CN115595322A - 一种核酸聚合酶底物类似物的混合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸聚合酶底物类似物的混合物及其应用。本发明所述核酸聚合酶底物类似物的混合物包含两种及以上核酸聚合酶底物类似物;所述核酸聚合酶底物类似物是在分子内形成互补配对的单个寡聚核酸分子或核酸分子类似物,或者是在分子间形成互补配对的单个或两个寡聚核酸分子或核酸分子类似物;所述核酸聚合酶底物类似物所形成的结构具备核酸聚合酶底物的特征;所述核酸聚合酶底物类似物的3’端具有抑制其延伸的修饰。本发明提供的核酸聚合酶底物类似物的混合物,能更有效地减少核酸聚合酶在一定温度下的酶活性,并且适用于所有类型的核酸聚合酶,通用性强。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,更具体的说是涉及一种核酸聚合酶底物类似物的混合物及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它是生物体外的特殊DNA复制,能将微量的DNA大幅增加。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至变性温度(通常≥90℃)一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至退火温度(通常≥55℃),引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板-引物结合物在延伸温度(通常≥60℃)、DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。在很短时间内就能将待扩目的基因扩增放大几百万~几十亿倍。
虽然PCR技术已经在生物医药领域得到广泛应用,但由于PCR副反应导致的非特异性扩增常常带来较大问题。特别是在临床诊断领域,需要在大量背景DNA下扩增微量的目的DNA,此时的非特异性扩增会导致假阳性。而非特异性扩增产生的很大原因,是由于酶在室温下延伸了非特异性退火的引物。因此,抑制聚合酶在室温条件下的活力,可以很大程度上减少非特异性扩增。
为了减少甚至避免操作过程中产生非特异性扩增,人们发明了热启动聚合酶链式反应,开发并使用了热启动聚合酶,热启动酶是能够通过热启动的方式避免低温下体系中发生错配,原理就是采用化学修饰或者抗体修饰的方法封闭酶的活性,化学修饰是利用一些分子基团(如酸酐、活化酯、醛等化学分子)和酶共价结合,温度到达一定温度时(一般是90度以上温度),小分子脱离开酶,此时发挥活性,实现核酸扩增,但化学修饰热启动酶性能需要高温保温逆转修饰,不适用于热不稳定的酶(如反转录酶)的修饰,同时需要逆转保温的时间长且不完全;而抗体修饰是以所修饰的聚合酶为抗原免疫实验动物产生相对应的抗体,经过一系列的筛选后,通过单克隆抗体技术大规模制备该抗体,并利用抗体的蛋白生物活性使其在PCR反应高温条件下失活、脱落,从而达到热启动的效果,但特定抗体的产生需要非常长的筛选周期,而且抗体修饰易带来外源DNA的污染。抗体与聚合酶的解离通常在高温,因此不适用于不耐高温的聚合酶如反转录酶。
美国专利(US6183967、US6020130)公开了与热稳定Taq酶,Tth酶,和TZ05酶特异性结合的寡核苷酸适配体,这些适配体能在室温下封闭聚合酶的活性。筛选适配体的过程一般包括五个基本的步骤,即:结合、分离、洗脱、扩增和调节,再通过迭代循环得到目标适配体,整个筛选需要非常长的周期,过程相对较慢和复杂。并且由特定方法筛选的适配体对相应的配体(聚合酶)具有高度专一性,因此不同的聚合酶需要不同的适配体。
虽然我们已经发明了一种核酸配体及其应用(申请号:202010576818.3),它能有效减少室温下核酸聚合酶导致的非特异性扩增,但单独使用(仅使用一种核酸聚合酶底物类似物)时,核酸聚合酶仍残存有少量酶活性。
因此需要一种能更好地抑制核酸聚合酶在一定温度下的酶活性的产品。本发明采用核酸聚合酶底物类似物的混合物更好地抑制了核酸聚合酶在一定温度下的酶活性。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种核酸聚合酶底物类似物的混合物,能更有效地减少核酸聚合酶在一定温度下的酶活性,并且适用于所有类型的核酸聚合酶,通用性强;
本发明所述核酸聚合酶底物类似物通过模拟与核酸聚合酶结合的底物,与核酸聚合酶结合,因此称为核酸聚合酶底物类似物。其能在温度控制下,使核酸聚合酶失去或恢复活性,所述核酸聚合酶底物类似物能适用于所有核酸聚合酶。
其中,所述核酸聚合酶底物类似物是分子内形成互补配对的单个核酸分子或核酸分子类似物,与核酸聚合酶作用的示意图见图1;所述核酸聚合酶底物类似物是分子间形成互补配对的单个或两个核酸分子或核酸分子类似物的示意图见图2。
本发明的另外一个目的在于提供上述核酸聚合酶底物类似物的混合物在核酸扩增、在制备核酸扩增试剂盒以及在制备核酸延伸反应混合物中的应用;
本发明的另外一个目的在于提供一种核酸扩增的方法,其使用上述核酸聚合酶底物类似物的混合物扩增待测样品的靶核酸。
本发明的另外一个目的在于提供含有上述核酸聚合酶底物类似物的混合物的核酸扩增试剂盒和核酸延伸反应混合物。
为实现上述发明目的,本发明提供如下技术方案:
本发明提供了一种核酸聚合酶底物类似物的混合物,其中:
a.包含两种及以上核酸聚合酶底物类似物;
b.所述核酸聚合酶底物类似物是在分子内形成互补配对的单个寡聚核酸分子或核酸分子类似物,或者是在分子间形成互补配对的单个或两个寡聚核酸分子或核酸分子类似物;所述核酸聚合酶底物类似物所形成的结构具备核酸聚合酶底物的特征;
c.所述核酸聚合酶底物类似物的3’端具有抑制其延伸的修饰;
d.所述两种及以上核酸聚合酶底物类似物具有不同的温度适应范围宽度;
e.当保持或低于第一温度时,所述两种及以上核酸聚合酶底物类似物与核酸聚合酶混合时,二者形成核酸聚合酶-底物类似物复合体,此时核酸聚合酶酶活性相对于无核酸聚合酶底物类似物存在时显著降低;
f.当高于所述第一温度时,“e”中的所述核酸聚合酶-底物类似物复合体解体,核酸聚合酶活性全部或部分被释放出来。
本发明还提供了一种核酸聚合酶底物类似物的混合物与核酸聚合酶的混合物,其中:
a.包含两种及以上核酸聚合酶底物类似物;
b.所述核酸聚合酶底物类似物是在分子内形成互补配对的单个寡聚核酸分子或核酸分子类似物,或者是在分子间形成互补配对的单个或两个寡聚核酸分子或核酸分子类似物;所述核酸聚合酶底物类似物所形成的结构具备核酸聚合酶底物的特征并能与核酸聚合酶结合;每种核酸聚合酶底物类似物的分子数目大于核酸聚合酶的分子数目,即每种核酸聚合酶底物类似物的摩尔浓度高于核酸聚合酶的摩尔浓度;
c.所述核酸聚合酶底物类似物的3’端具有抑制其延伸的修饰;
d.所述两种及以上核酸聚合酶底物类似物具有不同的温度适应范围宽度;
e.当保持或低于第一温度时,所述两种及以上核酸聚合酶底物类似物与核酸聚合酶混合时,二者形成核酸聚合酶-底物类似物复合体,此时核酸聚合酶酶活性相对于无核酸聚合酶底物类似物存在时显著降低;
f.当高于所述第一温度时,“e”中的所述核酸聚合酶-底物类似物复合体解体,核酸聚合酶活性全部或部分被释放出来。
在本发明的优选的实施方案中,g.当高于第二温度且低于第一温度时时,温度适应范围宽的核酸聚合酶底物类似物与核酸聚合酶形成核酸聚合酶-底物类似物复合体,温度适应范围窄的核酸聚合酶底物类似物不能与核酸聚合酶形成核酸聚合酶-底物类似物复合体;
所述第一温度高于所述第二温度。
在本发明中,两种及以上核酸聚合酶底物类似物具有不同的温度适应范围宽度,当保持或低于第一温度时,两种及以上核酸聚合酶底物类似物与核酸聚合酶形成稳定结构,此时核酸聚合酶的酶活被抑制;当高于第二温度且低于第一温度时,温度适应范围宽的核酸聚合酶底物类似物与核酸聚合酶形成稳定结构,但温度适应范围窄的核酸聚合酶底物类似物已不能与核酸聚合酶形成稳定结构,即该核酸聚合酶底物类似物已经失去抑制核酸聚合酶的能力,此时核酸聚合酶的酶活仅被另一种更为稳定的核酸聚合酶底物类似物所抑制;当高于所述第一温度时,所述两种及以上核酸聚合酶从核酸聚合酶底物类似物上脱离下来,发挥活性。
在本发明中,温度适应范围宽度是指核酸聚合酶底物类似物能够与核酸聚合酶形成稳定结构的温度范围(例如2~70℃,5~65℃等);温度适应范围宽的核酸聚合酶底物类似物是指在第一温度和第二温度下,均能够与核酸聚合酶形成稳定结构的核酸聚合酶底物类似物;温度适应范围窄的核酸聚合酶底物类似物是指在第二温度下,能够与核酸聚合酶形成稳定结构的核酸聚合酶底物类似物。
本发明的核酸聚合酶底物类似物通过模拟与核酸聚合酶结合的底物(例如NTP(核苷三磷酸)或dNTP(脱氧核苷三磷酸)),与核酸聚合酶结合。其能在温度控制下,使核酸聚合酶失去或恢复活性,核酸聚合酶底物类似物能适用于所有核酸聚合酶。
在本发明的优选的实施方案中,所述第一温度和第二温度具有温度差,所述温度差大于或等于5摄氏度。
在本发明的优选的实施方案中,所述第一温度和第二温度均是所述核酸聚合酶发挥活性的温度,具体温度依据核酸聚合酶及反应条件而定。
举例说明,本发明的核酸聚合酶底物类似物的混合物与核酸聚合酶的具体作用过程:
当核酸聚合酶底物类似物的混合物包含两种核酸聚合酶底物类似物,即分别为第一种核酸聚合酶底物类似物和第二种核酸聚合酶底物类似物,第一温度为50℃,第二温度为40℃。当保持或低于50℃时,两种核酸聚合酶底物类似物均能够与核酸聚合酶形成稳定结构,此时核酸聚合酶的酶活被抑制;但高于40℃且低于50℃时,具有该温度适应范围宽度的核酸聚合酶底物类似物与核酸聚合酶形成稳定结构,但不具有该温度适应范围宽度的核酸聚合酶底物类似物已不能与核酸聚合酶形成稳定结构,即该核酸聚合酶底物类似物已经失去抑制核酸聚合酶的能力,此时核酸聚合酶的酶活仅被另一种更为稳定的核酸聚合酶底物类似物所抑制;当高于50℃时,所述两种及以上核酸聚合酶从核酸聚合酶底物类似物上脱离下来,发挥活性。
发明人研究发现,核酸聚合酶底物类似物的温度适应范围宽度与其分子内或分子间互补链的稳定性有关,而互补链的衡量标准是解链温度。即核酸聚合酶底物类似物的互补链越稳定,其解链温度就越高,因此温度适应范围更宽;反之,解链温度就越低,其温度适应范围越窄。
申请人之前申请的专利(发明名称:一种核酸配体,申请号:202010576818.3)中研究了分子内或分子间互补配对的碱基数量对酶活的抑制作用。研究发现,随着配对的碱基数量增加,对酶活的抑制会逐渐增加随之降低。因此,在本发明的优选的实施方案中,互补配对碱基的个数为8~35;
优选地,所述互补配对碱基的个数为10~30;
更优选地,所述互补配对碱基的个数为10~20;
进一步优选地,分子内互补配对碱基的个数为8~20,分子间互补配对碱基的个数为10~32。
由于核酸聚合酶底物类似物的温度适应范围宽度与其分子内或分子间互补配对的碱基数量有关,与其自身的核酸序列关联不大,而本发明正是利用不同温度下,核酸聚合酶底物类似物的温度适应范围宽度不同来实现对一定温度下(特别是低温时)的酶活性,从而实现对非特异性扩增的抑制。因此,基于本发明的核酸聚合酶底物类似物与核酸聚合酶的作用机理,本发明对核酸聚合酶底物类似物的核酸序列不作具体的限定。只要核酸聚合酶底物类似物的互补配对碱基的数量满足本发明的条件,且两种及以上核酸聚合酶底物类似物的分子内或分子间互补配对的碱基数量不相同即可。本发明在实施例中也验证了,在一种核酸聚合酶底物类似物中加入一种、两种、三种或四种核酸聚合酶底物类似物均能在一定温度下(特别是低温时)有效地抑制非特异性扩增,即验证了本发明非特异性扩增的抑制与核酸聚合酶底物类似物本身的序列关联不大,主要在于其分子内或分子间互补配对的碱基数量。
在本发明的优选的实施方案中,所述核酸聚合酶底物类似物的3’端为非-OH基团;原则是3’端任何-OH基团但能形成与核酸聚合酶的复合体;核酸聚合酶底物类似物的3’端抑制其延伸的修饰包括但不限于双脱氧修饰、磷酸化修饰或氨基修饰等。
申请人之前申请的专利(发明名称:一种核酸配体,申请号:202010576818.3)中采用双脱氧方法进行3’端修饰以终止末端延伸,同时把3’端不修饰的核酸分子作为对照,测试3’端不修饰的核酸分子是否也能抑制酶活。试验结果表明,加入对照核酸配体的酶活保持完全活力,增加很快;而加入经修饰的核酸配体的体系,酶活被大部分抑制,达到预期的结果,可以封闭体系。此试验说明核酸配体的3’端修饰对于抑制核酸酶的酶活非常重要。
本发明核酸聚合酶底物类似物的混合物适用于所有的聚合酶,包括DNA聚合酶和RNA聚合酶。所述DNA聚合酶为热稳定DNA聚合酶如来自Family A,如Thermus aquaticus、Thermus thermophilus、Thermus filiformis、Thermus flavu、Bacillusstearothermophilus等,以及来自Family B,如Pyrococcus furiosus、ThermococcusKodakaraensis等,所述DNA聚合酶也可以是热不稳定如来自AMV、MMLV等家族的反转录酶。本发明的实施例也验证了核酸聚合酶底物类似物的混合物能够在一定下温度下抑制反转录酶或DNA聚合酶的活性,在高于一定温度时,核酸聚合酶的活性被部分或全部释放出来。这表明本发明的核酸聚合酶底物类似物的混合物能有在一定温度下抑制所有类型的核酸聚合酶的酶活性,适用于所有类型的核酸聚合酶,通用性强。
本发明的核酸聚合酶底物类似物混合物包含两种及以上核酸聚合酶底物类似物,并且至少两种核酸聚合酶底物类似物具有不同的温度适应范围宽度,与加入一种核酸聚合酶底物类似物的对照相比,能更好地抑制一定温度下核酸聚合酶的酶活,从而更好地抑制非特异性扩增。因此本发明还提供了所述核酸聚合酶底物类似物的混合物在核酸扩增、在制备核酸扩增试剂盒或在制备核酸延伸反应混合物中的应用。
根据上述应用,本发明提供了一种核酸扩增的方法,其包括:
步骤1、将含有靶核酸的待测样品与以下扩增反应试剂接触,形成反应混合物;
a)可与靶核酸杂交的引物;
b)核酸聚合酶;
c)核酸聚合酶底物类似物的混合物;
d)核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸或二者的混合物,或核苷/脱氧核苷三磷酸类似物;
步骤2、加热所述反应混合物使所述核酸聚合酶底物类似物的配对核苷酸解离成单链,核酸聚合酶从所述核酸聚合酶底物类似物上脱离下来,发挥活性,形成引物延伸产物。
在本发明的优选的实施方案中,所述核苷三磷酸包括dUTP、dATP、dCTP、dGTP或dTTP。
在本发明的优选的实施方案中,所述核酸扩增的方法,进一步包括检测引物延伸产物的步骤。
此外,本发明还提供了一种核酸扩增试剂盒,其包括上述核酸聚合酶底物类似物混合物或上述核酸聚合酶底物类似物的混合物与核酸聚合酶的混合物。
同时,本发明还提供了一种核酸延伸反应混合物,其包含上述核酸聚合酶底物类似物混合物或含有上述核酸聚合酶底物类似物的混合物与核酸聚合酶的混合物、任选地核酸聚合酶、至少一种引物、核酸模板;以及核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸或二者的混合物,或核苷/脱氧核苷三磷酸类似物。
由以上技术方案可知,本发明提供了一种核酸聚合酶底物类似物的混合物,当扩增反应混合物保持或低于一定的温度时,核酸聚合酶的酶活被核酸聚合酶底物类似物混合物抑制,没有残余酶活。而当加热反应混合物时,核酸聚合酶从所述核酸聚合酶底物类似物混合物上脱离下来,发挥活性,形成引物延伸产物,从而达到抑制非特异性扩增的作用。本发明核酸聚合酶底物类似物的混合物适用于所有的聚合酶,可以广泛应用于核酸扩增领域,从而减少非特异性反应。
附图说明
图1所示为本发明核酸聚合酶底物类似物(分子内互补配对)与核酸聚合酶作用的示意图;
图2所示为本发明核酸聚合酶底物类似物(分子间互补配对)与核酸聚合酶作用的示意图;
图3所示为反转录酶(Reverse transcriptase)在未添加核酸聚合酶底物类似物和添加两种核酸聚合酶底物类似物,在37℃等温延伸时的酶活;上图为未添加核酸聚合酶底物类似物和添加两种核酸聚合酶底物类似物的酶活曲线,下图为反应温度曲线;
图4所示为反转录酶(Reverse transcriptase)在未添加核酸聚合酶底物类似物和添加两种核酸聚合酶底物类似物,在55℃等温延伸时的酶活;上图为未添加核酸聚合酶底物类似物和添加两种核酸聚合酶底物类似物的酶活曲线,下图为反应温度曲线;
图5所示为DNA聚合酶(BST DNA Polymerase)在未添加核酸聚合酶底物类似物和添加一种核酸聚合酶底物类似物,在45℃等温延伸时的酶活;上图为未添加核酸聚合酶底物类似物和添加一种核酸聚合酶底物类似物的酶活曲线,下图为反应温度曲线;
图6所示为DNA聚合酶(BST DNA Polymerase)在未添加核酸聚合酶底物类似物和添加一种核酸聚合酶底物类似物,在65℃等温延伸时的酶活;上图为未添加核酸聚合酶底物类似物和添加一种核酸聚合酶底物类似物的酶活曲线,下图为反应温度曲线;
图7所示为TAQ酶在未添加核酸聚合酶底物类似物、分别添加核酸聚合酶底物类似物1和2,在30℃等温延伸时的酶活;
图8所示为TAQ酶在未添加核酸聚合酶底物类似物、分别添加核酸聚合酶底物类似物1和2,在40℃等温延伸时的酶活;
图9所示为TAQ酶在未添加核酸聚合酶底物类似物、分别添加核酸聚合酶底物类似物1和2,在50℃等温延伸时的酶活;
图10所示为TAQ酶在未添加核酸聚合酶底物类似物、分别添加核酸聚合酶底物类似物1和2,在60℃等温延伸时的酶活;
图11所示为TAQ酶在未添加核酸聚合酶底物类似物、分别添加核酸聚合酶底物类似物1和2,在70℃等温延伸时的酶活;
图12所示为模板量0.03125ng的人基因组M2扩增结果;从上至下依次为核酸聚合酶底物类似物1修饰TAQ酶的0.03125ng扩增结果、核酸聚合酶底物类似物2修饰TAQ酶的0.03125ng扩增结果、核酸聚合酶底物类似物1和2等比混合修饰TAQ酶的0.03125ng扩增结果;
图13所示为模板量0.0625ng的人基因组M2扩增结果;从上至下依次为核酸聚合酶底物类似物1修饰TAQ酶的0.0625ng扩增结果、核酸聚合酶底物类似物2修饰TAQ酶的0.0625ng扩增结果、核酸聚合酶底物类似物1和2等比混合修饰TAQ酶的0.0625ng扩增结果;
图14所示为模板量0.125ng的人基因组M2扩增结果;从上至下依次为核酸聚合酶底物类似物1修饰TAQ酶的0.125ng扩增结果、核酸聚合酶底物类似物2修饰TAQ酶的0.125ng扩增结果、核酸聚合酶底物类似物1和2等比混合修饰TAQ酶的0.125ng扩增结果;
图15所示为模板量为0.03125ng的人类基因组基因,添加不同的核酸聚合酶底物类似物,4℃下放置1天的扩增结果;从上至下依次为添加核酸聚合酶底物类似物1的扩增结果、添加核酸聚合酶底物类似物1和2混合物的扩增结果以及添加核酸聚合酶底物类似物1、2、3混合物的扩增结果;
图16所示为模板量为0.0625ng的人类基因组基因,添加不同的核酸聚合酶底物类似物,4℃下放置1天的扩增结果;从上至下依次为添加核酸聚合酶底物类似物1的扩增结果、添加核酸聚合酶底物类似物1和2混合物的扩增结果以及添加核酸聚合酶底物类似物1、2、3混合物的扩增结果;
图17所示为模板量为0.125ng的人类基因组基因,添加不同的核酸聚合酶底物类似物,4℃下放置1天的扩增结果;从上至下依次为添加核酸聚合酶底物类似物1的扩增结果、添加核酸聚合酶底物类似物1和2混合物的扩增结果以及添加核酸聚合酶底物类似物1、2、3混合物的扩增结果;
图18所示为模板量为0.03125ng的人类基因组基因,添加不同的核酸聚合酶底物类似物,未放置,直接扩增的结果;从上至下依次为添加核酸聚合酶底物类似物1的扩增结果、添加核酸聚合酶底物类似物1和2混合物的扩增结果以及添加核酸聚合酶底物类似物1、2、3混合物的扩增结果;
图19所示为模板量为0.0625ng的人类基因组基因,添加不同的核酸聚合酶底物类似物,未放置,直接扩增的结果;从上至下依次为添加核酸聚合酶底物类似物1的扩增结果、添加核酸聚合酶底物类似物1和2混合物的扩增结果以及添加核酸聚合酶底物类似物1、2、3混合物的扩增结果;
图20所示为模板量为0.125ng的人类基因组基因,添加不同的核酸聚合酶底物类似物,未放置,直接扩增的结果;从上至下依次为添加核酸聚合酶底物类似物1的扩增结果、添加核酸聚合酶底物类似物1和2混合物的扩增结果以及添加核酸聚合酶底物类似物1、2、3混合物的扩增结果;
图21所示为不同模板量的人类基因组基因,未添加核酸聚合酶底物类似物,4℃下放置1天的扩增结果;从上至下依次为模板量0.03125ng、0.0625ng和0.125ng的人类基因组基因的扩增结果;
图22所示为不同模板量的人类基因组基因,添加核酸聚合酶底物类似物1、2、3和4的混合物,4℃下放置1天的扩增结果;从上至下依次为模板量0.03125ng、0.0625ng和0.125ng的人类基因组基因的扩增结果;
图23所示为不同模板量的人类基因组基因,添加核酸聚合酶底物类似物1、2、3、4和5的混合物,4℃下放置1天的扩增结果;从上至下依次为模板量0.03125ng、0.0625ng和0.125ng的人类基因组基因的扩增结果。
具体实施方式
本发明公开了一种核酸聚合酶底物类似物的混合物及其应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明所述核酸聚合酶底物类似物的混合物及其应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述核酸聚合酶底物类似物及其应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中,所提供的对比试验各处理组所采用的原料均相同,且各组除去应有的区别外其他试验条件保持一致。本发明所涉及原料、试剂等,如无特殊说明均可通过市售途径获得。
除非特别定义,本专利所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。以下的文献中本领域中大部分专业名词的一般定义,本专利中所使用的专业名词与上述文献中对该专业名词描述一致。
名词“核苷酸”一般指的是一个核苷通过酯键与一个酸性分子或基团相连而形成的化合物,例如,核苷的磷酸酯,通常有一个、两个或三个磷酸基团共价连接在核苷的糖基团的5号位上。在一些情况下,核苷酸的定义还包括一些典型核苷酸的同系物或类似物。DNA聚合酶通常利用三磷酸2’脱氧核苷酸合成DNA。
名词“核酸”包括脱氧核糖核酸(DNA),核糖核酸(RNA),DNA-RNA杂交体,寡聚核苷酸,适配体(aptamers),肽核酸(PNAs),PNA-DNA杂交体,PNA-RNA杂交体等等。包括一切线性形式(单链或双链)或分支状形式的共价相连的核苷酸。一个典型的核酸通常是单链或者双链的,并包含磷酸二脂键。
名词“扩增”指的是目的核酸片段在核酸聚合酶的作用下数目变多的过程,包括但不限于聚合酶链式反应(PCR),连接酶链式反应(LCR),核酸序列基础扩增(NASBA)等。
在本发明实施例中,扩增指的是聚合酶链式反应(PCR)。模板变性解链,寡聚核苷酸引物与模板退火杂交,伴随着核苷酸加入的延伸,如此反复循环一定轮数,实现目的核苷酸片段的增多。
名词“嗜热酶”指的是对于加热是稳定的促进核苷酸的聚合以形成多核苷酸延伸产物。通常,在热循环过程中嗜热稳定的聚合酶是常用的,在PCR循环过程中通过高温(通常是95℃)使双链核苷酸变性。本文描述的有效用于PCR扩增反应的嗜热酶满足至少一个标准,当经受升高的温度为实现双链核苷酸变性所必需的时间时,该酶没有被变性。在一些实验体系中,90℃---100℃嗜热酶将不会变性。
如本文所用,“核酸聚合酶底物类似物”是对核酸聚合酶具有非共价结合作用的非天然存在的,且由寡聚核酸组成。在优选的实施方案中,该核酸聚合酶底物类似物对核酸聚合酶分子具有结合亲和力,其中核酸聚合酶底物类似物不是具有已知与靶分子结合的生理功能的核酸。
本文中用的核酸聚合酶底物类似物,通过模拟核酸聚合酶的底物与核酸聚合酶结合,是能在分子内或分子间形成互补配对的单个或两个核酸分子或核酸分子类似物,这些核酸分子或核酸分子类似物的3’端进行修饰,起到终止聚合酶延伸的作用,其结构在保持或低于一定温度时稳定,当在加热状态下,该核酸聚合酶底物类似物-核酸聚合酶复合体解体,核酸聚合酶从核酸聚合酶底物类似物中脱离下来,让核酸聚合酶发挥其应有的作用。
“核酸”是指DNA,RNA,单链或双链及其任何化学修饰。修饰包括但不限于那些提供其他化学基团的修饰,这些化学基团将附加电荷,极化性,氢键,静电相互作用和对核酸聚合酶底物类似物碱基或整个核酸聚合酶底物类似物的通量掺入。此类修饰包括但不限于2'-位糖修饰,5-位嘧啶修饰,8-位嘌呤修饰,环外胺上的修饰,4-硫尿苷的取代,5-溴或5-碘-的取代。尿嘧啶,主链修饰,甲基化,不同寻常的碱基配对组合,例如异碱基异胞苷和异胍等。修饰还可以包括3'和5'修饰,例如封端。
“等温延伸测酶活”方法涉及选择核酸聚合酶底物类似物的性能评估,所述核酸聚合酶底物类似物以理想的方式与聚合酶相互作用。在本发明中,采用等温延伸测酶活方法来验证核酸聚合酶的核酸聚合酶底物类似物。
如本文所用,“对于核酸聚合酶底物类似物”是通过等温延伸方法鉴定的核酸聚合酶底物类似物,其基于温度参数调节对其taq酶的亲和力大小。在优选的实施方案中,主要考参数是温度,并且核酸聚合酶底物类似物在升高的温度下对其taq酶的亲和力降低。
如本文所用,“核酸聚合酶”是指通过使用DNA或RNA(反转录酶)作为模板通过将脱氧核糖核苷酸单元添加至DNA链来催化DNA合成的任何酶。
“开关”是指根据某些特定的反应条件起开启或关闭反应作用的任何化合物。在本发明中,核酸聚合酶底物类似物的功能是根据以下情况将PCR“打开”或“关闭”。
本发明的核酸聚合酶底物类似物的3’端具有抑制其延伸的修饰,包括但不限于双脱氧修饰、磷酸化修饰或氨基修饰等。双脱氧修饰、磷酸化修饰或氨基修饰均可采用本领域已知的方法进行修饰。例如,双脱氧修饰可利用末端转移酶(TdT)催化脱氧核苷酸(dNTPs)或双脱氧核苷酸(ddNTPs)结合到DNA分子的3'羟基端的特性,将引物与四种双脱氧核苷酸(ddATP,ddTTP,ddCTP或ddGTP)中的任何一种混合,TdT可以将双脱氧核苷酸添加到引物的3’端,所获得的这种被ddNTP修饰的引物不能被DNA聚合酶催化延伸。Invitrogen提供3’氨基修饰(AminolinkerC6/7/12)。使用磷酸盐-ON(也称为化学磷酸化试剂(CPR))常规地实现3’末端的磷酸化,例如通过添加到任何支持物(例如dT柱)中掺入3’磷酸。3'-磷酸化用于阻断酶活性。
在本发明具体实施方式中,本发明提供了多种核酸聚合酶底物类似物,如SEQ IDNO:1-8所示。本发明在具体实施方式中主要用了反转录酶、BST DNA聚合酶和TAQ酶进行说明,但是实际上本发明所述的核酸聚合酶底物类似物可以适用于所有的核酸聚合酶,及核酸扩增反应。
下面结合具体的实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。下述实施例仅用于对本发明进行说明,并不会对本发明的保护范围进行限制。
实施例1:核酸聚合酶底物类似物的混合物对反转录酶(Reverse transcriptase)酶活的作用
使用两种核酸聚合酶底物类似物的混合物,核酸聚合酶底物类似物6,7分子间形成配对,测试在37℃等温延伸时能否抑制酶活,以及在55℃等温延伸时,能够释放RT(反转录酶)酶活力。本实施例中核酸聚合酶底物类似物的混合物为核酸聚合酶底物类似物6和7的等摩尔的混合物。
核酸聚合酶底物类似物6
TCGAACGGGACGGCTGGCTGTGTGTGT(如SEQ ID NO:1所示),3’端磷酸化修饰RNA
核酸聚合酶底物类似物7
CCAGCCGTCC(如SEQ ID NO:2所示),3’端双脱氧修饰DNA
核酸聚合酶底物类似物6和7中的下划线为互补配对碱基。
反应体系:
组分 | 每份加入体积ul |
5x RT buffer | 5 |
25mM each dNTPs | 0.2 |
100x SG | 0.1 |
100uM引物 | 0.1 |
0.8mg/ml RNA | 0.3 |
25%甘油 | 5.1 |
200U/ul RT | 0.1 |
40U/ul RNase inhibitor | 0.1 |
6uM核酸聚合酶底物类似物 | 1 |
ddH<sub>2</sub>O | 13 |
利用单链延伸方法检测,使用购买的RNA及相关引物进行测活,荧光定量方法实时检测,本发明使用的仪器为罗氏LC480II。
上述反应体系分别在以下反应条件下进行等温延伸:(37℃,30s)×45循环和(55℃,30s)×45循环。
37℃下等温延伸时的酶活见图3。从图3可以看出,在37℃等温延伸时,未添加核酸聚合酶底物类似物的RT酶(反转录酶)在第14个循环时曲线开始变弯,选择前14个循环数据进行计算。以未添加核酸聚合酶底物类似物的RT酶残余酶活为100%作为参照,添加了核酸聚合酶底物类似物的混合物的RT酶残余酶活为16%,表明添加核酸聚合酶底物类似物的混合物(核酸聚合酶底物类似物6和7)能有效抑制RT(反转录酶)酶活力。
名称 | 酶活信号增加值 | 残余酶活 |
未添加核酸聚合酶底物类似物 | 5.16 | 100% |
添加核酸聚合酶底物类似物的混合物 | 0.82 | 16% |
55℃下等温延伸时的酶活见图4。从图4可以看出,在55℃等温延伸时,添加核酸聚合酶底物类似物的混合物和未添加核酸聚合酶底物类似物的RT酶均在第8个循环时酶活曲线开始变弯,第15个循环时到达最高酶活信号值,表明添加核酸聚合酶底物类似物的混合物(核酸聚合酶底物类似物6和7)能100%释放RT(反转录酶)酶活力。
实施例2:核酸聚合酶底物类似物对BST DNA聚合酶(DNA Polymerase)酶活的作用
本实施例使用核酸聚合酶底物类似物8,测试在45℃等温延伸时能否抑制酶活,以及在65℃等温延伸时,能够释放BST DNA聚合酶酶活力。
核酸聚合酶底物类似物8
TTGATGACTGATCATGCATGATCAGTC(如SEQ ID NO:3所示),下划线为互补配对碱基
反应体系:
组分 | 每份加入体积ul |
10x bufferA | 2.5 |
1M MgCl<sub>2</sub> | 0.125 |
25mM each dNTP | 0.2 |
100x SG | 0.4 |
100uM引物 | 0.1 |
0.73mg/ml DNA | 0.45 |
100U/ul BST | 0.05 |
2uM核酸聚合酶底物类似物 | 1 |
ddH<sub>2</sub>O | 20.175 |
利用单链延伸方法检测,使用购买的DNA及相关引物进行测活,荧光定量方法实时检测,本发明使用的仪器为罗氏LC480II。
上述反应体系分别在以下反应条件下进行等温延伸:(45℃,2s)×99循环和(65℃,2s)×99循环
45℃下等温延伸时的酶活见图5。从图5可以看出,在45℃等温延伸时,未添加核酸聚合酶底物类似物8的BST酶在第48个循环时曲线开始变弯,选择前48个循环数据进行计算。以未添加核酸聚合酶底物类似物8的BST酶残余酶活为100%作为参照,添加了核酸聚合酶底物类似物8的BST酶残余酶活为8%,表明核酸聚合酶底物类似物8能有效抑制BST酶活力。
名称 | 酶活信号增加值 | 残余酶活 |
未添加核酸聚合酶底物类似物 | 135 | 100% |
添加核酸聚合酶底物类似物 | 11 | 8% |
65℃下等温延伸时的酶活见图6。从图6可以看出,在65℃等温延伸时,添加核酸聚合酶底物类似物8和未添加核酸聚合酶底物类似物8的BST酶均在第8个循环时酶活曲线开始变弯,第18个循环时基本到达最高酶活信号值,表明添加核酸聚合酶底物类似物8能100%释放BST DNA聚合酶酶活力。
实施例3不同核酸聚合酶底物类似物对TAQ酶酶活的作用不同
本实施例分别使用核酸聚合酶底物类似物1和2,测试在不同温度下(30℃、40℃、50℃、60℃和70℃)抑制和释放TAQ酶酶活力。
核酸聚合酶底物类似物1
TCGAACGGTATATATATTAATATATATATAC(如SEQ ID NO:4所示)
核酸聚合酶底物类似物2
TCGAACGGATTACAGCTGTAATC(如SEQ ID NO:5所示),下划线为互补配对碱基
核酸聚合酶底物类似物1和2均为3’端双脱氧修饰。
(一)抑制与释放TAQ酶活力对比
反应体系:
反应条件:(30/40/50/60/70℃,30s)×30循环。
核酸聚合酶底物类似物1和2在不同温度等温条件下,抑制和释放酶活力不一样,不同温度下等温延伸时的酶活分别见图7~11。从图7~11可以看出,核酸聚合酶底物类似物1和2在30℃和40℃时均能抑制TAQ酶活释放。添加了核酸聚合酶底物类似物2的TAQ酶,在50℃时开始释放酶活,60℃及以上能完全释放酶活。而核酸聚合酶底物类似物1在60℃时才开始释放酶活,到70℃时,完全释放酶活。
实施例4 2种核酸聚合酶底物类似物混合修饰TAQ酶与单一核酸聚合酶底物类似物修饰TAQ酶的功能试验对比
实验方法:
分别将核酸聚合酶底物类似物1、核酸聚合酶底物类似物2、核酸聚合酶底物类似物1和2的等摩尔混合物,与TAQ酶混合进行PCR扩增,比较酶的扩增效果。
反应体系:
组分 | 每份加入体积ul |
5x Mix1 buffer | 2 |
5x NH6A | 2 |
M2(0.03125/0.0625/0.125ng/ul) | 1 |
NU-TAQ 8U/ul | 1 |
ddH<sub>2</sub>O | 4 |
反应条件:
95℃,1min;(95℃,10s;59℃,1min;72℃,20s)×29循环;60℃,10min
图12~14分别为模板量为0.03125ng、0.0625ng和0.125ng的人基因组M2,添加不同的核酸聚合酶底物类似物的扩增结果。从图12~14可以看出,单一核酸聚合酶底物类似物修饰TAQ酶体系扩增试验,小片段非特异扩增明显多于2种核酸聚合酶底物类似物的混合物修饰TAQ酶的体系,表示为单一核酸聚合酶底物类似物扩增时,前面圆圈部位出现的非特异扩增条带明显多于2种核酸聚合酶底物类似物扩增时的非特异性扩增条带。故混合核酸聚合酶底物类似物修饰酶效果好于单一核酸聚合酶底物类似物修饰酶。
实施例5低温和常温下,1种、2种和3种核酸聚合酶底物类似物的混合物与Taq酶混合进行PCR扩增的结果
分别将核酸聚合酶底物类似物1,核酸聚合酶底物类似物1和2的混合物,核酸聚合酶底物类似物1、2和3的混合物与Taq酶混合进行PCR扩增,比较酶的扩增效果。核酸聚合酶底物类似物的3’端最后一个碱基进行修饰,本实施例采用3'端双脱氧修饰。将Taq DNA聚合酶与核酸聚合酶底物类似物1混合,作为对照。再将核酸聚合酶底物类似物2和核酸聚合酶底物类似物3分别与酶混合,最后制成4U的酶量进行试验。核酸聚合酶底物类似物1和2的混合物的总浓度为1U酶在对照基础上多加3um(3umol/L)核酸聚合酶底物类似物2;核酸聚合酶底物类似物1、2和3的混合物的总浓度为1U酶在对照基础上分别多加3um(3umol/L)核酸聚合酶底物类似物2和3um(3umol/L)核酸聚合酶底物类似物3。
核酸聚合酶底物类似物1
TCGAACGGTATATATATTAATATATATATAC(如SEQ ID NO:4所示)
核酸聚合酶底物类似物2
TCGAACGGATTACAGCTGTAATC(如SEQ ID NO:5所示)
核酸聚合酶底物类似物3
TCGAACGGCTACAGCTGTAGC(如SEQ ID NO:6所示)
核酸聚合酶底物类似物2和3中的下划线为互补配对碱基。
反应条件及反应加入量为
NH25:95℃,1min;(95℃,10s;59℃,1min;72℃,20s)×29循环;60℃,10min
组分 | 每份加入体积ul |
5x Mix1 buffer | 2 |
5x NH25 | 2 |
M2(0.03125/0.0625/0.125ng/ul) | 1 |
NU-TAQ 12 4U/ul | 2 |
ddH<sub>2</sub>O | 3 |
图15~17是将反应混合物在4℃放置一天后的试验结果,从试验结果可以看出,当在模板浓度范围内0.03125ng、0.0625ng和0.125ng时,当不加入核酸聚合酶底物类似物2,或不加入核酸聚合酶底物类似物2和3时,不同浓度的DNA扩增明显变差,表示为前面圆圈部位出现一些非特异扩增条带,甚至不能正确分型,影响试验判读准确性;而加入核酸聚合酶底物类似物2或核酸聚合酶底物类似物2和3的体系,非特异性扩增条带明显减少。本实施例说明加入2种或3种核酸聚合酶底物类似物的混合物,可以极大减少低温下的非特异扩增。
图18~20是反应混合物没有放置,直接试验的结果。从试验结果可以看出,当在模板浓度范围内0.03125ng、0.0625ng和0.125ng时,加入核酸聚合酶底物类似物2,或者加入核酸聚合酶底物类似物2和3,对正常试验并没有影响作用,可以正常分型。
实施例6低温下,4种、5种核酸聚合酶底物类似物的混合物与Taq酶混合进行PCR扩增的结果
分别将核酸聚合酶底物类似物1、2、3和4的混合物,核酸聚合酶底物类似物1、2、3、4和5的混合物与酶混合进行PCR扩增,比较酶的扩增效果。核酸聚合酶底物类似物的3’端最后一个碱基进行修饰,本实施例采用3'端双脱氧修饰。
核酸聚合酶底物类似物1
TCGAACGGTATATATATTAATATATATATAC(如SEQ ID NO:4所示)
核酸聚合酶底物类似物2TCGAACGGATTACAGCTGTAATC(如SEQ ID NO:5所示)
核酸聚合酶底物类似物3TCGAACGGCTACAGCTGTAGC(如SEQ ID NO:6所示)
核酸聚合酶底物类似物4TCGAACGGGATATATCC(如SEQ ID NO:7所示)
核酸聚合酶底物类似物5TCGAACGGGTATACC(如SEQ ID NO:8所示)
核酸聚合酶底物类似物2-5中的下划线为互补配对碱基。
实验方法同实施案例5。
图21是不添加核酸聚合酶底物类似物,将反应混合物4℃放置一天后的试验结果。从图21的试验结果可以看出,当在模板浓度范围内0.03125ng、0.0625ng和0.125ng时,不加入核酸聚合酶底物类似物,扩增效果变差,不能正确分型。
图22是添加核酸聚合酶底物类似物1、2、3和4的混合物,4℃放置一天后的试验结果。从图22的试验结果可以看出,当在模板浓度范围内0.03125ng、0.0625ng和0.125ng时,加入4种核酸聚合酶底物类似物,对正常实验并没有影响作用,能正确分型。
图23是添加核酸聚合酶底物类似物1、2、3、4、5混合物,4℃放置一天后的试验结果。从图23的试验结果可以看出,当在模板浓度范围内0.03125ng、0.0625ng和0.125ng时,加入5种核酸聚合酶底物类似物,对正常实验并没有影响作用,能正确分型。
本实施例说明加入4种或5种核酸聚合酶底物类似物的混合物,可以极大减少低温下的非特异扩增。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州新海生物科技股份有限公司
<120> 一种核酸聚合酶底物类似物的混合物及其应用
<130> CP1210295/CB
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgaacggga cggctggctg tgtgtgt 27
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagccgtcc 10
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgatgactg atcatgcatg atcagtc 27
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgaacggta tatatattaa tatatatata c 31
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgaacggat tacagctgta atc 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgaacggct acagctgtag c 21
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgaacggga tatatcc 17
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcgaacgggt atacc 15
Claims (12)
1.一种核酸聚合酶底物类似物的混合物,其中:
a.包含两种及以上核酸聚合酶底物类似物;
b.所述核酸聚合酶底物类似物是在分子内形成互补配对的单个寡聚核酸分子或核酸分子类似物,或者是在分子间形成互补配对的单个或两个寡聚核酸分子或核酸分子类似物;所述核酸聚合酶底物类似物所形成的结构具备核酸聚合酶底物的特征;
c.所述核酸聚合酶底物类似物的3’端具有抑制其延伸的修饰;
d.所述两种及以上核酸聚合酶底物类似物具有不同的温度适应范围宽度;
e.当保持或低于第一温度时,所述两种及以上核酸聚合酶底物类似物与核酸聚合酶混合时,二者形成核酸聚合酶-底物类似物复合体,此时核酸聚合酶酶活性相对于无核酸聚合酶底物类似物存在时显著降低;
f.当高于所述第一温度时,“e”中的所述核酸聚合酶-底物类似物复合体解体,核酸聚合酶活性全部或部分被释放出来。
2.一种核酸聚合酶底物类似物的混合物与核酸聚合酶的混合物,其中:
a.包含两种及以上核酸聚合酶底物类似物;
b.所述核酸聚合酶底物类似物是在分子内形成互补配对的单个寡聚核酸分子或核酸分子类似物,或者是在分子间形成互补配对的单个或两个寡聚核酸分子或核酸分子类似物;所述核酸聚合酶底物类似物所形成的结构具备核酸聚合酶底物的特征并能与核酸聚合酶结合;每种核酸聚合酶底物类似物的分子数目大于核酸聚合酶的分子数目;
c.所述核酸聚合酶底物类似物的3’端具有抑制其延伸的修饰;
d.所述两种及以上核酸聚合酶底物类似物具有不同的温度适应范围宽度;
e.当保持或低于第一温度时,所述两种及以上核酸聚合酶底物类似物与核酸聚合酶混合时,二者形成核酸聚合酶-底物类似物复合体,此时核酸聚合酶酶活性相对于无核酸聚合酶底物类似物存在时显著降低;
f.当高于所述第一温度时,“e”中的所述核酸聚合酶-底物类似物复合体解体,核酸聚合酶活性全部或部分被释放出来。
3.根据权利要求1或2所述的混合物,其中:
g.当高于第二温度且低于第一温度时,温度适应范围宽的核酸聚合酶底物类似物与核酸聚合酶形成核酸聚合酶-底物类似物复合体,温度适应范围窄的核酸聚合酶底物类似物不能与核酸聚合酶形成核酸聚合酶-底物类似物复合体;
所述第一温度高于所述第二温度。
4.根据权利要求1-3任一项所述的混合物,其中,所述第一温度和第二温度具有温度差,所述温度差大于或等于5摄氏度。
5.根据权利要求1-4任一项所述的混合物,其中,所述核酸聚合酶底物类似物的温度适应范围宽度与其分子内或分子间互补链的稳定性有关。
6.根据权利要求1-5任一项所述的混合物,其中,互补配对碱基的个数为8~35;
优选地,所述互补配对碱基的个数为10~30;
更优选地,所述互补配对碱基的个数为10~20;
进一步优选地,分子内互补配对碱基的个数为8~20,分子间互补配对碱基的个数为10~32。
7.根据权利要求1-6任一项所述的混合物,其中,所述核酸聚合酶底物类似物的3’端为非-OH基团;
优选地,核酸聚合酶底物类似物的3’端抑制其延伸的修饰包括双脱氧修饰、磷酸化修饰或氨基修饰。
8.根据权利要求1-7任一项所述的混合物,其中,所述核酸聚合酶为DNA聚合酶或RNA聚合酶;
优选地,所述DNA聚合酶为热稳定DNA聚合酶;
所述RNA聚合酶为反转录酶。
9.权利要求1-8任一项所述的混合物在核酸扩增、在制备核酸扩增试剂盒或在制备核酸延伸反应混合物中的应用。
10.一种核酸扩增的方法,其包括:
步骤1、将含有靶核酸的待测样品与以下扩增反应试剂接触,形成反应混合物;
a)可与靶核酸杂交的引物;
b)核酸聚合酶;
c)核酸聚合酶底物类似物的混合物;
d)核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸或二者的混合物,或核苷/脱氧核苷三磷酸类似物;
步骤2、加热所述反应混合物使所述核酸聚合酶底物类似物的配对核苷酸解离成单链,核酸聚合酶从所述核酸聚合酶底物类似物上脱离下来,发挥活性,形成引物延伸产物。
11.一种核酸扩增试剂盒,其包括权利要求1-8任一项所述的混合物。
12.一种核酸延伸反应混合物,其包含权利要求1-8任一项所述的混合物、任选地核酸聚合酶、至少一种引物、核酸模板;以及核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸或二者的混合物,或核苷/脱氧核苷三磷酸类似物。
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PB01 | Publication | ||
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