ES2310745T3 - Procedimiento de liberacion controlada de componentes de una reaccion enzimatica. - Google Patents

Abstract

Una composición que contiene: al menos un polímero sustancialmente insoluble en agua, permeable al agua; y al menos una sal de magnesio de un reactivo enzimático iónico y un contraión, donde la sal de magnesio tiene una solubilidad molar en agua menor de 1 x 10- 3 moles/l a 25ºC.

Description

Procedimiento de liberación controlada de componentes de una reacción enzimática.

Antecedentes

En los procesos biomoleculares es a menudo importante controlar la actividad de un enzima. Éste es el caso en particular de los enzimas ADN polimerasa utilizados para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las reacciones de PCR implican a menudo la utilización de un enzima ADN polimerasa resistente al calor, dependiente de Mg^{2+} (tal como la ADN polimerasa Taq) en un proceso de múltiples ciclos que emplea varias etapas alternantes de calentamiento y enfriamiento para amplificar ADN (Patentes de EE.UU. N^{os} 4.683.202 y 4.683.195). En primer lugar, una mezcla de reacción es calentada a una temperatura suficiente para desnaturalizar el ADN diana bicatenario en sus dos cadenas individuales. La temperatura de la mezcla de reacción es posteriormente disminuida con el fin de permitir que cebadores oligonucleotídicos específicos hibriden con sus ADNs diana monocatenarios complementarios respectivos. Después de la etapa de hibridación, se aumenta la temperatura hasta una temperatura óptima para la ADN polimerasa que esté siendo utilizada, lo cual permite la incorporación de nucleótidos complementarios en los extremos 3' de los cebadores oligonucleotídicos hibridados, volviéndose a producir de este modo ADN diana bicatenario. Utilizando una ADN polimerasa estable al calor, el ciclo de desnaturalización, hibridación y extensión puede ser repetido tantas veces como sea necesario para generar un producto deseado, sin la adición de polimerasa después de cada desnaturalización por calor. Veinte o treinta ciclos de replicación pueden dar lugar a una amplificación de hasta millones de veces de la secuencia de ADN diana ("Current Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel y col. (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., 1998).

Aunque la tecnología de PCR ha tenido un profundo impacto en la investigación biomédica y en el análisis de la identidad genética, la amplificación de oligonucleótidos no diana y un cebado erróneo de ADN, ARN de fondo no diana y/o de los propios cebadores, representa todavía un problema significativo. Esto es especialmente cierto en las aplicaciones de diagnóstico en las que la PCR se lleva a cabo en un medio de fondos genéticos complejos en los que el ADN diana puede estar presente proporcionalmente a un nivel muy bajo (Chou y col., Nucleic Acids Res., 20:1717-1723 (1992)).

Un problema clave es que aunque la temperatura óptima para la actividad de la ADN polimerasa Taq esté típicamente en el rango de 62ºC - 72ºC, puede tener lugar también una actividad significativa entre 20ºC - 37ºC (W.M. Barnes y col., Patente de EE.UU. Nº 6.403.341). Como resultado, durante la preparación de una PCR estándar a temperatura ambiente, los cebadores pueden cebar extensiones en secuencias no específicas debido a que solamente unos cuantos pares de bases en el extremo 3' de un cebador que sean complementarios a una secuencia de ADN pueden tener como resultado un complejo de cebado estable. Como resultado, pueden producirse productos competitivos o inhibidores a expensas del producto deseado. Así, por ejemplo, pueden formarse estructuras que consten solamente de cebadores, denominadas algunas veces "dímeros de cebadores", por la actividad de la ADN polimerasa Taq sobre los cebadores apareados entre sí de forma inapropiada.

La probabilidad de interacciones cebador-cebador indeseables aumenta también con el número de pares de cebadores en una reacción, particularmente en el caso de una PCR múltiple. El cebado erróneo del ADN molde puede tener también como resultado la producción de productos inhibidores o "bandas erróneas" de diferentes longitudes. Durante los ciclos de PCR, la amplificación no específica de productos no deseados puede competir con la amplificación del ADN diana deseado por factores y constituyentes de la extensión necesarios, tales como los dNTPs, lo cual puede dar lugar a una interpretación errónea del ensayo. Dada la sensibilidad de la ADN polimerasa Taq y su propensión a amplificar progresivamente cantidades de ADN relativamente grandes de cualquier acontecimiento cebado, es imperativo controlar la actividad de la ADN polimerasa Taq para impedir la producción de productos de amplificación de ADN contaminantes, irrelevantes, particularmente cuando se ponen a punto reacciones de PCR.

Las reacciones colaterales indeseables de la PCR tienen lugar típicamente durante la preparación de la PCR a temperatura ambiente. Un procedimiento para minimizar estas reacciones colaterales implica la exclusión de al menos un reactivo esencial (dNTPs, Mg^{2+}, ADN polimerasa o cebadores) de la reacción hasta que todos los componentes de la reacción hayan sido llevados a una temperatura elevada (por ejemplo, la temperatura de desnaturalización del ADN); la idea es impedir la unión de los cebadores entre sí o a secuencias no deseadas (Erlich y col., Science, 252:1643-1651, 1991; D'Aquila y col., Nucleic Acids Res., 19:3749, 1991). Este es un ejemplo de un procedimiento de inicio caliente de la PCR "físico" en el que un componente esencial es físicamente retenido hasta que se alcanza una temperatura de reacción deseada.

Se han descrito otros procedimientos físicos de inicio caliente que segregan físicamente los componentes de la reacción unos de otros con el fin de garantizar que la actividad de la ADN polimerasa esté suprimida durante el periodo que precede al inicio de la PCR (ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nº 5.643.764; Patente de Rusia RU 2.215.037) o que emplean los métodos de "inicio caliente químico/bioquímico" que utilizan ADN polimerasas modificadas que son activables de manera reversible tras el calentamiento (por ejemplo, ADN POLIMERASA AMPLITAQ GOLD^{TM}, PE Applied Biosystems) o anticuerpos monoclonales inactivadores contra la ADN polimerasa Taq que se unen a la polimerasa a temperatura ambiente (Scalice y col., J. Immun. Methods, 172:147-163, 1994; Sharkey y col., Bio/Technology, 12:506-509, 1994; Kellogg y col., Biotechniques, 16:1134-1137, 1994).

US 5.565.339 describe un método mejorado de PCR que utiliza una grasa o una cera en lugar de aceite mineral para impedir la evaporación de los solventes. Esto puede tener como resultado un retraso del mezclado de los reactivos hasta la primera etapa de calentamiento de la amplificación por PCR. Reduciéndose de este modo la generación enzimática de productos no específicos.

Los diferentes procedimientos de inicio caliente de la PCR tienen múltiples defectos. Los métodos de inicio caliente físicos están plagados de problemas de contaminación, de la obturación de las puntas de pipeta con cera o grasa y tiempos de calentamiento incrementados. Los métodos de inicio caliente químicos/bioquímicos pueden dañar el ADN molde y pueden requerir cantidades prohibitivamente excesivas, de anticuerpos anti-Taq caros.

Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de nuevos métodos de inicio caliente de la PCR que minimicen o eliminen los muchos problemas o defectos asociados con los procedimientos de la técnica anterior. De manera más general, existe la necesidad de nuevos procedimientos para controlar otros enzimas dependientes de Mg u otros enzimas no dependientes de Mg cuando se desea una actividad controlada.

US 3.761.437 describe una composición que contiene un material de matriz polimérica que consta de acetato de polivinilo o de butirato de polivinilo mezclado con cloruro de cobre o con nitrato de cobre en relación con enlaces anulables.

US 4.507.414 describe un copolímero de haluros de vinilo que incluye acetato de vinilo o butirato de vinilo mezclado con, entre otras posibilidades, oxalato de cobre, en relación con polímeros retardadores de humo.

Resumen

En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones y métodos para controlar un proceso enzimático en el cual un polímero sustancialmente insoluble en agua, permeable al agua, y una sal de magnesio poco soluble en agua de un reactivo enzimático iónico son combinados para formar una composición que proporciona la liberación controlada del reactivo enzimático iónico. El polímero insoluble en agua/permeable al agua es diseñado para facilitar interacción(es) electrostática(s) con un grupo catiónico de la sal y para actuar como barrera de difusión para liberar el reactivo iónico al medio de reacción circundante. La sal es seleccionada para que tenga baja solubilidad en agua, de tal manera que su secuestro y liberación por el polímero pueda tener lugar de manera controlada, dependiendo de varias condiciones de la reacción enzimática, tales como la temperatura, el tiempo de incubación y/o el pH. En efecto, el polímero proporciona una barrera de difusión para la liberación controlada de un reactivo enzimático iónico esencial a partir de la sal, cuya disociación y liberación del polímero está determinada además por, por ejemplo, la solubilidad de la sal y/o la temperatura en el medio de reacción.

En otro aspecto, una composición que contiene un polímero sustancialmente insoluble en agua, permeable al agua, y una sal de magnesio poco soluble en agua es incorporada a un recipiente de reacción o sobre una superficie de reacción y/o en un kit de reacción para controlar un proceso enzimático. Específicamente, se proporcionan método para preparar y utilizar recipientes de reacción revestidos con una sal de un reactivo enzimático iónico atrapada en polímeros insolubles en agua/permeables al agua, tales como resinas de poli(vinil acetal). Los recipientes de reacción revestidos pueden ser utilizados para regular procesos enzimáticos, tales como los que implican a los enzimas ADN polimerasa estables al calor en las reacciones de PCR.

Una sal del reactivo enzimático iónico puede incluir un ión metálico de magnesio. Las realizaciones preferidas incluyen composiciones y recipientes de reacción revestidos o superficies de reacción revestidas utilizados para controlar las actividades de enzimas dependientes de iones metálicos. Ejemplos de composiciones o kits de reacción incluyen iones magnesio o sales de magnesio, tales como oxalato de magnesio, atrapados en resinas de poli(vinil acetal) para regular las actividades de enzimas dependientes de Mg^{2+}.

El recipiente, la superficie o el kit de reacción pueden contener componente(s) adicional(es) para la reacción. Además, el kit de reacción puede contener una pluralidad de recipientes de reacción adicionales, conteniendo cada uno de ellos al menos un componente de reacción adicional. Entre los componentes de reacción adiciones se puede incluir un enzima (tal como una polimerasa estable al calor para PCR) cuya actividad sea dependiente de la liberación y/o la disociación de un reactivo iónico (tal como un ión metálico) procedente del polímero y de la sal.

Otras características, aspectos y ventajas de la invención serán, o resultarán, obvios a las personas expertas en la técnica tras el examen de las figuras y la descripción detallada siguientes. Se tiene la intención de que tales sistemas adicionales, características, aspectos y ventajas incluidos en esta descripción estén todos dentro del ámbito de la invención, y estén protegidos por las reivindicaciones siguientes.

Breve descripción de las figuras

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención serán mejor comprendidos con relación a la descripción, a las reivindicaciones y a las figuras acompañantes siguientes, en las cuales:

La Fig. 1 representa un análisis electroforético de los productos de PCR obtenidos en el Ejemplo 1 utilizando tubos de reacción revestidos con oxalato de Mg incluido en una resina de butiral (Calles 1 a 5) o utilizando tubos de reacción que contenían únicamente oxalato de Mg (esto es, sin la resina de butiral); Calles 6 a 10. Las mezclas de reacción fueron incubadas inicialmente a 94ºC durante 0 minutos (Calles 1 y 6), 1 minuto (Calles 2 y 7), 2 minutos (Calles 6 y 8), 3 minutos (4 y 9) y 5 minutos (5 y 10).

La Fig. 2 representa un análisis electroforético de fragmentos de ADN obtenidos después de la digestión con endonucleasas de restricción de pBR322 utilizando Taq I según se describe en el Ejemplo 2. Las mezclas de la digestión con enzimas de restricción fueron incubadas inicialmente a 64ºC durante 0 minutos (Calle 1), 1 minuto (Calle 2), 2 minutos (Calle 3), 3 minutos (Calle 4) y 5 minutos (Calle 5).

La Fig. 3 representa un análisis electroforético de los productos de ligadura de ADN obtenidos en el Ejemplo 3. Después de la adición de ADN ligasa de T4 a tubos que contenían oxalato de Mg, las mezclas de reacción fueron incubadas inicialmente a 30ºC durante 1 minuto (Calle 1), 2 minutos (Calle 2), durante 3 minutos (Calle 3), durante 5 minutos (Calle 4) y 10 minutos (Calle 5).

La Fig. 4 representa un análisis electroforético de productos de PCR amplificados a partir de 50 ng de ADN genómico humano. Se llevó a cabo un inicio caliente manual mediante la adición del enzima ADN polimerasa Taq (Calle 1, 0,5 U; Calle 2, 2,0 U) a 25 \mul de mezcla de reacción precalentada (94ºC, 5 minutos). La mezcla de reacción resultante fue sometida a las condiciones estándar de los ciclos de PCR (Calles 1 y 2). Con fines de comparación, mezclas de reacción completas de 25 \mul que contenían el enzima ADN polimerasa Taq (Calle 3, 0,5 U; Calle 4, 2,0 U) fueron añadidas a los tubos de reacción revestidos con polímero y sal y sometidas a las condiciones estándar de los ciclos de PCR (Calles 3 y 4).

La Fig. 5 representa un análisis electroforético de productos de amplificación obtenidos cuando se amplificaron 20 ng de ADN genómico del sapo sudafricano Xenopus laevis para producir un fragmento de 1,2 kb de una región promotora del gen XAC-2 de Xenopus laevis. Se utilizaron tubos de reacción convencionales (Calle 1) y revestidos (Calle 2) siguiendo las condiciones estándar de los ciclos de PCR.

Descripción detallada

Con el fin de proporcionar una comprensión clara y consistente de la especificación y las reivindicaciones, se proporcionan las siguientes definiciones.

Los términos "baja solubilidad en agua", "poco soluble" y "poco soluble en agua" son utilizados en la presente indistintamente para designar una sal con una solubilidad molar en agua menor de 1 x 10^{-3} moles/l aproximadamente a 25ºC.

"Reactivo enzimático iónico" y "reactivo iónico" se utilizan indistintamente en la presente para designar un cofactor iónico o un reactivo sustrato iónico necesario, pero no necesariamente suficiente, para activar un enzima (por sí mismo). El cofactor o sustrato iónico puede significar un reactivo catiónico incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, un ión metálico, o puede significar un reactivo aniónico, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, ATP, nucleótidos, nucleósidos, etc.

"Termoestable", "térmicamente estable" y "estable al calor" son utilizados indistintamente en la presente para describir enzimas que pueden soportar temperaturas de hasta al menos 95ºC durante varios minutos sin resultar desnaturalizados de manera irreversible. Típicamente, tales enzimas tienen una temperatura óptima superior a 45ºC, preferiblemente entre 50ºC y 75ºC.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición y un método para controlar un proceso enzimático en el cual un polímero sustancialmente insoluble en agua, permeable al agua, y una sal de magnesio de un reactivo enzimático iónico con una baja solubilidad en agua son combinados para proporcionar la liberación controlada del reactivo enzimático iónico. El polímero insoluble en agua/permeable al agua puede ser elegido para facilitar la(s) interacción(es) electrostática(s) con un grupo catiónico de la sal. Aunque no se tiene la intención de estar limitado, se cree que el polímero puede reducir los coeficientes de difusión de una sal poco soluble, retardando su distribución y liberación. En efecto, el polímero proporciona una barrera de difusión para la disociación y/o la liberación del reactivo enzimático iónico esencial a partir de la sal. La disociación y/o la liberación del reactivo enzimático iónico desde la sal al medio de reacción circundante puede estar determinada adicionalmente por las características físicas de la propia sal (por ejemplo, la solubilidad) o por condiciones de reacción que afecten a la solubilidad de la sal (por ejemplo, la temperatura, el tiempo y/o el pH). Mediante el control de la concentración y de las características de liberación de los reactivos enzimáticos iónicos, la presente invención proporciona un medio para controlar procesos enzimáticos, incluyendo, pero sin limitarse a, el comienzo de un proceso enzimático.

La composición puede comprender una mezcla de reacción que contenga un polímero sustancialmente insoluble en agua, permeable al agua, y una sal de magnesio poco soluble de un reactivo enzimático iónico para controlar procesos enzimáticos. La mezcla de reacción puede ser revestida sobre la pared de un recipiente de reacción proporcionado en un kit de reacción para controlar un proceso enzimático. El recipiente o el kit pueden incluir un primer recipiente de reacción que contenga la mezcla polímero/sal y pueden incluir además uno o más componentes de reacción adicionales para facilitar el proceso enzimático. Alternativamente, el kit de reacción puede incluir una pluralidad de recipientes de reacción adicionales, conteniendo cada uno de ellos al menos un componente de reacción adicional para facilitar un proceso enzimático.

Se proporcionan también métodos para preparar y utilizar recipientes de reacción para controlar un proceso enzimático, en los cuales un polímero insoluble en agua, permeable al agua, y una sal poco soluble de un reactivo enzimático iónico son añadidos a un recipiente de reacción. Etapas adicionales incluyen la incorporación de componente(s) de reacción adicional(es), incluyendo el enzima, y el ajuste de las condiciones de reacción para permitir el secuestro del reactivo enzimático iónico bajo una primera condición de reacción, y la liberación del reactivo enzimático iónico al medio de reacción circundante bajo una segunda condición de reacción (por ejemplo, una temperatura incrementada) para activar y/o completar un proceso enzimático.

Los polímeros de polivinil acetal son una clase preferida de polímeros insolubles en agua/permeables al agua para ser utilizados en la presente invención. Una realización particularmente preferida es un polímero de poli(vinil butiral), tal como poli(vinil butiral-co-alcohol vinílico-co-acetato de vinilo) (por ejemplo, el Producto Número 41.841-2 de Sigma Aldrich Co.). Este polímero puede ser producido mediante la condensación de poli(alcohol vinílico) con butiraldehído en presencia de un catalizador ácido, tal como ácido sulfúrico (ver "Textbook of Polymer Science", 3ª ed., F.W. Billmeyer (Ed.), John Wiley and Sons, Inc. 1984). La reacción puede ser llevada a cabo partiendo de una mezcla acuosa de poli(alcohol vinílico) y añadiendo butiraldehído y el catalizador ácido para formar un precipitado de poli(vinil butiral). Los grupos alcohol adyacentes reaccionan con el butiraldehído para formar enlaces éter ligados a una cadena de butilo alifático. La reacción de condensación puede ser parada cuando los grupos hidroxilo hayan reaccionado para formar un número suficiente de enlaces éter ligados.

Cuando se hace reaccionar poli(alcohol vinílico) con un aldehído en la reacción de condensación, una cadena alifática del butiraldehído se extiende desde el carbono de un enlace éter hasta los carbonos que se habían unido a los dos grupos alcohol reactivos anteriores. La extensión alifática puede ser representada por la fórmula C_{n}H_{2n+1}. Resinas alternativas dentro del ámbito de la presente invención pueden incluir otros poli(vinil acetales) en los cuales el poli(alcohol vinílico) se hace reaccionar con aldehídos diferentes del butiraldehído. Con butiraldehído, la cadena alifática unida tiene la fórmula C_{3}H_{7}. Sin embargo, el poli(alcohol vinílico) puede hacerse reaccionar también con otros aldehídos, tal como formaldehído, para producir una resina de poli(vinil formal) con una extensión C_{1}H_{3}. Pueden utilizarse otros aldehídos para producir otros polivinil acetales que tengan diferentes extensiones C_{n}H_{2n+1}. Pueden sintetizarse extensiones C_{n}H_{2n+1} adecuadas en las que n = 1-20.

Aunque sin intención de estar ligado a ninguna teoría, se cree que los polímeros insolubles en agua/permeables al agua de la presente invención proporcionan una barrera de difusión para la disponibilidad del reactivo enzimático iónico en un medio de reacción. Esta barrera puede ser electrostática y/o física. Por ejemplo, grupos cargados de la sal pueden mediar interacciones electrostáticas con el polímero insoluble en agua/permeable al agua, de tal manera que el reactivo enzimático iónico acomplejado es secuestrado preferencialmente por el polímero en una primera condición de reacción, pero liberado del polímero en una segunda condición de reacción. En particular, se cree que los átomos de oxígeno del anillo acetal de los polímeros poli(vinil) acetal facilitan interacciones electrostáticas con los grupos catiónicos (tales como Mg^{2+}) de las sales con una baja solubilidad en agua. Además, se cree que temperaturas incrementadas aumentan la permeabilidad de las sustancias asociadas con los polímeros insolubles en agua/permeables al agua. Por consiguiente, se cree que los polímeros insolubles en agua, permeables al agua de la presente invención proporcionan una barrera de difusión para las sales de los reactivos enzimáticos iónicos.

Un reactivo enzimático iónico que medie las interacciones electrostáticas con el polímero insoluble en agua, permeable al agua, puede ser necesario por sí mismo para iniciar o completar un proceso enzimático. Alternativamente, un contraión puede estar mediando la interacción electrostática con el polímero, influyendo de este modo indirectamente sobre la disociación y la liberación de un reactivo enzimático iónico implicado directamente en el proceso enzimático.

Los polímeros insolubles en agua, permeables al agua, de la presente invención pueden contener cantidades variables del monómero en un polímero dado. Por ejemplo, los polivinil acetales pueden contener entre un 5-40% de alcohol polivinílico aproximadamente, preferiblemente entre un 10-30% aproximadamente, más preferiblemente entre un 15-25% aproximadamente o, muy preferiblemente, entre un 15-20% de alcohol polivinílico aproximadamente. Los polivinil acetales pueden contener también menos de un 5% aproximadamente de poli(acetato de vinilo), menos de un 3% aproximadamente, entre un 0,3-2,5% aproximadamente o entre un 0,3-1,5% aproximadamente de poli(acetato de vinilo). Las proporciones de los monómeros de los polímeros insolubles en agua, permeables al agua, pueden ser ajustadas para optimizar la liberación controlada de los reactivos enzimáticos iónicos.

Ejemplos de polivinil acetales incluyen polivinil butiral, polivinil polivinil formal, combinaciones, mezclas y copolímeros de los mismos, etcétera. Pueden incorporarse también a los polímeros de la presente invención resinas poliméricas que contengan ésteres de alquilo, tales como ésteres de polivinilo y poliésteres de alquilo. Ejemplos de ésteres de polivinilo incluyen acetato de polivinilo, butirato de polivinilo, etc. Ejemplos de poliésteres de alquilo incluyen, pero no se limitan a, poli(láctido), poli(glicólido), copolímeros de los mismos, etcétera.

Los poli(alcoholes vinílicos) utilizados para sintetizar los polímeros de la presente invención pueden ser además producidos para que incluyan monómeros con estructuras semejantes a acetato con el fin de optimizar adicionalmente las características físicas y químicas del polímero resultante. Por ejemplo, el acetato de vinilo puede ser polimerizado para formar poli(acetato de vinilo), un precursor del poli(alcohol vinílico) en la formación de, por ejemplo, poli(vinil butiral-co-alcohol vinílico-co-acetato de vinilo). Sin embargo, otros monómeros pueden ser copolimerizados con acetato de vinilo incluyendo, pero sin limitarse a, acrilonitrilo, poliacilonitrilo, acrilamida, ácido acrílico, ácido metacrílico, metacrilato, metacrilato de metilo, metacrilato de 2-hidroxi etilo, metacrilato de glicidilo, dimetacrilato de etilén glicol, combinaciones, mezclas y copolímeros de los mismos, etcétera.

Están incluidos dentro del ámbito de la presente invención los polímeros insolubles en agua, permeables al agua, descritos y preparados según la descripción mostrada en la Patente de EE.UU. Nº 4.247.498. Polímeros insolubles en agua, permeables al agua, adecuados para ser utilizados en la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a, poliolefinas no acrílicas tales como polietileno de baja densidad, polietileno de alta densidad, polipropileno, poliestireno, cloruro de polivinilo, terpolímeros de acrilonitrilo-butadieno-estireno, copolímeros de estireno-acrilonitrilo, copolímeros de estireno butadieno, poli(4-metil-penteno-1), polibutileno, cloruro de polivinilideno, polivinil butiral, polietileno clorado, copolímeros de etileno-acetato de vinilo, acetato de polivinilo, alcohol polivinílico y combinaciones y mezclas de los mismos; poliolefinas acrílicas, tales como polimetil-metacrilato, polimetil-acrilato, copolímeros de etileno-ácido acrílico, copolímeros de etileno-sal metálica del ácido acrílico y combinaciones y mezclas de los mismos; polímeros de oxidación, incluyendo óxido de polifenileno; y polímeros de condensación, incluyendo tereftalato de polietileno, tereftalato de polibutileno, Nailon 6, Nailon 11, Nailon 13, Nailon-6,6, policarbonatos, polisulfona y combinaciones y mezclas de los mismos.

Están incluidos además dentro del ámbito de la invención los polímeros insolubles en agua, permeables al agua, de liberación controlada descritos y preparados según las descripciones mostradas en la Patente de EE.UU. Nº 5.580.573. Polímeros insolubles en agua, permeables al agua, adecuados para ser utilizados en la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a, poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de n-propilo) y poli(metacrilato de isobutilo).

Están también incluidos dentro del ámbito de la invención los polímeros cristalizables insolubles en agua, permeables al agua, con cadenas laterales controlados por la temperatura, descritos y preparados y/o entrecruzados de acuerdo con las descripciones mostradas en la Patente de EE.UU. Nº 4.830.855. Polímeros insolubles en agua, permeables al agua adecuados para ser utilizados en la presente invención pueden incluir, pero sin limitarse a, polímeros cristalizables con cadenas laterales (denominados algunas veces polímeros "similares a un peine"; revisados en J. Poly. Sci.: Macromol. Rev. (1974) 8: 117-253) o polímeros cristalizables con cadenas laterales entrecruzados, sustancialmente impermeables a agentes por debajo de la temperatura de fusión pero sustancialmente permeables a agentes por encima de la temperatura de fusión, incluyendo, pero sin limitarse a, poli(estearato de vinilo) (PVS) recristalizado, acrilato de polioctadecilo (PODA), Elvax 40, Elvax 250, polimetiltetradecil siloxano; acrilato, fluoroacrilato, metacrilato y polímeros de ésteres de vinilo (descritos también en J. Poly. Sci. (1972) 10: 3347; J. Poly. Sci. (1972) 10: 1657; J. Poly. Sci. (1971) 9: 3367; J. Poly. Sci. (1971) 9: 3349; J. Poly. Sci. (1971) 9: 1835; J.A.C.S. (1954) 76: 6280; J. Poly. Sci. (1969) 7: 3053; Polymer J. (1985) 17: 991); las acrilamidas correspondientes, polímeros de acrilamida y maleimida sustituidas (descritos también en J. Poly. Sci., Poly. Physics Ed. (1980) 18: 2197); polímeros de polialfaolefina (descritos también en J. Poly. Sci.: Macromol. Rev. (1974) 8: 117-253 y Macromolecules (1980) 13: 12); polialquilviniléteres, óxidos de polialquiletileno (descritos también en Macromolecules (1980) 13: 15); polímeros de alquilfosfaceno, poliaminoácidos (descritos también Poly. Sci. USSR (1979) 21: 241, Macromolecules (1985) 18: 2141); poliisocianatos (descritos también en Macromolecules (1979) 12: 94); poliuretanos producidos mediante la reacción de monómeros que contienen amina o alcohol con isocianatos de alquilo de cadena larga, poliésteres y poliéteres, polisiloxanos y polisilanos (descritos también en Macromolecules (1986) 19: 611) y polímeros de p-alquilestireno (descritos también en J.A.C.S. (1953) 75: 3326 y J. Poly. Sci. (1962) 60: 19).

La cantidad de polímero para ser utilizada en un recipiente de reacción puede depender del tamaño del recipiente de reacción y del volumen de la mezcla de reacción. Pequeños tubos de reacción (por ejemplo, tubos Eppendorf de 20, 50, 100, 200, 500 \mul) para reacciones de PCR que implican volúmenes de reacción de, por ejemplo, 100 \mul, pueden tener espacio para un rango de cantidades de resina. A manera de ejemplo, las resinas de poli(vinil butiral) (por ejemplo, poli(vinil butiral-co-alcohol vinílico-co-acetato de vinilo) para PCR pueden emplear 0,02-2,5 mg-, preferiblemente 0,03-1,0 mg- y aún más preferiblemente 0,3-0,5 mg- o 0,03-0,10 mg/tubo de reacción/100 \mul de volumen de reacción. Otras cantidades de polímero sustancialmente insoluble en agua, permeable al agua, pueden ser extrapoladas de estas cantidades, o pueden ser determinadas empíricamente por los expertos en la técnica sobre la base de una variedad de factores, incluyendo, pero sin limitarse a, el volumen de la reacción enzimática, la cantidad de reactivo iónico libre necesaria para la reacción enzimática, las características de liberación de sal del polímero, las características de solubilidad y disociación de la sal, las características de liberación y disociación de la sal como función de la temperatura y/o del pH, del peso molecular del polímero, etc.

Pueden prepararse soluciones madre de los polímeros insolubles en agua, permeables al agua, disolviendo el polímero en un solvente adecuado. Puede prepararse un rango de concentraciones de la resina incluyendo, pero sin limitarse a, 1,5-50 mg/ml. Una concentración preferida es 10-20 mg/ml. Solventes adecuados para suspender los polímeros insolubles en agua, permeables al agua, incluyen cloroformo, etanol, ácido acético glacial, acetona, cloruro de metileno, DMSO, etcétera. El cloroformo y el etanol son solventes particularmente preferidos para las resinas de poli(vinil butiral), tales como poli(vinil butiral-co-alcohol vinílico-co-acetato de vinilo).

Las sales para ser utilizadas en la presente invención incluyen sales de reactivos enzimáticos iónicos esenciales que tienen una baja solubilidad en agua con el fin de facilitar el secuestro o la liberación del reactivo iónico a partir del polímero de manera controlada, dependiendo de condiciones de la reacción enzimática tales como la temperatura, el tiempo de incubación y/o el pH. Los reactivos enzimáticos iónicos se convierten de manera temporal en insolubles en agua mediante la formación de complejos con contraiones catiónicos o aniónicos. Los cationes o aniones pueden ser monoméricos o poliméricos.

Los reactivos catiónicos para ser utilizados en ciertos aspectos de la presente invención pueden incluir cationes libres monovalentes, divalentes o polivalentes, incluyendo, pero sin limitarse a, iones metálicos de magnesio, manganeso, cadmio, calcio, cromo, cobalto, cobre, hierro, plomo, mercurio, molibdeno, níquel o zinc. Los reactivos catiónicos preferidos de esta lista incluyen, pero no se limitan a, Mg^{2+}, Mn^{2+}, Zn^{2+}, Ca^{2+}, Cd^{2+}, Cu^{2+}, Co^{2+}, Cr^{2+}, Cr^{3+}, Cr^{6+}, Ni^{2+}, Ni^{3+}, Pb^{2+}, Pb^{4+}, Fe^{2+}, Fe^{3+} y Hg^{2+}. Los reactivos catiónicos monovalentes adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, Na^{+}, K^{+}, NH_{4}^{+}. Otros reactivos catiónicos pueden incluir NAD^{+}, NADP^{+}, etcétera.

Puede hacerse que los cationes sean menos solubles en agua mediante la formación de complejos con aniones, incluyendo, pero sin limitarse a, haluro, nitrato, citrato, maleato, sulfato, acetato, oxalato, malonato, succinato, glutarato, fumarato, benzoato, ftalato, isoftalato, tereftalato, malato, tartrato, pirofosfato, formato, isocitrato, etiléndinitrilotetra-acetato, tetracarboxilato de 1,2,3,4-butano, benzoato, hemimelitato, trimelitato, trimesato, piromelitato, melitato, mesaconato, 2-naftilénsulfonato mesaconato (napsilato), gluconato, ácido 1,1'-metilén bis(2-hidroxi-3-naftaleno) carboxílico (pamoato), tolilsulfonato (tosilato), metanosulfonato (mersilato), glucoheptanoato (gluceptato), bitartrato, ácido poliglutámico y/o behenato (forma aniónica de un ácido graso ceroso).

Los reactivos aniónicos pueden incluir diferentes nucleósidos o derivados de nucleósidos incluyendo, pero sin limitarse a, ATP, ADP, pirofosfato, nucleótidos, desoxinucleótidos, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, didesoxirribonucleótidos, oligonucleótidos, Coenzima A, radicales aniónicos, etcétera.

Puede hacerse que los reactivos aniónicos sean menos solubles en agua mediante la formación de complejos con cationes, pero sin limitarse a, iones metálicos, calcio, magnesio o sus sales de ácidos grasos 1:1; varias aminas, incluyendo bibenciletiléndiamina (benzatina), N,N'-(dihidroabietil)etiléndiamina (hidrabamina) o polímeros tales como polilisina.

Las sales para ser utilizadas en la presente invención tienen baja solubilidad en agua. Las sales pueden tener solubilidades molares en agua a 25ºC menores de 1 x 10^{-3} aproximadamente, menores de 1 x 10^{-4} moles/l aproximadamente o menores de 1 x 10^{-5} moles/l aproximadamente. Preferiblemente, la solubilidad de la sal está entre 1 x 10^{-3} moles/l y 1 x 10^{-8} moles/l aproximadamente, entre 5 x 10^{-4} moles/l y 5 x 10^{-5} moles/l aproximadamente, entre 1 x 10^{-5} moles/l y 1 x 10^{-6} moles/l o una combinación de rangos de solubilidad de los mismos.

Preferiblemente, las sales presentan una solubilidad en agua dependiente de la temperatura, donde el incremento de la solubilidad en agua entre 15ºC-60ºC o 25ºC-50ºC es al menos de 2 veces, preferiblemente de 4 veces o incluso de 10 veces, o donde el incremento de la solubilidad en agua entre 15ºC-100ºC o 25ºC-90ºC es al menos de 4 veces, preferiblemente de al menos 10 veces o incluso de 30 veces.

La alteración de las condiciones de reacción (incremento de los tiempos de incubación, incremento de la temperatura o un cambio del pH) puede afectar a la solubilidad de la sal por extensión, disociación y/o liberación de iones libres. Por consiguiente, las sales pueden ser seleccionadas sobre la base de su tasa de disociación en un medio de reacción enzimático. En un aspecto específico, las sales pueden ser seleccionadas sobre la base de su capacidad para retener reactivos enzimáticos iónicos en un estado acomplejado a una temperatura más baja (con el fin de impedir una actividad enzimática apreciable o detectable), y para estimular la disociación y/o liberación de los reactivos enzimáticos iónicos libres a una temperatura más elevada con el fin de activar y completar el proceso enzimático (siempre que todos los demás componentes de la reacción necesarios estén presentes en el medio de reacción).

Las sales pueden incluir formas anhidras o formas hidratadas, tales como hemihidratos, dihidratos, trihidratos, etcétera. Sales con las características anteriores están descritas en, por ejemplo, el CRC Handbook of Chemistry and Physics, 82ª Edición, D.R. Lide (ed.), The Chemical Rubber Company, 2001. Pueden utilizarse metodologías convencionales conocidas por los expertos en la técnica para determinar o verificar las solubilidades empíricamente.

Las sales pueden ser suspendidas en las suspensiones de la resina polimérica y/o revestidas sobre la pared de un recipiente de reacción o sobre una superficie de reacción mediante liofilización. Los componentes adicionales de la reacción (por ejemplo, enzimas, sustratos, etc.) pueden ser incorporados a las suspensiones y/o a los revestimientos de las paredes.

Las sales preferidas para ser utilizadas con los enzimas dependientes de magnesio incluyen, pero no se limitan a, sulfito de magnesio (MgSO_{3}), oxalato de magnesio (MgC_{2}O_{4}), fluoruro de magnesio (MgF_{2}), tungstato de magnesio (MgWO_{4}) y combinaciones de las mismas.

En otros aspectos no limitados a sales de magnesio, las sales preferidas para ser utilizadas con los enzimas dependientes de manganeso incluyen, pero no se limitan a, yodato de manganeso II (Mn(IO_{3})_{2}), oxalato de manganeso II (MnC_{2}O_{4}), tungstato de manganeso II (MnWO_{4}) y combinaciones de las mismas.

Las sales preferidas para ser utilizadas con los enzimas dependientes de calcio incluyen, pero no se limitan a, tungstato de calcio (CaWO_{4}), hidrógeno fosfato de calcio (CaHPO_{4}), sulfito de calcio (CaSO_{3}), fluoruro de calcio (CaF_{2}), carbonato de calcio (CaCO_{3}), oxalato de calcio (CaC_{2}O_{4}), hidróxido de calcio (Ca(OH)_{2}), yodato de calcio (Ca(IO_{3})_{2}) y combinaciones de las mismas.

Las sales preferidas para ser utilizadas con los enzimas dependientes de cobre incluyen, pero no se limitan a, fluoruro de cobre II (CuF_{2}), yodato de cobre II (Cu(IO_{3})_{2}, molibdato de cobre II (CuMoO_{4}), cloruro de cobre I (CuCl), oxalato de cobre II (CuC_{2}O_{4}), bromuro de cobre I (CuBr) y combinaciones de las mismas.

Las sales preferidas para ser utilizadas con los enzimas dependientes de hierro incluyen, pero no se limitan a oxalato de hierro II (FeC_{2}O_{4}), fluoruro de hierro II (FeF_{2}) y combinaciones de las mismas.

Las sales preferidas para ser utilizadas con los enzimas dependientes de plomo incluyen, pero no se limitan a, bromuro de plomo II (PbBr_{2}), fluoruro de plomo II (PbF_{2}), yoduro de plomo II (PbI_{2}), tiocianato de plomo II (Pb(SCN)_{2}),
tungstato de plomo II (PbWO_{4}), sulfato de plomo II (PbSO_{4}), oxalato de plomo II (PbC_{2}O_{4}) y combinaciones de las mismas.

Una sal preferida para los enzimas dependientes de molibdeno incluye, pero no se limita a, óxido de molibdeno VI (MoO_{3}).

Las sales preferidas para ser utilizadas con los enzimas dependientes de níquel incluyen, pero no se limitan a, yodato de níquel II (Ni(IO_{3})_{2}), carbonato de níquel II (NiCO_{3}) y combinaciones de las mismas.

Las sales preferidas para ser utilizadas con los enzimas dependientes de potasio incluyen, pero no se limitan a, peryodato de potasio (KIO_{4}).

Las sales preferidas para ser utilizadas con los enzimas dependientes de sodio incluyen, pero no se limita a, telurato de sodio (Na_{2}TeO_{4}), hexafluorosilicato de sodio (Na_{2}SiF_{6}) y combinaciones de las mismas.

Las sales preferidas para ser utilizadas con los enzimas dependientes de zinc incluyen, pero no se limita a, yodato de zinc (Zn(IO_{3})_{2}), sulfito de zinc (ZnSO_{3}), oxalato de zinc (ZnC_{2}O_{4}) y combinaciones de las mismas.

Pueden utilizarse otras sales para controlar los procesos enzimáticos, siempre que tengan una baja solubilidad en agua y puedan proporcionar una liberación controlada desde el polímero. Preferiblemente, las sales presentan solubilidades incrementadas a temperaturas más elevadas.

El oxalato de magnesio (MgC_{2}O_{4}) es una sal particularmente preferida para los procesos enzimáticos dependientes de Mg^{2+}, tales como la PCR. El MgC_{2}O_{4} es difícil de disolver en agua a la vista de su baja solubilidad a temperatura ambiente. Por ejemplo, a 18ºC, el MgC_{2}O_{4} tiene una solubilidad en agua de 5,7 x 10^{-4} moles/l. Sin embargo, el MgC_{2}O_{4} es casi 10 veces más soluble a 100ºC (5,4 x 10^{-3} moles/l; Ignatov y col., Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol. 29, Nº 4, pp. 368-371, 2003). Por consiguiente, una composición que contenga una sal de magnesio poco soluble (tal como MgC_{2}O_{4}) y un polímero sustancialmente insoluble en agua, permeable al agua, puede incrementar la especificidad de las reacciones de PCR impidiendo la liberación de Mg^{2+} libre a temperaturas más bajas (para activar la ADN polimerasa Taq), a la vez que estimula la liberación dependiente de la temperatura de iones magnesio libres (por ejemplo, a 72ºC) y la selección de cebadores unidos específicamente para la extensión catalizada por la ADN polimerasa Taq.

La cantidad de sal en la composición de la presente invención dependerá de, por ejemplo, la cantidad de reactivo enzimático iónico libre requerida para un proceso enzimático particular. Las condiciones enzimáticas están publicadas extensamente y están disponibles de forma rutinaria para los expertos en la técnica. Además, pueden ser determinadas empíricamente y/u optimizadas de forma rutinaria. Por consiguiente, cuando se busca controlar una actividad enzimática, las cantidades de sal pueden ser determinadas empíricamente sobre la base del grado de secuestro de la sal por el polímero, de la solubilidad de la sal, de la cantidad de reactivo enzimático iónico libre necesaria para el proceso enzimático y/o de los efectos de las condiciones de reacción (por ejemplo, la temperatura, el pH, etc.) sobre los anteriores.

Para los procesos de PCR que emplean enzimas ADN polimerasa estables al calor, la cantidad de sal de magnesio asociada con el polímero puede ser determinada empíricamente y puede depender de una variedad de factores incluyendo, pero sin limitarse a, el volumen de la reacción enzimática, la cantidad de Mg^{2+} libre necesaria para el volumen de la reacción enzimática, las características de liberación de sal del polímero, la solubilidad y las características de disociación de la sal, las características de liberación y disociación de la sal como función de la temperatura y/o el pH, el peso molecular de la sal, etc. Tubos de reacción pequeños (por ejemplo, tubos Eppendorf de 20, 50, 100, 200, 500 \mul) para reacciones de PCR pueden tener espacio para un rango de cantidades de la sal de magnesio. A manera de ejemplo, cuando el polímero es poli(vinil butiral-co-alcohol vinílico-co-acetato de vinilo), la cantidad de oxalato de magnesio para las reacciones de PCR puede variar de 0,003-10 mg por tubo de reacción por 100 \mul de volumen de reacción. Una cantidad preferida de oxalato de magnesio/tubo de reacción/por 100 \mul de volumen de reacción puede ser 0,1 - 5 mg-, más preferiblemente 0,1 - 0,5 mg- y aún más preferiblemente 0,1 mg/tubo de reacción/100 \mul de volumen de reacción. Cantidades molares equivalentes pueden ser determinadas para otras sales de magnesio poco solubles dependiendo de, por ejemplo, los factores descritos anteriormente y pueden ser optimizadas adicionalmente mediante una determinación empírica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un recipiente de reacción o un kit de reacción para controlar un proceso enzimático. El recipiente o el kit puede incluir un primer recipiente de reacción conteniendo un polímero insoluble en agua/permeable al agua y un cofactor enzimático iónico en forma de una sal de magnesio de un reactivo enzimático necesario para completar un proceso enzimático. El primer recipiente de reacción puede incluir además uno o más componentes adicionales de la reacción para facilitar el proceso enzimático. Alternativamente, el kit de reacción puede incluir una pluralidad de recipientes de reacción adicionales, conteniendo cada uno de ellos al menos un componente adicional de la reacción para facilitar un proceso enzimático.

La composición puede ser revestida sobre la pared de un recipiente de reacción (tal como un tubo, pocillo o placa). El polímero y la sal pueden ser suspendidos en un solvente adecuado, por ejemplo cloroformo. En una realización particularmente preferida, la suspensión polímero/sal es revestida sobre la superficie de la pared de un recipiente de reacción mediante liofilización.

El recipiente de reacción revestido puede ser un tubo de reacción pequeño, tal como un tubo Eppendorf (con capacidades de volumen de reacción de, por ejemplo, 20, 50, 100, 200, 500 \mul, etc.), o puede ser un tubo más grande, tal como un tubo de ensayo, cuando se deseen niveles preparativos. El recipiente de reacción revestido puede ser también una placa de microvaloración conteniendo una pluralidad de pocillos, cada pocillo revestido con una mezcla polímero/sal. El recipiente de reacción revestido puede ser también un portaobjetos útil en las tecnologías de microarrays. El tamaño del recipiente o del tubo de reacción puede ser modificado, dependiendo del alcance o de la sensibilidad del proceso enzimático. Esencialmente, puede utilizarse cualquier forma o tamaño del recipiente, de acuerdo con los procedimientos enzimáticos convencionales.

Las cantidades óptimas de resina/sal para revestir un recipiente de reacción pueden ser determinadas empíricamente para una aplicación dada, y dependerán de los requerimientos del reactivo iónico para un proceso enzimático particular. En una realización preferida, una suspensión de polímero/sal (por ejemplo, en cloroformo) es añadida a un recipiente de reacción y secada. La suspensión puede ser posteriormente secada al aire. Alternativamente, puede ser secada bajo presión tras vacío (por ejemplo, speed vac) y/o secada durante, por ejemplo, 10 minutos a 50ºC o a una temperatura superior.

El recipiente de reacción revestido puede ser parte de un kit de reacción que contenga además uno o más componentes de reacción para facilitar un proceso enzimático. En un aspecto, el contenido de un tubo de reacción revestido puede ser resuspendido en un medio de reacción que contenga uno o más componentes de reacción adicionales para facilitar un proceso enzimático. Los componentes de reacción adicionales pueden incluir, por ejemplo, tampones enzimáticos, sales, cofactores y/o sustratos para completar un proceso enzimático. A manera de ejemplo, los procesos de PCR de acuerdo con la presente invención pueden incluir al menos una ADN polimerasa, desoxirribonucleósidos trifosfato, al menos dos cebadores, al menos una secuencia de ácido nucleico diana o combinaciones de los mismos. Pueden incorporarse componentes de reacción adicionales, incluyendo marcadores o colorantes (por ejemplo bioluminiscentes, quimioluminiscentes, etc.) con el fin de proporcionar una lectura cualitativa o cuantitativa del proceso enzimático.

Los componentes de reacción adicionales pueden ser incluidos en el recipiente de reacción revestido antes de la resuspensión, o pueden estar contenidos en uno o más recipientes de reacción adicionales suministrados en un kit de reacción dado. De este modo, un kit de reacción dado puede incluir una pluralidad de recipientes de reacción adicionales, conteniendo cada uno de ellos al menos un componente de reacción adicional para facilitar un proceso enzimático.

Los recipientes de reacción revestidos con las mezclas de polímero/sal pueden ser utilizados indistintamente con una variedad de enzimas que tengan diferentes requisitos de cofactor/sustrato para obtener una actividad óptima. Se ha observado que la ADN polimerasa Taq requiere menores cantidades de Mg^{2+} para una actividad óptima en PCR (1,5-3,0 mM) en comparación con otros enzimas polimerasa para PCR, tales como Klentaq, que requieren típicamente concentraciones mayores de Mg^{2+} libre (por ejemplo, 3-4 mM). Por consiguiente, pueden añadirse sales adicionales a un medio de reacción con el fin de influir sobre la disociación y/o liberación del reactivo enzimático iónico necesario para la reacción enzimática. Típicamente, la sal adicional comparte un anión común con la primera sal poco soluble que puede servir para el ajuste preciso (o para la reducción) de los niveles totales de sal iónica disponible libremente para conducir el proceso enzimático.

El oxalato de amonio ((NH_{4})_{2}C_{2}O_{4}) es una sal ejemplar que puede ser utilizada junto con sales que contengan oxalato, tal como MgC_{2}O_{4}, para el ajuste preciso del nivel del reactivo enzimático iónico liberado para un proceso enzimático. A 25ºC, la solubilidad en agua del (NH_{4})_{2}C_{2}O_{4} es 124 veces mayor en comparación con el MgC_{2}O_{4}. Por consiguiente, la adición de sales de oxalato más solubles, por ejemplo (NH_{4})_{2}C_{2}O_{4}, puede proporcionar un efecto de equilibrio sobre la concentración final de los Mg^{2+} liberados de la sal MgC_{2}O_{4} poco soluble.

A manera de ejemplo, puede incluirse (NH_{4})_{2}C_{2}O_{4} en un medio de reacción enzimático para optimizar los niveles de los iones Mg^{2+} disponibles libremente para controlar, en este caso, un proceso enzimático dependiente de Mg^{2+}, tal como la PCR. En un ejemplo, puede incluirse (NH_{4})_{2}C_{2}O_{4} a una concentración final de, por ejemplo, 10-12 mM para reducir la cantidad efectiva de Mg^{2+} disponibles libremente liberados en ciertas reacciones de PCR de inicio caliente que implican a la, por ejemplo, ADN polimerasa Taq, que requiere una menor concentración de Mg^{2+} que Klentaq.

La sal secundaria puede ser proporcionada en forma de un concentrado de tampón de reacción. Por ejemplo, un tampón de reacción 10x adecuado para ser utilizado en asociación con mezclas de resina polimérica/MgC_{2}O_{4} para reacciones de PCR, puede incluir KCl 300 mM, Tris-HCl 200 mM (pH = 9,0 a 25ºC), (NH_{4})_{2}C_{2}O_{4} 100 mM, Triton X-100 1%. Los tampones de la sal secundaria para utilización con otras sales y/o para controlar otros procesos enzimáticos pueden ser preparados de manera análoga. En general, el tampón será compatible con las condiciones de la reacción enzimática e incluirá una sal más soluble (secundaria) que comparta un contraión común con la sal poco soluble del reactivo iónico atrapada por el polímero.

En un aspecto adicional, las composiciones, los recipientes o kits de reacción de la presente invención son utilizados en métodos para controlar un proceso enzimático en el que una composición conteniendo un polímero insoluble en agua, permeable al agua, y una sal poco soluble conteniendo un reactivo enzimático iónico, son puestas en contacto con el(los) componente(s) adicional(es) de la reacción en un medio de reacción acuoso, que incluya al menos un enzima. La composición de los componentes de la reacción y las condiciones de la reacción (temperatura, pH, etc) son ajustadas para permitir el secuestro del reactivo enzimático iónico bajo una primera condición de reacción y la liberación del reactivo enzimático iónico al medio de reacción circundante bajo una segunda condición de reacción (por ejemplo, una temperatura incrementada) con el fin de activar y/o completar un proceso enzimático.

Los procesos enzimáticos preferidos incluyen aquéllos que requieren un reactivo enzimático iónico que puede ser formulado en una sal. El reactivo enzimático iónico puede ser un cofactor necesario para iniciar o completar un proceso enzimático, tal como un ión metálico. Sin embargo, una sal del reactivo iónico puede incluir también un ión metálico que no esté implicado directamente en el proceso enzimático. En este caso, el ión metálico puede afectar solamente a la disociación y/o liberación desde el polímero de un contraión (por ejemplo, ATP, Coenzima A, etc.) implicado directamente en el proceso enzimático.

Los iones metálicos participan en numerosos procesos metabólicos y desempeñan funciones esenciales en un tercio aproximadamente de los enzimas (para revisiones, ver, por ejemplo, Nelson, EMBO J., Vol. 18, Nº 16, pp. 4361-4371, 1999; Glusker y col., Rigaku K., Vol. 16, Nº 2, 1999). Ejemplos de iones metálicos requeridos para varios procesos enzimáticos incluyen, pero no se limitan a, Mg^{2+}, Mn^{2+}, Zn^{2+}, Ca^{2+}, Cd^{2+}, Cu^{2+}, Co^{2+}, Cr^{2+}, Cr^{3+}, Cr^{6+}, Ni^{2+}, Ni^{3+}, Pb^{2+}, Pb^{4+}, Fe^{2+}, Fe^{3+} y Hg^{2+}. La liberación controlada del ión metálico (o por extensión, de su contraión) puede ser proporciona por la incorporación de una sal de un ión metálico poco soluble en agua.

En un aspecto, la presente invención proporciona métodos y recipientes de reacción para controlar un proceso enzimático. Los enzimas preferidos incluyen los utilizados en aplicaciones de biología molecular. Puede encontrarse información adicional relacionada con enzimas para aplicaciones de biología molecular en, por ejemplo, "LabFax: Molecular Biology", T.A. Brown (Ed.), Academic Press, 1991; "Methods in Molecular Biology: Vol. 16 - Enzymes of Molecular Biology", M.M. Burrell (Ed.), Humana Press, 1993; y "Current Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel y col. (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., 1998).

En una realización preferida, la presente invención proporciona métodos y recipientes de reacción para controlar enzimas dependientes de Mg^{2+}. A manera de ejemplo, envolviendo la sal poco soluble en agua que contiene Mg^{2+}, tal como oxalato de magnesio, en un polímero insoluble en agua, permeable al agua, tal como poli(vinil butiral-co-alcohol vinílico-co-acetato de vinilo), la presente invención puede proporcionar la liberación controlada, regulada por la temperatura, de iones Mg^{2+} libres para procesos enzimáticos dependientes de Mg^{2+}, tal como la PCR. Así, además del requisito de una temperatura incrementada para la liberación de iones Mg^{2+} libres, el polímero proporciona un medio adicional para controlar la disponibilidad de iones Mg^{2+} libres para activar y/o completar el proceso enzimático. Preferiblemente, cantidades apreciables de iones Mg^{2+} no son liberadas hasta después de que la mezcla de reacción haya sido incubada durante al menos cinco minutos a 94ºC.

Los enzimas dependientes de Mg^{2+} que pueden ser controlados de acuerdo con la presente invención, incluyen una variedad de miembros enzimáticos o especies enzimáticas definidos por las diferentes clases genéricas de enzimas, incluyendo ADN polimerasas, ARN polimerasas, transcriptasas inversas, ADN ligasas, endonucleasas, endonucleasas de restricción, quinasas y proteasas. Los enzimas dependientes de Mg^{2+} pueden proceder de una amplia variedad de fuentes animales, bacterianas o víricas, y pueden ser sintetizados a partir de estructuras genéticas nativas o de variantes modificadas genéticamente mediante, por ejemplo, mutagénesis, o modificadas genéticamente para expresar proteínas de fusión que lleven múltiples dominios funcionales distintos.

Ejemplos adicionales de enzimas dependientes de Mg^{2+} incluyen ADN polimerasas, tales como el fragmento Klenow y ADN Pol I; transcriptasas inversas (RT), tales como la RT del VMA y la RT del VLMM; la mayoría de las endonucleasas de restricción; ribonucleasas, tales como la ARNasa H; y topoisomerasas tales como la Topoisomerasa I.

Algunos enzimas pueden utilizar alternativamente otros iones metálicos en lugar de Mg^{2+}. Por ejemplo, las ARN polimerasas tales como la ARN polimerasa I o las ARN polimerasas T7, SP6 y T4 pueden utilizar Mg^{2+} o Mn^{2+}. La nucleasa Bal31 puede utilizar Mg^{2+} o Ca^{2+}. La ADN polimerasa I puede utilizar una variedad de diferentes iones metálicos, incluyendo Mg^{2+}, Mn^{2+}, Ca^{2+}, Co^{2+} o Zn^{2+}.

Los enzimas para ser utilizados en la presente invención pueden ser seleccionados o producidos preferiblemente sobre la base de la retención de la estabilidad enzimática bajo un rango de condiciones de reacción que afectan a la liberación de los reactivos enzimáticos iónicos, incluyendo altas temperaturas y/o diferentes condiciones del pH (alto/bajo, etc.). Enzimas particularmente preferidos incluyen enzimas termoestables y/o resistentes al pH.

Enzimas termoestables pueden ser aislados de fuentes bacterianas termofílicas (por ejemplo, del género termofílico Thermus) o pueden ser aislados y preparados mediante medios recombinantes. Especies representativas del género Thermus incluyen T. aquaticus, T. thermophilus, T. rubber, T. filiformis, T. brockianus y T. scotoductus. Los enzimas termoestables para ser utilizados en la presente invención pueden derivar de un amplio rango de tipos enzimáticos.

Ejemplos de enzimas termoestables para ser utilizados en la presente invención incluyen, pero no se limitan a: ADN polimerasas termoestables descritas en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.889.819, 5.079.352, 5.192.674, 5.374.553, 5.413.926, 5.436.149, 5.455.170, 5.545.552, 5.466.591, 5.500.363, 5.614.402, 5.616.494, 5.736.373,
5.744.312, 6.008.025, 6.027.918, 6.033.859, 6.130.045, 6.214.557; transcriptasas inversas termoestables descritas en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.998.195 y en U.S. 2002/0090618; fosfatasas termoestables descritas en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.633.138, 5.665.551, 5.939.257; ligasas termoestables descritas en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.494.810, 5.506.137, 6.054.564 y 6.576.453; proteasas termoestables descritas en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.215.907, 5.346.820, 5.346.821, 5.643.777, 5.705.379, 6.143.517, 6.294.367, 6.358.726, 6.465.236; topoisomerasas termoestables descritas en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.427.928 y 5.656.463; ribonucleasas termoestables descritas en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.459.055 y 5.500.370; beta-galatosidasas termoestables descritas en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.432.078 y 5.744.345; endonucleasas de restricción termoestables incluyendo, por ejemplo, Acc III, Acs I/Apo I, Acy I, Bco I, BsaBI/BsiBI, BsaMI, BsaJI, BsaOI, BsaWI, BscBI, BscCI, BscFI, BseAI, BsiC1, BsiE1, Bsi HKAJ, BsiLI, BsiMI, BsiQI, BsiWI, BsiXI, BsiZI, Bsi I, Bsm I, BsmAI, BsmBI, Bss, T11, Bsr1, BsrD1, Bsi711, BsiB1, BsiN1, BsiU1, BsiY1, BsiZ1, Dsa 1, Mae 11, Mae 111, Mwo 1, Ssp B1, Taq I, Taq II, Taq52I, Tfi I, Tru91, TspE1, TspRI, Tsp45 I, Tsp4C I, Tsp509 I, Tth111 II; la endonucleasa Flap descrita en la Patente de EE.UU. Nº 6.251.649; y FLPe, una recombinasa termoestable mutante de Flp (Bucholz y col., Nature Biotechnology, Vol. 16, pp. 657-662,
1998).

Los enzimas dependientes de Mg^{2+} preferidos incluyen, pero no se limitan a, enzimas térmicamente estables. Los enzimas termoestables dependientes de Mg^{2+} pueden incluir ADN polimerasas, ARN polimerasas, transcriptasas inversas, ADN ligasas, endonucleasas, endonucleasas de restricción, quinasas y proteasas termoestables, incluyendo, pero sin limitarse a, los enzimas mencionados anteriormente. Los enzimas térmicamente estables pueden ser aislados de fuentes bacterianas termofílicas o pueden ser aislados y preparados por medios recombinantes.

Las ADN polimerasas preferidas para ser utilizadas en aplicaciones de PCR incluyen ADN polimerasas térmicamente estables y/o combinaciones de las mismas. Las ADN polimerasas térmicamente estables pueden incluir, pero no se limitan a, ADN polimerasa de Thermus aquaticus, deleciones N-terminales de la polimerasa Taq, incluyendo el fragmento Stoffel de la ADN polimerasa, Klentaq-235 y Klentaq-278; ADN polimerasa de Thermus thermophilus; ADN polimerasa de Bacillus caldotenax; ADN polimerasa de Thermus flavus; ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus; y ADN polimerasas de arqueobacterias tales como ADN polimerasa de Thermococcus litoralis (referida también como Vent_{R}®), Pfu, Pfx, Pwo y DeepVent_{R}®, o una mezcla de las mismas. Otras ADN polimerasas comercialmente disponibles incluyen TaqLa o Expand High Fidelity^{Plus} Enzyme Blend (Roche); KlenTaqLA, KlenTaq1, TthLA (Perkin-Elmer), ExTaq® (Takara Shuzo); Elongase® (Life Technologies); Taquenase^{TM} (Amersham), TthCL (Perkin-Elmer); Advantage^{TM} KlenTaq y Advantage^{TM} Tth (Clontech); TaqPlus® y TaqExtender^{TM} (Stratagene), o mezclas de las mismas.

En una realización preferida, la presente invención incluye composiciones y métodos para incrementar la especificidad de la PCR. Específicamente, la presente invención proporciona procesos y kits para realizar una PCR de inicio caliente. Los procesos y kits utilizan la etapa de secuestro de iones magnesio en un polímero insoluble en agua, permeable al agua, convirtiendo a la ADN polimerasa en gran parte inactiva hasta que la temperatura del medio de reacción sea elevada para solubilizar y liberar los iones magnesio del polímero secuestrante, a fin de que puedan activar la polimerasa. Limitando la actividad del enzima ADN polimerasa para PCR hasta el ciclo de extensión en el que se desee la polimerización, la especificidad de la amplificación de las moléculas de ADN diana es incrementada con una formación mínima o nula de productos competitivos o inhibidores.

La presente composición de la reacción puede ser aplicada a procesos de PCR como los mostrados en, por ejemplo, los Ejemplos 1, 4 y 5 posteriores, utilizando por lo demás metodologías convencionales de PCR (ver, por ejemplo, PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, M.A. Innis (ed.), Academic Press, Inc., 1990; PCR Technology: Principles And Applications For DNA Amplification, H.A. Erlich (ed.), Oxford University Press, Inc., 1992; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel y col. (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., 1998).

El ámbito de la presente invención incluye además composiciones que contienen enzimas y métodos para controlar los enzimas que requieran otros iones metálicos para su actividad. A manera de ejemplo, el Zn^{2+} es un reactivo enzimático iónico para la nucleasa S1, para la nucleasa Mung Bean y para la fosfatasa alcalina. La fosfatasa alcalina puede utilizar además otros iones metálicos tales como Mg^{2+}, Mn^{2+}, Co^{2+} o Hg^{2+}. El Ca^{2+} es un reactivo iónico para la nucleasa S7. El Co^{2+} es un reactivo iónico para la Desoxinucleotidil Transferasa Terminal (TdT) y para la metionil aminopeptidasa eucariótica (Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 92, pp. 7714-7718, Agosto de 1995). El Cd^{2+} es un reactivo iónico para la dimerización y la unión de factores de transcripción a los promotores de la metalotioneía (Biochemistry, Vol. 31, Nº 7, pp. 2181-2186, 25 de Febrero de 1992). El Pb^{2+} es un reactivo iónico para el proceso de corte de ARN mediado por ribozimas catalizado por "leadzima" (Wedekind y col., Biochemistry, Vol. 42, Nº 32, pp. 9554-9563, 19 de Agosto de 2003).

La ADN polimerasa Tth puede utilizar Mn^{2+} en lugar de Mg^{2+} para incrementar su actividad de transcriptasa inversa (Myers y col., Biochemistry, Vol. 30, Nº 31, 6 de Agosto de 1991). Así, en una variación del presente ejemplo dirigido al control de enzimas dependientes de Mg^{2+} utilizando oxalato de Mg, la actividad transcriptasa inversa de la ADN polimerasa Tth puede ser controlada mediante un proceso análogo utilizando una resina polimérica insoluble en agua, permeable al agua, tal como poli(vinil butiral) en combinación con una sal de Mn^{2+} poco soluble en agua, tal como oxalato de manganeso II, yodato de manganeso II o tungstato de manganeso II.

Los principios, las metodologías y los ejemplos descritos en la presente (y más adelante) para controlar la actividad ADN polimerasa dependiente de Mg^{2+} pueden ser aplicados de manera análoga para controlar otros tipos de enzimas dependientes de Mg^{2+} o independientes de Mg^{2+} descritos anteriormente. Tales enzimas pueden ser controlados de manera similar cuando el ión metálico requerido para la actividad proceda de magnesio, manganeso, cadmio, calcio, cobalto, cobre, hierro, plomo, molibdeno, mercurio, níquel o zinc. Los reactivos iónicos preferidos incluyen, pero no se limitan a, Mg^{2+}, Mn^{2+}, Zn^{2+}, Ca^{2+}, Cd^{2+}, Cu^{2+}, Co^{2+}, Cr^{2+}, Cr^{3+}, Cr^{6+}, Ni^{2+}, Ni^{3+}, Pb^{2+}, Pb^{4+}, Fe^{2+}, Fe^{3+} y Hg^{2+}. Los cationes monovalentes preferidos pueden incluir, pero no se limitan a, Na^{+}, K^{+} y NH_{4}^{+}.

Los principios para controlar procesos enzimáticos dependientes de iones metálicos pueden ser extendidos de manera similar a procesos enzimáticos que requieran otros reactivos iónicos incluyendo, pero sin limitarse a, ATP, ADP, pirofosfato, coenzimas, Dinucleótido de Nicotinamida Adenina (NAD^{+}), Fosfato del Dinucleótido de Nicotinamida Adenina (NADP^{+}), Coenzima A, Coenzima B_{12}, Coenzimas Q_{1-10}, fosfato de piridoxal, pirofosfato de tiamina, nucleótidos, desoxinucleótidos, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, didesoxirribonucleótidos, cebadores y oligonucleótidos; radicales aniónicos; etcétera.

Los ejemplos siguientes ilustran aspectos de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Control de la Actividad ADN Polimerasa para PCR

1. Preparación de una suspensión de oxalato de magnesio/resina de butiral. Se suspendió 1 gramo de oxalato de magnesio en 1 ml de solución de resina de butiral (0,05 g/ml en cloroformo). Se añadieron 5 \mul de la suspensión resultante a un tubo de reacción pequeño. La suspensión fue secada durante 10 minutos a 50ºC. Se preparó un tubo separado como control que tenía 5 \mul de una solución de oxalato de magnesio (1 g/ml en cloroformo) sin la resina de butiral.

2. Adición de los componentes de reacción para una reacción de PCR. Se añadió una mezcla de reacción de PCR de 100 \mul (Tris-HCl 10 mM, pH 9,0 a 25ºC; KCl 50 mM; Triton X-100 0,1%; desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs) 0,2 mM; cebadores P1 y P2 (20 pmoles de cada uno); 100 ng de ADN de E. coli como molde; y 10 U de polimerasa Klentaq) a tubos de reacción que contenían el oxalato de magnesio/resina de butiral o el oxalato de magnesio control. Se diseñaron los cebadores P1 (5'-ATGGCTAACGAATTAACCTGGCA, SEC ID Nº 1) y P2 (5'-TTACTCACTCTCTGCCGGTAAT, SEC ID Nº 2) para amplificar un fragmento de ADN de 690 pb del gen de la uracil ADN glicosilasa de E. coli.

3. Condiciones de la reacción de PCR y análisis. La mezcla de reacción fue calentada desde 24ºC a 94ºC a una velocidad de 1ºC/segundo. Después de alcanzar la temperatura de 94ºC, se recogieron muestras de 15 \mul a t = 0, 1, 2, 3 y 5 minutos. Cada una de las muestras fue transferida a un tubo limpio (sin oxalato de magnesio y/o resina) y sometida a 25 ciclos de acuerdo con las condiciones de reacción siguientes: 94ºC - 30 segundos; 58ºC - 30 segundos; 72ºC - 100 segundos. La Fig. 1 representa un análisis electroforético de los productos resultantes de la PCR obtenidos. Este análisis sugiere que se requería un periodo de incubación de al menos 3,5 minutos para liberar iones magnesio suficientes para activar la polimerasa, de tal manera que pudieran detectarse los productos amplificados de la PCR después de 25 ciclos (Fig. 1, Calle 4). El periodo de latencia observado refleja el control sobre la activación de la actividad de la ADN polimerasa Klentaq. La cantidad de magnesio liberada durante el inicio caliente es suficiente para mantener la actividad del enzima en la reacción de amplificación por PCR posterior sin añadir magnesio adicional. En contraste, las reacciones control mostraron que sin la resina polimérica de butiral, podían obtenerse productos de la PCR detectables sin incubación a 94ºC. Esto sugiere que estando ausente el secuestro de los iones magnesio por la resina de butiral, la polimerasa era activa incluso antes de alcanzar una temperatura de 94ºC.

Ejemplo 2

Control de la Digestión con Endonucleasas de Restricción

1. Preparación de tubos de reacción revestidos con oxalato de magnesio/resina de butiral. Se prepararon tubos de reacción revestidos con oxalato de magnesio/resina de butiral según se describió en el Ejemplo 1.

2. Adición de los componentes de reacción para la digestión con endonucleasas de restricción. Se añadieron 100 \mul de mezcla de digestión con enzima de restricción (NaCl 100 mM; Tris-HCl 10 mM (pH 8,4 a 25ºC); 2-mercaptoetanol 10 mM; 2 \mug de ADN de pBR322; 2 U de la endonucleasa de restricción Taq I) a cada uno de los tubos de reacción que contenían el oxalato de magnesio/resina de butiral.

3. Condiciones de la digestión con endonucleasa de restricción y análisis. Las mezclas de reacción fueron calentadas desde 24ºC a 64ºC a una velocidad de 0,5ºC/segundo. Después de una incubación a 64ºC durante t = 0, 1, 2, 3 y 5 minutos, se recogieron muestras de 15 \mul y se colocaron en tubos de reacción limpios (sin oxalato de magnesio). La incubación en los tubos de reacción continuó durante 1 hora a 64ºC. La Fig. 2 es un análisis electroforético de los productos de digestión, indicando que la activación de la actividad de la endonucleasa de restricción requería al menos una incubación a 64ºC durante 2 minutos. Este tiempo de incubación inicial es bastante para liberar suficiente magnesio al medio de reacción como para mantener la actividad del enzima de restricción durante la duración de la reacción continuada sin añadir magnesio adicional.

Ejemplo 3

Control de la Actividad ADN Ligasa

Preparación de tubos de reacción revestidos con oxalato de magnesio/resina de butiral. Se prepararon tubos de reacción revestidos con oxalato de magnesio/resina de butiral según se describió en el Ejemplo 1.

Se añadieron 100 \mul de una mezcla de reacción de ADN ligasa (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0 a 25ºC); 2-mercaptoetanol 10 mM; ATP 1 mM; 2 \mug de ADN de lambda digerido con HindIII; 2 Unidades Weiss de ADN ligasa de T4) a los tubos de reacción preparados. Después de la incubación del tubo que contenía oxalato de magnesio con la mezcla de reacción de la ADN ligasa a 30ºC durante t = 1, 2, 3, 5 y 10 minutos, se recogieron muestras de 15 \mul en tubos limpios (sin oxalato de magnesio) y la incubación procedió durante una hora adicional a 30ºC. El análisis electroforético indicó que se necesitaba un tiempo de incubación de 10 minutos a 30ºC para permitir que se difundiera suficiente magnesio desde la resina para activar la ADN ligasa de T4 (Fig. 3, Calle 5).

Ejemplo 4

Especificidad Incrementada de la PCR Utilizando Tubos de Reacción Revestidos en Comparación con los Procedimientos Convencionales de PCR A. Comparación con la reacción de PCR de inicio caliente convencional

Se amplificó un fragmento de ADN de 180 pb procedente de 50 ng de ADN genómico humano durante 30 ciclos. Se compararon las condiciones de reacción siguientes. Se llevó a cabo un inicio caliente manual añadiendo el enzima ADN polimerasa Taq (Fig. 4, Calle 1, 0,5 U; Calle 2, 2,0 U) a una mezcla de reacción de 25 \mul precalentada 5 minutos a 94ºC y se sometió a las condiciones de una PCR estándar (Calles 1 y 2). Para comparación, se añadieron 25 \mul de mezclas de reacción completas que contenían el enzima ADN polimerasa Taq (Calle 3, 0,5 U; Calle 4, 2,0 U) a los tubos de reacción revestidos de la presente invención. La mezclas de reacción completas fueron precalentadas 5 minutos a 94ºC y sometidas a las mismas condiciones de PCR que las utilizadas en las Calles 1 y 2. La Fig. 4 representa un análisis electroforético de los productos de amplificación obtenidos. En comparación con el procedimiento de inicio caliente manual, se obtuvieron menos productos de amplificación no específicos cuando se utilizaron los tubos de reacción revestidos (observar la ausencia de productos de amplificación de peso molecular mayor en las Calles 3, 4 en comparación con las Calles 1, 2).

B. Amplificación de la región promotora de 1,2 kb de Xenopus laevis

Utilizando cebadores diseñados apropiadamente bajo las condiciones de los ciclos de PCR convencionales (por ejemplo, 30 ciclos) se amplificó un fragmento de 1,2 kb de una región promotora del gen XAC-2 de Xenopus laevis a partir de 20 ng de una biblioteca de ADN genómico del sapo sudafricano Xenopus laevis. Las reacciones de PCR fueron preparadas en tubos de reacción convencionales (Calle 1) y en tubos de reacción revestidos (Calle 2). La Fig. 5 representa un análisis electroforético de los productos de amplificación obtenidos. Bajos estas condiciones de reacción, únicamente los tubos de reacción revestidos proporcionaron niveles detectables del producto deseado (Calle 2). Cuando se utilizaron los tubos convencionales más pequeños, se obtuvieron productos no específicos (Calle 1).

Claims (28)

1. Una composición que contiene:

al menos un polímero sustancialmente insoluble en agua, permeable al agua; y

al menos una sal de magnesio de un reactivo enzimático iónico y un contraión,

donde la sal de magnesio tiene una solubilidad molar en agua menor de 1 x 10^{-3} moles/l a 25ºC.

2. La composición de la Reivindicación 1, en la que el al menos un polímero es seleccionado del grupo que consta de: resina de butiral, polivinil acetal, poli(vinil butiral-co-alcohol vinílico-co-acetato de vinilo), butirato de polivinilo, acetato de polivinilo y combinaciones y comonómeros de los mismos.

3. La composición de la Reivindicación 1, en la que el al menos un polímero incluye poli(vinil butiral-co-alcohol vinílico-co-acetato de vinilo).

4. La composición de la Reivindicación 1, en la que la sal de magnesio tiene una solubilidad molar en agua a 25ºC de entre 1 x 10^{-3} moles/l y 1 x 10^{-7} moles/l aproximadamente.

5. La composición de la Reivindicación 1, en la que la sal de magnesio es seleccionada del grupo que consta de: sulfito de magnesio, oxalato de magnesio, fluoruro de magnesio y tungstato de magnesio.

6. La composición de la Reivindicación 5, en la que la sal de magnesio es oxalato de magnesio.

7. La composición de la Reivindicación 1, en la que el reactivo enzimático iónico es un cofactor enzimático.

8. La composición de la Reivindicación 1, en la que el reactivo enzimático iónico es un sustrato enzimático.

9. La composición de la Reivindicación 1, que contiene poli(vinil butiral-co-alcohol vinílico-co-acetato de vinilo) y oxalato de magnesio.

10. La composición de la Reivindicación 1, que contiene además al menos un componente reactivo para facilitar el proceso enzimático, en la que el al menos un componente de la reacción es un enzima.

11. La composición de la Reivindicación 10, en la que el enzima requiere el reactivo enzimático iónico para ser enzimáticamente activo.

12. La composición de la Reivindicación 11, en la que el enzima requiere Mg^{2+} para ser enzimáticamente activo.

13. La composición de la Reivindicación 11, en la que el enzima es un miembro del grupo que consta de: polimerasa, ligasa, endonucleasa, quinasa, proteasa y combinaciones de las mismas.

14. La composición de la Reivindicación 11, en la que el enzima es un enzima termoestable.

15. La composición de la Reivindicación 11, en la que el enzima es un enzima ADN polimerasa termoestable.

16. La composición de la Reivindicación 1, revestida sobre la superficie de una pared.

17. La composición de la Reivindicación 16, en la que la pared es la superficie de un tubo, una placa, un portaobjetos, un pocillo o una combinación de los mismos.

18. Una composición para un proceso enzimático que contiene:

al menos un polímero sustancialmente insoluble en agua, permeable al agua;

al menos una sal de un reactivo enzimático iónico y un contraión; y

al menos un enzima,

en la que la al menos una sal tiene una solubilidad molar en agua menor de 1 x 10^{-3} moles/l a 25ºC y

en la que el enzima requiere el reactivo enzimático iónico para ser enzimáticamente activo.

19. Un método para activar un proceso enzimático que comprende:

la provisión de una composición que contiene al menos un polímero sustancialmente insoluble en agua, permeable al agua y al menos una sal de un reactivo enzimático iónico, en la que la al menos una sal tiene una solubilidad molar en agua menor de 1 x 10^{-3} moles/l a 25ºC y

la puesta en contacto de dicha composición con un medio de reacción que contiene un enzima durante un tiempo suficiente para liberar el reactivo enzimático iónico, activando de este modo el proceso enzimático.

20. El método de la Reivindicación 19, que comprende además la etapa de elevar la temperatura del medio de reacción, estimulando de este modo la liberación del reactivo enzimático iónico.

21. El método de la Reivindicación 19, en el que la elevación de la temperatura incrementa la liberación del reactivo enzimático iónico desde el polímero.

22. El método de la Reivindicación 19, en el que la elevación de la temperatura incrementa la disociación del reactivo enzimático iónico de la sal.

23. El método de la Reivindicación 19, en el que la elevación de la temperatura incrementa la liberación del reactivo enzimático iónico desde el polímero e incrementa la disociación del reactivo enzimático iónico de la sal.

24. Un kit de reacción para un proceso enzimático que comprende:

un primer recipiente de reacción conteniendo una composición que contiene un polímero sustancialmente insoluble en agua, permeable al agua; y

al menos una sal de magnesio de un reactivo enzimático iónico;

donde la al menos una sal de magnesio tiene una solubilidad molar en agua menor de 1 x 10^{-3} moles/l a 25ºC.

25. El kit de reacción de la Reivindicación 24, en el que la composición está revestida o secada sobre la pared del primer recipiente de reacción.

26. El kit de reacción de la Reivindicación 24, que contiene además uno o más recipientes de reacción adicionales, en el que cada uno del uno o más recipientes de reacción contiene al menos un componente de reacción para facilitar el proceso enzimático.

27. El kit de reacción de la Reivindicación 24, que contiene al menos un enzima cuya actividad es dependiente del reactivo enzimático iónico.

28. El kit de reacción de la Reivindicación 27, que comprende un segundo recipiente de reacción que contiene el al menos un enzima.