JP6316505B2 - 易熱性エキソヌクレアーゼ - Google Patents
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Description
(i)10mM Tris−HCl(25℃でpH8.5)、50mM KClおよび5mM MgCl2から構成されるバッファー中で、約55℃の温度で10分間加熱することにより、実質的に不可逆的に不活性化され;
(ii)一本鎖DNAに実質的に特異的であり;ならびに
(iii)3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
(a)SEQ ID No.1またはこれに少なくとも65%同一なアミノ酸配列、
(b)SEQ ID No.2またはこれに少なくとも65%同一なアミノ酸配列、
(c)SEQ ID No.3またはこれに少なくとも65%同一なアミノ酸配列、
(d)SEQ ID No.4またはこれに少なくとも65%同一なアミノ酸配列、または
(e)SEQ ID No.5またはこれに少なくとも65%同一なアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片は、
(i)10mM Tris−HCl(25℃でpH8.5)、50mM KClおよび5mM MgCl2から構成されるバッファー中で、約55℃の温度で10分間加熱することにより、実質的に不可逆的に不活性化され;
(ii)一本鎖DNAに実質的に特異的であり、ならびに
(iii)3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
「実質的に不可逆的に不活性化される」により、特定の温度まで特定の時間の間、特定のバッファー条件下で加熱すると、酵素が少なくとも90%不活性化され、好ましくは95%、98%、99%、99.5%または99.9%不活性化されることが意味される。パーセンテージ不活性化は、例えば実施例5および6に示されるように、好適に標識された(例えば5’FAM標識された)一本鎖DNA試料(例えば、標準PCRプライマー、例えば、SEQ ID No21−GCTAACTACCACCTGATTACのヌクレオチド配列を有するデオキシリボ核酸プライマー)を、30分間、不活性化されたエキソヌクレアーゼまたは不活性化されていないエキソヌクレアーゼと共に好適なバッファー(例えばTris、HEPES、PBS)中、好適なpH(例えばpH7.5)、好適な温度(例えば30℃)で、Mg2+(例えば5mM)の存在下にてインキュベートし;反応生成物を好適なゲル(例えばアクリルアミド/尿素ゲル)上で電気泳動により分離し、DNAバンドの蛍光の相対強度をUV光下で測定することにより、便利に推定することができる。別の方法が、不活性化されたエキソヌクレアーゼおよび不活性化されていないエキソヌクレアーゼの相対的な活性を測定するために当業者により考案され得、特に10mM Tris−HCl(25℃でpH8.5)、50mM KClおよび5mM MgCl2から構成されるバッファーが使用され得る。
構造的観点では、発明による核酸増幅反応の生成物は鋳型核酸およびNTP、典型的には、加えて、ポリメラーゼおよび少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプライマー(部分的に伸長され得る)を含む。また、典型的には生成物の大半は、好適な核酸増幅バッファー、例えば本明細書で例示されるバッファーから構成されるであろう。核酸増幅反応の好ましい生成物はこれらの要素の全てを含む。
適切な場合には、発明のエキソヌクレアーゼは、自然源から単離され得、例えば、上記の生物の抽出物から単離され、または宿主細胞において組換えにより生成され、それから精製され得る。よって、発明のエキソヌクレアーゼは組換え酵素であってもよく、特に単離された組換え酵素であってもよい。ある一定の実施形態では、エキソヌクレアーゼは、そのエキソヌクレアーゼが天然で見出される生物と同じ生物ではないか、これに由来しない宿主細胞、すなわち異種宿主細胞、において組換え技術により生成される。あるいは、無細胞発現系がエキソヌクレアーゼの生成のために使用され得る。これらのアプローチにより、グリコシル化パターンの変化が得られ得る。
モリテラ・ビスコーサ(HL−ExoI(Mv))、ビブリオ・ウォダニス(HL−ExoI(Vw))、ハロモナス(HL−ExoI(Ha))、サイクロモナス(HL−ExoI(Ps))およびシュワネラ(HL−ExoI(Sh))gDNA由来のsbcBエキソデオキシリボヌクレアーゼI(exoI)遺伝子を、大腸菌TOP10における発現用のpTrc99A発現ベクター中にクローン化遺伝子を挿入することによりC末端His−タグを用いてオーバーラップエクステンションPCRクローニング(Bryksin and Matsumura, 2010, Biotechniques, 48 (6), 463−465)によりクローン化した。使用したプライマーを表1に列挙する。遺伝子源材料を、ノルウェー沖合の海水から単離した細菌から入手した。
実施例2−エキソヌクレアーゼの活性プロファイリング:触媒活性のための最適温度
実施例1からの異なる組換えHL−ExoIをよりよく特徴付けるために温度プロファイルを作成した。異なるHL−ExoIをゲル上での基質分解間の区別を可能にする濃度まで希釈した。異なる希釈係数のために、試料を直接互いに比較することはできなかったが、活性における相対的な温度依存性の差は推定することができた。試料を様々な時間間隔の間インキュベートし、酵素が設定温度をより長い時間維持することができるかどうか決定した。
HL−ExoIを、試料間で最もよい区別を与えると考えられるものまで希釈した(10mM Tris−HCl(25℃でpH7.5)、5mM MgCl2)。PCRクリーンアッププロトコルを模倣するために、ポストPCR溶液を反応バッファーとして使用した。ロバスト性は、実験を並行で、2つの異なるPCRバッファー(GoTaq(Promega)またはTEMPase Key(VWR))に基づくポストPCR溶液を用いて実行することにより達成した。基質として、5pmolの5’FAM標識オリゴヌクレオチド(GCTAACTACCACCTGATTAC;SEQ ID No21)を各反応に添加した。ExoIの添加の後、各試料の総体積は7μlであった。試料を熱サイクラー中で1分、5分または10分間、20℃、25℃、30℃または37℃でインキュベートし、続いて5分80℃でインキュベートした。TBE−Ureaサンプルバッファー(Bio−Rad)を添加し、試料をキャスト20%アクリルアミド/7M尿素ゲルに適用し、180Vでおよそ45分間実行した。全ての試薬は特に指定がない限り全プロトコルの間、氷上で維持され、ワークフローは冷却ブロック上で実施された。
結果を図12に示す。一般に、全てのHL−ExoIはポストPCR試料を調製するために使用された2つのバッファー中で同様に作用し、観察された効果はPCRバッファーの組成に特異的ではなかったことが示される。
実施例3−エキソヌクレアーゼの活性プロファイリング:触媒活性に対する不活性化温度
この実施例では、HL−ExoI(Sh)の熱不活性化特性を様々な市販の大腸菌ExoIと比較した。
HL−ExoI(Sh)は迅速PCRクリーンアップシナリオにおいて満足のいくように作用することができることを確認するために、実験を設定した。比較および陽性対照のために、並行試料を、一流ブランドの酵素PCRクリーンアップ試薬ExoSAP−IT(Affymetrix)で処理した。
ExoSAP−ITで処理される試料は、製造者プロトコルに従い取り扱った。リバースプライマーまたはdNTPのいずれかをPCR溶液に添加した後、試料に2μlのクリーンアップ試薬を添加し、最終体積を7μlとした。試料を15分、37℃で、続いて15分、80℃でインキュベートした。試料を、2つの異なるPCRバッファーを用いて設定し、全ての試料を3連で設定した。
最小不活性化温度および時間を、試験下の各HL−ExoIについて、所与のアッセイ条件下で決定した。これは、HL−ExoIを異なる温度で異なる時間間隔の間インキュベートすることにより達成した。熱処理後、5’標識一本鎖DNAを添加し、基質分解の程度を視覚化した(図15)。基質分解の量を、図16の結果と比較し、熱処理後の残存活性を推定した。
上記の実施例の様々なHL−ExoIについての最小不活性化温度を決定するために、実施例5の不活性化アッセイについての感度閾値を決定した。半定量的アッセイを、エキソヌクレアーゼの段階希釈を用い、各希釈についての基質分解の程度を推定して準備した。比較測定のために、不活性アッセイに使用されたのと同じアッセイ条件および反応設定をここでも適用した。
実施例7−二本鎖および一本鎖エキソヌクレアーゼ活性を決定するためのアッセイ
試験エキソヌクレアーゼ酵素をおよそ20ヌクレオチドの短い5’−FAM−DNA−TAMRA−3’標識一本鎖または二本鎖基質と共にインキュベートすることによりエキソヌクレアーゼ活性を測定する。エキソヌクレアーゼが基質を分解することができる場合、これは直ちに開始し、フルオロフォアが放出されるであろう。活性は、経時的に追跡することができ、というのも、放出されたフルオロフォアは光励起すると光を再放射することができるからである。
一本鎖DNAエキソヌクレアーゼ活性を、変性させた3H−dATP組み込みPCR生成物と酵素をインキュベートすることにより測定した。エキソヌクレアーゼが基質を分解することができる場合、エキソヌクレアーゼは酸可溶性ヌクレオチドを放出し、これは、シンチレーションカウンターで検出することができる。過剰の高分子量基質DNAは、トリクロロ酢酸(TCA)で沈殿させる。このアッセイでは、1単位(1U)は、30℃にて30分で、20μlの最終体積において10nmolの酸可溶性ヌクレオチドの放出を触媒する酵素の量として規定される。
二本鎖DNAエキソヌクレアーゼ活性を、PCR基質が酵素とのインキュベーション前に変性されないことを除き、実施例8と同じように測定する。
一本鎖DNAエキソヌクレアーゼ活性を、変性させた3H−dATP組み込みPCR生成物と試験酵素をインキュベートすることにより測定した。二本鎖DNAエキソヌクレアーゼ活性を、変性されていない3H−dATP組み込みPCR生成物と酵素をインキュベートしたことを除き、同様に測定した。エキソヌクレアーゼが基質を分解することができる場合、エキソヌクレアーゼはシンチレーションカウンターで検出することができる酸可溶性ヌクレオチドを放出する。過剰の高分子量基質DNAは、トリクロロ酢酸(TCA)で沈殿させる。このアッセイでは、1単位(1U)は、30℃にて30分で、20μlの最終体積において10nmolの酸可溶性ヌクレオチドの放出を触媒する酵素の量として規定される。特定的には、アッセイ混合物は、4μlの5×バッファー(50mM Tris−HCl(25℃でpH8.5)、250mM KClおよび25mM MgCl2)、5μlの基質(ssDNAを得るために、dsDNA基質を3分間100℃でのインキュベーションにより変性させ、直ちに、3分間の氷水浴に移した)および3μlのMiliQ H2Oから構成された。アッセイ混合物(12μl)を氷上の1.5ml微量遠心管に移した。試験用の酵素を希釈し、8μlの酵素試料をアッセイ混合物に添加し、上下にピペッティングすることにより混合した。対照およびブランクもまた、構成に含めた。試料を30℃の水浴で10分間インキュベートした。インキュベーション後、反応物を氷上に置き、20μlの氷冷子ウシ胸腺DNA(1mg/ml)および250μlの氷冷10%(w/v)TCAを直ちに添加した。試料をその後、氷上で15分間インキュベートし、4℃で10分間13,000rpmにて遠心分離した。上清(200μl)を24−ウェルプレートに移し、0.8mlのUltima Gold XRシンチレーション流体を添加した。ウェルをシーリングテープで密閉し、試料を振盪により完全に混合した。試料をMicroBeta2プレートカウンターにおいて5分間カウントした。
発明のHL−ExoIが3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を示し、実質的な5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を示さないことを確認するためにこの実験を実施した。基質特異性を5’FAMまたは3’FAM−標識オリゴヌクレオチド(GCTAACTACCACCTGATTAC;SEQ ID No21)のいずれかを使用してポリアクリルアミドゲル上で分析した。
さらに、3’−5’方向性を有する発明のHL−ExoII酵素の方向性を裏付けるために、HL−ExoI(Mv)をssDNAと共に結晶化し、複合体の構造を決定した。
発明のある一定のHL−ExoIが迅速PCRクリーンアップシナリオにおいて満足のいくように作用することができることを確認するためにこの実験を実施した。この実験では、80℃での試験用のHL−ExoIの熱不活性化特性を2つの市販の大腸菌ExoI(ExoI AおよびExoI B)と比較した。
PCRクリーンアップ状況での発明のある一定のHL−ExoIの機能性を示すために、この実施例を実施した。実験設定は、実験4に非常に類似した。実施例4のように、試験用のポストPCR溶液に、PCR後に過剰のプライマー(10pmol)を添加した。しかしながら、実施例4とは異なり、たった1つのPCRバッファー(GoTaq、Promega)を使用し、HL−ExoIで処理した試料に対するインキュベーション温度を37℃から30℃まで低減させ、通常の30分プロトコルのみをExoSAP−ITについて試験した。
配列は、精製およびApplied Biosystems 3500xlジェネティックアナライザを使用したシークエンシングのために、トロムソ大学のDNAシークエンシングコア施設に配達した。結果を、Sequence Scanner Software v2.0(LifeTech)を用いて解析した。
Claims (20)
- 試料から一本鎖DNAを除去する方法であって、前記方法は、前記試料をエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と、前記試料中に存在する任意の一本鎖DNAの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させ、その後、エキソヌクレアーゼ処理試料を加熱して、前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化することを含み、前記エキソヌクレアーゼは、SEQ ID No.1のアミノ酸配列またはこれに少なくとも90%同一なアミノ酸配列を有し、前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片は、
(i)55℃の温度で10分間、10mM Tris−HCl(25℃でpH8.5)、50mM KClおよび5mM MgCl2から構成されるバッファー中で加熱することにより少なくとも90%不可逆的に不活性化され;
(ii)同じ条件下で、二本鎖DNAに対する活性が、等しい量の一本鎖DNAに対する活性の15%以下であり;ならびに
(iii)3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を有する、
方法。 - 試料から一本鎖DNAを除去する方法であって、前記方法は、前記試料をエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と、前記試料中に存在する任意の一本鎖DNAの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させ、その後、エキソヌクレアーゼ処理試料を加熱して、前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化することを含み、前記エキソヌクレアーゼは、
(a)SEQ ID No.1またはこれに少なくとも90%同一なアミノ酸配列、
(b)SEQ ID No.2またはこれに少なくとも90%同一なアミノ酸配列、
(c)SEQ ID No.3またはこれに少なくとも90%同一なアミノ酸配列、
(d)SEQ ID No.4またはこれに少なくとも90%同一なアミノ酸配列、または(e)SEQ ID No.5またはこれに少なくとも90%同一なアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片は
(i)55℃の温度で10分間、10mM Tris−HCl(25℃でpH8.5)、50mM KClおよび5mM MgCl2から構成されるバッファー中で加熱することにより少なくとも90%不可逆的に不活性化され;
(ii)同じ条件下で、二本鎖DNAに対する活性が、等しい量の一本鎖DNAに対する活性の15%以下であり、ならびに
(iii)3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を有する、
方法。 - 前記エキソヌクレアーゼは、SEQ ID No1〜5およびSEQ ID No11〜15のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記試料は生体高分子の試料である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料は核酸、タンパク質、炭水化物ポリマーまたは脂質を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料は、二本鎖核酸、対象となるDNA:RNA二本鎖または組換えにより生成されたタンパク質を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記試料は核酸増幅反応の生成物または逆転写反応の生成物である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応は、PCR、3SR、SDA、LAR/LCR、およびLAMPから選択される、請求項7に記載の方法。
- 核酸増幅の方法であって、前記方法は、核酸増幅反応の生成物を請求項1〜3のいずれか一項で規定されるエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と、前記生成物中に存在する任意の一本鎖DNAの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させ、その後、混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化する工程を最終増幅工程後に含む、方法。
- 前記生成物は前記最終増幅工程の直接生成物である、請求項9に記載の方法。
- 前記方法はさらに、前記増幅反応の生成物を前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と接触させる前に、これと同時に、またはその後に、前記生成物中に存在する任意の取り込まれないヌクレオチド三リン酸の脱リン酸を可能にする条件下で、アルカリホスファターゼを前記生成物と接触させることを前記最終増幅工程後に含む、請求項9または請求項10に記載の方法。
- 一以上の逆転写工程を含む逆転写の方法であって、前記方法は、逆転写反応の生成物と請求項1〜3のいずれか一項で規定されるエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片とを、前記生成物中に存在する任意の一本鎖DNAの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させ、その後、混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化する工程を最終逆転写工程の後に含む、方法。
- 前記生成物は、前記最終逆転写工程の直接生成物である、請求項12に記載の方法。
- 前記方法はさらに、前記逆転写反応の生成物を前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と接触させる前に、これと同時に、またはその後に、前記生成物中に存在する任意の取り込まれないヌクレオチド三リン酸の脱リン酸を可能にする条件下でアルカリホスファターゼを前記生成物と接触させる工程を前記最終逆転写工程、の後に含む、請求項12または請求項13に記載の方法。
- 一以上の第二鎖cDNA合成工程を含み、最終第二鎖cDNA合成工程の後に、その生成物中に存在する任意の一本鎖DNAの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で前記最終第二鎖cDNA合成工程の生成物と請求項1〜3のいずれか一項で規定されるエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片とを接触させ、その後、混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化する工程を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記生成物が前記最終第二鎖cDNA合成工程の直接生成物である請求項15に記載の方法。
- 最終第二鎖cDNA合成工程の後であって、前記生成物と前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片とを接触させる前に、これと同時に、またはその後に、さらに前記生成物中に存在する任意の取り込まれないヌクレオチド三リン酸の脱リン酸を可能にする条件下で、アルカリホスファターゼと前記最終第二鎖cDNA合成工程の生成物とを接触させる工程をさらに含む、
請求項15または16に記載の方法。 - 核酸配列解析の方法であって、前記方法は、解析工程前に試料調製の工程を含み、前記試料調製の工程は、解析される前記試料を請求項1〜3のいずれか一項で規定されるエキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と、前記試料中に存在する任意の一本鎖DNAの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で接触させ、その後、混合物を加熱して前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片を不活性化することを含む、方法。
- 前記試料調製の工程はさらに、アルカリホスファターゼを解析される前記試料と、前記試料を前記エキソヌクレアーゼまたはその酵素的に活性な断片と接触させる前に、これと同時に、またはその後に、前記試料中に存在する任意の取り込まれないヌクレオチド三リン酸の脱リン酸を可能にする条件下で接触させることを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記核酸配列解析は、シークエンシング技術またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブに基づく技術である、請求項18または請求項19に記載の方法。
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