JP7420850B2 - 熱安定性ポリメラーゼ阻害剤組成物及び方法 - Google Patents
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Description
本出願は、全ての目的についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる2016年6月7日に出願された米国特許出願公開第62/347,004号の利益及び優先権を主張する。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。2017年6月6日に作成されたこのASCIIコピーはCPHDP012WO_2017-06-06_SeqList.txtと名付けられ、サイズは20795バイトである。
TATAATTGCAAAATAA(配列番号1)若しくはその変異型又はTTATTTTGCAATTATA(配列番号2)若しくはその変異型を含む第1のヌクレオチド配列;TTCTTAGCGTTT(配列番号3)又はその変異型を含む第2のヌクレオチド配列、配列番号1若しくはその変異型又は配列番号2若しくはその変異型を含む第3のヌクレオチド配列;及び配列番号3又はその変異型を含む第4のヌクレオチド配列
を含み、第1の配列は第2の配列に相補的である。
CAAAATAATTCTTAGCGTTTTTATTTTGCAATTATATTCTTAGCGTTTTATAATTG-C3(配列番号106);
CAAAATAATTCTTAGCGTTTTTATTTTGGAATTATATTCTTAGCGTTTTATAATTC-C3(配列番号:107);
GAAAATAATTCTTAGCGTTTTTATTTTCGAATTATATTCTTAGCGTTTTATAATTC-C3(配列番号:108);
CAATTATATTCTTAGCGTTTTATAATTGGAAAATAATTCTTAGCGTTTTTATTTTC-C3(配列番号:109);
CAATTATATTCTTAGCGTTTTATAATTGCAAAATAATTCTTAGCGTTTTTATTTTG-C3(配列番号:110);又は
GAATTATATTCTTAGCGTTTTATAATTCGAAAATAATTCTTAGCGTTTTTATTTTC-C3(配列番号:111)
を含む。他の実施形態では、配列番号106~111の1つの配列を含むアプタマーの最初のヌクレオチドと最後のヌクレオチドの間に共有結合はない。
本明細書で使用される場合及び添付の請求項において、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、文脈がはっきりと他に示さない限り複数の参照を含むことに注意が必要である。
本開示は、ポリメラーゼによるプライマー伸長を必要とする反応での使用のための熱安定性ポリメラーゼの可逆的阻害剤を提供する。これらの可逆的阻害剤は、アプタマー、ステム及びループを含む二次構造を採用するように設計される核酸である。アプタマーは、ホットスタートを組み入れることから利益を得る反応及びアッセイに有用であり、核酸合成の感度及び特異性を改善することができる。
本明細書に記載したようにアプタマーを熱安定性ポリメラーゼとインキュベートする工程を含む、ポリメラーゼ活性を可逆的に阻害する方法も企図される。本開示のアプタマーは、熱安定性ポリメラーゼに結合し、より低い温度でそのポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害し、次いで反応温度が上昇するとポリメラーゼから解離するように設計された。いくつかの実施形態では、熱安定性ポリメラーゼは、限定はされないが、サーマス・アクウァーティクス、サーマス・サーモフィラス、T.ボッキアヌス、T.フラバス、T.ラバー、サーモコッカス・リトラリス、パイロコッカス・フリオサス、パイロコッカス・ヴェッセイ、パイロコッカス属 KGD、サーモトガ・マリティマ、サーモプラズマ・アシドフィラス、及びスルホロブス属を含む、限定はされないが、好熱性真正細菌又は古細菌由来のDNAポリメラーゼから選択される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは55~60℃の間で逆転写酵素機能性であり、限定はされないが、MmLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、RSV逆転写酵素、HIV-1逆転写酵素、及びHIV-2逆転写酵素が挙げられる。
上記のように、本開示のアプタマーは周囲温度又は様々な熱安定性ポリメラーゼの最適な温度より低い温度で熱安定性ポリメラーゼを可逆的に阻害する能力を有する。従って、これらのアプタマーは、熱安定性ヌクレオチドポリメラーゼが使用され、低い温度ではポリメラーゼ活性が遮断されるが、次いで高い温度ではその活性を回復することができる(ホットスタート)ポリメラーゼ活性を有することが望ましい任意の適用に容易に適用され得る。そのような適用としては、限定はされないが、標準的なPCR、逆転写酵素PCR、in-situ PCR、定量的PCR、及びミニシーケンシング又は熱安定性ポリメラーゼが存在し、ホットスタート法が有益であるプライマー伸長を含む他の反応が挙げられる。そのような方法は当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、開示された組成物によって提供される感度及び特異性の増加は、医学的遺伝子研究及び診断、病原体検出、法医学分析、並びに動物及び植物遺伝学の適用におけるDNA及びRNAの増幅及び分析中に有用である。本開示の方法及び組成物は、40℃と80℃の間のどこかでサイクルに熱安定性ポリメラーゼを必要とする任意のポリヌクレオチド合成反応において有用である。
いくつかの実施形態では、標的核酸配列がコピー又は増幅され、次いで自動の試料操作及び/又は分析プラットフォームを使用して検出される。いくつかの実施形態では、市販の自動化分析プラットフォームが利用される。例えば、いくつかの実施形態では、GeneXpert(登録商標)システム(Cepheid社、Sunnyvale、Calif.)が利用される。
固体、半固体、又は液体の生物試料中に存在する核酸標的配列を検出するキットも提供される。キットは、本明細書に記載のように熱安定性ポリメラーゼ及びポリメラーゼの活性を可逆的に阻害し得るアプタマーを含む試薬混合物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、任意の標的核酸の検出、定量、又はシーケンシングに使用され得る。代わりに、キットは、当技術分野で通例であるように、特定の標的核酸に特異的にハイブリダイズし、標識されたプライマー及び/又はプローブも含み得る1つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマー(例えば、フォワード及び/又はリバースプライマー)を含む。
オリゴヌクレオチド合成及びライゲーション
本明細書に記載のアプタマーは、標準的なオリゴヌクレオチド合成方法を使用して合成された。オリゴヌクレオチド合成はMerMade 12 DNA Synthesizer(BioAutomation社)で実施された。標準的なホスホロアミダイト合成サイクルが使用され、結合時間は、修飾ホスホロアミダイトでは360秒に増加された。固体支持体からの開裂及び脱保護は、24時間室温の濃縮した水性アンモニア中で行われた。HPLC分析は、第四ポンプ、オートサンプラー、及びダイオードアレイ検出器を備えたAgilent1100装置で実施された。オリゴヌクレオチドは、直線勾配のアセトニトリル/0.1M重炭酸トリエチルアンモニウム、pH7: DMT-onオリゴヌクレオチドは20分間にわたり16~23%アセトニトリル及びDMT基を除いた(DMT-off)オリゴヌクレオチドは7~14%アセトニトリルによって溶出する、C18 Geminiカラム(4.6mm×250mm、5um、Phenomenex社)の逆相HPLC(RP HPLC)を使用して分析された。DMT-onオリゴヌクレオチドは逆相HPLCを使用して精製され、DMT基は開裂され、最終オリゴヌクレオチド産物はエタノール沈殿によって単離され、UVによって定量された。
融解温度(Tm)決定
UV-融解曲線分析が、上記の実施例1に従って生成された様々なアプタマーに関して実施された。オリゴヌクレオチドは緩衝液(3mM MgCl2、15 KCl、25mM HEPES、pH8.0)中1μMの濃度で調製され、Agilent Technologies Cary 4000 Series UV-Vis-NIR分光光度計及び製造業者の指示による関連ソフトウェアを使用して分析された。結果は以下のTable 5(表5)に示す。予想通り、ライゲートされていないダンベルアプタマーのTmは、ライゲートされたダンベルアプタマーのTmよりも低い。
ポリメラーゼ阻害
温度の関数として本明細書に記載されたアプタマーの阻害活性を測定するために研究を行った。アプタマーの存在下でのTaqポリメラーゼのポリメラーゼ活性は、以下の修飾を伴う当技術分野で記載される方法(Nikiforov T.、Analytical Biochemistry、412:229~236頁(2011))によりアッセイされる。本発明のアプタマーは、上記周囲温度でTaqポリメラーゼ活性を阻害するため、ヘアピン基質の構造が修飾されそのTmが上昇する。Xが蛍光dT残基を示すヘアピン基質TTTTTTTGCAGGTGACAGGCGCGAAGCGCCTGTCACCXGC(配列番号6)がアッセイで使用される。50mM Tris-HCl、50mM NaCl、5mM MgCl2、及びTaqポリメラーゼ中150nMのヘアピン基質の溶液に、2μLの2mM dATPが添加され、反応混合物が標準的な解離曲線プログラム(Mx3005P、Agilent社)を使用して25℃から74℃に加熱される間にFAMシグナルがモニターされる。アッセイはアプタマーの可逆的な阻害活性を測定し、それによりポリメラーゼ活性は反応混合物の加熱により回復される。阻害が喪失する温度は、配列及びアプタマーの構造に依存する。
ホットスタート活性
本明細書に記載のように設計されたアプタマーの、PCR反応における非特異的産物生成を低減する能力を試験するため、ベータグロビン遺伝子の2つの領域が検出され、Eva-Greenを使用するPCR後融解曲線分析に続くヒトゲノムbiplex PCR増幅アッセイが実施された。2つのプライマー対は、配列: AAAAGGCATTCCTGAAGCTGACAGCATTC (配列番号7、フォワードプライマー1)及びGAGAGAGTAGCGCGAGCACAGCTA(配列番号8、リバースプライマー1);並びにAAAACCTGCCTTCTGCGTGAGATTCT(配列番号9、フォワードプライマー2)及びCTGTACGAAAAGACCACAGGGCCCAT(配列番号10、リバースプライマー2)を有する。PCRマスターミックスは室温で調製され、100μM dNTPs、5mM MgCl2、25mM HEPES、pH8.5、×1 EvaGreen(登録商標)(1×濃度)、ヒトゲノムDNA(1000コピー/反応)、0.30% Tween 20、及び1mg/mL BSAを含有した。4u Taq DNAポリメラーゼ(GMP Taq、Roche Diagnostics社)は0.25μ/μL調製物から各反応に添加された。CAAAATAATTCTTAGCGTTTTTATTTTGCAATTATATTCTTAGCGTTTTATAATTG-C3(配列番号106)を含むアプタマーは、200nMの濃度で選択された反応に添加された。反応は、Taq又はTaqプラスアプタマーの添加によって開始された。アプタマーが反応中でインキュベートされた場合、Taq及びアプタマーは、PCRマスターミックスへの添加の直前に室温で予混合された。PCR反応を実行及び分析するためにStratagene Mx3005P 96ウェルプレートシステム(Agilent Technologies社)が使用された。サイクル条件は以下の通りであり: 95℃100秒、95℃8秒と68℃30秒の45サイクル、次いで95℃10秒、60℃30秒、20分間にわたる60℃から95℃での融解曲線分析で終結した。
ホットスタートPCR
本明細書に記載のように、アプタマーはポリメラーゼに最適な反応温度より低い温度でポリメラーゼ活性を可逆的に阻害することができる。Xpert(登録商標) C. difficile/Epi Assay(Cepheid社)を使用して、アプタマー:Taq(サーマス・アクウァーティクスDNAポリメラーゼ)比の変更の効果を評価するために研究を行い、標的産物及び非特異的標的産物生成に関して最適なアプタマー:Taq比を決定した。本実施例で使用したアプタマーは、配列番号106(CAAAATAATTCTTAGCGTTTTTATTTTGCAATTATATTCTTAGCGTTTTATAATTG-C3)として本明細書に記載のアプタマーであり、実施例1に記載のようにプロパンジオールスペーサーCPGによってその3'端を修飾された。
Claims (15)
- アプタマー及び熱安定性ポリメラーゼを含む乾燥組成物を含むキットであって、前記アプタマーが、
配列番号1若しくはその変異型又は配列番号2若しくはその変異型を含む第1の配列、
配列番号3を含む第2の配列、
配列番号1若しくはその変異型又は配列番号2若しくはその変異型を含む第3の配列、及び
配列番号3を含む第4の配列
を含み、
第1の配列及び第3の配列のそれぞれが、16~18ヌクレオチド長であり、互いに長さが等しく、その全長に沿って互いに100%相補的であり、かつ14から16個のA-T塩基対を有するステムを形成し、
前記変異型は、1以下の塩基対置換を有し、
第2の配列及び第4の配列が12ヌクレオチド長であり、互いに同一であり、
第1の配列内の隣接する2つのヌクレオチド間に共有結合がなく、かつ、アプタマーが第1の配列内に5’末端及び3’末端を含み、又は、
第3の配列内の隣接する2つのヌクレオチド間に共有結合がなく、かつ、アプタマーが第3の配列内に5’末端及び3’末端を含み、並びに、
前記アプタマーが熱安定性ポリメラーゼの活性を阻害する、キット。 - デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び二価の金属陽イオンを更に含む、請求項1に記載のキット。
- 水性緩衝液を更に含む、請求項1又は2に記載のキット。
- 組成物が標的核酸に特異的なフォワードプライマーを更に含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のキット。
- 組成物が、標的核酸に特異的なリバースプライマーを更に含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のキット。
- 逆転写酵素を更に含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のキット。
- 第1の配列の5'端と第4の配列の3'端の間に共有結合がある、請求項1に記載のキット。
- 共有結合がホスホジエステル結合である、請求項7に記載のキット。
- 第1の配列内の隣接する2つのヌクレオチド間に共有結合がなく、及び、アプタマーが第1の配列内に5'末端及び3'末端を含む、請求項7又は8に記載のキット。
- 第3の配列内の隣接する2つのヌクレオチド間に共有結合がなく、及び、アプタマーが第3の配列内に5'末端及び3'末端を含む、請求項7又は8に記載のキット。
- 第1の配列が配列番号1を含み、第3の配列が配列番号2を含み、及び、配列番号1のヌクレオチド8と9の間に共有結合がない、請求項7から9のいずれか一項に記載のキット。
- 第1の配列が配列番号2を含み、第3の配列が配列番号1を含み、及び、配列番号2のヌクレオチド8と9の間に共有結合がない、請求項7から9のいずれか一項に記載のキット。
- 第1の配列及び第3の配列が、第1の配列及び第3の配列のそれぞれの全長に沿って互いにハイブリダイズされる、請求項1又は7から12のいずれか一項に記載のキット。
- アプタマーが配列番号106を含む、請求項11に記載のキット。
- アプタマーが配列番号110を含む、請求項12に記載のキット。
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