성 및 보습성을 가지고 있어서 음식물, 화장품, 의약품 등의 일반 조성물에 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 증량제, 부형제, 보조제 등으로 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-2 : 트레할로오스 함유 분말상 제품으로의 변환

실시예 B-1 의 시럽상 제품을 강산성 양이온 교환 수지를 사용한 칼럼 크로마토그레피 처리하여 트레할로오스 합량을 증가시켰다. 그 공정은 다음과 같다.즉, 자켓부 스테인레스강 칼럼 (직경 5.4 cm, 길이 5 m) 4 개를 미리 물속에 현탁시켜둔 " XT-l0l6 (Na⁺형) " (일본국의 Tokyo Organic Chmical Industries 사 판매의 강산성 양이온 교환 수지) 로 균일히 충전하고 직렬로 연결하여 칼럼 총 길이를 20 m 로 하였다. 수지에 대해 약 5 v/v ％ 의 체적으로 물로 적당히 희석한 시럽상 제품을 칼럼 내부 은도 55℃ 에서 칼럼에 공급한 다음 55℃ 의 온수를 SV (공간 속도) 0.13 으로 하여 공급함으로써 당질 성분을 용출하였다. 트레할로오스 고함유 획분을 회수하며 농축하고 진공 건조한 후 분쇄하여 트레할로오스를 약 97 w/w ％ 함유하는 분말상 제품을 원료 고형물당 약 55 w/w ％ 의 수율로 얻었다.

이 제품은 은화하고 중간 정도의 감미를 가지고 실질적인 환원성이 없으므로 없으므로 음식물, 화장품, 의약품 등의 일반 조성물에 있어서 감미료, 정미 개량제, 품절 개량제, 안정제, 증량제, 부형제, 보조제로서 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-3 : 비환원성 당질 함유 시럽상 제품으로의 변환

실시에 B-2 방법으로 얻은 트레할로오스 고함유 획분을 약 75 w/w ％ 의 용액으로 농축한 다음 결정화기에 넣어 완만히 교반하면서 결정화하여 결정화을 약 45 w/w ％ (d.s.b.) 의 매스키트를 얻었다. 이 매스키트를 분무탑 상부의 노즐로 부터 약 150 kg/cm²의 압력으로 아래쪽으로 분무하면서 약 85℃ 의 열풍을 분무탑 상부로 부터 아래쪽으로 송풍하였다. 수득한 결정질 분말을 건조탑 저부의 금망식 컨베이어 위에 포집하여 컨베이어 아래에서 약 45℃ 의 열풍을 보내면서 서서히 건조탑 밖으로 배출시켰다. 수득한 결정질 분말을 숙성탑에 옮겨 약 40℃ 의 열풍기류중에서 10 시간 숙성하여 결정화와 건조를 완료함으로써 트레할로오스 함수 결정 분말을 원료 고형물당 약 90 w/w ％ 의 수율로 얻었다.

이 제품은 온화하고 고품위의 감미틀 가지고 실질적으로 흡습성이 없으므로 음식물, 화장품, 의약품 등의 일반 조성물에서 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 증량제, 부형제, 보조제로서 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-4 : 결정질 트레할로오스 함유 분말상 제품으로의 변환

타피오카 전분을 물에 현탁하여 36 w/w ％ 현탁액으로 한 다음 여기에 탄산칼슘 0.1 w/w ％ 을 가하고 pH 6.0 으로 조정후 " TERMAMYL 60L " (덴마크국의 Novo Nordisk Bioindustri A/S 판매의 α-아밀라아제) 0.2 w/w ％ 을 가하고 95℃ 에서15 분간효소반응시켜 전분을 호화 및 액화하였다. 반응액을 120℃ 에서 30 분간 오토클레이브하여 잔존 효소를 실활하고 58℃ 로 냉각후 pH 5.2 로 조정하고 전분 고형물 1 g 당 각각 이소아밀라아제 (일본국의 林原생물화학연구소 판매) 2,000 단위, 실시예 B-1 (가) 의 방법으로 얻은 열안정성 효소 2.5 단위 및 실시예 A-1 의 방법으로 얻은 재조합 열안정성 효소 5.0 단위를 가하여 혼합한 다음 72 시간 동안 효소반응시켰다. 수득한 반응액을 97℃ 에서 30 분간 가열하여 잔존 효소를 실활하고, 50℃ 로 냉각하여 여기에 전분 고형물 1 g 당 " GLUCOZYME " (일본국의 Nagase 생화학공업주식회사제) 를10 단위 혼합하고 40 시간 효소반응시켰다. 수득한 반응액을 95℃ 에서 10 분간 가열하여 잔존 효소를 실활하고 통상의 방법으로 냉각, 여과후 활성탄으로 탈색하고 이온 교환 수지로 탈염하여 정제한 다음 농축하여 농도 약 60 w/w ％ 의 시럽으로 함으로써 원료 트레할로오스에 대해 고형물기준으로 약 75.5 w/w ％ 의 수율로 시럽상 제품을 얻었다.

이 시럽상 제품을 농축하여 약 84 w/w ％ 농도의 용액으로 한 다음 결정화기에 넣어 여기에 씨 결정으로서 트레할로오스 함수 결정을 약 2 w/w ％ 혼합하고, 완만한 교반 조건하에서 결정화하여 결정화율 약 45 w/w ％ (d.s.b.) 의 매스키트를 얻었다. 이 매스키트를 플라스틱제의 평평한 용기에 나누어 넣고 주위 온도 에서 3 일간 방치하여 내용물을 고화, 숙성시켰다. 이어서, 생성된 블록을 용기에서 끄내어 분쇄기에서 분말화하여 트레할로오스 함수 결정을 함유하는 고형 제품을 원료 전분에 대해 약 90 w/w ％ 의 수율로 얻었다.

이 제품은 온화한 고품위의 감미를 가지며 실질적으로 흡습성이 없으므로 음식물, 화장품, 의약품 등의 일반 조성물에 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 증량제, 부형제, 보조제 등으로 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-5 : 결정질 트레할로오스 함유 분말상 제품으로의 변환

감자 전분을 물에 현탁하여 6 w/w ％ 현탁액으로 한 다음 여기에 " NEO-SPITASE " (일본국의 Nagase Biochemicals 사 판매의 α-아밀라아제)0.01w/w ％ 를 혼합하고 pH 6.2 로 조정한 후 85∼90℃ 에서 1 시간 효소반응시켜 전분을 호화 및 액화하였다. 이 혼합물을 120℃ 에서 10 분 가열하여 잔존효소를 실활시키고 60℃ 로 냉각하여 pH 5.5 로 조정한 다음 여기에 전분 고형물 1 g 당 각각 " PROMOZYME 200L " (덴마크국의 Novo Nordisk Bioindustri A/S 사 판매의 풀룰라나아제) 500 단위, 실시예 B-1 (가) 의 방법으로 얻은 열안정성의 비환원성 당질 생성 효소 3.0 단위, 실시예 A-1 의 방법으로 얻은 재조합 열안정성 효소 5.0 단위를혼합하고 48 시간 효소반응시켰다. 반응액을 97℃ 에서 30분 가열하여 잔존 효소를 실활하고, 50℃ 및 pH 5.0 으로 조정하여 " GLUCOZYME " (일본국의 Nagase Biochemicals 사제) 를 전분 고형물 1 g 당 10 단위 혼합한 다음 40 시간 효소반응시켰다. 수득한 반응액을 95℃ 에서 10 분간 가열하여 잔존 효소를 실활하고 냉각하여 여과한 후 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 이온 교환 수지로 탈염 및 정제한 다음 농축하여 농도 약 60 w/w ％ 의 시럽으로 함으로써 트레할로오스를 약 79.3 w/w ％ (d.s.b.) 함유하는 시럽상 제품은 얻었다.

강산성 양이온 교환 수지 (Na⁺형) 인 " C6000 " (일본국의 Japan Organo 사 판매) 를 사용한 것 외에는 실시예 B-2 와 마찬가지로 이 시럽상 제품을 칼럼 크로마토그래피한 다음 트레할로오스 약 95 w/w ％ (d.s.b.) 함유의 획분을 회수하였다. 이 획분을 약 75 w/w ％ 로 농축하고 실시예 B-4 와 마찬가지로 결정화하여 블록형상의 매스키트를 얻은 다음 이것을 분쇄하여 트레할로오스 함수 결정을 함유하는 분말상 제품을 원료 전분에 대해 약 70 w/w ％ 의 수율로 얻었다.

이 제품은 흡습성이 없고 취급이 용이하며 음식물, 화장품, 의약품 등 일반 조성물에서 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 증량제, 부형재, 보조제로서 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-6 : 트레할로오스 무수 결정 함유 분말상 제품으로의 변환

" EX-I " (일본국 林原생물화학연구소 판매의 아밀로오스) 1 종량부를 물 15 중량부에 가열 용해하고 이 용액을 65℃ 및 pH 5.5 로 조정하여 여기에 실시예 B-1 (가) 의 방법으로 얻은 열안정성의 비환원성 당질 생성 효소를 아밀로오스 1 g 당(d.s.b.) 2.0 단위와 실시예 A-2 의 법으로 얻은 재조합 열안정성 효소를 아밀로오스 1 g 당 (d.s.d.) 6.0 단위 혼합하고 48 시간 효소 반응시켰다. 이 반응액을 97℃ 에서 30 분간 유지하여 잔존 효소를 실활하고 50℃ 및 pH 5.0 으로 조정하여 여기에 " GLUCOZYME " (일본국의 Nagase Biochemicals 사 판매의 글루코아밀라아제) 을 아밀로오스 1 g 당 (d.s.b.) 10 단위 혼합하고 다시 40 시간 유지하였다. 새로 생성된 반응액을 95℃ 에서 10 분간 가열하며 잔존 효소를 실활하고 통상의 방법으로 냉각, 여과, 활성탄에 의한 탈색, 이온 교환 수지에 의한 탈염 및 정제 후 약 60 w/w ％ 의 농도로 농축함으로써 트레할로오스 82.2 w/w ％ (d.s.b.) 함유하는 시럽상 제품을 얻었다.

이 시럽상 제품을 실시예 B-5 와 마찬가지로 칼럼 분획을 하여 트레할로오스를 98 w/w ％ (d.s.b.) 함유하는 획분을 얻어 이것을 감압하에 가열 농축하여 약 85 w/w ％ 의 농도로 하였다. 이 농축물에 트레할로오스 무수 결정을 씨 결정으로 하여 약 2 w/w ％ 가하고 120℃ 에서 5 분간 교반하여 혼합하였다.

수득한 혼합물을 플라스틱제 평평한 용기에 넣고 100℃ 에서 진공 건조하여 결정화한 후, 블록 형상의 제품을 용기에서 꺼내어 절삭기로 분쇄하여 고형 제품을 얻었다. 이 제품은 트레할로오스 무수 결정을 함유하고 있었고 수분 함량은 약 0.3 w/w ％ 이었으며 결정화율은 약 70 w/w ％ 로서 원료 아밀로오스 고형물당 약 70 ％ 의 수율로 얻었다.

트레할로오스 무수 결정은 무수물로 부터 수분을 흡수하며 트레할로오스 함수 결정으로 변환되므로 트레할로오스 무수 결정 고함유 제품은 음식물, 화장품,의약품, 이들의 원재료와 중간 가공재료 등의 조성물을 탈수하는 탈수제로 유용하다. 이 제품은 온화하고 고품위의 감미를 가지고 있어서 음식물, 화장품, 의약품 등의 일반 조성물에 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 증량제, 부형제, 보조제 등으로 유리하게 사용할 수 있다.

위에 설명한 바와 같이 본 발명은 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 당절로 부터 트레할로오스를 유리하는 신규의 열안정성 효소의 발견에 근거한 것이다. 본 발명은 재조합 DNA 기술에 의하여 열안정성 효소를 공업적 규모로 비교적 고수율로 제조할 수 있는 길을 개척 하는 것이다. 재조합 열안정성 효소를 사용하는 본 발명의 변환 방법에 의해 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 전분당을 미생물의 감염의 우려없이 트레할로오스와 글루코오스 및/또는 말토올리고당으로 쉽사리 변환시킨다. 트레할로오스는 온화하고 고품질의 감미를 가지고 있고 분자내에 환원성 잔기가 없으므로 음식물, 화장품, 의약품 등의 일반 조성물에 착색이나 열화의 우려도 없이 첨가하여 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 열안정성 효소는 확인된 아미노산 배열을 가지고 있는 것이어서 음식물과 의약품에서의 사용을 전제로 하는 트레할로오스의 제조시에 마음데로 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 위에 니온 만족스러운 효과를 발휘하는 의의가 있는 발명이어서 이 기술분야에 대해 크게 기여하게 된다.

제 1 도는 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 유래의 열안정성 효소의 최적 온도를 나타내는 그래프.

제 2 도는 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 유래의 열안정성 효소의 최적 pH 를 나타내는 그래프.

제 3 도는 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 유래의 열안정성 효소의 열안정성을 나타내는 그래프.

제 4 도는 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 유래의 열안정성 효소의 pH 안정성을 나타내는 그래프.

제 5 도는 본 발명의 재조합DNApSUl8 의 제한도.

Claims

아래의 물리화학적 성질 (1)∼(5)을 가진 재조합 열안정성 효소.

(1) 작용

말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 유리함.

(2) 열안정성

수용액 (pH 7.0) 중에서 85℃ 에서 60 분간 유지하더라도 실질적으로 실활하지 않음.

(3) 술폴로부스속(Sulfolobus屬)에 속하는 미생물에서 유래하는 SEQ ID NO : 1의 아미노산 배열을 가짐.

(4) 분자량

소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE) 으로 54,000∼64,000 달톤

(5) 등전점 (pI)

등전점 전기 영동법으로 5.6∼6.6
제1항 기재의 재조합 열안정성 효소를 코우드하고, 술폴로부스속에 속하는 미생물에서 유래하는 SEQ ID NO:2와, 이 염기배열에 대해 상동적인 염기배열 및 상보적인 염기배열로 된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 배열을 가진 DNA.
제2항 기재의 DNA와 자체 복제가능한 벡터를 함유하는 복제가능한 재조합 DNA.
제3항에 있어서, 자체 복제 가능한 벡터가 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+) 인 복제 가능한 재조합 DNA.
자체 복제가능한 벡터와 제2항 기재의 DNA를 함유한 복제가능한 재조합 DNA를 박테리아에 도입하여 수득되는 형질 전환체.
제5항에 있어서, 자체 복제 가능한 벡터가 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+) 인 형질 전환체.
제5항에 있어서, 박테리아가 대장균종, 바실루스속 또는 악티노마이세스속에 속하는 형질 전환체.
제5항 기재의 형질 전환체를 배양하여 제1항 기재의 재조합 열안정성 효소를 생성시키고, 생성된 상기 재조합 열안정성 효소를 배양물로부터 회수함을 포함하는, 제1항 기재의 재조합 열안정성 효소의 제조 방법.
제8항에 있어서, 제조된 재조합 열안정성 효소는 원심분리, 여과, 농축, 염석, 투석, 분별 침강, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기 영동 및 등전점 전기 영동으로 된 군으로 부터 선택되는 한가지 이상의 방법으로 회수되는 제조 방법.
말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 당질에 제1항의 재조합 열안정성 효소를 작용시켜 트레할로오스를 유리시키는 단계를 포함하는 효소적 변환 방법.
제10항에 있어서, 건조 고형물 기준으로 상기 비환원성 당질을 50 w/w ％ 또는 그 이하 함유하는 수용액중에 상기 재조합 열안정성 효소를 공존시키고, 이 재조합 열안정성 효소를 비환원성 당질에 55℃를 초과하는 온도에서 작용 시키는 단계를 포함하는 효소적 변환 방법.
제10항에 있어서, 상기 비환원성 당질에 비환원성 당질 생성 효소를 작용 시키고, 생성된 비환원성 당질에 상기 재조합 열안정성 효소를 작용시키는 효소적 변환 방법.
제10항에 있어서, 비환원성 당질은 α-글루코실트레할로오스, a -말토실 트레할로오스, α -말토트리오실트레할로오스, α -말토테트라오실트레할로오스, α-말토펜타오실트레할로오스 및 이들의 혼합물로 된 군으로 부터 선택되는 1 종인 효소적 변환 방법.