JP2021118748A - ポリメラーゼ酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
ファミリーBポリメラーゼ酵素であって、以下の変異:2番目のアミノ酸がトレオニンであり、9°N内のアミノ酸408〜410と相同であるモチーフA領域における変異と、前記ファミリーBポリメラーゼに存在する場合に3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の低下または排除をもたらす変異とを含み、以下の前記モチーフA領域における変異:L408YもしくはL408Fおよび/またはP410SもしくはP410Gの一方または両方をさらに含む、ファミリーBポリメラーゼ酵素。
(項目2)
変異Y409Tを有する9°Nポリメラーゼ、変異Y412Tを有するVentポリメラーゼ、変異Y410Tを有するPfuポリメラーゼ、変異Y409Tを有するJDF−3ポリメラーゼおよび変異E615Tを有するTaqポリメラーゼからなる群から選択される、項目1に記載のポリメラーゼ。
(項目3)
以下の変異:D215Aおよび/またはD315Aのうちの1つまたは複数を含む、項目1または2に記載のポリメラーゼ。
(項目4)
変異A485Lをさらに含む、項目1から3のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
(項目5)
以下の変異のセット:(i)D215A、D315A、L408Y、Y409T、P410SおよびA485L、または(ii)D215A、D315A、L408F、Y409T、P410GおよびA485Lを有する、項目1から4のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
(項目6)
対照ポリメラーゼと比較して、置換基が天然に存在する3’ヒドロキシル基よりも大きなサイズになるように、3’糖ヒドロキシルにおいて改変されたヌクレオチドの取り込み率の増大を示す、項目1から5のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
(項目7)
項目1から6のいずれか一項に記載のポリメラーゼをコードする核酸分子。
(項目8)
項目7に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
(項目9)
置換基が天然に存在する3’ヒドロキシル基よりも大きなサイズになるように、3’糖ヒドロキシルにおいて改変されたヌクレオチドをDNAに取り込むための方法であって、以下の物質:(i)項目1から6のいずれか一項に記載のポリメラーゼ、(ii)鋳型DNA、(iii)置換基が前記天然に存在する3’ヒドロキシル基よりも大きなサイズになるように、前記3’糖ヒドロキシルにおいて改変された1つまたは複数のヌクレオチドを含む方法。
(項目10)
DNAシークエンシング、DNA標識化、プライマー伸長、増幅などのための、項目1から6のいずれか一項に記載のポリメラーゼの使用。
(項目11)
項目1から6のいずれか一項に記載のポリメラーゼを含むキット。
PLA159[配列番号2]:
D215A/D315A/L408Y/Y409T/P410S/A485L/C末端Hisタグ
PLA163[配列番号4]:
D215A/D315A/L408F/Y409T/P410G/A485L/C末端Hisタグ
Hisタグを付けた変異体ポリメラーゼをNi−NTA−スーパーフローカラムによって分取スケールで精製した。変異体は、SDS−Gel分析によると、99%純粋であった(図1)。
異なるポリメラーゼ変異体の、標識化ヌクレオチド(=ヌクレオチド+ブロッキング基+リンカー−フルオロフォア基)を取り込む能力を測定するために、一塩基取り込みアッセイを実施した。
エキソヌクレアーゼ活性を測定するために、12.5nMのFAM標識化プライマーを25nMの鋳型DNAとアニーリングさせた。アニーリングステップ後にポリメラーゼを鋳型/プライマー混合物に添加した。反応混合物を、ヌクレオチドの添加を伴わずに65℃で60分間インキュベートした。インキュベーション期間後、反応産物をキャピラリー電気泳動によって分析した。分解されたオリゴヌクレオチドと分解されなかったオリゴヌクレオチドはサイズが異なる(分解されなかったオリゴヌクレオチドのピークサイズ:7〜7.2;分解されたオリゴヌクレオチドのピークサイズ:<7)。サイズの異なるピークの蛍光ピーク面積を利用して、分解されたプライマーの量を算出した。
実験的セットアップにおいて、酵素を鋳型−プライマー混合物および4種のヌクレオチド(マッチしないヌクレオチド3種およびマッチするヌクレオチド1種)と一緒にインキュベートした。GeneReader実行の伸長期の間のヌクレオチドの取り込みのために与えられた時間枠である2分後、および30分後に取り込みを測定した(図10)。PLA159およびPLA163をT3およびT9と比較した。ミスマッチ取り込みにより、シークエンシング性能が妨害される可能性があるので、ミスマッチ取り込みがほとんどないか全くないポリメラーゼをシークエンシングのために選択するべきである。
標識化ヌクレオチドについてのT3の取り込み活性を異なるポリメラーゼおよび逆転写酵素と比較した。T3(9°N exo−/L408S/Y409A/P410V)と9°N野生型ポリメラーゼRox−N3−dATPのexo−バリアントの比較を使用した(図11、黒棒)。T3ポリメラーゼを、他の、単一の変異を有する9°N exo−変異体(Therminatorポリメラーゼ;変異A485L)または2つの変異を有する9°N exo−変異体(TherminatorポリメラーゼL408Q)、ならびに単一の変異を有するKOD exo−変異体(L408Q)、野生型Taq−ポリメラーゼ、QiagenからのOmniscript、およびEnzymaticsにより販売されているexo−Klenowポリメラーゼとも比較した。これらの酵素とT3ポリメラーゼの比較のために、R6G−N3−dUTPを使用した(黒色/白棒)。さらに、種々の市販のRT酵素を、Cy5−N3−dGTPを使用してT3と比較した(白棒)。
ポリメラーゼ:1μg/ml
ヌクレオチド濃度:125nM
鋳型:25nM
プライマー:12,5nM
インキュベート時間:2分
温度:65℃
Claims (1)
- 本明細書に記載の発明。
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