DE10315640A1 - Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung - Google Patents
Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung Download PDFInfo
- Publication number
- DE10315640A1 DE10315640A1 DE10315640A DE10315640A DE10315640A1 DE 10315640 A1 DE10315640 A1 DE 10315640A1 DE 10315640 A DE10315640 A DE 10315640A DE 10315640 A DE10315640 A DE 10315640A DE 10315640 A1 DE10315640 A1 DE 10315640A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- reaction
- pcr
- water
- polymer
- salt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
Abstract
Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung sowie ein dafür geeignetes Reaktionsgefäß.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrolle chemischer, molekularbiologischer oder biochemischer Prozesse, insbesondere enzymatischer Reaktionen, durch die kontrollierte Freisetzung von prozessrelevanten Komponenten. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Spezifität der PCR.
- In molekularbiologischen oder biochemischen Verfahren ist es häufig von erheblicher Bedeutung, den Start der Reaktion zu kontrollieren und die Reaktion ggf. ebenso wieder zu einem definierten Zeitpunkt zu beenden. Dazu kann beispielsweise die Aktivität eines Enzyms an- oder abgeschaltet werden. Ebenso ist es vorteilhaft, die Aktivität eines Enzyms zu kontrollieren.
- Die Aktivität einer Vielzahl von Enzymen ist Mg++-abhängig. Dies gilt beispielsweise für die DNA- und RNA abhängige DNA-Polymerase, die Restriktionsendonukleasen, Kinasen oder Proteasen.
- Die Frage nach der Kontrolle einer enzymatischen Reaktion stellt sich in der Praxis beispielsweise bei der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction; PCR). Bei der PCR handelt es sich um eine Methode zur spezifischen Amplifikation beliebiger Nukleinsäureabschnitte mittels der DNA-Polymerase.
- Eine typische PCR besteht in der Regel aus dem zyklischen Ablauf dreier Verfahrensschritte, die bei unterschiedlichen Temperaturstufen ablaufen: In einem ersten Schritt erfolgt durch eine Aufhitzung des Reaktionsansatzes auf 94 bis 98°C eine Denaturierung der doppelsträngigen Ziel-DNA. In einem zweiten Schritt wird die Temperatur abgesenkt, um eine Hybridisierung der für die Amplifikation der Ziel-Oligonukleotide erforderlichen Primer an die einzelsträngig vorliegende DNA-Matrize zu ermöglichen (annealing).
- Die Festlegung der Temperatur, auf die der Reaktionsansatz für das annealing abgesenkt werden muß, wird durch die verwendeten Primer bestimmt.
- Nach dem annealing wird die Temperatur erneut erhöht, nämlich auf eine Temperatur von etwa 72°, um die Verlängerung (extension) der Primer durch die DNA-Polymerase zu gewährleisten.
- Die Anlagerung der Primer an den Einzelstrang der Zielsequenz bestimmt entscheidend die Spezifität der PCR. So besteht bei einer niedrigen Temperatur des Reaktionsansatzes die Gefahr, daß sich die Primer unspezifisch an der Zielsequenz anlagern. Die ebenso im Reaktionsansatz befindliche DNA-Polymerase weist zwar ihre höchste Aktivität bei 55 bis 80 °C. Selbst bei Temperaturen zwischen 20 und 55 °C ist sie jedoch noch aktiv. So weist sie beispielsweise bei 40 bis 50 °C noch eine Aktivität von 27 bis 70 % auf.
- Daraus folgt, daß bei einer Temperaturabsenkung zum annealing auch die unspezifisch paarenden Primer durch die DNA-Polymerase verlängert werden, da dafür bereits ein Primerkomplex aus nur wenigen Basenpaaren ausreicht. Dabei können z.B. sog. „Primer Dimere" entstehen, bei denen es sich um Verlängerungen von miteinander gepaarten Primern handelt.
- Das Risiko von ungewollten Primer/Primer-Interaktionen nimmt mit der Anzahl der Primerpaare zu, so z.B. in einer Multiplex-PCR.
- Die unspezifische Anlagerung der Primer an andere Primer oder an der Ziel-DNA hat zur Folge, daß – möglicherweise bereits im ersten Schritt der PCR – unspezifische Syntheseprodukte („wrong bands") entstehen, die während der PCR noch weiter amplifiziert werden. Die Spezifität der PCR ist in diesen Fällen erheblich reduziert.
- Zur möglichen Verhinderung der unspezifischen Amplifikationen wurde das Prinzip der sogenannten "Hot-Start-PCR" entwickelt. Diese Form der PCR basiert im Prinzip darauf zu gewährleisten, daß die Aktivität der DNA-Polymerase erst bei einer hohen Temperatur einsetzt, bei der nur noch die spezifisch paarenden Primer hybridisiert vorliegen, so daß eine Polymerisation an anderenfalls unspezifisch hybrisierten Primern unterdrückt wird.
- In ersten Ansätzen der Hot-Start-PCR wurde die DNA-Polymerase erst nach Erwärmung des Reaktionsansatzes hinzugefügt. Alternativ wird mindestens eines der für die Aktivität der DNA-Polymerase unerlässlichen Reagentien – z.B. Mg++, dNTPs oder die Primer – erst nach der Erwärmung auf die gewünschte Temperatur hinzugefügt (H.A. Ehrlich et al., Science 252, 643-1651 (1991) und R.T. D'Aquila et al., Nucleic Acid res. 19, 3749 (1991).
- Diese Möglichkeiten des nachträglichen Hinzufügens der für die DNA-Polymerase-Aktivität erforderlichen Reagentien ist jedoch mit einem zusätzlichen Schritt im PCR-Verlauf verbunden und hat sich daher in der Praxis nicht durchgesetzt.
- Andere Überlegungen basieren darauf, dem Reaktionsansatz von Beginn an einen gegen die DNA-Polymerase gerichteten Antikörper beizufügen, der bei höheren Temperaturen denaturiert. Damit wird die DNA-Polymerase freigegeben.
- In einer neueren Entwicklung wird dem Reaktionsmix in Wachs eingebettetes Magnesiumchlorid hinzugefügt. Bei einer Erwärmung über 68° hinaus schmilzt das Wachs und gibt das Magnesiumsalz frei. Danach liegen die für die Aktivierung der DNA-Polymerase erforderlichen Magnesiumionen in der Lösung DNA vor. Die Verwendung von Wachsbetten ist u.a. bekannt aus der PCT Offenlegungsschrift WO 91/12342 oder dem US Patent 5, 643, 764.
- Die Verwendung von in Wachs eingebetteten Reaktionskomponenten zum kontrollierten Beginn enzymatischer Reaktionen hat den Nachteil, daß stets das Erhitzen des Reaktionssystems zur Freisetzung der wesentlichen Reaktions-Komponente erforderlich ist. Das setzt wiederum – wie bei der Hot-Start-PCR – hitzresistente Enzyme voraus. Damit ist der Anwendungsbereich dieser Kontrollsysteme im Ergebnis erheblich eingeschränkt.
- Des weiteren gewährleisten die bekannten PCR-Hot-Start Systeme mit in Wachs eingebettetem Mg++-Salz zwar, daß die DNA-Polymerase-Aktivität beim Anfahren der PCR – d.h. bei dem ersten Erwärmen der PCR auf die für die Denaturierung der Ziel-DNA erforderlichen Temperatur – unterdrückt wird. Nach dem erstmaligen Aufschmelzen der das Magnesiumchlorid freisetzenden Wachsschicht kann jedoch nicht mehr verhindert werden, daß die DNA-Polymerase bei dem für das annealing notwendigen Absenken der Temperatur aktiv bleibt. Bei diesen zyklisch wiederkehrenden annealing- Bedingungen bleibt somit das Risiko der unspezifischen Primer-Paarung – und somit das Risiko der unspezifischen Amplifikationsprodukte – erhalten.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren sowie ein entsprechendes Reaktionsgefäß für die Kontrolle des Ablaufs chemischer Reaktionen bereitzustellen. Als chemische Reaktion wird dabei auch jedes molekularbiologische oder biochemische Verfahren verstanden. Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verbesserung der Hot-Start-PCR bereitzustellen.
- Diese Aufgabe wird gelöst, indem mindestens eine für die Reaktion wesentliche Reaktionskomponente in ein wasserunlösliches aber wasserpermeables Polymer eingebettet wird. Die Komponente selber ist wasserlöslich. Im Falle der PCR-Kontrolle handelt es sich dabei vorzugsweise um ein Magnesiumsalz, bevorzugt um ein in Wasser schwer lösliches Magnesiumsalz.
- Der Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, durch das wasserunlösliche aber wasserpermeable Polymer eine Diffusionsbarriere zu schaffen und somit die Konzentration des darin zunächst eingebetteten Salzes in dem Reaktionsansatz zu kontrollieren. Somit verhindert das Polymer nicht das Eintreten der wasserlöslichen Komponente in den Reaktionsansatz, sondern reduziert lediglich dessen Diffusionskoeffizienten und damit dessen Gehalt in der Lösung. Durch die Kontrolle der Konzentration der für den Beginn oder den Ablauf der Reaktion wesentlichen Komponente in dem Reaktionsansatz wird somit im Ergebnis eine Kontrolle der Reaktion, insbesondere des Beginnes der Reaktion, erreicht.
- In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Bytyralharze, Polyvinylbutyrat, Polyvinylacetal oder Polyvinylacetat eingesetzt.
- Das Polymer mit der darin eingebetteten Komponente, beispielsweise in Form von Salzkristallen, kann den Wänden eines Reaktionsgefäßes anliegen. Diese Reaktionsgefäße können für spezielle Anwendungen mit jeweils auf die Anwendung abgestimmten Polymeren und darin eingebetteten Komponenten vorgefertigt werden. Dazu kann die Komponente, beispielsweise ein Salz, gemeinsam mit dem Polymer in Lösemitteln, z.B. Chloroform suspendiert werden.
- Im Falle der PCR-Kontrolle wird vorzugsweise ein Magnesiumsalz in das Polymer eingebettet, dessen Löslichkeit in dem für die DNA-Polymerase-Aktivität erforderlichen Temperaturbereich ebenso temperaturabhängig ist. So wird erreicht, daß in dem für die Verlängerung der Primer erforderlichen Temperaturbereich von beispielsweise 72° C eine ausreichende Konzentration freier Magnesiumionen vorliegt, während in dem Temperaturbereich von beispielsweise 50 bis 60° C die Magnesiumionen wieder als Salz ausfallen und daher für die DNA-Polymerase nicht zur Verfügung stehen. Demnach ist die DNA-Polymerase in diesem niedrigeren Temperaturbereich nicht oder wesentlich weniger aktiv.
- Es ist darüber hinaus vorteilhaft, die Menge des dem Reaktionsansatz hinzugefügten schwerlöslichen Magnesiumsalzes so zu bestimmen, daß in beiden relevanten Temperaturbereichen – d.h. beim annealing und bei der extension – eine an diesem Salz gesättigte Lösung vorliegt.
- Die Art des Salzes kann so gewählt sein, daß eine für die DNA-Polymerase günstige Magnesiumionen-Konzentration im hohen Temperaturbereich und eine die Aktivität weitgehendst ausschließende Konzentration im niedrigeren Temperaturbereich vorliegt. So wird gemäß der erfindungsgemäßen Verwendung des Magnesiumsalzes gewährleistet, daß selbst bei den wiederkehrenden Schritten der Temperaturabsenkung beim PCR-Verlauf die unspezifische Paarung der Primer nicht zu einer ungewollten Verlängerung der Primer führt. Im Ergebnis wird somit das Risiko der Synthese unspezifischer PCR-Produkte reduziert.
- Das erfindungsgemäß eingesetzte Mg++-Salz weist bevorzugt bei 18°C eine Löslichkeit in Wasser von 5,7–4 mol/l und bei 100°C eine Löslichkeit von 5,4 10–3 mol/l auf.
- In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird Magnesiumoxalat als schwerlösliches Salz eingesetzt.
- Die Verwendung des in einem wasserunlöslichen aber wasserpermeablen Polymer eingebetteten schwerlöslichen Mg++-Salzes hat den Vorteil, daß die vorteilhafte Konzentration der Mg++-Ionen in dem Reaktionsmix selbst bei einer schnellen Erhitzung des Systems erst bei einer Temperatur erreicht ist, die für die Extension der Primer durch die DNA-Polymerase geeignet ist. Somit führt die Verwendung des Polymerbettes zu einer nochmaligen Verzögerung der Freisetzung der Mg++-Ionen. Vorzugsweise werden die Magnesiumionen erst nach einer 5-minütigen Erhitzung des Reaktinsmixes bei 94°C freigesetzt.
- In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die in der Lösung vorhandene Magnesiomkonzentration durch ein weiteres – leichter lösliches – Oxalatsalz eingestellt werden. Dazu kann z.B. Ammoniumoxalat eingesetzt werden. Die damit geänderte Konzentration der in Lösung befindlichen Oxalationen hat über die chemischen Gleichgewichtsreaktionen wiederum einen Einfluß auf die Konzentration des Magnesiomoxalats. Vorteilhafterweise ist dazu eine Ammoniumoxalat-Konzentration von 10 bis 12 mM vorhanden.
- Das Prinzip der Verwendung einer weiteren Komponente, deren Löslichkeit oder Verfügbarkeit die Löslichkeit oder die Verfügbarkeit der für die Reaktion erforderlichen Komponente beeinflußt, selber aber kein Reaktionspartner ist, gilt grundsätzlich. Bei dieser weiteren Komponente handelt es sich vorzugsweise um ein Salz.
- In die verwendete Polymerschicht können auch andere Mg-++-abhängige Enzyme – so z.B. die Restriktionsendonukleasen, Kinasen, Proteasen oder Ligasen -eingebettet werden. Das erfindungsgemäße System kann zwar besonders vorteilhaft in der PCR eingesetzt werden. Es eignet sich aber auch für die Kontrolle beliebiger andere Mg++-abhängiger Reaktionen, die ebenso temperatursensibel sind.
- Beispiel 1:
- Beginn der PCR
- 1. Bereitstellung des in Butyralharz eingebetteten Magnesiumoxalates:
- 1 g. von Magnesiumoxalates wird in 1 ml Butyralharzlösung (0.5g/ml) in Chloroform suspendiert. 5 mkL der Suspension werden in ein Reaktionsgefäß (vorzugsweise in ein Eppendort-Röhrchen) gefüllt. Die Suspension wird für 10 min. bei 50°C belüftet.
- 2. Reaktionsansatz und Durchführung der Reaktion:
- Der PCR-Reaktionsansatz (100 μl) wird in das mit dem Butyralharz versehene Reaktionsgefäß gefüllt. Der Reaktionsansatz enhält: 10 mM Tris-HCl (pH 9.0 bei 25°C); 50 mM KCl; 0.1 % Triton X-100; 0.2 mM von Nukleotiden (dNTP); Primer P1 and P2 (je 20 pmol); 100 ng von E. coli DNA als Matrize und 10 U Klentaq DNA Polymerase.
- Das DNA Fragment (690 bp) des E. coli Uracil DNA Glycosylasegens wird amplifiziert durch die Primer P1 (5'-ATGGCTAACGAATTAACCTGGCA) und P2 (5'-TTACTCACTCTCTGCCGGTAAT).
- Das Gefäß mit dem Reaktionsansatz wird von 24°C auf 94°C bei einer Rate von 1°C/sec erhitzt. Nach der Inkubation des Ansatzes bei 94°C bei 0, 1, 2, 3 und 5 min werden die Proben (
15 μl) in neue Reaktionsgefäße überführt. 25 Zyklen der Reaktion verlaufen in den neuen Gefäßen bei 94°C – 30 sek; 58°C – 30 sek; 72°C – 100 sek. Die PCR Produkte werden in der Elektrophorese analysiert (1 ). - Die Ergebnisse zeigen, daß die PCR nach einer Inkubation bei 94°C für 3 min beginnt.
- Beispiel 2 (Kontrolle zu 1):
- Das Verfahren wird wie oben durchgeführt mit der Ausnahme, daß 1 g. Magnesiumoxalat in 1 ml Chloroform ohne das Butyralharz verwendet wird.
- Die Ergebnisse zeigen, daß die PCR bereits vor der Inkubation bei 94°C beginnt.
- Beispiel 3:
- Beginn der DNA Verdauung.
- Das Verfahren wird wie oben durchgeführt mit folgenden Änderungen:
-
- a) Der Reaktionsansatz (100 μl) enthält: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl (pH 8.4 bei 25°C); 10 mM 2-Mercaptoethanol; 2 μg. DNA pBR322; 2 U Taq 1 Restriktionsendonuklease.
- b) Das Gefäß mit dem eingebetteten Magnesiumoxalat und dem Reaktionsansatz wird bei einer Rate von 0.5°C/sek von 24°C auf 64°C erhitzt. Nach der Inkubation des Ansatzes bei 64°C für 0, 1 , 2 , 3 und 5 min werden die Proben (15 μL) in neue Reaktionsgefäße überführt. Die Reaktion wird in den neuen Gefäßen für eine Stunde bei 64°C fortgesetzt.
- Die Daten (
2 ) zeigen, daß die Reaktion nach einer Inkubation für 2 min bei 64°C beginnt. - Beispiel 4 (als Kontrolle zu 3):
- Das Verfahren gemäß Beispiel 3, wobei 1 g. des Magnesiumoxalates in 1 ml Chloroform ohne Butyralharz suspendiert wird.
- Die Ergebnisse machen deutlich (
2 ), daß die Reaktion nach der Inkubation bei 30°C für 10 min beginnt. - Die
1 zeigt die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte aus dem Beispiel 1 (Spuren1 bis5 ) und dem Beispiel 2 (Spuren6 bis10 ). Die Reaktionsansätze waren bei 94°C für 0 (Spuren1 und6 ), 1 min (Spuren2 und7 ) 2 min (Spuren3 und8 ), 3 min (4 und9 ) und 5 min (5 und10 ) inkubiert. - Die Daten zeigen, daß im Beispiel 1 die PCR nach 3 Inkubation bei 94^C min beginnt (Spuren
4 und5 ) und daß im Beispiel 2 die PCR noch vor der Inkubation bei 94° (Spur6 ) beginnt. - Die
2 zeigt die elektrophoretische Analyse der DNA-Ligation aus dem Beispiel 4. Der Reaktionsansatz war bei 30°C für 1 (Spur1 ), für 2 min (Spur2 ), für 3 min (Spur3 ), für 5 min (Spur4 ) und 10 min (Spur5 ) inkubiert. Die Ligation beginnt ausweislich der Ergebnisse nach der Inkubation für 10 min (Spur5 ). - Beispiel 5: Verwendung der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße
- Das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß kann für PCR-Reaktionen mit beliebigen DNA-Polymerasen versendest werden. Beispielsweise geeignete Polymerasen sind nachfolgend aufgeführt.
- Versuchsprotokoll:
- Bei den erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßen handelt es sich um gewöhnliche PCR-Gefäße, deren innere Wände von einem Polymer beschichtet sind. Dieses Polymer enthält beispielsweise ein schwer lösliches Magnesiumsalz. Die optimale Wirkung entfalten die erfindungsgemäßen Gefäße bei einer Erhitzung des PCR-Reaktionsansatzes auf Temperaturen auf 90 bis 95 °C während des PCR-Zyklus:
- 1. Vorbereiten des Reaktionsansatzes
- 2. Einfüllen von 20 bis 80 μl des Reaktionsansatzes in das Gefäß
- 3. Inkubation bei 90 bis 95 °C für 5 Minuten
- 4. Beginn der PCR-Reaktion: 90 – 95 °C für 30 Sekunden 50 – 60 °C für 30 bis 45 Sekunden 70 – 75 °C ≥ 30 Sekunden
- Vorsicht das der Reaktionsansatz sollte keinen zusätzlichen Magnesiumionen enthalten.
-
Fig. 3 : Erhöhung der PCR-Spezifität durch Verwendung der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße nach Beispiel 5. - Ein 180 by DNA Fragment aus 50 ng einen humanen genomischnen DNA wurde über 30 Zyklen amplifiziert. "Hot-Start" wird manuell durchgeführt d. h. das Enzym wurde in den 94 °C heizen Reaktionsansatz gegeben ( Spuren
1 und2 ). Die erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße wurden werden (Spuren3 und4 ). - Die PCR wurde durchgeführt in einem Volumen von 25 μl enthaltend 0,5 U (Spuren
1 und3 ) oder 2,0 U (Spuren2 und4 ) der Tagpolymerase (Spur5 : Marker für das Molekulargewicht). -
4 : Erfolgreiches Auffinden und Amplifikation der Promotor Region (1,2 kb) des Xenopus laevis Gens XAC-2 durch des erfindungsgemäße Verfahren. - Die Promoto-Region (1,2 kb) wurde amplifiziert aus 20 ng der genomischen Bibliothek des südafrikanischen Frosches Xenopus laevis. Die PCR (30 Zyklen) wurde in einer herkömmlichen PCR-Gefäß (Spur
1 ) und in den erfindungsgemäßen Gefäß (Spur2 ).
Claims (18)
- Verfahren zur kontrollierten Freisetzung einer Komponente in einen Reaktionsansatz zur Kontrolle einer chemischen Reaktion umfassend die Verwendung eines wasserunlöslichen, wasserpermeablen Polymers enthaltend eine für die chemische Reaktion wesentliche Reaktionskomponente.
- Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer aus der Gruppe folgender Polymere ausgewählt ist: Bytyralharz, Polyvinylbutyrat, Polyvinylacetal oder Polyvinylacetat.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer in dem Reaktionsansatz vorliegt.
- Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche gekennzeichnet durch eine Erwärmung des Polymers oder des Reaktionsansatzes.
- Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Reaktion eine enzymatische Reaktion ist.
- Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Reaktion die Aktivität eines der folgenden Enzyme umfaßt: DNA- oder RNA-Polymerasen, Ligasen, Endonukleasen, Kinasen oder Proteasen.
- Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche gekennzeichnet durch eine PCR
- Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionskomponente ein schwerlösliches Magnesiumsalzes ist.
- Verwendung nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß das Mg++-Salz bei 18 °C in Wasser eine Löslichkeit von 5,7–4 mol/l und bei 100°C eine Löslichkeit von 5,4 10– 3 mol/l aufweist.
- Verwendung nach Anspruch 9 gekennzeichnet durch Mg++-Oxalat.
- Verwendung eines Magnesiumsalzes, das in einem wasserunlöslichen, aber Wasser permeablen Polymer eingebettet, zur Steuerung der PCR.
- Reaktions-Kit enthaltend ein Magnesiumsalz, das in einem wasserunlöslichen, aber Wasser permeablen Polymer eingebettet.
- Reaktionskit nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, daß das Magnesiumsalz in Wasser schwer löslich ist.
- Reaktions-Kit nach Anspruch 13 dadurch gekennzeichnet, daß das Mg++-Salz bei 18 °C in Wasser eine Löslichkeit von 50 nmol/l aufweist.
- Reaktions-Kit nach Anspruch 14 gekennzeichnet durch Mg++-Oxalat.
- Reaktions-Kit nach einem vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer aus der Gruppe folgender Polymere ausgewählt ist: Bytyralharz, Polyvinylbutyrat, Polyvinylacetal oder Polyvinylacetat.
- Gefäß enthaltend einen Reaktionskit nach einem der Ansprüche 12 bis 16.
- Gefäß nach Anspruch 17 für die Verwendung in der PCR.
Priority Applications (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10315640A DE10315640A1 (de) | 2003-04-04 | 2003-04-04 | Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung |
DE602004015958T DE602004015958D1 (de) | 2003-04-04 | 2004-04-01 | Verfahren zur kontrollierten freisetzung enzymatischer reaktionskomponenten |
AT04758773T ATE405677T1 (de) | 2003-04-04 | 2004-04-01 | Verfahren zur kontrollierten freisetzung enzymatischer reaktionskomponenten |
CA002521476A CA2521476A1 (en) | 2003-04-04 | 2004-04-01 | Compositions for controlled release of enzymatic reaction components |
EP04758773A EP1611257B1 (de) | 2003-04-04 | 2004-04-01 | Verfahren zur kontrollierten freisetzung enzymatischer reaktionskomponenten |
PCT/US2004/010168 WO2004090169A2 (en) | 2003-04-04 | 2004-04-01 | Compositions for controlled release of enzymatic reaction components |
ES04758773T ES2310745T3 (es) | 2003-04-04 | 2004-04-01 | Procedimiento de liberacion controlada de componentes de una reaccion enzimatica. |
JP2006509623A JP2006521827A (ja) | 2003-04-04 | 2004-04-01 | 酵素反応成分の放出を制御する方法 |
US10/817,680 US7306929B2 (en) | 2003-04-04 | 2004-04-01 | Method for controlled release of enzymatic reaction components |
AU2004227368A AU2004227368B2 (en) | 2003-04-04 | 2004-04-01 | Compositions for controlled release of enzymatic reaction components |
US11/924,342 US20080138879A1 (en) | 2003-04-04 | 2007-10-25 | Method for controlled release of enzymatic reaction components |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10315640A DE10315640A1 (de) | 2003-04-04 | 2003-04-04 | Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10315640A1 true DE10315640A1 (de) | 2004-10-14 |
Family
ID=32981089
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE10315640A Withdrawn DE10315640A1 (de) | 2003-04-04 | 2003-04-04 | Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung |
DE602004015958T Expired - Lifetime DE602004015958D1 (de) | 2003-04-04 | 2004-04-01 | Verfahren zur kontrollierten freisetzung enzymatischer reaktionskomponenten |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE602004015958T Expired - Lifetime DE602004015958D1 (de) | 2003-04-04 | 2004-04-01 | Verfahren zur kontrollierten freisetzung enzymatischer reaktionskomponenten |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7306929B2 (de) |
EP (1) | EP1611257B1 (de) |
JP (1) | JP2006521827A (de) |
AT (1) | ATE405677T1 (de) |
AU (1) | AU2004227368B2 (de) |
CA (1) | CA2521476A1 (de) |
DE (2) | DE10315640A1 (de) |
ES (1) | ES2310745T3 (de) |
WO (1) | WO2004090169A2 (de) |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8030000B2 (en) | 2002-02-21 | 2011-10-04 | Alere San Diego, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
US7399590B2 (en) | 2002-02-21 | 2008-07-15 | Asm Scientific, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
EP1499738B1 (de) | 2002-02-21 | 2008-07-09 | ASM Scientific, Inc. | Rekombinase-polymerase-amplifikation |
WO2006119419A2 (en) * | 2005-05-03 | 2006-11-09 | Geunsook Jeon | Materials and kits for use in hot-start pcr, and methods of amplifying nucleic acids in a polymerase chain reaction |
US8062850B2 (en) | 2005-07-25 | 2011-11-22 | Alere San Diego, Inc. | Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification |
WO2008035205A2 (en) | 2006-05-04 | 2008-03-27 | Asm Scientific, Inc. | Recombinase polymerase amplification |
US9132394B2 (en) | 2008-09-23 | 2015-09-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for detection of spaced droplets |
US9156010B2 (en) | 2008-09-23 | 2015-10-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based assay system |
US8633015B2 (en) | 2008-09-23 | 2014-01-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Flow-based thermocycling system with thermoelectric cooler |
US8663920B2 (en) | 2011-07-29 | 2014-03-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Library characterization by digital assay |
US9399215B2 (en) | 2012-04-13 | 2016-07-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sample holder with a well having a wicking promoter |
WO2011120024A1 (en) | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Quantalife, Inc. | Droplet generation for droplet-based assays |
US8951939B2 (en) | 2011-07-12 | 2015-02-10 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel |
US8709762B2 (en) | 2010-03-02 | 2014-04-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for hot-start amplification via a multiple emulsion |
US9194861B2 (en) | 2009-09-02 | 2015-11-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method of mixing fluids by coalescence of multiple emulsions |
US10512910B2 (en) | 2008-09-23 | 2019-12-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based analysis method |
US9764322B2 (en) | 2008-09-23 | 2017-09-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for generating droplets with pressure monitoring |
US11130128B2 (en) | 2008-09-23 | 2021-09-28 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detection method for a target nucleic acid |
US9492797B2 (en) | 2008-09-23 | 2016-11-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for detection of spaced droplets |
US9598725B2 (en) * | 2010-03-02 | 2017-03-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Emulsion chemistry for encapsulated droplets |
US9417190B2 (en) | 2008-09-23 | 2016-08-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Calibrations and controls for droplet-based assays |
WO2010135310A1 (en) | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Biosite Incorporated | Dna glycosylase/lyase and ap endonuclease substrates |
EP3360974A1 (de) * | 2009-06-05 | 2018-08-15 | Alere San Diego, Inc. | Reagentien zur rekombinase polymerase amplifikation |
CA2767113A1 (en) | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detection system for droplet-based assays |
CA2767114A1 (en) | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet transport system for detection |
CN103429331B (zh) | 2010-11-01 | 2016-09-28 | 伯乐生命医学产品有限公司 | 用于形成乳液的系统 |
EP2686449B1 (de) | 2011-03-18 | 2020-11-18 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multiplexierte digitalassays mit kombinatorischer nutzung von signalen |
WO2012149042A2 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid analysis |
US20150307930A1 (en) * | 2012-12-28 | 2015-10-29 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Detection method for hydroxymethylated cytosine in dna and reagent kit for detection |
Family Cites Families (109)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US419909A (en) * | 1890-01-21 | Post-hole auger | ||
DE2029419C3 (de) * | 1969-09-26 | 1974-02-07 | American Optical Corp., Southbridge, Mass. (V.St.A.) | Durch Laserstrahlen löschbare Druckfarbe |
US3761437A (en) * | 1969-09-26 | 1973-09-25 | American Optical Corp | Laser energy absorbing composition containing a copper salt |
US4098728A (en) | 1976-01-02 | 1978-07-04 | Solomon Rosenblatt | Medical surgical sponge and method of making same |
US4247498A (en) | 1976-08-30 | 1981-01-27 | Akzona Incorporated | Methods for making microporous products |
US4519909A (en) | 1977-07-11 | 1985-05-28 | Akzona Incorporated | Microporous products |
US4186189A (en) | 1977-09-28 | 1980-01-29 | Ethicon, Inc. | Absorbable pharmaceutical compositions based on poly(alkylene oxalates) |
US4384975A (en) | 1980-06-13 | 1983-05-24 | Sandoz, Inc. | Process for preparation of microspheres |
US4507414A (en) * | 1982-05-14 | 1985-03-26 | The B. F. Goodrich Company | Smoke retardant vinyl halide polymer compositions |
DK151608C (da) | 1982-08-13 | 1988-06-20 | Benzon As Alfred | Fremgangsmaade til fremstilling af et farmaceutisk peroralt polydepotpraeparat med kontrolleret afgivelse |
HU187215B (en) | 1983-01-26 | 1985-11-28 | Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar | Method for producing pharmaceutical product of high actor content and prolonged effect |
US4469743A (en) | 1983-03-14 | 1984-09-04 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Polyvinyl butyral laminates |
US5135477A (en) | 1984-10-29 | 1992-08-04 | Medtronic, Inc. | Iontophoretic drug delivery |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4789630A (en) | 1985-10-04 | 1988-12-06 | Cetus Corporation | Ionic compounds containing the cationic meriquinone of a benzidine |
US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
US5079352A (en) | 1986-08-22 | 1992-01-07 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
US5466591A (en) | 1986-08-22 | 1995-11-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases |
US5455170A (en) | 1986-08-22 | 1995-10-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from Thermus species Z05 |
US5374553A (en) | 1986-08-22 | 1994-12-20 | Hoffmann-La Roche Inc. | DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima |
US5283189A (en) | 1987-02-09 | 1994-02-01 | Research Development Corporation Of Japan | β-galactosidase from Thermus sp |
US4830855A (en) * | 1987-11-13 | 1989-05-16 | Landec Labs, Inc. | Temperature-controlled active agent dispenser |
JP2531246B2 (ja) | 1988-08-26 | 1996-09-04 | 東洋紡績株式会社 | 耐熱性dnaポリメラ―ゼおよびその製法 |
US5215907A (en) | 1989-02-24 | 1993-06-01 | Oklahoma Medical Research Foundation | Thermostable acid protease from sulfolobus acidocaldarius |
GB8905269D0 (en) | 1989-03-08 | 1989-04-19 | Univ Bristol | Novel modified nad-dependent dehydrogenases |
HU203041B (en) | 1989-03-14 | 1991-05-28 | Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar | Process for producing pharmaceutical compositions of controlled releasing factor containing nifedipin |
US5071648A (en) | 1989-04-06 | 1991-12-10 | Merocel Corporation | Polymeric broad-spectrum antimicrobial materials |
EP0515506B1 (de) * | 1990-02-16 | 2000-01-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Verbesserungen in der spezifität und zweckmässigkeit der polymerase-kettenreaktion |
JP3078859B2 (ja) | 1990-02-23 | 2000-08-21 | 武田薬品工業株式会社 | 安定な放出制御性製剤用コーティング剤 |
US5192675A (en) | 1990-03-20 | 1993-03-09 | Life Technologies, Inc. | Cloned KpnI restriction-modification system |
US5091187A (en) | 1990-04-26 | 1992-02-25 | Haynes Duncan H | Phospholipid-coated microcrystals: injectable formulations of water-insoluble drugs |
US5500363A (en) | 1990-04-26 | 1996-03-19 | New England Biolabs, Inc. | Recombinant thermostable DNA polymerase from archaebacteria |
US5246707A (en) | 1990-04-26 | 1993-09-21 | Haynes Duncan H | Sustained release delivery of water-soluble bio-molecules and drugs using phospholipid-coated microcrystals, microdroplets and high-concentration liposomes |
US5494810A (en) * | 1990-05-03 | 1996-02-27 | Cornell Research Foundation, Inc. | Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease |
US6787338B2 (en) | 1990-06-04 | 2004-09-07 | The University Of Utah | Method for rapid thermal cycling of biological samples |
DK145990D0 (da) | 1990-06-15 | 1990-06-15 | Novo Nordisk As | Thermostabil protease |
DK146090D0 (da) | 1990-06-15 | 1990-06-15 | Novo Nordisk As | Thermostabil protease |
US5643777A (en) | 1990-06-15 | 1997-07-01 | Novo Nordisk A/S | Thermostable protease from thermococcus |
US5283179A (en) | 1990-09-10 | 1994-02-01 | Promega Corporation | Luciferase assay method |
AU8906091A (en) | 1990-10-05 | 1992-04-28 | Wayne M. Barnes | Thermostable dna polymerase |
US5545552A (en) | 1990-12-03 | 1996-08-13 | Stratagene | Purified thermostable pyrococcus furiosus DNA polymerase I |
US5120349A (en) | 1990-12-07 | 1992-06-09 | Landec Labs, Inc. | Microcapsule having temperature-dependent permeability profile |
US5580573A (en) | 1991-02-01 | 1996-12-03 | E. R. Squibb And Sons, Inc. | Temperature activated controlled release |
CH680325B5 (de) * | 1991-02-25 | 1993-02-15 | Ebauchesfabrik Eta Ag | |
US5229285A (en) | 1991-06-27 | 1993-07-20 | Kikkoman Corporation | Thermostable luciferase of firefly, thermostable luciferase gene of firefly, novel recombinant dna, and process for the preparation of thermostable luciferase of firefly |
US5459055A (en) | 1991-12-27 | 1995-10-17 | Epicentre Technologies Corporation | Thermostable ribonuclease H isolated from Thermus flavus |
US5700672A (en) | 1992-07-23 | 1997-12-23 | Stratagene | Purified thermostable pyrococcus furiousus DNA ligase |
US5744345A (en) | 1992-10-05 | 1998-04-28 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Hyperthermostable β-galactosidase gene, enzyme encoded thereby, and process for production |
US5565339A (en) * | 1992-10-08 | 1996-10-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Compositions and methods for inhibiting dimerization of primers during storage of polymerase chain reaction reagents |
US5332774A (en) | 1992-10-16 | 1994-07-26 | Arco Chemical Technology, L.P. | Polyvinyl acetal resins based on hydroxyaldehydes and use of the resins in laminar structures |
US5614402A (en) | 1992-12-07 | 1997-03-25 | Third Wave Technologies, Inc. | 5' nucleases derived from thermostable DNA polymerase |
US5662935A (en) | 1992-12-23 | 1997-09-02 | Saitec S.R.L. | Process for preparing controlled release pharmaceutical forms and the forms thus obtained |
US5436149A (en) | 1993-02-19 | 1995-07-25 | Barnes; Wayne M. | Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension |
US5616402A (en) * | 1993-03-19 | 1997-04-01 | Ncr Corporation | Printing ribbon for printing red scannable bar codes |
US5427928A (en) | 1993-03-24 | 1995-06-27 | Slesarev; Alexei I. | Thermostable DNA Topoisomerase V |
DE69414921T3 (de) * | 1993-06-29 | 2004-04-15 | Hewlett-Packard Co. (N.D.Ges.D.Staates Delaware), Palo Alto | Vernetztes Polyvinylbutyral Bindemittel für organische Photoleiter |
JP3808501B2 (ja) | 1994-04-01 | 2006-08-16 | ジェン−プローブ・インコーポレイテッド | 高度に精製された組み換え逆転写酵素 |
US5939257A (en) | 1994-04-18 | 1999-08-17 | Amersham Life Science, Inc. | Thermostable alkaline phosphatases |
WO1995030756A1 (en) | 1994-04-18 | 1995-11-16 | United States Biochemical Corporation | Thermostable alkaline phosphatase of thermus thermophilus |
FR2719417B1 (fr) | 1994-04-28 | 1996-07-19 | Person Henri Le | Composant à hétérostructure semi-conductrice, commande par la lumière pour la génération d'oscillations hyperfréquences. |
US5643754A (en) | 1994-05-25 | 1997-07-01 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids encoding a leptospira outer membrane protein |
JP3557289B2 (ja) | 1994-07-21 | 2004-08-25 | 株式会社林原生物化学研究所 | 非還元性糖質からトレハロースを遊離する組換え型耐熱性酵素 |
US5660854A (en) | 1994-11-28 | 1997-08-26 | Haynes; Duncan H | Drug releasing surgical implant or dressing material |
AUPN245295A0 (en) | 1995-04-13 | 1995-05-11 | Johnson & Johnson Research Pty. Limited | Assay for genetic abnormalities |
US5776720A (en) | 1995-05-18 | 1998-07-07 | Coulter Corporation | Assay reagent |
JP3112148B2 (ja) | 1995-05-31 | 2000-11-27 | 東洋紡績株式会社 | 核酸の増幅方法およびその試薬 |
US6033859A (en) | 1996-05-24 | 2000-03-07 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Thermostable DNA polymerase from a hyperthermophilic archaeon strain KOD1 |
US5773258A (en) | 1995-08-25 | 1998-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme |
US5665551A (en) | 1995-09-13 | 1997-09-09 | Roche Molecular Systems, Inc. | Purified nucleic acid encoding a thermostable pyrophosphatase |
ES2162132T3 (es) | 1995-12-15 | 2001-12-16 | Amersham Pharm Biotech Inc | Polimerasa de adn termoestable procedente de thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus y enzimas mutantes, de actividad exonucleasa suprimida asi obtenidos. |
EP1009964A4 (de) * | 1996-01-25 | 2003-01-22 | Frazier Simplex | Wärmerückführung für sauerstoff-brennstoff befeuerte öfen |
US20020164751A1 (en) | 1996-06-19 | 2002-11-07 | Short Jay M. | Enzymes having thermostable phosphatase activity and methods of use thereof |
US6312892B1 (en) | 1996-07-19 | 2001-11-06 | Cornell Research Foundation, Inc. | High fidelity detection of nucleic acid differences by ligase detection reaction |
EP0822256B1 (de) | 1996-07-29 | 2003-09-24 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Modifizierte thermostabile DNA Polymerase und eine DNA Polymerasezusammensetzung zur Amplifikation von Nukleinsäuren |
US5736373A (en) | 1996-09-23 | 1998-04-07 | Becton, Dickinson And Company | Thermostable DNA polymerase from Bacillus pallidus |
DE19641064A1 (de) | 1996-10-04 | 1998-04-09 | Wacker Chemie Gmbh | Modifizierte Polyvinylbutyrale mit niederer Lösungsviskosität |
US5705379A (en) | 1996-10-23 | 1998-01-06 | Cornell Research Foundation, Inc. | Nucleotide sequences encoding a thermostable alkaline protease |
FR2756560A1 (fr) * | 1996-12-04 | 1998-06-05 | Adir | Nouveaux derives de l'imidazoline, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent |
US6143517A (en) * | 1996-12-23 | 2000-11-07 | University Of Florida | Thermostable proteolytic enzymes and uses thereof in peptide and protein synthesis |
US5744150A (en) | 1997-01-29 | 1998-04-28 | Xomed Surgical Products, Inc. | Softened antimicrobial sponge material with color change indication of antimicrobial activity |
EP0994191B1 (de) | 1997-06-10 | 2006-03-01 | Takara Bio Inc. | System zum exprimieren einer hyperthermostabilen protease |
US6113947A (en) | 1997-06-13 | 2000-09-05 | Genentech, Inc. | Controlled release microencapsulated NGF formulation |
US6004752A (en) * | 1997-07-29 | 1999-12-21 | Sarnoff Corporation | Solid support with attached molecules |
JP3018163B2 (ja) | 1997-09-04 | 2000-03-13 | 工業技術院長 | パイロコッカス属に属する超好熱性細菌由来の耐熱性Flapエンドヌクレアーゼ |
CA2243985C (en) * | 1997-09-11 | 2004-08-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Thermostable dna polymerases incorporating nucleoside triphosphates labeled with fluorescein family dyes |
EP2860252A1 (de) | 1997-09-19 | 2015-04-15 | Promega Corporation | Thermostabile Luciferasen und Verfahren zur Herstellung |
US6602677B1 (en) | 1997-09-19 | 2003-08-05 | Promega Corporation | Thermostable luciferases and methods of production |
US6183998B1 (en) | 1998-05-29 | 2001-02-06 | Qiagen Gmbh Max-Volmer-Strasse 4 | Method for reversible modification of thermostable enzymes |
US6130045A (en) | 1998-06-11 | 2000-10-10 | Clontech Laboratories, Inc. | Thermostable polymerase |
US6294367B1 (en) | 1998-06-15 | 2001-09-25 | California Institute Of Technology | Thermostable peptidase |
JP3482140B2 (ja) * | 1998-10-06 | 2003-12-22 | 株式会社東芝 | 核酸鎖合成方法、核酸固定化チップおよび核酸鎖検出方法 |
KR20010082251A (ko) | 1998-10-26 | 2001-08-29 | 찌바따 이찌로, 다나까 도시오 | 서방성 입자 |
JP4374441B2 (ja) * | 1998-12-23 | 2009-12-02 | ジェイピーアイ コマーシャル,リミティド ライアビリティ カンパニー | 睡眠発作治療のための、ガンマ−ヒドロキシ酪酸塩の微生物的に安全で安定な液剤 |
US6380380B1 (en) | 1999-01-04 | 2002-04-30 | Specialty Assays, Inc. | Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucliotide phosphate (NADP) analogs to measure enzyme activities metabolites and substrates |
JP4175746B2 (ja) | 1999-08-30 | 2008-11-05 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 新規な耐熱性コラーゲン分解酵素、前記酵素を産生する新規な微生物および前記酵素の製造方法 |
US6541216B1 (en) | 1999-12-22 | 2003-04-01 | Roche Diagnostics Corporation | Amperometric biosensor test strip |
US7078208B2 (en) | 2000-05-26 | 2006-07-18 | Invitrogen Corporation | Thermostable reverse transcriptases and uses thereof |
US6214557B1 (en) | 2000-06-06 | 2001-04-10 | Washington University | Cold sensitive mutant DNA polymerases |
KR100392501B1 (ko) | 2000-06-28 | 2003-07-22 | 동국제약 주식회사 | 다중 에멀젼법에 의한 서방출성 미립구의 제조방법 |
US6576109B1 (en) * | 2000-09-27 | 2003-06-10 | Wealtec Enterprise Co., Ltd. | Gel tray structure of an electrophoresis trough |
WO2002050234A1 (en) | 2000-12-21 | 2002-06-27 | Unilever N.V. | Cleaning compositions |
JP4146095B2 (ja) | 2001-01-15 | 2008-09-03 | ユニチカ株式会社 | 耐熱性グルコキナーゼ遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いた耐熱性グルコキナーゼの製造方法 |
US7833701B2 (en) * | 2001-05-11 | 2010-11-16 | Panasonic Corporation | Biomolecule substrate, and test and diagnosis methods and apparatuses using the same |
EP1275735A1 (de) * | 2001-07-11 | 2003-01-15 | Roche Diagnostics GmbH | Zusammensetzung und Methode zur 'Hot start' Nukleinsäureamplifizierung |
US20030027196A1 (en) | 2001-08-02 | 2003-02-06 | Barnes Wayne M. | Magnesium precipitate methods for magnesium dependent enzymes |
US6403341B1 (en) * | 2001-08-02 | 2002-06-11 | Wayne M. Barnes | Magnesium precipitate hot start method for PCR |
US6921641B2 (en) * | 2001-08-10 | 2005-07-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Thermostable UvrA and UvrB polypeptides and methods of use |
US6902921B2 (en) * | 2001-10-30 | 2005-06-07 | 454 Corporation | Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase |
-
2003
- 2003-04-04 DE DE10315640A patent/DE10315640A1/de not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-04-01 ES ES04758773T patent/ES2310745T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-01 JP JP2006509623A patent/JP2006521827A/ja active Pending
- 2004-04-01 AU AU2004227368A patent/AU2004227368B2/en not_active Ceased
- 2004-04-01 EP EP04758773A patent/EP1611257B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-01 WO PCT/US2004/010168 patent/WO2004090169A2/en active Application Filing
- 2004-04-01 US US10/817,680 patent/US7306929B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-04-01 DE DE602004015958T patent/DE602004015958D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-04-01 AT AT04758773T patent/ATE405677T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-04-01 CA CA002521476A patent/CA2521476A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-25 US US11/924,342 patent/US20080138879A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20060194209A1 (en) | 2006-08-31 |
US7306929B2 (en) | 2007-12-11 |
JP2006521827A (ja) | 2006-09-28 |
US20080138879A1 (en) | 2008-06-12 |
EP1611257A2 (de) | 2006-01-04 |
DE602004015958D1 (de) | 2008-10-02 |
ATE405677T1 (de) | 2008-09-15 |
WO2004090169A2 (en) | 2004-10-21 |
ES2310745T3 (es) | 2009-01-16 |
WO2004090169A3 (en) | 2005-03-24 |
AU2004227368A1 (en) | 2004-10-21 |
CA2521476A1 (en) | 2004-10-21 |
EP1611257B1 (de) | 2008-08-20 |
AU2004227368B2 (en) | 2009-01-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE10315640A1 (de) | Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung | |
US20210222236A1 (en) | Template Switch-Based Methods for Producing a Product Nucleic Acid | |
DE60116651T2 (de) | Methode zur amplifizierung und möglicher charakterisierung von nukleinsäuren | |
DE60034396T2 (de) | Reaktionsgemisch und Verfahren für RT-PCR mittels einer homopolymeren Nukleinsäure | |
DE69233041T2 (de) | Behandlung von amplifizierter DNS mit alkalischer Phosphatase | |
DE10150121B4 (de) | Echtzeitdetektion von DNA-Amplifikationsprodukten | |
DE69937223T3 (de) | Verfahren zur synthese von nukleinsäuren | |
DE60123980T2 (de) | Amplifizierung von nukleinsäuresequenzen mittels multiplex priming | |
EP0705905B1 (de) | Verfahren zum sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren | |
DE60112746T2 (de) | Kälteempfindliche dna-polymerasemutanten | |
EP1386006B1 (de) | Verfahren zur manipulation von nukleinsäuren | |
EP3504338B1 (de) | Verfahren zur amplifikation von nukleinsäuren und verwendung eines kits zu dessen durchführung | |
DE69930765T2 (de) | Methode zur kontrollierten verlängerung eines oligonukleotids | |
EP2316965B1 (de) | Einführung von Sequenzelementen in Nukleinsäuren | |
CA3068615C (en) | Dna production method and dna fragment-joining kit | |
DE3929030A1 (de) | Verfahren zur vermehrung von nukleinsaeuren | |
DE4336266A1 (de) | Stabilisierte flüssige Mischungen für die Markierung von Nukleinsäuren | |
US20190048334A1 (en) | Methods for sample preparation | |
EP2002015B1 (de) | Gemisch reversibel inhibierter enzyme | |
DE19741714C2 (de) | Verfahren zur Synthese und Amplifikation von Nukleinsäuren | |
EP3530755B1 (de) | Verfahren zum anzeigen des fortschrittes der amplifikation von nukleinsäuren und kit zu dessen durchführung | |
WO1992006216A1 (de) | Verfahren zum empfindlichen nachweis von nukleinsäuren | |
DE4106473C2 (de) | Verfahren zur Herstellung in vitro replizierbarer Nukleinsäuren | |
EP3759248A1 (de) | Agverfahren zur amplifikation einer nukleinsäure mit verbesserter spezifität | |
DE102018001586A1 (de) | Verfahren zur Detektion der Amplifikation einer Nukleinsäure mit verbesserter Spezifität |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: PROMEGA CORP., MADISON, WIS., US |
|
8181 | Inventor (new situation) |
Inventor name: PLACHOV, DIMITRIJ, DR., 48249 DUELMEN, DE |
|
8141 | Disposal/no request for examination |