JP6966681B2 - 限られたヌクレオチド組成を有するプライマーを用いた増幅 - Google Patents

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関連出願についてのクロスリファレンス
本出願は、非仮出願であり、2015年4月24日に出願の第62/152,756号の利益を主張し、参照によって全目的についてその全てを援用する。
PCR増幅は、1983年にKary Mullis(Mullis、1987、米国特許第4,683,202号; Saiki et al., 1985, Science (New York, N.Y.), 230(4732), 1350-1354)によって発明された。彼は、後にノーベル賞を受賞した。以来、様々なプライマーに基づくテンプレート依存的核酸増幅方法が提示され、それらには、ストランド変位アッセイ(George T. Walker, Little, & Nadeau、1993、米国特許第5,270,184号; George T. Walker, 1995, U.S. Pat. No. 5,455,166; G. T. Walker et al., 1992, Nucleic Acids Research, 20(7), 1691-1696, 1992, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89(1), 392-396)、米国特許第5437990号、第5409818号、及び5399491号に記載されている方法を含む転写に基づく増幅システム、転写増幅システム(TSA)(Kwoh et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86(4), 1173-1177;Kacian & Fultz、1995、米国特許第5,480,784号;Kacian & Fultz、1996、米国特許第5,399,491号)、及び、自家持続配列複製法(3SR)(Fahy, Gingeras, Guatelli, Kwoh, & Whitfield、1992、WO 92/08800;Guatelli et al., 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87(5), 1874-1878);ライゲーション連鎖反応(時に、オリゴヌクレオチドリガーゼ増幅OLAと称されるもの)(Laffler, Carrino, & Marshall, 1993, Annales De Biologie Clinique, 51(9), 821-826);サイクリングプローブ技術(CPT)(Duck, Alvarado-Urbina, Burdick, & Collier, 1990a, BioTechniques, 9(2), 142-148)、ローリングサークル増幅(RCA)(Fire & Xu, 1995, Proceedings of the National Academy of Sciences, 92(10), 4641-4645;Lizardi、1998、米国特許第5,854,033号)、塩基配列に基づく増幅(NASBA)(Compton, 1991, Nature, 350(6313), 91-92, Malek, Davey, Henderson, & Sooknanan, 1992)、侵入的開裂(invasive cleavage)技術、ヘリカーゼ依存的増幅(HDA)(Kong, Vincent, & Xu、2004、米国特許公開US2004/0058378A1;Kong, Vincent, & Xu、 2007、米国特許公開US2007/0254304A1)、指数関数増幅(EXPAR)(Van Ness, Van Ness, & Galas, 2003, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100(8), 4504-4509)、ハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)(R. M. Dirks & Pierce, 2004, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(43)、15275-15278、R. Dirks & Pierce、2012、米国特許番号8,105,778)、及び触媒ヘアピンアセンブリ(CHA)(Li, Ellington, & Chen, 2011, Nucleic Acids Research, 39(16), e110)が含まれる。上記参照の全ては、本願明細書に引用したものとする。核酸増幅技術が広く採用されてきたにもかかわらず、その精度及び感度が制限されるという欠点が存在する。意図された増幅産物は、完全な相補的プライマー結合サイトに結合する一対の順方向及び逆方向プライマー結合からの伸長の結果である。しかし、予想外の増幅産物が、プライマーの二重化及びその他の伸長のテンプレートとなる各々(プライマー二量体)から生じたり、従来型のワトソン-クリックペアリング規則による様々な程度のミスマッチを有する第２の(予想外の)プライマー結合サイトに起因するプライマーから生じたりする可能性がある。結果として、意図された増幅産物は、様々な予想外の産物又はバックグラウンド産物と共に合成される。これらの予想外の産物又はバックグラウンド産物の存在は、意図するターゲットサンプルの初期濃度が減少するにつれて、PCRの繰り返し数が増加するにつれて(従来型のプライマーと本発明のプライマーの限られた組成物と比較している図2及び3を参照)、そして、複数のプライマー対が多重増幅で用いられると、より顕著になる。結果として、検出感度は、所望の増幅産物のシグナルが線形増加していることを検出できるサイクル内に制限される。
非特異的増幅は、反応開始前にプライマー伸長産物の形成を低減することによって減らすことができる。「ホットスタート」プロトコールと呼ばれる1つの方法においては、1又は複数の重要な試薬を、必要なハイブリダイゼーション特性が得られる十分な温度に上がるまで反応混合物に使用しない。初期の高温インキュベーションステップの後に反応チューブを開けて足りない試薬を加える手動のホットスタート方法は、労働集約的であり、反応混合物の汚染の危険性を増加させる。あるいは、Bloch, Raymond, & Read、1995、米国特許第5411876号及びChou, Russell, Birch, Raymond, & Bloch、1992、Nucleic Acids Research、20(7)、1717-1723(いずれも本願明細書に引用したものとする）に記載の通り、感熱素材(例えばロウ)を用いて反応成分を分離又は封止することができる。これらの方法では、高温前反応インキュベーションによって感熱素材が溶解し、それによって、試薬の混合が可能になる。
反応開始前にプライマー伸長産物の形成を低減させる他の方法は、DNAポリメラーゼの熱可逆的不活性化による方法である。Birch, Laird, & Zoccoli、1997、米国特許第5677152号;Birch, Laird, & Zoccoli、1998、米国特許第5773258号(いずれも本願明細書に引用したものとする)は、修飾因子群の共有結合による結合によって可逆的に修飾されたDNAポリメラーゼについて述べている。高温不活化DNAポリメラーゼのインキュベーションによって、修飾因子-酵素結合が裂開し、それによって、酵素が再活性化される。
DNAポリメラーゼ-特異的抗体によるDNAポリメラーゼの非共有可逆的阻害は、Scalice, Sharkey, Christy Jr., Esders, & Daiss、1994、米国特許第5338671号(本願明細書に引用したものとする)に記載されている。
また、非特異的増幅は、Gelfand, Kwok, & Sninsky、1995、米国特許第5418149号(本願明細書に引用したものとする)において記載されている方法を使用する、反応開始前に形成された伸長産物を酵素的に分解させることによって低減させることができる。新しく合成された伸長産物の分解は、増幅反応の実行前に反応混合物にdUTP及びUNGを入れて45-60℃で反応混合物をインキュベートすることによって成し遂げられる。プライマー伸長によって、ウラシル含有DNAが形成され、それが増幅前の条件下でUNGによって分解される。この方法の不利な点は、伸長産物の分解が伸長産物の形成と拮抗することであり、非特異的プライマー伸長産物の除去は、完全ではない可能性がある。この方法の利点は、以前の反応由来の汚染物として反応混合物に導入されたウラシル含有DNAも分解される点である。従って、この方法も、以前の反応由来の増幅された核酸によるPCRの汚染物の問題を低減する。
反応開始前にプライマー伸長産物の形成を低減させる他の方法は、Will、1999、米国特許第6001611号((本願明細書に引用したものとする))にて説明されているように、環外アミンへの成分(moiety)の追加によって3'末端で又はその近くで修飾されたプライマーの使用によるものである。
非特異的増幅を減らす効果にもかかわらず、ほとんどの方法は、低温でプライマー伸長由来の偽陽性産物の低減に焦点が当てられている。ほとんど方法は、増幅サイクルが開始した後の高温でのプライマー相互作用由来の産物の問題に対処していない。本願明細書では、これを、増幅過程の間のプライマー由来の一時的な相互作用として記載している。この問題は、ハイスループットな結果を成し遂げる増幅反応において多くのプライマーを同時に使用すればするほど深刻になる。一時的な相互作用は、プライマーの内部セグメントが1つのプライマーの中で又はプライマー間で互いにハイブリダイズすることで形成される。ハイブリダイゼーションは、ワトソン-クリックペアリング規則による連続的な塩基対、又は、ワトソン-クリックペアリング(完全マッチ)及び非-ワトソン-クリックペアリング(ミスマッチ又はミスペアリング)と混合した塩基対であってもよい。溶液中のDNAミスマッチ形成は、Seela & Budow, 2008, Molecular bioSystems, 4(3), 232-245において検討されている。可能性がある8つのミスマッチの中で、GG、GT及びGA対は、最も安定である。ミスマッチ塩基対は、ワトソン-クリック対より安定ではなく、安定性は、配列の塩基部分によって影響を受けるが、この問題は、極端な配列多様性でハイスループットな結果を成し遂げる増幅反応において多くのプライマーを同時に使用すればするほど特に深刻になる。理論的には、プライマーの3'末端の近くのミスマッチは、プライマーの伸長効率に劇的に影響する。これは、真実である一方で、Kwok et al., 1990, Nucleic Acids Research, 18(4), 999-1005及びStadhouders et al., 2010, The Journal of Molecular Diagnostics: JMD, 12(1), 109-117は、3'末端のミスマッチが小さな影響から深刻な影響まで有していることを示しているが、いずれにしても、プライマー伸長は失われなかった。ミスマッチがプライマーの3'末端の#2位置に位置していると、AA GA対だけは、プライマー伸長に強い有害な影響を及ぼした。まとめると、ミスマッチを有するDNA二重螺旋は、増幅の前及び増幅の間に、一時的な相互作用によって形成される。テンプレートとプライマーの3'ヌクレオチドとの動的なペアリング(完全マッチ又はミスマッチ)によって、プライマー伸長が開始し、結果として予想外の増幅産物になる。
プライマー-プライマー相互作用及び非特異的増幅は、全ての増幅方法の基本的な問題である。この基本的な問題に対処する、プライマー二量体及び不必要な副反応増幅産物を実質的に抑制することができる新規のプライマー又はプローブ設計法を発見した。
本発明は、
順方向及び逆方向プライマーと標的核酸を含むサンプルとを接触させる接触工程と、
増幅反応を実行する実行工程と、を有し、
上記標的核酸の増幅されたセグメントは、上記標的核酸がテンプレートとしての役割を果たしつつ、上記順方向及び逆方向プライマーの伸長によって形成され、
上記プライマーは、4つの標準ヌクレオチドタイプのうちの1又は複数が非主流のものであり、
上記非主流ヌクレオチドタイプは、上記プライマーにおいて同じであり、
増幅された上記セグメントは、上記順方向及び/又は逆方向プライマーの伸長によって形成された主要な増幅産物である、
標的核酸のセグメントを増幅する方法を提供する。
本発明は、
種々のプライマーで同一である5'人工セグメントに連結し且つプライマー間でランダムな多様性を有する3'ハイブリダイゼーションセグメントを有するプライマーと標的核酸とを接触させる接触工程を有し、
上記5'人工セグメントは、5'ヌクレオチドが非主流ヌクレオチドとすることができることを除いては、3つのヌクレオチドタイプだけからなり、
上記3'セグメントは、そのユニットの最高で20%が3'末端以外の位置において第4のヌクレオチドタイプとすることができることを除いては、同じ3つのヌクレオチドタイプからなる、
標的核酸を増幅する方法を更に提供する。
本発明は、4つのヌクレオチドタイプA、T、C及びI(イノシン)からなるランダムプライマーと標的核酸とを接触させる接触工程を有する、標的核酸を増幅する方法を更に提供する。
本発明は、
プライマーと標的核酸を含むサンプルとを接触させる接触工程と、
増幅反応を実行する実行工程と、を有し、
上記標的核酸の伸長セグメントは、上記プライマーの伸長によって形成され、
上記プライマーは、4つの標準ヌクレオチドタイプのうちの1又は複数が非主流のものであり、
上記伸長セグメントは、上記プライマーの伸長から形成された主要な伸長産物である、
標的核酸のセグメントを伸長させる方法を更に提供する。
開示する本発明において、検出される標的は、特定領域を含むことができ、プライマー又はプローブハイブリダイゼーション又は結合領域は、3つのヌクレオチドタイプだけを有する。こうした状況では、プライマー又はプローブ組成は、また、3つのヌクレオチドタイプATC、ATG、ACG及びTCGだけ有する。含まれていないヌクレオチドは、非主流ヌクレオチドと称する。非主流ヌクレオチドは、プライマー又はプローブにおける1つのヌクレオチドタイプ又は2つのヌクレオチドタイプ又は3つのヌクレオチドタイプであってもよい。プライマー又はプローブ組成の一例がATCだけを有する場合、非主流ヌクレオチドは、Gである。プライマーは、3'ヌクレオチドが非主流ヌクレオチドと相補的であるオプションを有する3つのヌクレオチドタイプを含む。例えば、ATCプライマーに関して、3'末端ヌクレオチドは、非主流ヌクレオチドGと相補的であるCである。この3つのヌクレオチドタイプのプライマー又はプローブは、プライマー又はプローブの3'末端が常にミスマッチで伸長できないため、偽陽性産物を生産するプライマー二量体を形成しない。これらのタイプのプライマー又はプローブは、非主流プライマー又はプローブと称する。プライマー結合サイトは、非主流結合サイトと称する。テンプレート増幅システムにおいて、テンプレートである標的核酸を用いて非主流プライマーを伸長させる適切な試薬が含まれる。シグナル増幅システムにおいて、非主流プローブが標的とハイブリダイズして検出シグナルを発生させる適切な試薬が含まれる。
指数関数増幅の場合(例えばPCR)において、2つのプライマーが必要である。1つ又は両方のプライマーは、非主流プライマーとすることができる。両方の場合において、順方向及び逆方向プライマーは、非主流プライマーであり、検出される標的核酸は、3つのセグメント:順方向プライマー結合セグメント、逆方向プライマー結合セグメント及び2つのプライマー結合サイト間のセグメントを含む領域を有することができる。両プライマー結合セグメントは、同じ3つのヌクレオチドタイプを含む。2つのプライマー結合サイト間のセグメントは、非主流ヌクレオチド及び非主流ヌクレオチドの相補的なヌクレオチドを有しないヌクレオチド又はゼロヌクレオチドを含む。こうした場合では、PCR増幅は、3つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸タイプだけを必要とする。これらのタイプの順方向及び逆報告非主流プライマーは、プライマー二量体産物を形成するテンプレートとして互いを使用しない。加えて、両方の順方向及び逆方向非主流プライマーのミスハイブリダイゼーション由来の不必要な増幅産物は、システムの中に第4のヌクレオチドが含まれていないため停止する。ソフトウェアは、かかる増幅に適している標的中の領域を探すために設計されている。
別の実施形態において、上述した増幅システムは、プライマーの非主流ヌクレオチドに相補的なジデオキシヌクレオチド三リン酸を含むことができる。順方向及び逆方向プライマー由来の任意の不必要な伸長産物は、ジデオキシヌクレオチドの組込みによって停止する。
別の実施形態において、標的中に非主流プライマー結合セグメントを見つけることがでず、非主流プライマーは、限られた数(例えば1又は2又は3つ、プライマー長の20%以下)の非主流ヌクレオチドを含んでいてもよい。プライマーは、1又は2又は3つの非主流ヌクレオチドを有し、プライマー-プライマー相互作用を激減させることができる一方で、プライマー-テンプレートハイブリダイゼーション効率は上昇する。限られた数の非主流ヌクレオチドがプライマーに含まれていると、反応系では、4つ全てのデオキシヌクレオチド三リン酸タイプのセットが増幅のために必要となる。
別の実施形態において、限られた数の非主流ヌクレオチドが非主流プライマーに含まれている場合、非主流ヌクレオチドに相補的な低下した量のデオキシヌクレオチド三リン酸を増幅システムに用いることができる。低下した量は、増幅システムのデオキシヌクレオチド三リン酸の標準的な量に対して99%〜0.001%であってもよい。
別の実施形態において、標的中に非主流プライマー結合セグメントを見つけることができず、プライマーは、非主流プライマーにおける少なくとも1つ又は全ての非主流ヌクレオチドを除外するために、限られた数のミスマッチ塩基対を有していてもよい。
別の実施形態において、非主流プライマーが限られた数のミスマッチ塩基対を有するプライマー結合セグメントとハイブリダイズすると、多くのアプローチでも非主流プライマーハイブリダイゼーション効率を高めることができる。例えば、非主流プライマーハイブリダイゼーション効率を向上させるために、ミスマッチ結合試薬を増幅システムに含めることができる。例えば、C-Cミスマッチでのプライマーハイブリダイゼーション効率は、銀イオン、ロジウム錯体、2-アミノ-7-メチル-1,8-ナフチリジン誘導体等を含めることによって高めることができる。
別の実施形態において、非主流プライマーを用いて、標的中の任意のセグメントを増幅させることができる一方で、4つ全てのデオキシヌクレオチド三リン酸タイプの標準的なセットが増幅システムに含まれている。
別の実施形態において、非主流プライマーの5'末端は、コンカテマープライマー二量体を生産するプライマーとして更に用いられる任意の生産されたプライマー二量体産物を阻害する非主流ヌクレオチドである。
別の実施形態において、プライマーは、限られたヌクレオチド組成を有する3'セグメント、標準的な4つのタイプのヌクレオチド組成を有する5'セグメント、及び3'セグメントと同じ限られたヌクレオチド組成の人工配列を有する2つのセグメント間のリンカー、からなる。
別の実施形態において、上述のリンカーは、ヘアピン構造を形成することができる。
別の実施形態において、非主流プライマーは、その結合サイトへの非主流プライマー結合を容易にするスリーウェイジャンクション構造を形成するために標的とコハイブリダイズするジャンクションプローブを必要とする。
別の実施形態において、非主流プライマーは、それらの5'末端末尾に人工配列を有する。
別の実施形態において、非主流プライマーが5'セグメントの人工配列を有すると、人工配列は、プライマーの相補的なストランドの合成前又は後に特異的酵素と相互作用する又は特定の化学認識構造を形成する配列を含むことができる。例えば、ニッキング増幅(nicking amplification)に関して、人工配列は、制限酵素認識配列を含む。転写増幅(例えばTMA(転写媒介増幅))に関して、人工配列は、プロモーター配列を含む。5'末端配列は、特異的リガンド等を認識するG-四重構造を形成することができる。人工配列は、バーコードを含むこともできる。
別の実施形態において、非主流プライマーは、縮重プライマー混合物である。別の実施形態において、非主流プライマーは、ランダムプライマー混合物である。混合物における全てのオリゴヌクレオチドは、同じヌクレオチドタイプの非主流である。いくつかの実施形態において、プライマーは、1%超20%以下の非主流ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、縮重プライマー又はランダムプライマーは、人工配列を有する5'尾部を有する。
別の実施形態において、標的配列が様々な種若しくは遺伝子型の生命体又は複数のアレルの混合物由来である場合、非主流ヌクレオチドを有するプライマーは、種々の配列バリエーションにマッチするある種の位置で、ある種の縮重塩基を含むことができ、増幅は、非主流プライマー及び縮重プライマーの組み合わせを含むことができる。非主流プライマー及び縮重プライマーの濃度割合は、変えることができる。
別の実施形態において、非主流プライマーは、標的ハイブリダイゼーション及び増幅を容易にするヘルパープライマーと共に提供される。ヘルパープライマーは、より少ない数のミスマッチを有する非主流プライマーと同じプライマー結合サイトに結合する。ヘルパープライマーは、低濃度(例えば、非主流プライマーの濃度の≦0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%又は50%)で提供される。
別の実施形態において、二以上の非主流プライマー又はプローブが必要である。プライマー又はプローブは、テンプレートの同じストランド又は反対のストランドに結合することができる。スリーウエイジャンクションシグナル増幅のために、2本のプローブが同じスタンドにハイブリダイズするだろ。PCR増幅のために、順方向及び逆方向非主流プライマーは、反対のストランドにハイブリダイズする。
別の実施形態において、非主流プライマー又はプローブが標的核酸とハイブリダイズした後、標的を増幅する伸長反応は、線形増幅又は指数関数増幅であってもよく、増幅条件は、等温又は温度サイクルであってもよい。
別の実施形態において、1つ又は複数のプライマー又はプローブを反応系で用いる場合、全てのプライマー又はプローブが非主流プライマーである必要はない。例えば、LAMP増幅において4つのプライマーが必要である。BIP若しくはFIP又はBIP及びFIPの両方は、非主流プライマーであってもよい。しかし、他のプライマーは、非主流プライマーである必要はない。
別の実施形態において、1本の非主流プローブ(例えばパドロックプローブ)が必要な場合、プローブの3'末端セグメント又は5'末端セグメント又は3'末端セグメント及び5'末端セグメントの両方は、同じタイプの非主流ヌクレオチドを有することができる。3'末端と5'末端との間のリンカーは、任意の人工配列であってもよい。
別の実施形態において、ハイマルチプレックスシステムにおいて、非主流プライマーの複数対が必要である。いくつかの実施形態において、非主流プライマーの複数対は、5'末端で1つ又は複数の種類の汎用配列を有する。5'末端汎用配列は、任意の人工配列であってもよい。マルチプレックス増幅において、増幅標的は、同じ遺伝子(若しくは、種々の遺伝子)由来又は同じサンプル若しくは種々のサンプル由来であってもよい。
別の実施形態において、非主流プライマー又はプローブは、非天然ヌクレオチド(例えばイノシン、5'ニトロインドール、7-デアザ-2'-デオキシアデノシン、7-デアザ-2'-デオキシグアノシン、IsoC又はisoG)を有することができる。非主流プライマー又はプローブは、PNA、LNA等であってもよい。いくつかの実施形態において、プライマーにおける上記非天然ヌクレオチドの包含は、そのTm及びテンプレートに対するハイブリダイゼーション効率を増加させる。
別の実施形態において、非主流プライマーは、ステムループ構造を形成することができるオリゴヌクレオチドセグメントによって、その5'末端に結合する。セグメントの5'末端塩基は、非主流ヌクレオチドに対して相補的である。かかる2つのプライマーが増幅システムにおいて含まれる3つのデオキシヌクレオチド三リン酸タイプと共にPCR増幅において用いられると、リガーゼによって増幅された産物がライゲーションして環状産物を形成する。別の実施形態において、1つのプライマーだけが5'ステムループ構造を有する場合、増幅産物がライゲーションされてヘアピン構造を形成する。
別の実施形態において、非主流プライマーは、内部的に非主流ヌクレオチドを含む。非主流ヌクレオチドに相補的なデオキシヌクレオチド三リン酸が反応に含まれていない場合、伸長は、プライマーの内部非主流ヌクレオチドで停止し、増幅産物は、設計された粘着末端を含むだろう。設計された粘着末端は、下流でのアプリケーションのために任意の種類のアダプターとライゲーションすることができる。
別の実施形態において、1、2又は3つのタイプのdNTPが非主流プライマー反応において提供される。
別の実施形態において、デオキシイノシン三リン酸、5'-三リン酸及び/又は7-デアザ-2'-デオキシグアノシン又は7-デアザ-2'-デオキシアデノシン5'-三リン酸が増幅反応に提供される。
別の実施形態において、4つのタイプのdNTPが提供されるが、1、2又は3つのタイプのdNTPは、非主流プライマー伸長反応のために種々の濃度である。
別の実施形態において、1、2又は3つのタイプのヌクレオチド三リン酸モノマーが非主流プライマー伸長反応に提供される。
別の実施形態において、非天然ヌクレオチド三リン酸モノマーが非主流プライマー伸長反応に提供される。
別の実施形態において、複数の非主流プライマーを用いる場合、プライマーは、反応において種々の濃度で提供することができる。例えば、より高濃度の1つのプライマーは、非対称増幅を行なうことができる。
別の実施形態において、非主流プライマー又はプローブは、表面(例えばビーズ又はガラス面)にコート又は付加することができる。増幅反応のために、順方向プライマー又は逆方向プライマー又は順方向及び逆方向プライマーの両方は、表面に付加することができる。
別の実施形態において、複数対の非主流プライマーを用いるマルチプレックス増幅に関して、増幅産物は、マイクロアレイ、配列決定、ビーズ又はナノ粒子で検出することができる。一対の非主流プライマーのうちの1つは、溶液中の遊離プライマーと関連して表面に結合される。これらの方法は、表面上へPCR産物の同時増幅及び結合を可能にする。任意に、両方のプライマーは、増幅のために表面に結合することができる。非主流プライマー又はプローブがどのように表面に結合するかというパターンは、コード化又は非コード化又はランダム分配とすることができる。
別の実施形態において、増幅は、蛍光インターカレーティング染料、蛍光プローブ、検出ラベルタグ、質量タグ、電気泳動、磁性タグ又は融解曲線分析によって検出される。
別の実施形態において、1つの非主流プライマーは、その5'末端で、融解温度がそのプライマーから増幅された増幅産物とは異なる人工オリゴヌクレオチドに連結される。増幅反応は、人工オリゴヌクレオチドの融解ピークから増幅産物の融解ピークへの遷移に基づいてモニターされる。かかるフォーマットは、種々のプライマーを種々の融解温度を有する種々の人工オリゴヌクレオチドに連結することによって多重化することができる。別の実施形態において、非主流プライマーは、それらの5'末端上に、アンプリコンの融解温度とは異なる種々の融解温度を有するステム-ループ構造を形成することができる人工配列によって付加する。いくつかの実施形態において、融解曲線分析は、二本鎖インターカレーティング染料の存在から測定される。別の実施形態において、蛍光体及び消光物質が5'末端人工配列に付加されている。別の実施形態において、蛍光体及び消光物質は、5'末端人工配列の相補的な配列に付加されている。別の実施形態において、蛍光体及び消光物質は、5'末端人工配列及び5'末端人工配列の相補的な配列に別々に付加されている。別の実施形態において、非主流プライマーの5'末端人工配列は、ステム-ループ構造を形成することができる。
いくつかの実施形態において、マルチプレックス反応において、非主流プライマーは、それらの5'末端で、複数のタイプの人工配列に付加する。1つ又は複数のタイプの5'末端人工配列の相補的な配列が反応に含まれる。いくつかの実施形態において、5'末端人工配列の種々の相補的な配列は、種々の蛍光体及び消光物質が付加されている。別の実施形態において、非主流プライマー上の複数の5'末端人工配列は、5'末端人工配列の共通相補的配列を有する二本鎖を形成することができる。しかしながら、5'末端人工配列は、1又は複数の変異だけが異なっている。融解ピークの消滅は、その対応する標的の存在を示している。
別の実施形態において、蛍光体及び消光物質がラベル化されたオリゴヌクレオチドがテンプレート増幅反応に提供される。オリゴヌクレオチドは、アンプリコン上のセグメントに相補的である。増幅反応後の融解曲線分析の間、オリゴヌクレオチドは、結合したアンプリコンから解離して、そのTmでの融解ピークがテンプレートの存在を示す。いくつかの実施形態において、種々のTmを有する多重オリゴヌクレオチドが反応に提供される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするアンプリコン上のセグメントは、Tmを変化させる変異を含む。いくつかの実施形態において、種々の蛍光体がラベル化されている複数のオリゴヌクレオチドが反応に含まれており、融解曲線分析が多重性を増加させる多重チャネルにおいて実行される。
別の実施形態において、1つの非主流プライマーは、その5'末端で、人工配列がラベル化された蛍光体が付加されている。消光物質がラベル化されたオリゴヌクレオチドが反応に提供される。消光物質オリゴヌクレオチドが非主流プライマーとハイブリダイズして、蛍光が消光される。テンプレート増幅において、非主流プライマーは、プライマー伸長に関与して、二本鎖アンプリコンになる。消光物質オリゴヌクレオチドがプライマーから解離して、蛍光が放出される。
別の実施形態において、1つの非主流プライマーは、その3'末端に非主流ヌクレオチドを有する人工配列にその5'末端で連結される。蛍光体及び消光物質がラベル化されたオリゴヌクレオチドが反応に提供される。オリゴヌクレオチドは、プライマー上の人工配列とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション領域は、非主流ヌクレオチドを包含する。増幅の間、DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性は、蛍光体と消光物質を分離しているオリゴヌクレオチドを消化して、蛍光を放出する。伸長は、非主流ヌクレオチドで停止して、消化されたオリゴヌクレオチドは、その結合領域から解離して、他の完全なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが可能になる。このプロセスを繰り返して、シグナルが増幅される。
別の実施形態において、複数対の非主流プライマーを用いたマルチプレックス増幅に関して、人工配列を有する汎用尾部が、非主流プライマーの5'末端に付加されている。3'オーバーハングセグメントを有する二本鎖DNAからなる汎用検出プローブも反応に提供される。汎用プローブは、二本鎖形態においてプローブが非蛍光性であるように、1つのストランドに蛍光体が、そして他のストランドに消光物質がラベル化されている。3'オーバーハングセグメントは、非主流プライマーの汎用尾部と同じ配列を含む。汎用尾部と相補的な合成配列は、汎用プローブの3'オーバーハングセグメントとハイブリダイズし、伸長によって、汎用プローブの二本鎖が開裂して蛍光が解放される。いくつかの実施形態において、複数のタイプの汎用尾部及び汎用プローブがマルチプレックス検出のために反応に提供される。いくつかの実施形態において、汎用プローブは、3'オーバーハングを有する分子ビーコンである。別の実施形態において、蛍光体が、非主流プライマーに付加されており、二本鎖インターカレーティング消光化学物質が反応に提供される。指数関数増幅の間、液体消光物質が、増幅された二本鎖産物にインターカレートしてリアルタイム検出のための蛍光タグを消光する。液体消光物質は、二本鎖DNAと相互に作用して、付近の蛍光タグを消光する非蛍光性化学物質である。
別の実施形態において、蛍光体が非主流プライマーに付加されており、付加したプライマーが伸長して二本鎖(ライトアッププローブ)を形成すると強い蛍光が発生する。
別の実施形態において、蛍光体が非主流プライマーに付加されており、1つのタイプのdNTPは、種々の蛍光体がラベル化されている。リアルタイム蛍光は、FRETによって検出される。いくつかの実施形態において、蛍光体がラベル化されたddNTPが提供される。
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドテンプレートは、分析物に付加することができる。例えば、分析物は、タンパク質又は抗体であってもよい。非主流プライマーを用いたオリゴヌクレオチドテンプレートの増幅は、分析物の存在を示す。いくつかの実施形態において、非主流プライマー又はプローブは、分析物に付加されている。非主流プライマー又はプローブを用いた増幅は、分析物の存在又は非存在を示す。
別の実施形態において、本発明は、変異検出のために用いられる。かかる変異は、ヌクレオチド挿入、欠失、再配置、転移、トランスバージョン、多型及び置換を含む。
別の実施形態において、本発明は、配列決定、再配列決定、遺伝子形質発現モニタリング、遺伝的多様性プロファイリング、診断、スクリーニング、全ゲノム配列決定、全ゲノム多型発見及びスコアリング、トランスクリプトーム分析、又は、核酸の増幅若しくは検出又は配列決定を伴う任意の他の用途に用いるためのキットを提供する。このキットは、本願明細書に記載されている非主流プライマー又はプライマー対又はプローブのいずれか及び特定の用途に必要な試薬を含んでいてもよい。
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法を実行する装置を提供する。かかる装置は、例えば、サンプルプロセス、非主流プライマー又はプローブ混合、試薬混合、増幅及びシグナル検出を行なうことができる。
図1は、標的核酸及び例示的な3つのヌクレオチドのプライマー及びプライマー結合サイトを示している。図の上側は、逆方向プライマー結合サイト(ATGサイト)に隣接する順方向プライマー結合サイトの相補体(ATCヌクレオチド)を含む標的核酸の1つのストランドを示す。下側は、プライマーが、反対のストランドにおけるそれらのそれぞれの結合サイトに結合していることを示している。増幅は、dTTP、dATP及びdGTP(そして、他の典型的なPCR成分)存在下で進行することができるが、dCTPは、増幅されている標的核酸のストランドにGヌクレオチドがないため必要ではない。
図2A及びBは、従来型の4つのヌクレオチドタイプのプライマー(A)及び3つのヌクレオチドのプライマー(B)の一時的プライマー相互作用の比較を示している。
図3A及びBは、従来型の4つのヌクレオチドタイプのプライマー(B)と3つのヌクレオチドのプライマー(A)のプライマー二量体増幅からの増幅産物の比較を示している。
図4A-Bは、テンプレートコントロールなし(B)と比較した、3つのヌクレオチドタイプのプライマー及び3つのdNTPを用いたヒトゲノムDNA(A)のリアルタイムPCRを示している。
図5は、プライマー結合サイトが3つのヌクレオチドタイプ組成のプライマーに対して3つのミスマッチ(順方向プライマー)又は2つのミスマッチ(逆方向プライマー)を示すテンプレートを示している。
図6は、ミスマッチ結合試薬の例を示している。
図7は、3つのヌクレオチドタイプのプライマー結合サイトが全4つのヌクレオチドタイプを含むセグメントによって分離されているテンプレートの増幅を示している。増幅は、全4つのヌクレオチドタイプのモノヌクレオチド三リン酸の存在下で実行している。
図8A-Cは、3つのヌクレオチドタイプのプライマー及び4つ全てのdNTPを用いた増幅からの時系列の蛍光(A、B)及びゲル電気泳動(C)を示している。
図9は、3つのヌクレオチドのプライマーと4つのヌクレオチドのプライマーとの間のプライマー二量体の比較を示している。
図10A-Dは、非主流ヌクレオチド(G)の1又は2つのユニットを含むプライマーを用いたPCRを示している。
図11A-Cは、他のヌクレオチド三リン酸タイプ(A)、非存在(B)、及び、テンプレート非存在(C)と比較して、低下した量で存在する非主流ヌクレオチドの相補体であるモノヌクレオチド三リン酸を用いた増幅を示している。
図12は、ddNTPとして供給された、プライマーにおける非主流ヌクレオチドの相補体であるモノヌクレオチド三リン酸を用いた増幅を示している。
図13A及びBは、融解曲線分析を用いた複数テンプレートのマルチプレックス検出を示している。
図14は、それ自体によるプライマー増幅ではあまりにも短い3つのヌクレオチドタイプのプライマーの足場セグメントへの連結を示している。
図15は、代替的な足場フォーマットを示している。
図16は、3つのヌクレオチドのプライマーが単独で増幅をサポートするにはあまりに短いスリーウェイジャンクションの使用を示している。
図17A-Bは、代替的なスリーウェイジャンクションフォーマットを示している。 図18A-Bは、代替的なスリーウェイジャンクションフォーマットを示している。
図19は、3つのヌクレオチドタイプのプライマーが、蛍光体に連結した人工セグメントにその5'末端で連結されているマルチプレックス増幅及び検出を示している。
図20A及びBは、テンプレート増幅(A)及びテンプレートなし(B)に関する蛍光を時間とともに示している。
図21A及びBは、テンプレート増幅(A)及びテンプレートなし(B)に関する蛍光を時間とともに示している。
図22は、逆方向プライマーを過剰に有する非対称PCRを示している。
図23は、Taqmanプローブフォーマットを示している。
図24は、分子ビーコンフォーマットを示している。
図25は、汎用蛍光尾部及び消光物質を有する3つのヌクレオチドタイプのプライマーを使用したマルチプレックス増幅及び検出を示している。
図26は、粘着末端産物の増幅及び検出を示している。
図27は、環状産物の増幅及び検出を示している。
図28は、3つのヌクレオチドタイプのプライマーを用いた全ゲノム増幅を示している。
図29は、ニッキング増幅又は転写媒介増幅との組み合わせにおける3つのヌクレオチドのプライマーの使用を示している。
図30は、LAMP増幅又はリコンビナーゼポリメラーゼ増幅のための3つのヌクレオチドタイプのプライマーの使用を示している。
図31A、B及びCは、ニッキング機構による等温増幅、転写媒介増幅又はローリングサークル増幅を示している。
図32A及びBは、標的核酸が1又は複数の抗体を経て分析物に付加した免疫PCRを示している。
図33は、プライマーが第一蛍光体でラベル化され、増幅において使用するヌクレオチド三リン酸が第二蛍光体でラベル化されている増幅反応を示している。増幅産物における蛍光体間のエネルギー転移によってシグナルが発生している。
図34は、プライマーが蛍光体でラベル化され、増幅において使用するヌクレオチド三リン酸が消光物質でラベル化されている増幅反応を示している。蛍光体からのシグナルは、増幅産物が形成されるにつれて消光され、その結果、シグナルが発生する。
図35は、プライマーが蛍光体でラベル化され、DNAインターカレーティング薬剤が増幅混合物に導入される増幅反応を示している。増幅産物への薬剤のインターカレーションは、増幅産物が形成されるにつれて蛍光体由来のシグナルを消光する。
図36は、プライマーがライトアップ蛍光体でラベル化されている増幅反応を示している。かかる蛍光体は、プライマーにシグナルを有していないが、プライマーが増幅産物に組み込まれると、蛍光体は、増幅生産にインターカレートされて、シグナルが生じる。
図37は、二本鎖尾部を有する非主流プライマーを用いたマルチプレックス増幅反応及び融解曲線分析を用いた検出法を示している。
図38A-Eは、特別な尾部を有する非主流プライマー及びそれらに部分的に相補的なストランドを用いたマルチプレックス増幅反応及びDNAポリメラーゼの5'フラップ活性を用いた検出法を示している。図38Aは、蛍光体及び消光物質でラベル化した相補的なオリゴヌクレオチド及びプライマーを示している。図38Bは、伸長を示している。図38Cは、5'フラップエンドヌクレアーゼ活性によってそのオリゴヌクレオチドから蛍光体が裂開して蛍光シグナルが生じることを示している。図38D及びEは、他のテンプレートの伸長及び裂開を示している。
図39A及びBは、蛍光体及び消光物質でラベル化された尾部に相補的なオリゴヌクレオチドを含む増幅反応における人工オリゴヌクレオチド尾部にプライマーの1つが連結される増幅反応をモニターする方法を示している。増幅の前(A)、消光物質及び蛍光体及び消光物質は近くに存在しており、シグナルは低い。増幅の後(B)、ラベル化オリゴヌクレオチドは、相補的なプライマー尾部とハイブリダイズして、消光物質及び蛍光体が分離して、シグナルが増加する。
図40A及びBは、消光物質及び蛍光体を含む人工オリゴヌクレオチド尾部にプライマーの1つが連結する増幅反応をモニターする方法を示している。増幅の前(A)、消光物質及び蛍光体は、空間的に近いためシグナルが低い。増幅の後(B)、蛍光体及び消光物質は、相補的なストランドへの人工オリゴヌクレオチドの二重化によって更に分離されて、蛍光発光が増加する。
定義
別途規定しない限り、本願明細書において用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、一般に、本発明が関係する技術分野で理解されているものと同じ意味を有する。以下の定義は、従来技術のそれらを補充して、本願での使用を目的とし、任意の関連ケースにも無関係のケース(例えば、任意の一般の特許又は特許出願)にも帰属するものではない。本願明細書に記載されているものと類似又は等価な任意の方法及び素材を本発明の試験の実施に用いることができるが、好ましい素材及び方法は、本願明細書に記載されている。従って、本願明細書において用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載するためだけにあり、限定することを目的とするものではない。用語「a」又は「an」は、1又複数のものを指し、例えば、「核酸」は、1又は複数の核酸を表す。従って、用語「a」(又は、「an」)、「1又は複数」及び「少なくとも1つ」は、本願明細書において互いに置換可能に用いることができる。
核酸は、DNA及びRNAを含み、DNA-RNAキメラは、二本鎖又は一本鎖とすることができる。DNAは、ゲノム、cDNA又は合成物とすることができる。RNAは、とりわけmRNA、tRNA、rRNA、hnRNAとすることができる。用語「核酸」は、ヌクレオチドのストリングに対応させることができる、モノマー単位の任意の物理的ストリングを含む。これは、ヌクレオチドのポリマー(例えば、典型的なDNA又はRNAポリマー)、ペプチド核酸(PNA)、改変型オリゴヌクレオチド(例えば、溶液中において典型的には生物学的RNA又はDNAではない塩基を含むオリゴヌクレオチド(例えば2'-O-メチル化オリゴヌクレオチド))等を含む。核酸は、例えば、一本鎖又は二本鎖とすることができる。
4つの従来型のヌクレオチド塩基は、A、T/U、C及びGであり、Tは、DNAに存在し、Uは、RNAに存在する。標的で見つかるヌクレオチドは、通常、天然ヌクレオチド(デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド)である。そのようなものは、プライマーを形成するヌクレオチドのケースである。
核酸ストランドの相補性は、ストランドがそれらの核酸塩基グループ間での水素結合に起因する安定した二重化を形成することを意味する。相補的な塩基は、DNAでは、AとT及びCとGであり、RNAでは、CとG及びUとAである。それぞれのストランドのヌクレオチドは、ストランドを最大限整列配置させると、それらがこれら(ワトソン-クリックペアリング)のうちの1つを形成する場合、相補性である。ヌクレオチドは、それらのそれぞれのストランドを最大限整列配置させても、それらが相補性対を形成しない場合、ミスマッチである。ストランドの相補性は、完全であってもよく実質的であってもよい。2つのストランド間の完全な相補性は、2つのストランドが二体鎖のあらゆる塩基がワトソン-クリックペアリングによって相補的な塩基に結合している二体鎖を形成することができることを意味する。実質的な相補性は、ストランドの殆ど(全てである必要はない)の塩基がハイブリダイゼーション条件(例えば、塩濃度及び温度)のセットにおいてワトソン-クリック対を形成し、安定ハイブリッド複合体を形成することを意味する。例えば、あるプライマーは、最高で1つ、2つ又は、3つの位置にミスマッチを有するにも関わらずプライマー結合サイトで二本鎖を形成することができる。ただし、かかるミスマッチは、3'末端にはなくて、好ましくはその付近(例えば、4つのヌクレオチドの中)にない。かかる条件は、ハイブリダイズしたストランドのTmを予測する標準数学的計算及び配列を用いて、又は、ルーチン法を使用するTmの経験的測定によって予測することができる。Tmは、2つの核酸ストランドの間で形成されたハイブリダイゼーション複合体の集団が50%変性する温度を指す。Tm未満の温度においてハイブリダイゼーション複合体が形成される一方で、Tm超の温度においてハイブリダイゼーション複合体のストランドが融解又は分離される。Tmは、例えば、Tm=81.5+0.41(% G+C)-675/N-%ミスマッチ(N =塩基の合計数)を使用することにより、水性の1MのNaCl溶液における公知のG+C内容物を有する核酸について推定することができる。
ミスマッチは、核酸の1つのストランドにおけるヌクレオチドが反対の相補的な核酸ストランドのヌクレオチドとワトソン-クリック型塩基ペアリングを通じて対にならない又は対になることができないことを意味する。ミスマッチの例は、限定するものではないが、AA、AG、AC、GG、CC、TT、TG、TC、UU、UG、UC及びUT塩基対である。ミスマッチは、DNAとDNA分子間、DNAとRNA分子間、RNAとRNA分子間、及び、他の天然又は人工核酸アナログの間で生じることができる。
ミスマッチ結合試薬又は薬剤は、化学的相互作用又は物理的相互作用による非主流プライマー結合サイトとの非主流プライマーハイブリダイゼーションを安定させることができる非主流プライマーの任意の改変又は任意の分子である。非主流プライマーの改変は、所定の改変が容易に決定することができる所定の非主流プライマーの所望の機能と適合する限り、いかなる形の改変であってもよい。改変は、塩基改変、糖改変又は主鎖改変を含む。ある低分子は、ミスマッチした塩基に、ミスマッチ塩基におけるそれらとおそらく相補的な水素結合を通じて結合することができ、高い塩基選択性をもって二体鎖を安定させることができる。金属イオンは、それらの構造形成及びフォールディングのための核酸と相互作用することが示されている。Ono A., Togashi H. (Ono & Togashi, 2004, Angewandte Chemie (International Ed. in English), 43(33), 4300-4302)は、溶液中の水銀イオンの添加によってTTミスマッチを有するDNA二本鎖のTmが5℃上昇するを示している。Torigoe H., Okamoto I. et al. (Torigoe et al., 2012, Biochimie, 94(11), 2431-2440)は、銀イオンが選択的に結合して、C-Cミスマッチを安定させることを示している。高い選択性ミスマッチサイト認識が可能な一連のロジウム錯体は、Cordier C., Pierre V.C. et al. (Cordier, Pierre, & Barton, 2007, Journal of the American Chemical Society, 129(40), 12287-12295)によって設計され合成された。Nakatani K., Sando S., et al. (Nakatani, Sando, Kumasawa, Kikuchi, & Saito, 2001, Journal of the American Chemical Society, 123(50), 12650-12657)は、ミスマッチDNAを選択的に認識する一連のナフチリジン系低分子を開発した。
ハイブリダイゼーション又はアニーリング条件は、核酸を含む水性又は有機溶液の化学成分(例えば、塩類、キレート剤、ホルムアミド)及びそれらの濃度と、1つの核酸ストランドがハイブリダイゼーション複合体を生産する相補的なストランド相互作用によって第二核酸ストランドに結合する混合物の温度を含む。
サンプルは、関心のある1又は複数の標的核酸が存在している可能性がある組成物であり、これには、患者試料、植物又は動物の素材、廃棄物、法医学用素材、環境サンプル、循環器腫瘍細胞(CTC)、細胞遊離DNA、液生検などが含まれる。サンプルには、標的核酸(例えば、末しょう血液、骨髄、プラズマ、血清、リンパ節、呼吸組織又は滲出物、胃腸組織、尿、糞、精液又は他の体液を含む生検組織)を含む、生きた又は死んだ生命体由来の任意の組織、細胞又は抽出物が含まれる。特に興味があるサンプルは、疾患又は状態、特にウイルスによる感染に罹患している又はその疑いがあるヒト又は動物からの組織サンプル(体液を含む)である。関心がある他のサンプルは、産業サンプル(例えば水試験、食品試験、汚染物コントロール等)を含む。サンプル成分として、標的及び非標的核酸を含むことができ、その他の材料(例えば、酸、塩基、界面活性剤、タンパク質、糖質、脂質及び他の有機又は無機素材)が挙げられるサンプルは、増幅の前に標的核酸を精製処理してもよくしなくてもよい。更なる処理として、細胞又はウイルスから核酸を放出して、非核酸成分を除去又は非活化する界面活性剤又は変性剤での処理や核酸の濃縮を行ってもよい。
標的核酸は、サンプル内に存在する又は存在する可能性がある関連した核酸分子又は核酸分子の集団を指す。標的核酸は、プライマー結合サイトによって規定される、増幅されるセグメントを含む。セグメントは、増幅に適する長さの全体の核酸又はその任意のセグメントであってもよい。例えば、標的核酸は、全染色体、遺伝子又はcDNAであってもよく、標的セグメントは、例えば、これらのヌクレオチドのわずか40-500であってもよい。標的セグメントは、任意のストランド(センス又はアンチセンス)の構造に表すことができる。標的核酸は、とりわけRNA(例えば、ウイルスRNA、マイクロRNA、mRNA、cRNA、rRNA、hnRNA又はDNA(ゲノム又はcDNA)であってもよい。
標的核酸は、病原微生物(例えばウイルス、細菌又は真菌)由来であってもよく、患者内因性のものであってもよい。ウイルス核酸(例えば、ゲノム、mRNA)は、ウイルス配列の分析のために有効な標的を形成する。検出することができるウイルスのある例として、HIV、肝炎(A、B又はC)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV及びイプシュタインバーウイルス)、アデノウイルス、XMRV、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、おたふくかぜウイルス、ロタウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デング熱ウイルス、MLV関連ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルス及びアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。かかる細菌の例としては、クラミジア、リケッチア性細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、トレプトッカス(treptocci)、肺球菌、髄膜炎菌及びコノコッカス(conococci)、クレブシェラ、プロテウス、セラチア(serratia)、プソイドモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ菌、細菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス菌中毒、炭疽菌、疫病、レプトスピラ症、ライム(lymes)病細菌、連鎖球菌又はナイセリア類が挙げられる。rRNAは、細菌の分類に特に有効な標的核酸である。ヒト又は動物の遺伝子の検出は、疾患の存在又は罹病性を検出するために有効である。検出の対象の可能性がある遺伝子の例として、遺伝子タイピング(例えば、法医学同定、父子鑑別、ホモ接合の際に作用する遺伝子のヘテロ接合キャリア、HLAタイピング)を行い、個々のユーザー及び他のユーザーの薬の有効性を決定(例えば、コンパニオン診断)するためのがん遺伝子融合、BRACA-1又はBRAC-2、p53、CFTR、シトクロムP450が挙げられる。
非主流ヌクレオチドタイプは、プライマー又はプライマー結合サイト又はプライマー及びプライマー結合サイトの両方における20%以下の位置に1つ存在する。一般的に、プライマーは、A、G、C、T又はA、G、C、Uのヌクレオチド組成を有する。プライマーは、非天然ヌクレオチド(例えばIsoC及びIsoG、デアザG又はデアザA)を含むことができる。これらは、非主流ヌクレオチドの数又はパーセントの決定において、対応する標準ヌクレオチドと同一の方法で記録される。アナログは、それが他の天然ヌクレオチドと同じ相対的ペアリング親和性を有する場合、天然ヌクレオチドに対応する。従って、デアザG又はイノシンは、それらが他の天然ヌクレオチドのいずれよりもCと強く対をなすため、Gのアナログである。一例として、Gが非主流ヌクレオチドタイプである場合、プライマーの非主流ヌクレオチドタイプのパーセントを決定するために、デアザGは、(分母だけでなく)分子に含まれ、デアザAは分母だけに含まれる。従って、1つのG、1つのデアザG及び合計20ヌクレオチドを含むプライマーにおける非主流ヌクレオチドのパーセントは、10%である。一般的に、非主流ヌクレオチドタイプは、内部位置で0、1又は、2ユニット存在し、任意に各プライマーの5'末端位置で1つ存在し、各プライマー結合サイトで0、1、2、3又は4ユニット存在し、人工配列で0ユニットに存在する。理想的には、非主流ヌクレオチドタイプの唯一のユニットは、5'末端位置である。4つのヌクレオチドタイプのうちの唯一のものが非主流である場合、それは、4つの標準ヌクレオチドタイプのうち最も少なく表される(null表現を含む)。プライマーが縮重位置を含み、縮重が非主流ヌクレオチドタイプを含む場合、その位置は、非主流ヌクレオチドタイプ位置として(即ち、分母だけでなく分子に)計算に入れ、そうでなければ分母にだけ入れる。天然ヌクレオチドタイプに対する結合を好まないヌクレオチドアナログは、縮重位置と同様に処理する。非主流ヌクレオチドタイプを含むプライマーは、非主流プライマーと称される。非主流ヌクレオチドタイプを含むプローブは、非主流プローブと称する。
一般的に「dNTP」という用語は、三リン酸の形態のホスファート、糖及び有機塩基を含むデオキシヌクレオチドの各々又は組み合わせを指すものであり、DNA合成のDNAポリメラーゼが必要とする前駆体を提供する。dNTP混合物は、天然デオキシヌクレオチド(即ち、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、ウラシル(U)及びチミン(T))の各々を含むことができる。いくつかの実施形態において、天然デオキシヌクレオチドの各々は、合成アナログ(例えばイノシン、isoG、IsoC、デアザG、デアザA等)で置き換え又は補充することができる。ヌクレオチドがプライマー又はプローブにおいて非主流である場合、ヌクレオチドは、非主流ヌクレオチドと称する。非主流ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチド又はリボヌクレオチドの形態として、反応系に含めることができる。それらの相補体は、非主流ヌクレオチドの相補的なヌクレオチドと称される。「ddNTP」という用語は、一般的に、三リン酸の形態のホスファート、糖及び有機塩基を含むジデオキシヌクレオチドの各々又は組み合わせを指すものであり、DNA合成のDNAポリメラーゼが必要とする前駆体を提供する。ddNTP混合物は、天然ジデオキシヌクレオチド(即ち、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、ウラシル(U)及びチミン(T))の各々を含むことができる。いくつかの実施形態において、天然ジデオキシヌクレオチドの各々は、合成アナログ(例えばイノシン、isoG、IsoC、デアザG、デアザA等)で置き換え又は補充することができる。「NTP」という用語は、一般的に、三リン酸の形態のホスファート、糖及び有機塩基を含むリボヌクレオチドの各々又は組み合わせを指すものであり、RNA合成のRNAポリメラーゼが必要とする前駆体を提供する。NTP混合物は、天然リボヌクレオチド(即ち、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、ウラシル(U))の各々を含むことができる。いくつかの実施形態において、天然リボヌクレオチドの各々は、合成アナログ(例えば、イノシン、isoG、IsoC、デアザG、デアザA等)で置き換え又は補充することができる。
プライマー結合サイト又はプローブ結合サイトは、本発明の非主流プライマー結合サイト又は非主流プローブ結合サイトと交換可能である。プライマー結合サイトは、プライマーがハイブリダイズする標的核酸の完全又は部分的なサイトである。部分的なサイトは、足場及びジャンクション配列の供給によって補充することができ、それには、部分的なプライマー結合サイトも含まれる。足場又はジャンクション配列由来の部分的な結合サイトは、標的核酸の部分的なプライマー結合サイトと組み合わせて完全なプライマー結合サイトを形成することができる。
プライマー又はプローブという用語は、本発明の非主流プライマー又は非主流プローブと交換可能である。プライマー又はプローブは、標的核酸が全部又は一部関与しているプライマー又はプローブ結合サイトに相補的なオリゴヌクレオチドである。プライマー又はプローブは、その5'末端で、標的核酸で見つけることもそれに相補的でもない他の核酸(時には、尾部と称される)に連結することができる。5'尾部は、人工配列を有することができる。プライマー又はプローブ結合サイトに正確に相補的なプライマー又はプローブに関して、プライマー又はプローブと尾部との間の境界は、尾部がプライマー又はプローブの3'末端から進んで出会う第一非相補的ヌクレオチドから始まるという点で、非常に明白である。プライマー結合サイトに実質的に相補的なプライマーに関して、プライマーの最後のヌクレオチドは、標的核酸へのプライマー結合に関与するプライマーの3'末端から離れるように進んで出会うプライマー結合サイトに相補的な最後のヌクレオチドである(即ち、この5'ヌクレオチドを有するプライマーは、5'ヌクレオチドのないプライマーよりも標的核酸に関するTMが高い)。プライマー及びプライミング結合サイトにおけるヌクレオチドの相補性又は非相補性は、ワトソン-クリックペアリング組合せによって決定されるか、それぞれの配列の最大整列配置でも決定されない。
プライマー又はプローブは、オリゴヌクレオチドである。「オリゴヌクレオチド」という用語は、単数の「オリゴヌクレオチド」だけでなく複数の「オリゴヌクレオチド」を含み、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基又は本発明の増幅方法及びその後の検出法において試薬として使用する関連化合物の二個以上の任意のポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、DNA及び/又はRNA及び/又はそのアナログ及び/又はDNA RNAキメラであってもよい。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対する任意の特定の機能を意味するものでなく、むしろ、本願明細書に記載されているかかる試薬の全てをカバーするように一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは、様々な機能を果す。例えば、それが相補的なストランドにハイブリダイズすることができ、核酸ポリメラーゼの存在下で更に伸長することができる場合、それはプライマーとして機能することができ、それがRNAポリメラーゼによって認識される配列を含み転写が可能な場合、それはプロモーターを提供することができ、それは、シグナル発生/増幅のための検出試薬を含むことができ、適切な位置にある及び/又は適切に改変されている場合、それはハイブリダイゼーションを防止する又はプライマー伸長を阻害するように機能することができる。本発明の特異的オリゴヌクレオチドは、以下で更に詳細に記載する。本明細書で用いられるように、オリゴヌクレオチドは、実質的に任意の長さであってもよく、増幅反応の際の又は増幅反応の増幅産物を検出する際のその特定の機能によってのみ制限される。定義済みの配列及び化学構造のオリゴヌクレオチドは、従来型の技術によって、例えば化学又は生化学合成によって、及び、組換え核酸分子(例えば、細菌又はウイルスベクター)からのインビトロ又はインビボ発現によって生産することができる。この開示によって意図されるように、オリゴヌクレオチドは、単に野生型染色体DNA又はそのインビボ転写産物だけからなるものではない。オリゴヌクレオチドは、所定の改変が容易に決定することができる所定のオリゴヌクレオチドの所望の機能と適合する限り、いかなる形の改変であってもよい。改変は、塩基改変、糖改変又は主鎖改変を含む。塩基改変は、限定するものではないが、アデニン、シチジン、グアノシン、チミン及びウラシルに加えて、以下の塩基：C-5プロピン、2-アミノアデニン、5-メチルシチジン、イノシン及びdP及びdK塩基の使用を含む。ヌクレオシドサブユニットの糖グループは、リボース、デオキシリボース及びそのアナログであってもよく、例えば、リボフラノシル部分への2'-O-メチル(2'-OME)置換を有するリボヌクレオシドが含まれる。「Method for Amplifying Target Nucleic Acids Using Modified Primers」(Becker, Majlessi, & Brentano、2000、米国特許第6,130,038号)を参照。他の糖改変は、限定するものではないが、2'-アミノ、2'-フルオロ、(L)-アルファ-トレオフラノシル及びペントプラノシル改変を含む。ヌクレオシドサブユニットは、結合(例えばホスホジエステル結合、改変型結合)によって、又は、相補的な標的塩基配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを阻害しない非ヌクレオチド部分によって連結することができる。改変型結合は、標準ホスホジエステル結合が種々の結合(例えばホスホロチオネート結合又はメチルホスホネート結合)に置き換えられているそれらの結合を含む。核酸塩基サブユニットは、例えば、DNAの天然デオキシリボースホスファート主鎖を疑似ペプチド主鎖(例えば、カルボキシメチルリンカーによって中央第二級アミンへ核酸塩基サブユニットを接続する2-アミノエチルグリシン主鎖)に置き換えることによって連結することができる。疑似ペプチド主鎖を有するDNAアナログは、一般に、「ペプチド核酸」又は「PNA」と称され、Nielsen et al.、Peptide Nucleic Acids,(Nielsen, Buchardt, Egholm, & Berg、1996、米国特許第5,539,082号)によって開示されている。別の結合改変は、限定するものではないが、モルホリノ結合が含まれる。本発明によって予想されるオリゴヌクレオチド又はオリゴマーの非制限的な例として、二環式及び三環式ヌクレオシド及びヌクレオチドアナログ(LNA)を含む核酸アナログが挙げられる。Imanishi et al., "Bicyclonucleoside and Oligonucleotide Analogues," (Imanishi & Obika、2001、米国特許第6,268,490号)、及び、Wengel et al., "Oligonucleotide Analogues," (Wengel & Nielsen、2003、米国特許第6,670,461号)を参照。任意の核酸アナログは、本発明によって予想される。但し、改変型オリゴヌクレオチドは、その意図された機能を果すことができ、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件又は増幅条件下で標的核酸にハイブリダイズすることができ、又はDNA又はRNAポリメラーゼと相互作用することができるため、伸長又は転写を開始することができる。検出プローブの場合、改変型オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸に優先してハイブリダイズすることもできなければならない。オリゴヌクレオチド(又は、他の核酸)の3'-末端は、後述するように、遮断部分を使用してさまざまな方法で遮断することができる。「遮断された」オリゴヌクレオチドは、その3'-末端へのヌクレオチドの追加に起因して、DNAの相補的なストランドを生産するDNA又はRNA依存性DNAポリメラーゼによっても効率的に伸長されない。このように、「遮断された」オリゴヌクレオチドは、「プライマー」として振る舞うことができない。
縮重プライマーという用語は、様々な位置に異なる塩基を有する類似のプライマーの混合物を指す(Mitsuhashi, J. Clin. Lab. Anal., 10(5): 285 93 (1996);von Eggeling et al., Cell. Mol. Biol., 41(5):653 70 (1995);Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5847 5851 (1992);Telenius et al., Genomics, 13(3):718 25 (1992))。イノシンは、アデノシン、シトシン、グアニン又はチミジンと塩基対を形成することができるため、かかるプライマーは、イノシンを含むことができる。縮重プライマーによって、関連する可能性がある様々な標的配列に対するアニーリング及び増幅が可能になる。標的DNAにアニーリングする縮重プライマーは、更なる増幅のためのプライミングサイトとして機能することができる。縮重領域は、多様性があるプライマーの領域である一方で、プライマーの残りの部分は、同じにすることができる。縮重プライマー(又は、領域)は、複数のプライマーを意味し、ランダムであってもよい。ランダムプライマー(又は、領域)は、配列が選択されていないことを意味する。それは、縮重といえるが、そうである必要はない。いくつかの実施形態において、3'標的特異的領域は、約5℃から50℃のTmを有する。いくつかの実施形態において、15-塩基長は、約60℃未満のTmを有する。
プライマー「3'セグメント又は3'結合領域又は3'結合サイト又は3'ハイブリダイゼーション領域」は、特定の頻度で、ゲノムに生じるゲノム配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、この頻度は、約0.01%と2.0%の間、例えば、約0.05%及び0.1%の間、又は、約0.1%と0.5%の間にある。いくつかの実施形態において、プライマーの「結合サイト」の長さは、主に生物情報科学の計算に基づいて予測されるPCR産物の平均長に依存する。この定義は、限定するものではないが、長さが約4から12塩基の「結合領域」を含む。より特定の実施形態において、3'結合領域の長さは、例えば、約4から20塩基、又は、約8から15塩基とすることができる。約10℃から60℃のTmを有する結合領域は、定義中に含まれる。用語「プライマー結合セグメント」は、本願明細書において用いる場合、特定の配列のプライマーを指す。
「ランダム又はランダム領域」という用語は、一群の標的配列(例えばゲノム)において明らかでないサイトにアニーリングことができるオリゴヌクレオチドプライマーの領域を指す。本明細書で使用される用語「ランダムプライマー」とは、3'セグメント標的特異的結合領域及び5'セグメント人工配列を含むことができるプライマーを指す。「ランダム領域」は、標的DNAに対するプライマーの結合及びプライマーと標的DNAとの間に形成される二体鎖に対するPCR増幅で使用するポリメラーゼ酵素の結合を容易にする。ランダム領域ヌクレオチドは、縮重又は非特異的な雑多な核酸塩基又は核酸塩基アナログとすることができる。オリゴヌクレオチドプライマーの「ランダム領域」の長さは、とりわけ、特異的領域の長さに依存する。ある種の実施形態では、限定するものではないが、「ランダム領域」は、長さが約2から15塩基、長さが約4から12塩基、又は、長さが約4から6塩基である。別の実施形態において、特異的及びランダム領域の組み合わせは、長さが約9つの塩基であり、例えば、特異的領域が4つの塩基を有する場合、ランダム領域は5つの塩基を有する。
いくつかの実施形態において、プライマー3'セグメントは、特異的領域及びランダム領域又は縮重領域を含む。他の実施態様において、3'セグメントは、特異的領域、及び、ランダム領域又は縮重領域を含む。他の実施態様において、標的プライマーの3'セグメントは、特異的領域、ランダム領域又は縮重領域のみを含む。当然、公知の領域(知られている配列)を使用することもでき、本願明細書に開示されるオプションの一部とすることもできる。
ポリメラーゼは、テンプレートにハイブリダイズするプライマーのテンプレート直接伸長を行なうことができる酵素である。それは、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ又は逆転写酵素とすることができる。DNAポリメラーゼの例として、大腸菌DNAポリメラーゼI、Taq DNAポリメラーゼ、肺炎連鎖球菌DNAポリメラーゼI、Tfl DNAポリメラーゼ、D.ラジオデュランスDNAポリメラーゼI、Tth DNAポリメラーゼ、Tth XL DNAポリメラーゼ、M.結核DNAポリメラーゼI、M.サーモオートトロフィカム(thermoautotrophicum) DNAポリメラーゼI、ヘルペスシンプレックス-1 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、サーモシーケナーゼ、又は、野生型又は改変型T7 DNAポリメラーゼ、Φ29ポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、ベントポリメラーゼ、9°Nmポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントが挙げられる。逆転写酵素の例:AMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素、HIV逆転写酵素。RNAポリメラーゼの例として、T7 RNAポリメラーゼ又はSP6 RNAポリメラーゼ、細菌性RNAポリメラーゼ及び真核性RNAポリメラーゼが挙げられる。
増幅は、テンプレート直接プライマー伸長によって標的核酸の全て又はセグメントの追加のコピーを生産すること(標的増幅)又は質的/量的に測定するための検出シグナルを増幅すること(シグナル増幅)又はその両方を指す。増幅は、温度サイクル条件下又は等温条件下又はその組み合わせで実行することができる。増幅は、線形又は指数関数的であってもよい。
核酸標的増幅の多くの周知の方法は、二本鎖の核酸を代わるがわる変性させてプライマーをハイブリダイズさせる温度サイクルを必要とするが、核酸増幅の他の周知の方法は、等温である。ポリメラーゼ連鎖反応法(一般にPCRと呼ばれる) (Mullis、1987、米国特許第4,683,202号; Saiki et al., 1985, Science (New York, N.Y.), 230(4732), 1350-1354)は、変性、反対のストランドへのプライマー対のアニーリング及び標的配列のコピー数を指数関数的に増加させるプライマー伸長の複数サイクルを用いる。RT-PCRと呼ばれているバリエーションにおいて、逆転写酵素(RT)は、mRNAから相補DNA(cDNA)を作るために用いられ、cDNAは、次に、PCRによって増幅され複数コピーのDNAを生産する(Gelfand et al., "Reverse Transcription with Thermostable DNA Polymerases-High Temperature Reverse Transcription,"(Gelfand、1994、米国特許第5,322,770号; Gelfand & Myers、1994、米国特許第5,310,652号)。核酸を増幅する他の方法は、LCR方法と称されている(リガーゼ鎖反応、Laffler, Carrino, & Marshall、1993、Annales De Biologie Clinique、51(9)、821-826)。LCR(Laffler et al., 1993, Annales De Biologie Clinique, 51(9), 821-826)は、2つの隣接するプローブが標的配列とハイブリダイズして、リガーゼによって互いに連結する反応に基づく。2つのプローブは、標的ヌクレオチド配列の非存在下で連結することができず、連結した産物の存在は、標的ヌクレオチド配列を示す。LCR方法は、また、テンプレートから相補的な鎖を分離するための温度コントロールを必要とする。他の方法は、ストランド変位増幅(George T. Walker, Little, & Nadeau、1993、米国特許第5,270,184号; George T. Walker、1995、米国特許第5,455,166号; G. T. Walker et al., 1992, Nucleic Acids Research, 20(7), 1691-1696, 1992, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89(1), 392-396)であり、一般には、SDAと呼ばれている。これは、標的配列の反対のストランドにプライマー配列の対をアニールすることと、二体鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を生産するdNTP存在下でのプライマー伸長と、ヘミ改変型制限エンドヌクレアーゼ認識サイトのエンドヌクレアーゼ媒介ニッキングと、現存しているストランドを変位させて、次のプライマーアニーリング、切断及びストランド変位用のストランドを生産するニックの3'末端からのポリメラーゼ媒介プライマー伸長、のサイクルを用いることで、結果として産物の幾何学級数的な増幅になる。好熱性SDA(tSDA)は、本質的に同じ方法よりも高い温度で、好熱性エンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼを使用する(Fraiser, Spargo, Van, Walker, & Wright、2002、欧州特許番号0 684 315)。他の増幅方法として、塩基配列に基づく増幅法(Compton, 1991, Nature, 350(6313), 91-92, Malek, Davey, Henderson, & Sooknanan, 1992)(一般的にNASBAと呼ばれている);プローブ分子自体を増幅するRNAレプリカーゼを使用する方法(Lizardi, Guerra, Lomeli, Tussie-Luna, & Russell Kramer, 1988, Nature Biotechnology, 6(10), 1197=1202)(一般的にQβレプリカーゼと呼ばれている);転写に基づく増幅方法(Kwoh et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86(4), 1173-1177);自家持続配列複製法(3SR)、(Guatelli et al., 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87(5), 1874-1878; Landgren (1993) Trends in Genetics 9, 199-202;、及びLee, H. et al., NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TECHNOLOGIES(1997));及び転写媒介増幅(Kwoh et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86(4), 1173-1177; Kacian & Fultz、1995、米国特許第5,480,784号; Kacian & Fultz、1996、米国特許第5,399,491号)(一般的にTMAと呼ばれている)が挙げられる。公知の増幅方法に関する更なる議論については、Persing, David H., 1993, "In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques" in Diagnostic Medical Microbiology:Principles and Applications (Persing et al., Eds.), pp. 51-87 (American Society for Microbiology, Washington, D.C.)を参照。本発明による使用に適している他の解説となる増幅方法には、ローリングサークル増幅(RCA)(Fire & Xu, 1995, Proceedings of the National Academy of Sciences, 92(10), 4641-4645;Lizardi、1998、米国特許第5,854,033号);Nucleic Acid Amplification Using Nicking Agents(Van Ness, Galas, & Van Ness、2006、米国特許番号7,112,423);Nicking and Extension Amplification Reaction (NEAR)(Maples et al.、2009、US 2009-0017453 A1);Helicase Dependent Amplification (HDA)(Kong, Vincent, & Xu、2004、US 2004-0058378 A1;Kong, Vincent, & Xu, 2007 US pat. US2007/0254304 A1);及びループ媒介等温増幅法(LAMP)(Notomi & Hase、2002、米国特許第6,410,278号)、及び四重プライミング増幅法(Analyst, 2014,139, 1644-1652)も含まれる。Expar増幅法(PNAS April 15、2003 100、4504-4509)。クロスプライミング増幅法(Sci Rep. 2012; 2: 246)。SMAP増幅法(Nature Methods 04/2007; 4(3):257-62)。多重変位増幅法(MDA, Proceedings of the National Academy of Sciences 2005, 102 (48): 17332-6.)、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法(Journal of Clinical Virology 54 (4): 308-12)。単一プライマー等温増幅法(SPIA)(clinical chemistry, 2005 vol. 51 no. 10 1973-1981)。
増幅の他の態様は、シグナル増幅である。検出予定の核酸の量が充分利用可能な場合、その標的のより多くのコピーを(例えば、PCR及びLCRで)製作する代わりに、その配列を直接検出することに利点がある。ノーザン及びサザンブロッティング及びRNase保護アッセイを含む直接検出の従来の方法は、通常、放射性物質の使用を必要とし、オートメーションに適していない。他の技術は、放射性物質の使用を排除しようとしている、及び/又は自動化可能なフォーマットの感度を向上させようとしている。サイクリングプローブ反応(CPR)(Duck, Alvarado-Urbina, Burdick, & Collier, 1990b, BioTechniques, 9(2), 142-148)は、中央部分がRNAでできている一方で2つの末端がDNAでできている長いキメラオリゴヌクレオチドを使用する。標的DNAに対するプローブのハイブリダイゼーション及び耐熱性RNase Hに対する曝露によって消化されるRNA部分が生じる。これは、二体鎖の残りのDNA部分を不安定にし、標的DNAからプローブの残部を放出して、他のプローブ分子によってプロセスを繰り返すことができる。Urdea et al., 1987, Gene, 61(3), 253-264によって記載されている分岐DNA(bDNA)は、個々のオリゴヌクレオチドが35〜40個の標識(例えば、アルカリホスファターゼ酵素)を載せることができる分岐構造を有するオリゴヌクレオチドに関する。これがハイブリダイゼーションイベントからのシグナルを高める一方で、非特異的結合からのシグナルを同じように増加させる。他のシグナル増幅として、侵入的開裂(invasive cleavage)(Prudent, Hall, Lyamichev, Brow, & Dahlberg、2006、米国特許第7,011,944号);ハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)(R. M. Dirks & Pierce, 2004, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(43), 15275-15278, R. Dirks & Pierce、2012、米国特許番号8,105,778)及びG-四重DNAzymeに基づく比色検出が挙げられる。CHA増幅法(J. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (20), pp 7430-7433)。SMARTシグナル増幅法(Biotechniques 2002 Mar; 32(3):604-6, 608-11.)
増幅産物は、質的に(即ち、コントロールに関連するポジティブシグナル)又は、量的に(増幅産物を引き起こす分析物の絶対量又は相対的量に関連したシグナルの強さ)検出することができる。検出は、更なる分析(例えば増幅産物の配列決定)を含めることができるが、必須ではない。本発明によって提供される方法は、捕獲反応産物又は増幅反応産物(例えば、特定の標的アンプリコン又はアンプリコンのセット)における特定の核酸を直接検出することを含めることもできる。従って、本発明の混合物は、5'->3'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼによって放出することができる検出可能なリポーター及び消光物質部分を含む加水分解性プローブを使用する、TAQMANTMを含む特殊なプローブセットを含むことができる(Livak, Flood, & Marmaro、1996、米国特許第5,538,848号);反対の末端でリポーター及び消光物質部分を有するヘアピンプローブを使用する分子ビーコン(Tyagi, Kramer, & Lizardi、1999、米国特許第5,925,517号);蛍光ドナー及びアクセプターをそれぞれ有する一対の隣接するプライマーを使用する蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)プライマー(Wittwer, Ririe, & Rasmussen、2001、米国特許第6,174,670号);LIGHTUPTM、標的に結合した時にだけ蛍光を発する単一のショートプローブ(Kubista & Svanvik、2001、米国特許第6,329,144号)。同様に、SCORPIONTM(Whitcombe, Theaker, Gibson, & Little、2001、米国特許第6,326,145号)及びSIMPLEPROBESTM(Wittwer et al.、2003、米国特許第6,635,427号)は、単一リポーター/染料プローブを使用する。アンプリコン検出プローブは、上述した特許において述べられているように、使用する特定の検出種類に従って設計してもよい。他の検出方法としては、ゲル電気泳動、マススペクトル分析又はキャピラリー電気泳動、融解曲線、核酸に基づく蛍光キレート染料(例えばSYBRグリーン)又は蛍光ラベル及び可溶性消光物質を用いた増幅産物の検出(Will, Gupta, & Geyer、2014、米国特許第8,658,366号)が挙げられる。
マルチプレックス増幅という用語は、関心を引く複数の核酸の増幅を指す。それは、例えば、George T. Walker, Nadeau, & Little、1995、米国特許第5,422,252号;、及び、George T. Walker, Nadeau, Spears, et al.、1995、米国特許第5,470,723号において述べられている通り、サンプルのいくつかの配列のうちの1つの増幅又は同じサンプル由来の複数配列の増幅と称することができ、それは、マルチプレックスストランド変位増幅の例を提供する。また、この用語は、複数サンプルに存在する1又は複数の配列の同時又はステップワイズ増幅を指す。
リアルタイム増幅とは、反応が進行するにつれて、反応産物(即ちアンプリコン)の量がモニターされる増幅反応を指す。リアルタイム増幅の形態は、反応産物をモニターするために使用する検出機構が主に異なる。検出法は、Mackay, Arden, & Nitsche, 2002, Nucleic Acids Research, 30(6), 1292-1305(本願明細書に引用したものとする)において検討されている。
「検出ラベル」という用語は、検出可能な(好ましくは定量化可能な)シグナルを提供するために用いることができる、又は提供することを補助することができ、核酸又はタンパク質に付加することができる任意の原子又は分子を指す。ラベルは、蛍光、放射性物質、比色、重量測定、磁気、酵素活性等によって検出可能なシグナルを提供することができる。検出ラベルは、さまざまな方法で組み込むことができる:(1)プライマーは、例えば、塩基、リボース、ホスファート又は核酸アナログにおける類似した構造に付加したラベルを含んでいる;(2)ヌクレオチド三リン酸は、ラベルを有する塩基又はリボース(又は、核酸アナログにおける類似した構造)で改変される;ラベル改変型ヌクレオチドは、次に、伸長酵素(例えば、ポリメラーゼ)によって新しく合成されたストランドに組み込まれる;(3)検出可能なラベルを付加するために用いる(ポスト酵素反応)ことができる機能的なグループを有する改変型ヌクレオチドを用いる;(4)同様の方法で検出可能なラベルを付加するために用いることができる機能的なグループを有する改変型プライマーを用いる;(5)直接ラベル化して、アンプリコンの一部にハイブリダイズするラベルプローブを用いることができる;(6)増幅産物に組み込むことができるラベル;(7)増幅反応の副産物と反応することができるラベル。
用語「熱的サイクリング」、「熱サイクリング」、「熱サイクル」又は「サーマルサイクル」は、完全変性温度からアニーリング(又はハイブリダイズ)温度、伸長温度、そして完全変性温度に戻る温度変化の繰り返しサイクルを指す。また、この用語は、変性温度及び伸長温度の繰り返しサイクルも指し、アニーリング及び伸長温度は、1つの温度に組み合わされている。完全変性温度は、全ての二本鎖断片を一本鎖に戻す。アニーリング温度によって、核酸テンプレートからの分離されたストランドの相補的な配列にプライマーがハイブリダイズ又はアニールすることができる。伸長温度によって、アンプリコンの初期DNA鎖合成が可能になる。
「反応混合物」、「増幅混合物」、又は「PCR混合物」という用語は、核酸テンプレートから少なくとも1つのアンプリコンを増幅するのに必要な成分の混合物を指す。混合物は、ヌクレオチド(dNTP)、耐熱性ポリメラーゼ、プライマー及び複数の核酸テンプレートを含むことができる。混合物は、Tris緩衝液、一価の塩及びMg2+を更に含むことができる。各成分の濃度は、公知技術であり、更に最適化することができる。
用語「増幅された産物」又は「アンプリコン」は、増幅方法(例えばPCR)において一対のプライマーを使用してポリメラーゼによって増幅されるDNAの断片を指す。
「蛍光体」とは、規定の励起波長での光エネルギーを吸収して、様々な規定の波長で光エネルギーを発するものを指す。
「消光物質」は、それが蛍光ラベルの近くに位置すると励起した蛍光ラベルのエネルギーを吸収することができ、そのエネルギーを消失させることができる任意のものを含む。消光物質は、蛍光消光物質又は非蛍光性消光物質とすることができ、それは暗い消光物質ともいえる。上記の蛍光体は、他の蛍光体に近づくと、消光物質としての役割を果すことができ、FRET消光か接触消光が発生する可能性もある。任意の可視光を発しない暗い消光物質が用いられることが好ましい。暗い消光物質の例として、限定するものではないが、DABCYL(4-(4-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸)スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシンイミジルエステル(QSY-7)及び4',5'-ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシンイミジルエステル(QSY-33)、クエンチャール又は「ブラックホール消光物質」(BHQ-1、BHQ-2及びBHQ-3)、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチドG残基、ナノ粒子及び金粒子が挙げられる。
「変異」という用語は、野生型と称される標的核酸の原型形態とは異なる標的塩基配列における1又は複数のヌクレオチドを指す。野生型と称される配列は、配列の最も一般的な対立形質、配列の第一発見形態及び/又は正常(非病気表現型)と関連している配列の形態である。単一のヌクレオチド多型(SNP)は、変異の1つの形態である。
「表面」という用語は、核酸が共有結合的に付加できる任意の固体表面(例えばラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレン、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス面及びシリコンウェーハ)を指す。好ましくは、固体担体は、ガラス面である。
本明細書で使用される「表面に付加」という用語は、化学的に改変可能な機能的な基を含む任意の化学又は非化学結合方法を指す。「付加」は、共有結合的付加による又は不可逆受動的吸着を介して又は分子間の親和性(例えば、ビオチン化された分子によるアビジンコート表面上へ固定化)を介して固体担体への核酸の固定化に関する。付加は、DNA変性条件下で水又は水性バッファーを用いての洗浄でも取り除くことができない充分な強さでなければならない。
粘着末端は、核酸の二本鎖セグメントに隣接する核酸の一本鎖末端である。相補配列を有する粘着末端付き核酸は、粘着末端を介してアニーリングすることができ、互いにライゲーションを受けることができる。
人工配列は、試料中に存在していることが知られている又は存在しているか疑わしい天然標的核酸との相補性を欠いているか、少なくともそれらに対して相補性を有することを意図しない配列である。人工配列は、他の目的の中でも、標的核酸にハイブリダイズするセグメントに結合するリンカーとして、又はプライマーを標識するための尾部として役割を果すことができる。
詳細な説明
I. 概略
本発明は、限られたヌクレオチド組成の単一のプライマー又は一対の順方向及び逆方向プライマーからの増幅方法を提供する。限られたヌクレオチド組成は、プライマーが少なくとも1つのヌクレオチドタイプにおいて非主流であることを意味する。かかるプライマーは、互いをプライミングする能力、又は、標的核酸におけるそれらの意図するプライマー結合サイト以外からのミスプライミングによって開始される伸張する能力がかなり低下している。標的特異的増幅に関するかかるプライマーの使用には、プライマー結合及び増幅をサポートする標的核酸のプライマー結合サイトの同定を必要とする。ある標的核酸において、限られたヌクレオチド組成のプライマーに対して完全な相補性を有するプライマー結合サイトは、同定することができる。多くの場合、標的核酸の限られたヌクレオチド組成のセグメントは、プライマー結合サイトとして機能するにはそれ自体があまりにも短い。しかしながら、かかるサイトは、補助的足場又はジャンクションオリゴヌクレオチドの使用、プライマー結合サイトに対してミスマッチハイブリダイズするプライマー、ミスマッチ安定化剤及びプライマーにおける限られて数の非主流ヌクレオチドの存在を含む、後述する様々な技術によって、限られたヌクレオチド組成のプライマーを用いた増幅に適しているといえる。本開示発明は、非主流プライマー結合サイトに対する非主流プライマーハイブリダイゼーション効率を向上させることができる方法を含む。本方法が、様々な検出フォーマットと共に、様々な増幅フォーマット(例えばPCR、TMA、リガーゼ鎖反応、NEAR、LAMP、RPA、EXPAR等)において用いることができる。この方法は、同時に複数の標的核酸の検出のためにマルチプレックスを行なうこともできる。
II. プライマー設計
a. 基本原理
本方法は、1又は複数のヌクレオチドタイプが非主流である(例えば、A、T、C及びGではない)プライマーの限られたヌクレオチド組成の基礎的コンセプトを用いて開始して、その組成物のプライマーとペアリングするための、標的核酸内の最も適したプライマー結合サイト(例えば、A、T及びG)を選択する。選択したプライマー結合サイトに応じて、プライマーのヌクレオチド組成を(例えば、非主流ヌクレオチドのユニットを限られた数にすることによって)調節してプライマー結合サイトとの相補性を向上させることができる。
好ましいプライマー設計は、4つの標準ヌクレオチドタイプのうちの一つだけを順方向及び逆方向プライマーの両方において非主流とすることである。言い換えると、かかるプライマーは、A、T/U及びC並びに非主流Gか、A、T/U及びG並びに非主流Cか、A、G及びC並びに非主流Tか、T、G及びC並びに非主流Aからなることができる。非主流ヌクレオチドタイプは、好ましくはG又はCである。非主流ヌクレオチドタイプがプライマーに存在する場合、好ましくは3'ヌクレオチド以外の位置に位置し、最も好ましくは5'ヌクレオチドの位置又はプライマーの5'ヌクレオチドに連結する5'尾部ヌクレオチドの位置である。5'非主流ヌクレオチドの包含は、予想外の増幅産物が著しく増加することなくプライマー結合の融解温度(TM)を上昇させる。
プライマーの3'ヌクレオチドは、非主流ヌクレオチタイプの相補体によって好ましくは占められる。例えば、非主流ヌクレオチドタイプがGである場合、3'ヌクレオチドは、好ましくはCであり、その逆もまた同じである。末端C又はGは、対になる相補的な塩基がプライマー上にないため、プライマー二量体伸長を阻害する。1つのヌクレオチドタイプの除去又は非主流化は、実質的にヌクレオチドの数を、プライマー間又はプライマーとミスマッチプライマー結合サイトとの間でワトソン-クリック対を形成することができる数よりも制限する。プライマーの3'ヌクレオチドの適切な塩基ペアリングは、テンプレート依存的伸長をサポートするその能力に非常に重要である。この位置での非主流ヌクレオチドタイプの相補体の使用は、プライマー二量体及びプライマーミスマッチ伸長を実質的に低減する。
プライマー設計の他の特徴は、従来型のプライマーと類似している。プライマーは、そのプライマー結合サイトに相補的な配列を有する。あるプライマーは、長さが少なくとも15、20、25、30、35又は40ヌクレオチドである。あるプライマーは、長さが25、30、40、50又は75ヌクレオチド以下である。プライマーは、これらの上限の長さ及び下限の長さの任意の組み合わせ(例えば、15-50、20-30又は30-40ヌクレオチド)を有することができる。そのプライマー結合サイトに対するプライマーの融解温度は、例えば45-80℃又は好ましくは55-65℃であってもよい。規則によれば、コーディングストランドの1つである逆ストランドに結合しているプライマーに関しては、順方向プライマーは、非コーディングストランドに相補的であるため、伸長産物は、コーディングストランドであり、逆方向プライマーは、コーディングストランドであるため、伸長産物は、非コーディングストランドである。コーディング及び非コーディングストランドを有さない標的核酸に関しては、順方向及び逆方向プライマーの指定は、任意である。そのようなケースは、順方向及び逆方向プライマーが同じストランド上のプライマー結合サイトに結合するようなケースでもある。プライマーは、標的核酸に相補的でない5'尾部を有することができる。かかる尾部は、蛍光体又は消光物質を付加するために用いることができたり、識別コードを含めることができるたり、その標的核酸に相補的なプライマーの不連続なセグメントを連結することができたりする。
増幅条件は、通常、バッファー、Mg2+、酵素、温度等に関しては、従来型のプライマーと同様である。従来型の増幅は、dNTPモノマーとして表される全部で4つの標準ヌクレオチドタイプによって実行される。限られたヌクレオチド組成のプライマーを用いた増幅は、実行することができるが、低下した濃度で存在若しくは非存在する又はddNTP(更に後述する)として提供される非主流ヌクレオチドタイプの相補体を用いて実行することもできる。
通常、しかしながら常にではないが、順方向及び逆方向プライマーは、標的核酸の逆ストランドに結合する。従って、標的核酸の1つのストランドは、例えば、逆方向プライマー結合サイト及び順方向プライマー結合サイトの相補体を含み、他のストランドは、順方向プライマー結合サイト及び逆方向プライマー結合サイトの相補体を含む。あるフォーマットにおいて、順方向及び逆方向プライマー結合サイトは、同じストランドにある。例えば、連結した順方向及び逆方向プライマーは、同じストランド上の結合サイトに結合することができ、ローリングサークル機構によって増幅することができる。ある対のスリーウエイジャンクションプライマーは、同じ核酸ストランド上のサイトに結合することもできるため、1つのプライマーは、その他のテンプレートとしての役割を果す。
標的核酸における適切なプライマー結合サイトのための調査は、プライマー結合サイトがプライマーに相補的でなければならないというプライマー設計の原則による情報に基づく。例えば、単一のヌクレオチドタイプにおいて非主流であるプライマーの使用によって、プライマーにおいて非主流であるヌクレオチドタイプの相補体において順方向プライマー結合サイト及び逆方向プライマー結合サイトに関する標的核酸をサーチすることができる。好ましくは、非主流ヌクレオチドタイプの相補体が非存在である順方向プライマー結合サイト及び逆方向プライマー結合サイトが同定される。しかしながら、かかるサイトを見つけられることができない場合、他のプライマー結合サイトを更に用いることができ、好ましくは、それは、非主流ヌクレオチドタイプの相補体のユニット数が最も小さいものである。多くの場合、プライマーの非主流ヌクレオチドタイプの相補体は、プライマー結合サイトにおいて非主流のそれ自体であるが、これは重要ではない。ある順方向及び逆方向プライマー結合サイトは、それぞれ、プライマーにおいて非主流のヌクレオチドの相補体を4以下のユニット、3以下のユニット、2以下のユニット又は1ユニットだけ有する。
ATCプライマーに関していえば、ソフトウェアを用いて、逆方向プライマー結合サイト及び順方向プライマー結合サイトの相補体をそれぞれ表している隣接又は近接ATG及びATC領域を探すことができる。ATGプライマーを用いるために、ソフトウェアは、逆方向プライマー結合サイト及び順方向プライマー結合サイトの相補体のそれぞれのためのATC及びATG領域を探すことができる。CGAプライマーを用いるために、ソフトウェアは、逆方向プライマー結合サイト及び順方向プライマー結合サイトの相補体をそれぞれ表しているCGT及びCGA領域を探すことができる。CGTプライマーを用いるために、ソフトウェアは、逆方向プライマー結合サイト及び順方向プライマー結合サイトの相補体のそれぞれのためのCGA及びCGT領域を探すことができる。
逆方向プライマー結合サイト及び順方向プライマー結合サイト(又は、逆方向プライマーと同じストランドにある場合は、順方向プライマー結合サイト自体)の相補体は、互いに隣接することができたり、標的核酸のストランドにおける介在ヌクレオチドによって分離することができたりする。介在ヌクレオチドは、もしあれば、プライマー及びその相補体の非主流ヌクレオチドを除外することができたり、これらのヌクレオチドのうちの1つ又は両方、及び、4つの標準ヌクレオチドタイプのうちの他の2つのいずれかを含むことができたりする。隣接ではない場合、逆方向プライマー結合サイト及び順方向プライマー結合サイト(又は、順方向プライマー結合サイト自体)の相補体は、増幅技術と適合する伸長するほど互いが十分に近く(例えば、100、500、1000、又は10000ヌクレオチド以下で)なければならない。
図1は、3'位にCヌクレオチドを有する順方向及び逆方向プライマーのそれぞれがA、T及びCヌクレオチドからなる方法を簡単に示している。言い換えると、Gは、非主流ヌクレオチドタイプである。逆方向プライマー結合サイトは、A、T及びG(プライマーにおいて非主流であるCの相補体)からなる。示されている順方向プライマー結合サイトの相補体はA、T及びCからなり、順方向プライマー結合サイトが(逆方向プライマー結合サイトのように)A、T及びGからなることを意味している。順方向及び逆方向プライマーは、それぞれ、順方向及び逆方向プライマー結合サイトに完全に相補的である。逆方向プライマー結合サイト及び順方向プライマー結合サイトの相補体は、隣接する。増幅産物は、順方向及び逆方向プライマーの3つのヌクレオチドタイプに相補的な3つのヌクレオチド三リン酸モノマーA、T及びGと共に反応が開始すると形成することができる。プライマー二量体形成及びミスペアリングは、ほとんどの塩基がプライマー間及び/又はプライマーとミスマッチプライマー結合サイトとの間で対になることができないため、説明した通り阻害される。しかしながら、伸長を開始するのに十分な予想外のプライマー結合サイトにプライマーが十分に結合することができる場合であっても、増幅産物は、形成されないだろう。理由は、増幅混合物において省略されたヌクレオチド三リン酸モノマーによって、伸長鎖がCを組み込む必要がある場合に増幅が停止するためである。
あるいは、図7に示すように、プライマー結合サイトは、標準ヌクレオチドのうちの全4つを含む領域によって非連続となる且つ分離される可能性がある。この場合には、増幅は、標準ヌクレオチド三リン酸モノマーのうちの全4つによって実行される。
b. プライマー結合サイトとプライマーとの間のミスマッチ
図5は、順方向及び逆方向プライマー結合サイトに関する標的核酸の調査によってA、T、Cヌクレオチドからなるプライマーに完全な相補性を有する順方向及び逆方向プライマー結合サイトの一対として適合していなかった(即ち、非主流ヌクレオチドタイプが完全に存在していないプライマー結合サイトでない)ことを示すより典型的な状態を示している。最も長いATC領域は、7ヌクレオチド(CATCCTC)を含み、最も長いATG領域(CGATTGGTATG)は、12ヌクレオチドを含む。これらの領域は、それらのTmが非常に低いため、プライマーとして使用するにはそれほど長くはない。そのような場合、プライマー結合サイトとミスマッチなプライマーを用いることができる。図5において、順方向プライマー結合サイト及び逆方向プライマー結合サイトは、それぞれ、プライマーにおけるC-ヌクレオチドによって整列配置された3つのCユニット及び2つのCユニットを有する。従って、かかるプライマー及びプライマー結合サイトが互いにハイブリダイズする場合、3つのミスマッチ位置が逆方向プライマーとその結合サイトとの間に、そして、2つのミスマッチが順方向プライマーとその結合サイトとの間に存在することになる。それにもかかわらず、ハイブリダイゼーション及び伸長は、効率が低下してもまだ生じることがある。ハイブリダイゼーション及び伸長は、反応混合物がミスマッチ安定化剤と共に供給される場合に増加することができる。ミスマッチ結合又は安定化剤は、化学的相互作用又は物理的相互作用により、非主流プライマー結合サイトとの非主流プライマーハイブリダイゼーションを安定させることができる非主流プライマーの任意の分子又は任意の改変である(図6を参照)。非主流プライマーの改変は、容易に決定することができる所定の非主流プライマーの所望の機能と所定の改変が適合する限り、任意の方法で改変することができる。改変は、塩基改変、糖改変又は主鎖改変(例えばPNA、LNA又は2'フルオリン2'メンチルオキシ)を含む。ミスマッチ安定化剤の例としてのロジウム金属挿入剤は、Ernst et al. J. Am. Chem. Soc. 131, 2359-2366 (2009)に記載されている。ロジウム金属挿入剤のような化学薬品は、具体的には、DNAミスマッチと結合することができ、CCミスマッチで2.0 x 107M-1の結合定数を有することができる。ロジウム金属挿入剤の結合は、18.7℃だけ、ミスマッチを含む二本鎖DNAの融解温度を上昇させることができる。従って、かかるミスマッチ結合試薬を3-ヌクレオチドタイププライマーPCR反応に加えて、特にミスマッチを安定させてPCR効率を上昇させることができる。C-Cミスマッチと同様に、TC又はACミスマッチも、他の可能性のあるもの中のかかる試薬によって安定化することができる。かかる安定化剤を用いても、ミスマッチプライマーは、わずかに効率が低下するもののテンプレートとハイブリダイズして、増幅を進行させることができる。
c. 数ユニットの非主流ヌクレオチドの包含
代わりに又は付加的に、ミスマッチ安定化剤を使用することによって、ミスマッチの数は、そのプライマー結合サイトとのミスマッチの数を減らすプライマーにおける位置で非主流ヌクレオチドタイプの限定されたユニット数(一般的に最大2つの内部位置)を導入することによって減らすことができる。非主流ヌクレオチドは、プライマーの5'位で使用することもできるし、プライマーの5'末端に隣接する5'の尾部で用いることもできる。例えば、図5に示されるプライマー及びプライマー結合サイトに関して、順方向及び逆方向プライマーの各々への2つGの導入は、順方向プライマーの場合はミスマッチが1つに減少し、逆方向プライマーの場合はミスマッチが存在しない。
ミスマッチ安定化剤を使用するかプライマーに非主流ヌクレオチドタイプの1又は複数のユニットを含めるかの選択は、非主流ヌクレオチドタイプとそれらのそれぞれの結合サイトが完全に欠如している仮定の順方向及び逆方向プライマー間におけるミスマッチ位置の数次第である。2つを超えるミスマッチがかかるプライマーとその結合サイトとの間に存在する又はミスマッチがプライマーの3'末端近くで(例えば、4ヌクレオチド以内で)生じている場合、プライマーにおける1又は複数の非主流ヌクレオチドの包含によって1又は複数のミスマッチを排除することが好ましい。
ATCプライマーの場合、Gを非主流プライマーに導入する代わりに、1又は複数の非天然塩基を代替物として、非天然塩基が従来型のATGCプライマーと比較してプライマー二量体相互作用を減らすのを助けることができる限り導入することができる。非天然塩基の例は、イノシンである。Gの導入は、プライマーのその結合サイトに対するハイブリダイゼーション効率を増加させるが、CG対が存在しているためプライマー間及びプライマー内相互作用も増加する。一方で、イノシンは、フランキング塩基対の助けを借りて、プライマーのその結合サイトへのハイブリダイゼーション効率を維持する。しかしながら、プライマー間又はその中の1個又は数個のC及びI対は、結合に殆ど寄与せず、実質的なプライマー二量体形成とはならない。好ましくは、かかるプライマーは、プライマー伸長効率に対するミスマッチ効果を最小化するためにA、T及びCだけを含む3'セグメント及び任意の数(例えば、1-10)のイノシン残基だけを含んでいる5'セグメントからなる。
プライマー結合サイトが、非主流ヌクレオチドタイプが完全に不在であるプライマーと完全に適合しない状態において、増幅は、ヌクレオチド三リン酸モノマーとして供給されているプライマーにおいて非主流ヌクレオチドタイプの相補体なしでも生じる可能性があるが、このヌクレオチドタイプが供給される場合は、より効率的に進行する。しかしながら、このヌクレオチドタイプは、標準の4ヌクレオチドの他のものと比較して少ない濃度(例えば、他のヌクレオチド三リン酸モノマーのそれぞれ< 10x、<100X又は<1000X)で供給することができる、又はジデオキシNTPとして供給することができる。ミスプライミングから生じる伸長は、ジデオキシNTPによって終了する。いずれかの戦略の使用(ヌクレオチド濃度を減らすこと又はddNTPの使用)によって、ミスペアリングからの予想外の増幅産物又はプライマー二量体が減少する。イノシン置換を有するプライマーは、イノシン塩基上での効果的な伸長のために反応においてdCTPを必要とする。しかしながら、dCTPは、ヌクレオチド三リン酸モノマーの他のタイプと比較して、低い濃度で供給することができる。
標的配列が様々な種又は遺伝子型の生命体由来である場合、テンプレートは、複数のアレルの混合物である。非主流ヌクレオチドを有するプライマーは、種々の配列バリエーションにマッチするために、ある位置で縮重塩基を含むことができる。
ミスマッチ又はイノシン置換を有する非主流プライマーは、増幅反応において、それらの本来の(即ち、ミスマッチでもイノシン置換でもない)配列の従来型のプライマーとの組み合わせで用いることができる。しかしながら、従来型のプライマーは、0.1%〜50%の非主流プライマーの濃度にその濃度を低下させなければならなかった。従来型のプライマーは、非主流プライマーよりも効率的にそれらの結合サイトにハイブリダイズし、それらの伸長産物は、より多くのテンプレートと共に非主流プライマーを提供する。非主流ヌクレオチドの相補体であるdNTPのタイプは、前述のとおり低濃度で提供されるか、非主流プライマーの組成に応じて完全に省略される。従来型及び非主流プライマーのかかる組み合わせは、非主流プライマーからの増幅を容易にして、低プライマー-プライマー相互作用を維持する。
d. 足場プライマー
図14は、適切なプライマー結合サイトのための標的核酸の調査によって適切な逆方向プライマー結合サイト及び潜在性順方向プライマー結合サイトを示す状態を示している。ここでは、ヌクレオチド組成を制限(例えば、1つのヌクレオチドタイプを不在に)したが、プライマー結合を支持するには単独ではあまりにも短い。この状態において、非主流ヌクレオチドタイプを有するプライマーセグメントが同じ非主流ヌクレオチドを有する人工配列の核酸セグメント(即ち、標的核酸に相補的ではない)にその5'末端で連結し、その5'末端で、4つ全てのヌクレオチドが表される標的核酸に相補的である第二プライマーセグメントに連結している順方向プライマーが設計される。かかるプライマーは、人工配列のセグメントが、標的核酸にハイブリダイズする2つのプライマーセグメントの側面にループを形成しながら標的核酸にハイブリダイズすることができる。第二プライマーセグメントは、安定二体鎖を形成するにはあまりに短いにもかかわらず第一プライマーセグメントが標的核酸と二体鎖を形成するのを補助するため、第二プライマーセグメントは、足場プライマーとして称することができる。かかるプライマーは、非主流ヌクレオチドタイプの相補体がヌクレオチド三リン酸モノマーとして供給されない増幅混合物、又は、4つ全ての標準ヌクレオチド三リン酸モノマーが供給される増幅混合物において増幅することができる。一方又は両方のプライマーは、記載のように、足場配列及び人工配列と共に供給することができる。更なるバリエーションにおいて、単にループを形成する人工配列の代わりに、第一及び第二プライマーセグメントが図14に示すように標的核酸にハイブリダイズする場合、人工配列は、図15に示すステムループ構造を形成することができる。リンカー領域の3'末端は、5'プライミング領域の3'末端に対する相補体である。プライマーは、テンプレートとのハイブリダイゼーションを安定させ、増幅効率を上昇させるヘアピン構造を形成する。
他のフォーマットにおいて、単一のプライマー結合サイトは、増幅のために2種類のプライマーを同時に使用することができる。1つのプライマーは、非主流ヌクレオチドを有する3'プライマーセグメントが従来型のプライマーと類似している5'プライマーセグメントと直接連結するヘルパーと呼ばれている。ヘルパーは、従来型のプライマーセグメントからの補助に起因して、増幅を開始するのに充分な効率で標的とハイブリダイズすることができる。多重アレルの検出のために、5'プライマーセグメントは、縮重塩基を含むことができる。他のプライマーは、非主流プライマーであり、その5'セグメントの第4のヌクレオチドを非主流ヌクレオチドタイプの相補体と単に交換することによってヘルパープライマーと非常に似たものになる。ヘルパーは、予想外の増幅を最小化するために限定した量で提供される一方で、増幅を開始するには十分である。第二プライマーは、増幅を行なうのに標準的な濃度で提供される。
e. スリーウエイジャンクションプライマー
非主流ヌクレオチドタイプを有するプライマー結合サイトの一方又は両方がプライマー結合を支持するにはあまりに短い図14に示される状態のタイプは、図16に示すようにスリーウェイジャンクション配列を用いて代わり対処することができる。ここで、非主流ヌクレオチドタイプを有するプライマーセグメント(1)は、同じ非主流ヌクレオチドタイプの人工セグメント(2)にその5'末端で連結する。そして、このプライマーは、標的結合サイト(4)及び人工セグメントの相補体(3)を含んでいるジャンクションプライマーを有する標的核酸に、適所に保持される。ジャンクションプライマーの標的結合サイトは、4つ全ての標準ヌクレオチドを含む。ジャンクションプライマーは、限られたヌクレオチド組成プライマーに対して低濃度(コピー数)で用いることができる。順方向及び逆方向プライマーの一方又は両方は、スリーウェイジャンクション配列と置き換えることができる。
図17は、スリーウェイジャンクションプローブの代替物フォーマットを示している。このフォーマットにおいて、非主流ヌクレオチドタイプを有するプライマーセグメント(2)は、同じヌクレオチドタイプにおいて非主流の人工セグメント(1)に、その3'末端で連結される。ジャンクションプローブは、プライマーセグメント(2)において非主流のヌクレオチドの相補体である非主流ヌクレオチドを有する人工セグメント(4)にその5'末端で連結される標的結合セグメント(3)を有して供給される。2つの人工セグメント(1)及び(4)は、互いに相補的であるが、不等な長さであるため、短い人工配列(1)は、テンプレートとして長い人工セグメントを使用して伸長することができる。逆方向プライマーは、類似したアプローチを使用して設計される。順方向及び逆方向プライマーからの伸長産物は、相補的な配列であり、増幅産物が他の伸長のためのテンプレートとして役割を果すことができる。
図31Bは、非主流ヌクレオチドタイプを有するプライマーセグメントがプロモーター配列の相補体を有する核酸にその3'末端で連結する類似の配置を示している。ジャンクションプローブは、プロモーター配列を有する核酸にその5'末端で連結する非主流ヌクレオチドを有する標的結合セグメントとして供給され、それは、人工配列を有する核酸にその5'末端で次々に連結される。プロモーターは、転写を開始して、プロモーターに連結した人工配列の転写産物を発生させ、標的核酸の存在を示す。
図31Aは、図31Bに類似の配置を示しているが、プロモーターに代わるものとして、ジャンクションプローブは、制限サイトを有する核酸を通じて人工配列を有する核酸に連結することができる。かかる配置は、ニッキング増幅をサポートする。オリゴヌクレオチド1(左)は、5'セグメントに連結した制限サイトを有する3'人工セグメントからなり、3-ヌクレオチドタイプのプライマーである。オリゴヌクレオチド2(右)は、3-ヌクレオチドタイプのプライマーである3'セグメントに連結した5'人工3-ヌクレオチドタイプの配列と、オリゴヌクレオチド1の3'配列に相補的なリンカーセグメントからなる。オリゴヌクレオチド1及び2は、テンプレートを用いてスリーウェイジャンクション構造を形成する。オリゴヌクレオチド１は、伸長し、完全な制限サイトを形成する。切断酵素は、伸長産物を切断して放出する。切断及び伸長は、後のサイクルで繰り返す。
図18A、Bは、図17のフォーマットのバリエーションを示すものであり、順方向プライマーは図17にて説明している通りであるが、逆方向プライマーは、順方向プライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する人工汎用プライマーである。順方向プライマーは、標的配列に特異的であり、汎用プライマーは、種々の標的に関して同程度の特異性である。図18Aにおいて、プライマー1の3つのヌクレオチドタイプの領域(配列2)は、テンプレートにハイブリダイズする。プライマー1の3'末端(配列1)は、3つのヌクレオチドタイプの領域(配列4)にハイブリダイズして、配列5を伸長する。順方向プライマーの伸長産物は、増幅産物を生じる汎用プライマーの伸長のテンプレートとしての役割を果すことができる(図18B)。
f. ローリングサークルフォーマット
図31Cは、人工配列の核酸によって連結した順方向及び逆方向プライマーを示している。順方向及び逆方向プライマー及び人工配列は、非主流ヌクレオチドタイプを有する。順方向及び逆方向プライマーは、核酸標的の同じストランド上の結合サイトに結合し、切れ目は、リガーゼで埋められる。ライゲーション後、遊離プライマーは消化され、連結した環状産物だけが残る。ライゲーションした産物は、ローリングサイクル複製によって増幅することができる。
g. 検出フォーマット
上記方法は、様々な検出フォーマットに適合する。1つのフォーマットにおいて、増幅用に用いる1又は複数のヌクレオチド三リン酸モノマーをラベル化して、検出ラベルをラベル化モノマーと共に増幅産物に組み込ませる。任意の組み込まれたラベル化モノマー由来の増幅産物の識別によって、増幅シグナルの検出が可能になる。他のフォーマットにおいて、順方向及び逆方向非主流プライマーの一方又は両方は、検出ラベルに連結している。任意の組み込まれたラベル化プライマー由来の増幅産物の識別によって、増幅シグナルの検出が可能になる。検出ラベルは、プライマーの任意の位置で付加される。他のフォーマットにおいて、順方向及び逆方向非主流プライマーの一方又は両方は、酵素認識セグメント(例えば、ポリメラーゼによって認識されるプロモーター)に連結している。他のフォーマットにおいて、増幅用に用いる順方向及び逆方向非主流ヌクレオチドプライマーの一方又は両方並びにヌクレオチド三リン酸モノマーの両方をラベル化する。任意の組み込まれたラベル化プライマー又はヌクレオチド三リン酸モノマー由来の増幅産物の識別によって、増幅シグナルの検出が可能になる。他のフォーマットにおいて、特殊試薬又は化学薬品としては、増幅をモニターすることができるSYBRのような増幅混合物が挙げられる。他のフォーマットにおいて、ピロリン酸のような副産物によって増幅反応の検出が可能になる。他のフォーマットにおいて、増幅産物は、質量、サイズ、温度、電気、放射線、色、吸収量、反射及び速度等に基づいて検出される。他のフォーマットにおいて、順方向及び逆方向非主流プライマーの一方若しくは両方又は非主流プライマーの一部は、蛍光体でラベル化されている。消光化学薬品(例えばニューメチレンブルー、7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸又は7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸)は、増幅反応に提供することができる。消光化学薬品は、増幅産物に特異的に組み込まれて蛍光シグナルを消光する一方で、それらは、遊離蛍光ラベル化プライマーに影響を及ぼさない。
バリエーションにおいて、人工セグメントは、消光物質に連結される相補的なオリゴヌクレオチドに最初にハイブリダイズされ、蛍光ラベルからの蛍光を消光する。消光物質を有する相補的なオリゴヌクレオチドは、増幅を実行する際に外れ、その結果、増幅が進行するにつれて蛍光発光が現れる。図19は、左のプライマー1がF1でラベル化されていることを示している。右のプライマー2は、F2でラベル化されている。かかる増幅産物は、組み込まれなかった蛍光ラベル化プライマーを除去することなくリアルタイムに検出することができる。任意に、かかる検出フォーマットは、非ラベル化プライマー(図20で示す逆方向プライマー)を過剰量で実行してプローブ検出効率を向上させることができる。かかる検出フォーマットは、複数標的の同時検出のためにマルチプレックスを行なうことができる。
図25Aは、例示的な方法として使用したプライマーの組成を示している。3つのヌクレオチドタイプのプライマーの1つは、その5'末端において、3つの汎用人工ヌクレオチド配列を尾部として付加されている。5'末端蛍光ラベル化プローブは、人工配列と同じである3'プライマー配列と、5'検出プローブからなる。5'検出プローブに相補的である3'末端消光物質ラベル化プローブも提供される。蛍光は、増幅しない場合、消光される。
図25Bは、複数標的を検出するために用いる同じ5'人工尾部を有する複数プライマー対を示している。逆方向プライマーは、人工尾部配列まで伸長して、人工尾部に相補的な配列を発生させる。その3'末端で伸長した新しく発生した逆方向プライマーは、蛍光ラベル化プローブにハイブリダイズして伸長し、消光物質ラベル化プローブを置き換える。これで終了し、遊離蛍光が検出される。種々の蛍光ラベル化プローブ及びプライマー尾部配列を、多色検出のために用いることができる。
図23に示される他の検出フォーマット(Taqman(登録商標)フォーマット)において、プライマーの1つは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチド有する人工セグメントにその5'末端で連結することができる。かかるプライマーは、一方の末端の蛍光ラベルともう一方の末端の消光物質を有する相補的なオリゴヌクレオチドと共に供給される。逆方向プライマー伸長が消光物質オリゴヌクレオチドと出会うと、ポリメラーゼの5'エキソヌクレアーゼ活性がTaqman(登録商標)プローブを消化して、蛍光体と消光物質とを分離して蛍光シグナルを発生させる。かかるシグナルは、未使用プライマーを除去することなく検出でき、リアルタイム検出が可能になる。
図38A-Eは、Taq DNAポリメラーゼの5'フラップエンドヌクレアーゼ活性を用いる他の検出フォーマットを示している。図38Aは、プライマー構造を示している。プライマーの1つは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドを有する人工セグメントにその5'末端で連結する。単一のヌクレオチド「G」は、プライマーと人工セグメントとの間のリンカーとしての役割を果す。1つの末端でラベル化された蛍光体及び内部的にラベル化された消光物質を有する相補的なオリゴヌクレオチドは、等しい量又は過剰な量で供給される。相補的なオリゴヌクレオチドの3'セグメントは、プライマーの人工セグメントにハイブリダイズする。5'セグメントは、プライマー配列に相補的ではない。図38Bは、プライマーがプライマー伸長産物を生産したことと、逆方向プライマーが産物に結合して伸長することを示している。図38Cは、逆方向プライマー伸長が人工セグメントと相補オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションのジャンクションと出会うと、DNAポリメラーゼの5'フラップエンドヌクレアーゼ活性が相補オリゴヌクレオチドを切断して、蛍光体と消光物質を分離し、蛍光シグナルが生じることを示している。逆方向プライマーの伸長は、dCTPが反応に提供されないため「G」で停止する。他の相補オリゴヌクレオチドは、プライマー上の人工セグメントに結合することができ(図38D)、蛍光シグナルを放出するために切断される(図38E)。プロセスを繰り返して、蛍光シグナルを増幅させる。
図39A、Bは、蛍光体と消光物質がラベル化されたオリゴを用いたマルチプレックスに適したリアルタイム検出フォーマットを示している。図39Aは、プライマー構造を示している。プライマーの1つは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドを有する人工セグメントにその5'末端で連結する。蛍光体及び消光物質は、増幅反応においても提供される人工セグメントと同じ配列を有するオリゴヌクレオチドをラベルしている。その単一のストランドの形態において、蛍光体及び消光物質は、近傍にあり、蛍光は、消光されている。図39Bは、標的増幅の間、逆方向プライマー伸長が人工尾部の相補的な配列を発生させることを示している。人工尾部と同じ配列有するFQラベル化オリゴヌクレオチドは、合成された相補的な配列にハイブリダイズすることができる。蛍光体及び消光物質は、もはや近傍になく、蛍光が放出される。この反応は、逆方向プライマーが過剰量である不斉反応によって促進させることができるため、相補的な配列の単一のストランドを、ハイブリダイズするFQオリゴヌクレオチドに利用することができる。
図40A、Bは、マルチプレックスに適する更なるリアルタイム検出フォーマットを示している。図40Aは、プライマー構造を示している。プライマーの1つは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドを有する人工セグメントにその5'末端で連結する。蛍光体及び消光物質は、人工セグメントに付加され、ラベルのうちの少なくとも1つは、人工セグメント内にある。単一のストランドの形態において、蛍光体及び消光物質は、近傍にあり、蛍光が消光されている。図40Bは、標的増幅の間、人工セグメントが二本鎖になることを示している。蛍光体及び消光物質は、もはや近傍にないため、蛍光が放出される。
図24は、更なる検出フォーマット(分子ビーコン)を示している。プライマーの1つは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドを有する人工セグメントにその5'末端で再び連結する。増幅は、ヘアピンの末端における蛍光体及び消光物質を有するヘアピンステム構造と、プライマーに連結する人工セグメントの相補体に相補的なループ配列を有する分子ビーコンプローブの存在下で実行される。増幅産物が形成されると、分子ビーコンのループセグメントは、人工セグメントにハイブリダイズして、蛍光体及び消光物質が分離し、蛍光シグナルが生じる。このシグナルは、組み込まれた分子ビーコンを除去することなくリアルタイムに検出することができる。
ラベル化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする連結人工配列を有するプライマー又はラベル化プライマーを必要とするフォーマットの全ては、検出する各標的のための種々の人工配列及び種々の蛍光ラベルを用いて容易にマルチプレックスを行なうことができる。多重増幅を複数プライマー又はプライマー対を用いて実行する場合、非主流ヌクレオチドタイプは、通常、マルチプレックスにおいて存在する全てのプライマーにおいて同じである。例えば、全てのプライマーは、非主流G又は非主流Cを有することができる。
増幅産物は、他の技術における融解曲線分析(温度と吸収度の変化)、マススペクトル分析、ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動によって検出することもできる。
開示する方法は、プライマー二量体形成及び非特異的増幅を著しく低減し、二本鎖インターカレーティング染料の使用によってアンプリコンを検出することができ、蛍光ラベル化オリゴヌクレオチドの使用法と比較して非常に費用効率が高い。これらの方法は、それらのTmに基づいて異なるアンプリコンを識別する融解曲線分析を使用するのに適合させることができる。ある種の温度での融解ピークの存在及び非存在によって、その対応するアンプリコンの存在及び非存在が決まる。好ましくは、3又は4又は5つ又は6つのアンプリコンは、65℃から95℃にわたるそれらのTmによって識別することができる。しかしながら、標準的なアンプリコンの性質に起因して、そのTmは、低いTm範囲(即ち40℃-65℃)とすることができない。低いTm範囲(40℃-65℃)のTmを有する人工尾部配列は、1つ又は複数の非主流プライマーの5'末端に付加される(図37)。人工尾部配列の1つのストランドは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有することができる。種々の非主流プライマーは、種々のTmを有する同じ人工尾部又は種々の人工尾部を有することができる。人工尾部の相補的な配列も反応に提供され、それらは、二本鎖を形成することができる。プライマーをPCR反応に含めない場合、それは、溶液において変化が生じない。PCR後、二本鎖の尾部は残り、融解曲線分析の間、そのTmで融解ピークを示す。しかしながら、プライマーをPCR反応に含める場合、その伸長産物は、ハイブリダイズする他のプライマーのテンプレートとしての役割を果たし、二本鎖アンプリコンの一部となる。二本鎖の尾部は、分離して、低いTm範囲(40℃-65℃)のその対応する融解ピークが消える。従って、増幅が進行するにつれて、プライマー尾部の融解ピークから、かかるプライマーを組み込んでいる増幅産物の融解ピークへの遷移が存在する。好ましくは、種々のTmを有する人工尾部の3又は4又は5つ又は6つのタイプを、種々の非主流プライマーに導入することができる。1つの融解ピークの消滅は、対応する標的の存在を明示する。この方法は、1つのタイプの二本鎖インターカレーティング染料だけを用いた反応の多重性を顕著に増加させる。人工尾部及び相補的なストランドの代わりに、ステム-ループ構造を用いて非主流プライマーを付加することもできる。
マルチチャネル蛍光検出及びTm識別の組み合わせは、さらに高い多重性を可能にする。種々のTmを有する一連の人工配列は、蛍光体でラベル化することができ、それらの相補配列は、消光物質でラベル化されている。第二の一連の人工配列は、他の消光物質でラベル化することができ、それらの相補配列は、他の蛍光体でラベル化されている。2つの一連の配列が種々の非主流プライマーの5'末端に付加されると、蛍光チャネルにおける増幅反応後の融解ピークの消滅は、対応する標的の存在を示す。蛍光体及び消光物質の両方は、相補配列にラベル化することもできるため、その蛍光は、単一のストランドの形態において最小レベルにあり、それが非主流プライマー上の人工尾部にハイブリダイズすると増加する。ステム-ループ構造を用いて非主流プライマーに付加されると、蛍光体及び消光物質は、ステム-ループ構造の2つの末端にラベル化され、言い換えれば、蛍光体及び消光物質のうちの1つは、プライマーに内部的にラベル化される。二本鎖/ステム-ループ間のTmの差異は、種々の配列を用いて、又は、1つのストランドにおけるミスマッチ塩基を用いて導入することができる。
マルチチャネル融解曲線分析の他のフォーマットにおいて、非主流プライマーは、その5'末端に人工配列を尾部として付加されている。蛍光体及び消光物質は、人工尾部と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドも提供する。人工尾部(又は、蛍光体及び消光物質ラベル化オリゴ)の相補的な配列は、非主流プライマーが反応に含まれる場合に合成される。増幅反応後の融解曲線分析の間、蛍光体及び消光物質ラベル化オリゴヌクレオチドは、相補的な配列にハイブリダイズして、温度がそのTmに到達すると解離する。このオリゴヌクレオチドは、それがその相補的なストランドと二本鎖化すると、単一のストランド携帯である場合のシグナルよりも高い蛍光シグナルを有する。従って、融解ピークが観察される。好ましくは2又は3又は4又は5又は6つの融解ピークを、1つの蛍光チャネルにおける温度範囲において分割することができる。この方法は、マルチチャネルフォーマットにおいてより多くの標的を検出することができる。Tmの差異は、種々の塩基組成を有する配列、種々の長さを有する配列、その相補的なストランドに対してミスマッチを有する配列等によって導入することができる。
開示する方法は、核酸以外の分析物(例えば、タンパク質又は抗体)を検出するために用いることができる。オリゴヌクレオチドテンプレートを分析物に付加することができる。未結合オリゴヌクレオチドテンプレートを分離した後、非主流プライマーを有するオリゴヌクレオチドテンプレートの増幅は、分析物の存在を示す。あるいは、非主流プライマー又はプローブは、分析物に付加することができる。非主流プライマー又はプローブの検出は、分析物の存在又は非存在を示す。例えば、分析物に付加された非主流プライマー又はプローブの近接ライゲーションの後、ライゲーションされた産物の検出は、分析物の存在又は非存在を示す。
図32A及び図Bは、プライマーが1又は複数の非主流ヌクレオチドタイプを有する免疫PCRのための例示的なフォーマットを示している。図32Aにおいて、固体の表面にコートされている抗原は、リアルタイムPCRテンプレートとしての役割を果すオリゴヌクレオチドによって付加した抗体によって検出される。リアルタイムPCRシグナルは、抗原の存在を示す。オリゴヌクレオチドは、一次抗体に結合する二次抗体に付加することもできる。アッセイは、サンドイッチ免疫学的測定法において用いることもできる。図32Bにおいて、抗原上の種々のエピトープに特異的な抗体又は多重抗体は、種々のオリゴヌクレオチドに付加される。抗体が抗原に結合すると、オリゴヌクレオチド1及び2は、ヘルパーオリゴヌクレオチドの補助によってライゲーションされる。ライゲーション産物は、抗原検出のためのリアルタイムPCRテンプレートとしての役割を果す。かかるアッセイは、タンパク質-タンパク相互作用の検出のために用いることもでき、各タンパク質は、オリゴヌクレオチドが付加された特異的抗体と結合する。タンパク質-タンパク相互作用は、検出用リアルタイムPCRテンプレートとして役割を果すと、2つのオリゴヌクレオチドの近傍ライゲーションになる。
図33は、蛍光体間でのエネルギー転移を有するリアルタイムPCR検出を示している。
非主流ヌクレオチドタイプを有するプライマー1(又は、両方のプライマー)は、その5'末端上の蛍光体1でラベル化されている。例えば、図に示すように、プライマー1は、その5'Aにラベル化されている。PCR反応において、蛍光体2ラベル化dTTPは、産物に組み込まれている。蛍光体2の励起は、蛍光体2から蛍光体1へのエネルギー転移による。次に、蛍光体1は、励起状態となり、シグナルが検出される。
図34は、化学的改変型dNTPを有するリアルタイムPCR検出を示している。非主流ヌクレオチドを有する1又は複数のプライマーは、蛍光体でラベル化されている。1又は複数のタイプのdNTPは、二本鎖DNAインターカレーティング化学物質でラベル化されている、又はデアザdGTP又はデアザdATP等で改変されている。ラベル化又は改変型dNTPは、PCR産物にインターカレートされ、プライマーからの蛍光は消光される。シグナル低下は、テンプレートの存在を示す。別の実施形態において、改変型dNTPは、二本鎖DNAインターカレーティング染料から選択的にシグナルを検出するために用いることができる。例えば、デアザ-G又はデアザ-Aは、その付近のSYBRグリーンシグナルを消光することから、均一に分配されたデアザ-Gを含む標準的なPCR産物は、SYBRグリーンによって検出されない。非主流プライマーは、改変型デオキシヌクレオチド三リン酸に相補的な塩基を含まない、それらの5'末端で人工配列を有することができる。5'末端の人工配列の合成された相補的な配列は、インターカレーティング染料を消光する改変型dNTPを含まない。例えば、ATCプライマーがその5'末端にCを含まない人工配列を尾部として付加されている場合、PCR増幅産物は、2つのセグメント:デアザ-Gを含むセグメント及びデアザ-Gを含まないセグメントを含む。インターカレーティング染料SYBRグリーン蛍光は、第一セグメントのデアザ-Gによって消光され、第二セグメントのSYBRグリーン蛍光は消光されない。
図35は、蛍光体とDNAインターカレート化学物質との間でのエネルギー転移を有するリアルタイムPCR検出を示している。非主流ヌクレオチドを有する1又は複数のプライマーは、蛍光体でラベル化されている。dsDNAインターカレーティング化学物質は、PCR反応に加えられる。化学物質は、テンプレートが存在していると蛍光シグナルが低下する蛍光消光物質であってもよい。化学物質は、テンプレートが存在しているとプライマー上の蛍光体を刺激するエネルギー転移ドナーとしての役割を果すこともできる。
図36は、Lightup(登録商標)蛍光体を有するリアルタイムPCR検出を示している。非主流ヌクレオチドを有する1又は複数のプライマーは、Lightup(登録商標)蛍光体でラベル化されている。蛍光体は、プライマーが単一のストランド形態である場合、蛍光を発しない。PCR反応において、プライマーは、テンプレートにハイブリダイズして伸長し、二本鎖を形成する。次に、蛍光体は、二本鎖DNAにインターカレートして、蛍光が検出される。
非主流プライマー又はプローブの複数対を有するマルチプレックス増幅のために、増幅産物は、マイクロアレイ、又は配列、又はビーズ又はナノバーで検出することができる。一対の非主流プライマーの1つは、溶液において遊離プライマーと共に表面にグラフトされる。これらの方法によって、同時増幅及び表面上へPCR産物の付加が可能になる(Oroskar et al., 1996, Clinical Chemistry, 42(9), 1547-1555)。任意に、両方のプライマーを増幅のために表面にグラフトすることができる。表面に付加された非主流プライマー又はプローブは、コード化又は非コード化又はランダム分配することができる。
W096/04404(Mosaic Technologies, Inc. et al)は、標的核酸を潜在的に含むサンプルの標的核酸の検出方法を開示している。この方法は、標的核酸が試験サンプルに存在する場合にだけ、PCRに基づく標的核酸の増幅が誘導される。標的配列の増幅のために、両方のプライマーを固体担体に付加して、増幅された標的塩基配列が固体担体に付加される。この文献において開示されている増幅技術は、担体に付加される順方向及び逆方向の両方の非主流プライマーを用いた「ブリッジ増幅」技術として時には称される。この技術において、2つの非主流プライマーは、従来型のPCRに対して、それらが増幅される特定の標的DNA配列の側面に位置するように特に設計されている。従って、特定の標的核酸がサンプルに存在する場合、標的核酸は、非主流プライマーにハイブリダイズすることができ、PCRによって増幅することができる。このPCR増幅過程における第一ステップは、担体に付加する第一特異的非主流プライマー(「プライマー1」)に対する標的核酸のハイブリダイゼーションである。標的核酸に相補的である第一増幅産物は、次に、プライマー1配列の伸長によって形成される。担体を変質条件下に置くことで、標的核酸は放出され、担体に付加することができる他のプライマー1配列と更なるハイブリダイゼーション反応に参加することができる。担体に付加した第一増幅産物は、次に、担体に付加した第二特異的非主流プライマー(「プライマー2」)とハイブリダイズすることができり、第一増幅産物に相補的な塩基配列を含む第二増幅産物は、プライマー2配列の伸長によって形成することができ、担体にも付加される。従って、標的核酸並びに第一及び第二増幅産物は、複数のハイブリダイゼーション及び伸長プロセスに参加することができるが、標的核酸の初期存在並びに最初に存在するプライマー1及びプライマー2配列の数のみによって制限される。その結果は、表面に付加される標的配列のコピー数である。
標的核酸が存在する場合、増幅産物だけが形成される。従って、1又は複数の増幅産物の存在又は非存在に関する担体をモニターすることによって、特異的標的配列の存在又は非存在が示される。
Mosaic技術を用いて、いくつかの種々の標的塩基配列を固体担体の種々の領域において、それぞれ異なる標的塩基配列に特異的な(本願明細書に開示される）第一及び第二非主流プライマーの種々のセットを整列させることによって同時に増幅させることができる量のマルチプレックスを成し遂げることができる。
h. 粘着末端を有する産物の増幅
従来、粘着末端を有するPCR産物は、後に制限酵素消化するために、尾部に制限サイトを有するプライマーを用いて、又はTaqポリメラーゼのアデニントランスフェラーゼ活性によって3'末端上に更なるアデニンを追加して生産される。第一アプローチは、望ましい結果を与えるが、余分のステップを必要とし、時間もかかり、下流のアプリケーションに必ずしも適していない。第二アプローチは、ライゲーションの効率が低い短いオーバーハングを生産するだけである。図26に示すように本発明は、非主流プライマーは、それらの5'末端で、人工配列及び5'末端人工配列と非主流プライマーとの間に位置する非主流ヌクレオチドと連結することを開示する。アプリケーションに応じて、1つ又は両方の非主流プライマーは、人工配列を尾部として付加することができる。非主流ヌクレオチドの相補体を除く3つのヌクレオチド三リン酸モノマーだけを提供すると、プライマー伸長は、プライマーの非主流ヌクレオチドの位置で停止する。増幅は、片側又は両側に5'オーバーハングを有する産物になる。人工尾部の長さ及び配列の自由選択によって、様々なアプリケーション(例えばクローニング、固体の表面上の一本鎖DNAとのハイブリダイゼーション、アダプターとのライゲーション)が可能になる。
i. 環状増幅産物のためのSmrtTM-ベルプライマー
この方法は、図26及び27に示すように、次世代配列決定のための環状産物を発生させるために有効なベル型プライマーを形成するヘアピンループに連結したプライマーを用いて実行することもできる。非主流ヌクレオチドタイプを有する順方向及び逆方向プライマーは、それぞれ、(それは、任意のヌクレオチド組成を有することができる)ヘアピンプライマーの1つのアームに、5'末端で連結される。プライマーの5'におけるほとんどのヌクレオチドは、非主流ヌクレオチドの相補体である。2つのプライマーは、標的核酸上の隣接する結合サイト又は非隣接であるが非主流ヌクレオチドタイプがない結合サイトにハイブリダイズする。両方のプライマーは、非主流ヌクレオチドの相補体を欠いている増幅混合物において伸長する。伸長は、非主流ヌクレオチドの相補体のヌクレオチド三リン酸の組み込みに必要な場合に停止する。2つのプライマーの伸長したストランドは、互いにハイブリダイズして、一方のプライマーの3'末端と他方のプライマーの5'末端の間に切れ目を有する環状構造をとる。切れ目をリガーゼで封止して、SMRTTMベル配列決定のテンプレートとしての役割を果す環状産物を生産する。プロセスは、図27A-Cに更に詳細に示している。図27Aは、標的結合領域でもある相補的なステム領域C及びC'並びに標的結合領域であるループE3'を有するヘアピンに連結した非主流ヌクレオチドを有する標的結合領域Aを含む第一プライマーを示している。逆方向プライマーは、ステムを形成する標的結合領域でもあるセグメントD及びD'並びに標的結合領域であるF3'ループを有するヘアピンループに連結した非主流ヌクレオチドタイプを有する標的結合領域Bを有する。この構成セグメントにおいて、順方向プライマーのA、C及びEの一部は、逆方向プライマーのセグメントB、D及びFの一部に関するテンプレートに結合する。図27Bは、両方のプライマーがテンプレートにアニーリングしていることを示している。プライマー1のACE配列は、テンプレートのA'C'E'配列にハイブリダイズして、B'配列を伸長する。プライマー2のBDF配列は、テンプレートの配列であるB'D'Fにハイブリダイズして、A'配列を伸長する。伸長は、非提供ヌクレオチドが必要になると停止する。図27Cは、ステップBからの2つの伸長産物がヘアピン構造を形成して、A'B又はAB'領域で互いにハイブリダイズすることを示している。矢が示す切れ目は、ライゲーションされて環状産物が生じる。システムにおける非環状オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによって消化することができる。あるいは、非主流プライマーは、5'末端セグメントでステムループ構造を有することができる。かかる種類の非主流プライマーの両方を増幅システムの非ストランド変位ポリメラーゼを用いる増幅で用いられると、増幅された産物をリガーゼによりライゲーションして環状産物を形成することができる。システムの非環状オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによって消化することができる。5'末端セグメントのステムループ配列は、両方の非主流プライマーについて同じでも異なっていてもよい。ライゲーションされた環状産物を種々の化学薬品又は酵素で切断して、下流のアプリケーションのために環状産物を線形化してもよい。開示する本発明の方法は、第二世代配列ライブラリー調製のために用いることができる。
i. 複数のヌクレオチドタイプにおける非主流のプライマー
単一の非主流ヌクレオチドタイプを有するプライマーに関する戦略及び原理は、2又は3つの非主流ヌクレオチドを有する(言い換えると単一のヌクレオチドから完全な又は主要な)プライマーに適用することができる。単一のヌクレオチドにおいて非主流のプライマーの使用は、かかるプライマーのための結合サイトが統計学的により大きな頻度で生じるため、天然標的核酸においてより広い適用性を有する。しかしながら、ある増幅形態(例えば免疫PCR)は、人工配列の核酸を増幅する。かかる人工配列は、1つの非主流ヌクレオチドタイプと同様に2又は3つの非主流ヌクレオチドタイプを有するプライマーによって増幅されるように設計することができる。
2つのヌクレオチドタイプにおいて非主流のプライマーにおいて、2つの非主流ヌクレオチドタイプは、互いに相補的であってはならない。言い換えれば、非主流ヌクレオチドタイプは、AとC、AとG、T/UとC又はT/UとGであってもよい。これによって、同じ2つの非相補的ヌクレオチドタイプから完全な又は主要なプライマーとなる。かかるプライマーは、プライマー-二量体又はプライマー-ミスマッチ伸長を支持する能力が低下している。プライマーは、非主流の3つのヌクレオチドを有する。言い換えると、単一のヌクレオチドタイプから完全に又は実質的になることは、プライマー二量体又はミスマッチプライマー伸長を支持する能力も低下させる。プライマー結合サイトは、上述のものと類似した原理によって選択され、プライマー配列は、必要に応じて少数の非主流ヌクレオチドを収容するように調整することができる。足場及びジャンクションプライマー戦略も用いられることができる。かかるプライマーを有する増幅を、少なくとも、プライマーにおいて非主流ではないヌクレオチドの相補体と共に、任意に、言及の通り、低濃度で又はジデオキシヌクレオチドとして供給することができる非主流ヌクレオチドの相補体と共に実行される。
j. 増幅方法
上述の戦略及び原理は、単一又対プライマーからのテンプレートダイレクト伸長拡張に関する任意の増幅方法に組み込むことができる。ポリメラーゼ連鎖反応法は、任意にRT-PCRを含む1つの実装である。PCRは、プライマーアニーリング、プライマー伸長及びそのテンプレートからの伸長ストランドの変性ができる温度サイクルによって特徴づけられる。
転写媒介増幅(TMA)は、図29Bに示すように、1つ又は両方のプライマーがその5'末端のプロモーター(通常、T7プロモーター)に連結される代替の等温形態である。図29Bは、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を尾部として付加されている2又は3つのヌクレオチドタイプのプライマーを示している。一旦、二本鎖プロモーターが形成されると、RNAポリメラーゼは、転写増幅を始める。増幅産物は、一本鎖RNA分子である。TMAは、逆転写につなげることもできる。
本発明のプライマーを使用するのに適した他の等温増幅フォーマットは、ニッキング増幅反応(NEAR)である。NEARは、ポリメラーゼ及び切断酵素を使用して一定の温度でDNAを指数関数的に増幅させる。ニッキング増幅のためのプライマーは、その5'末端で人工セグメントに連結している。5'セグメントは、(図29Aに示すように)切断酵素のための切断部位を含む。第一サイクルにおいて、プライマーは、テンプレートにハイブリダイズして伸長する。次のサイクルにおいて、プライマーは、第一サイクル産物にハイブリダイズして伸長し、人工尾部上の完全なニッキングサイトを発生させることができる。一旦ニッキングサイトが形成されると、切断酵素が切断して、1つのストランドが放出される。伸長及び切断は、次のサイクルで繰り返される。
本発明のプライマーを使用するのに適した他の等温増幅手順は、ループ媒介等温増幅又は(LAMP)である。LAMPは、本発明による非主流ヌクレオチドを有する1又は複数のプライマーを使用する。(図30、左パネル)。LAMPにおいて、標的配列は、複製活性に加えて2又は3セットのプライマー及び高ストランド変位活性を有するポリメラーゼを使用して60-65℃の一定温度で増幅される。一般的に、4つの異なるプライマーを用いて標的遺伝子上の6つの互いに異なる領域を高い特異性で同定する。追加の一対「ループプライマー」は、更に反応を加速させることができる。
他の等温増幅フォーマットは、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)である。RPAは、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)に代わる単一のチューブでの等温増幅である(図30右)。RPAプロセスは、3つのコアエンザイム、リコンビナーゼ、一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)及びストランド変位ポリメラーゼを使用する。リコンビナーゼは、二重鎖DNAにおける相同配列とオリゴヌクレオチドプライマーを対にすることができる。SSBは、DNAの変位ストランドに結合して、プライマーが変位する防止する。最後に、ストランド変位ポリメラーゼは、プライマーが標的DNAに結合した場所でDNA合成を開始する。PCRのように2つの対向するプライマーを用いて、標的配列が実際に存在する場合、指数関数的DNA増幅反応が開始する。2つのプライマーの両方は、上記の通り、非主流ヌクレオチドタイプを有するプライマーであってもよい。
本発明のプライマーを用いることができる更に別の増幅フォーマットには、ストランド変位アッセイ、転写に基づく増幅システム、自家持続配列複製法(3SR)、ライゲーション鎖反応(時には、オリゴヌクレオチドリガーゼ増幅OLAと称される)、サイクルプローブ技術(CPT)、ローリングサークル増幅(RCA)、塩基配列に基づく増幅(NASBA)、侵入的開裂技術、ヘリカーゼ依存的増幅(HDA)、指数関数増幅(EXPAR)、ハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)、及び触媒ヘアピンアセンブリ(CHA)が含まれる。
他の増幅フォーマットは、分析物が(人工配列を有することができる)核酸に連結されて分析物が核酸の増幅によって検出される免疫PCRである。かかる増幅は、非主流ヌクレオチドの相補体において非主流であるプライマー結合サイトに相補的な非主流ヌクレオチドタイプ(例えば、完全に不存在)を有するプライマー対を用いて実行することができる。
上記方法は、選択されたプライマー及びそれらの相補的なプライマー結合サイトによって決定される所定の特異的標的核酸又はそのセグメントを増幅(言い換えると、標的特異的増幅)する。意図するプライマー結合サイトに結合する一対のプライマーからの増幅産物は、標的配列上のミスプライミング又はプライマー二量体結合のいずれかによって同じプライマー対からプライミングされた一部又は全部の他の増幅産物を支配する。好ましくは、意図するプライマー結合サイトに結合するプライマーからの増幅産物は、プライマー対からプライミングされた一部又は全部の他の増幅産物に対して(モル、質量又はコピー数で)少なくとも10、50、100又は1000倍過剰で存在する。ある方法において、1対のプライマーが増幅に用いられる。他の方法において、複数のプライマー対をマルチプレックス増幅に用いられる。プライマー対の数は、例えば2-50又はそれ以上とすることができ、好ましくは、5-25又は10-20又は少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20とすることができる。複数のプライマー対を用いると、意図するプライマー結合サイトへのプライマー対の結合からの各プライマー対の意図する増幅産物は、そのプライマー対によってプライミングされる一部又は全部の他の増幅産物に対して(モル、質量又はコピー数で)少なくとも10、50、100又は1000倍過剰に存在する。後述するランダムプライミングフォーマットを除いて、この方法で使用するプライマーは、ほとんど又は全てのプライマー位置がランダムに占められる又はプライマー間でヌクレオチドが縮重しているランダムプライマーではない。むしろ、各プライマー対は、標的核酸の特異的プライマー結合サイトにハイブリダイズするように設計されており、一般的に、種々のプライマー対は、検出される標的核酸の種々のプライマー結合サイトが要求するように互いに関係してはいない。例えば、1つのプライマー対は、1つの病原体の標的核酸上のプライマー結合サイトに結合するように設計することができ、第二プライマー対は、種々の病原体の種々の標的核酸上のプライマー結合サイトに結合するように設計することができる。偶然の一致を除いて、種々の標的核酸及びその結果としてのプライマー結合サイト及びプライマーは、互いに関係してはいない。
III. 縮重プライマーを用いるランダムプライミング
本発明は、非主流縮重プライマーと称される縮重非主流プライマーを用いたランダムプライミング増幅方法を更に提供する。かかる方法は、(図28に示すように)種々のプライマーで同一である5'人工セグメントに連結し且つプライマー間でランダムな多様性を有する3'ハイブリダイゼーションセグメントを有するプライマーを使用する。5'人工セグメントは、3つのヌクレオチドタイプ(5'末端で例外的に非主流ヌクレオチドである可能性がある)だけからなり、3'ハイブリダイゼーションセグメントは、同じ3つのヌクレオチドタイプからなる。別の実施形態において、3'セグメントも、3つの同じヌクレオチドタイプからなるが、3'末端以外の位置で第4のヌクレオチドタイプの限られたユニット数を含むこともできる点は除く。3'ランダムセグメントに存在する第4のヌクレオチドタイプ(G)の限られたユニット数は、1%超から20%未満である。通常、1個、2個以下又は3個以下のかかるヌクレオチドだけは、3'ランダムセグメントに存在する。3'セグメントの非主流ヌクレオチドタイプの限られたユニット数を含むことは、予想外のランダムプライマー相互作用を著しく増加させることなくランダムプライマーの多様性を著しく増加させる。別の実施形態において、非主流縮重プライマーは、非主流プライマーに含まれる非天然ヌクレオチドが従来のA、T、G、Cプライマーと比較してプライマー相互作用の低減を補助することができる限り、非天然ヌクレオチド(例えばイノシン、ニトロインドール)を含むことができる。非天然ヌクレオチドは、5'人工セグメント又は3'ランダムハイブリダイゼーションセグメントに含めることができる、又は5'人工セグメント及び3'ランダムハイブリダイゼーションセグメントの両方に含めることができる。3'ハイブリダイゼーションセグメントの例は、A、T、Cからなり、第4の非天然ヌクレオチドであるイノシンは、ランダムな位置に含めることができる。このような場合、3'ランダムハイブリダイゼーションセグメントは、A、T、C及びIの4ヌクレオチドからなる。別の実施形態において、縮重された非主流プライマーにおける非主流として、非天然ヌクレオチドも含めることができる。A、T、C縮重非主流プライマーの例として、0.1%から25%の量のイノシンを挙げることができる。開示する本発明は、1又は2ステップ増幅を含んでいてもよい。4つのヌクレオチド三リン酸モノマーの各々を用いて実行される最初の増幅は、5'人工セグメント及びその相補体が側面に並んでいる一次増幅産物を発生させる。第２の増幅は、次に、ランダムプライマーの5'人工セグメントの相補体に相補的である3'セグメントを有するプライマーを用いて実行される。かかる方法は、特にDNAの大きな領域(例えばBACS、YACS、全染色体又は全ゲノム)の増幅又はシングルセル増幅に有効である。増幅された産物は、SYBRグリーンの追加によって、又は、他の方法の蛍光ラベル化プローブによって検出することができる。第２の増幅において使用するプライマーは、他の応用(例えば配列決定ライブラリー調製、とりわけシングルセル増幅)のために5'尾部を有することができる。増幅は、本願明細書に開示されるPCR又は等温法によって行なうことができる。
IV. 伸長反応
上記のプライマー設計の原理は、伸長反応(例えば、プライマーが変異(例えばSNP)付近にハイブリダイズするがそこには及ばない単一塩基伸長)又はプライマーが変異サイト全体にハイブリダイズするアレル特異的伸長に使用するプライマーにも用いることもできる。単一のプライマーからの伸長を伴う反応において、プライマー-プライマー二量体化は、懸念することではないが、標的核酸(又は、非標的核酸)に対するプライマーのミスマッチ結合は、懸念事項であり、プライマー-二量体の問題は、マルチプレックス伸長にも起こり得る。
V. 変異検出
本発明は、ゲノムの不安定性を示す標的核酸の変異を検出するために用いることができる。例えば、変異検出の方法は、疾患(例えばがん)及び他の病理学的遺伝的状態、障害又は症候群と関連する変異又は他の改変を検出及び/又は同定するために有効である。かかる変異として、ヌクレオチド挿入、欠失、再配置、転移、翻訳、トランスバージョン、多型及び置換が挙げられる。より具体的にいえば、変異として、単一のヌクレオチド多型(SNP's)を挙げることができる。本発明は、変異の存在又は非存在を同定するために用いることができる。一般的に、変異として、標的核酸の任意の変化(例えばヘテロ接合の減少又はゲノム不安定性の他の証拠)を挙げることができる。
一般的に、標的核酸の変異を検出する方法は、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、又は変異を含むと思われる標的核酸テンプレートを、疑わしい変異付近の公知領域にハイブリダイズすることができる非主流プライマーに暴露するステップを含む。非主流プライマーが伸長して、1又は複数の相補的なヌクレオチドが、変異を含むと思われるサイトを通じてハイブリダイズされる。変異の存在又は非存在は、非主流プライマーに組み込まれている又は組み込まれていないヌクレオチドを分析することによって決定される。1つのフォーマットにおいて、1又は複数の非主流プライマーは、3'末端に7-デアザ-2'-デオキシグアノシン及び/又は7-デアザ-2'-デオキシアデノシンを含む。3'末端の非天然ヌクレオチドは、変異を検出するテンプレート上の増幅を更に阻害又は促進する。
論文において報告されている多くの変異検出法を、検出精度を向上させるために本発明に用いることができる。例えば、SNP検出は、2つの主要な方法(従来型及びハイスループット方法)を使用して実行される。従来のゲルに基づくアプローチは、標準分子技術、例えば、増幅耐性変異システム(amplification refractory mutation system)(ARMS、制限消化及び様々な形態のゲル電気泳動(例えば、RFLP)、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)及び一本鎖高次構造多型(SSCP)を用いる。ハイスループット法として、アレル差別方法(アレル特異的ハイブリダイゼーション、アレル特異的シングル-塩基プライマー伸長)、パドロックプローブ、分子反転プローブ(MIP)、ハイ-スループットアッセイ化学(フラップエンドヌクレアーゼ識別、オリゴヌクレアーゼライゲーション)、DNAアレイ、ピロシーケンス、第二発生配列決定及びライトサイクラーが挙げられる。
コンピューター実装プライマー結合サイト及びプライマーの選択は、非一時的コンピューター可読記録媒体にプログラムされているコンピューターにおける標的核酸のコンピューター実装分析によって実行することができる。標的核酸(1つ又は両方のストランド)の配列は、コンピューターに受信される。コンピューターは、所望のヌクレオチド組成のプライマー(例えば、A、T、C)もユーザー入力によって保存又は受信する。次に、コンピューターは、標的配列をサーチし、プライマー組成に最も密接に対応する増幅と適合する互いの距離の中で順方向及び逆方向プライマー結合サイトを同定するようにプログラムされている。プライマー組成がA、T、Cである場合、順方向及び逆方向プライマー結合サイトは、A、T及びGに最も密接に対応しなければならない。コンピューターは、逆のストランド上の順方向及び逆方向プライマー結合サイトを同定することができる、又は同じストランド上の逆方向プライマー結合サイト及び順方向プライマー結合サイトの相補体を同定してその相補体から順方向プライマー結合サイトを算出することができる。次に、コンピューターは、プライマー結合サイトの候補対を出力することができる。そして、程度を様々なものに変えて理想的な組成を探してもよい。コンピューターは、プライマー結合サイト対の各々にハイブリダイズするプライマー設計を示すこともできる。多重プライマー設計は、非主流ヌクレオチドの種々の数のユニット及び種々の数のミスマッチを有する同じプライマー結合サイト対について示すことができる。
コンピューターシステムは、主要なサブシステム(例えば中央プロセッサー)と相互接続するバスと、システム記憶装置と、入出力制御装置と、外部デバイス(例えばパラレルポートを経たプリンター)と、ディスプレイアダプターを経たディスプレイスクリーンと、シリアルポートと、キーボードと、固定ディスクドライブと、インターネット接続と、を備える。多くの他のデバイス(例えばI/Oコントローラを経たスキャナ、シリアルポートに接続したマウス又はネットワークインタフェース)を接続することができる。多くの他のデバイス又はサブシステムを同様の方法で接続してもよい。また、後述するように、本発明を実施するために存在する全てのデバイスは必ずしも必要ではない。デバイス及びサブシステムは、種々の方法で相互接続することができる。本発明を実施するソースコードは、システムメモリーにおいて操作可能な状態で配置したり、記録媒体(例えば、固定ディスク、コンパクトディスク等)に保存したりすることができる。コンピューターシステムは、他の可能性のあるメインフレーム、PC、表又は携帯電話であってもよい。
アプリケーションのための方法及びキット開示しているプライマー及びプローブのいずれかをキットに組み込むことができる。かかるキットは、好ましくは、少なくとも1つのプライマー対と、好ましくは、少なくとも5つ、20又は、20のプライマー対を含む。キットのプライマー対は、好ましくは、それらが同じ非主流ヌクレオチドタイプと同様に適合する融解温度を有することを意味する同じ多重反応に用いることができる。かかるプライマー及びプローブを用いるとして開示されている任意の他の試薬を、増幅反応における内容物としてのNTP、ミスマッチ安定化剤、蛍光体又は他ラベル化合物を含むかかるキットに含めることができる。キットは、何れかの開示方法でのキットの使い方を詳述している指示書を含むこともできる。
開示する本発明は、微生物(例えば、哺乳動物に感染する病原体)の検出及び同定するキットを提供する。従って、本発明は、例えば、ヒト対象に感染しているウイルスの特定の株(例えば、ヒト免疫不全ウイルス又はとりわけパピローマウイルス(HPV)の特定の株)を同定するために用いることができる。微生物の株は、多くの場合、数個のヌクレオチドで互いに異なる一方で、それらのゲノムの残りの部分は同一である。従って、プローブは、保存された領域を認識して、特定の可変ヌクレオチドを同定するために実行することができる。
例えば、多種多様な感染症を、本発明のプロセスによって検出することができる。一般的に、これらは、細菌、ウイルス、寄生虫及び菌類の病原体によって引き起こされる。薬に対する様々な病原体抵抗性は、本発明を使用して決定することもできる。
本発明は、病原体における薬剤耐性の検出にも有効である。例えば、バンコマイシン耐性エンテロコッカスヘシュウム、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌、多種薬剤耐性結核菌及びAZT耐性ヒト免疫不全ウイルスは、全て、本発明によって同定することができる。
遺伝病も、本発明のプロセスによって検出することができる。これは、染色体及び遺伝子異常又は遺伝病のための出生前又は出産後のスクリーンによって行なうことができる。検出可能な遺伝子異常の例としては、21個のヒドロキシラーゼ欠乏、嚢胞性線維症、脆弱性X症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ダウン症又は他のトリソミー、心疾患、単一遺伝子疾患、HLAタイピング、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、テイ-サックス病、サラセミア、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リピドーシス、肥満症不良、血友病、先天性代謝異常及び糖尿病が挙げられる。
本発明のプロセスによって検出することができるがんは、一般的に、オンコジーン、がん抑制遺伝子、又はDNA増幅、複製、組換若しくは修復に関係する遺伝子を伴う。これらの例としては、BRCA1遺伝子、p53遺伝子、APC遺伝子、Her2/Neu増幅、Bcr/AB1、クラス遺伝子及びヒトパピローマウイルスタイプ16及び18が挙げられる。本発明の様々な態様は、一般的なヒトがん(白血病、結腸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、脳腫瘍、中央神経系腫瘍、膀胱腫瘍、メラノーマ、肝がん、骨肉腫及び他の骨がん、睾丸及び卵巣の癌腫、頭頚部腫瘍及び頸部腫瘍)における上記遺伝子の増幅、大規模な欠失、点変異及び小規模な欠失/挿入の同定に用いることができる。
環境モニタリングにおいて、本発明は、天然の及び技術的に対処されている生態系及び社会(例えば都市廃棄物排水処理装置及び貯水槽、又は、バイオレメディエーションを受けている汚染地域)の病原微生物及び固有の微生物の検出、同定及びモニタリングのために用いることができる。生体外物質を代謝することができる遺伝子を有するプラスミドを検出すること、個体群動態調査での特定標的微生物をモニターすること、又は環境植物及び工業用植物の遺伝子改変微生物を検出、同定若しくはモニターすることも可能である。
本発明が、NGS、単一セル増幅及び検出(例えば例えばRNA-seq)、出生前の検出(例えば、ダウン症)等の配列決定ライブラリー調製のために用いることができる。
本発明は、軍人調査及び犯罪捜査に関するヒト同定、父子鑑別及び家族関係分析、HLA互換性タイピング、縦列型反復配列(STR)及び血液、精液又は移植臓器の汚染検査を含む様々な法医学領域に用いることもできる。
食品及び飼料産業において、本発明は、多種多様な応用を有する。例えば、生産生物(例えば、ビール、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パンの生産のための酵母)の同定及び特性評価のために用いることができる。他の領域での用途は、夾雑物に関する生産物及びプロセス(例えば、家畜、殺菌及び食肉加工)の品質コントロール及び証明に関する。他の用途は、育種を目的とする植物、球根及び種の特性評価、植物特異的病原体の存在の同定並びに動物繁殖プログラムでの獣医学感染症の検出及び同定を含む。
本発明は、説明の明快さのために詳述しているが、ある種の改変は、添付の特許請求の範囲で行なうことができる。アクセッション番号及びウェブサイト等を含む全ての刊行物、並びにこの出願において引用している特許文献は、各々が独立して示されているが、全ての目的のためにそれらの全てを同程度に引用したものとする。配列、ウェブサイト又は他の参照について異なるバージョンが異なる時間に存在する場合、有効出願日の参照に関連するバージョンが意味をなす。有効出願日は、争点になっているアクセッション番号が開示された最も初期の優先日を意味する。別のことが文脈から明白でない限り、本発明の任意の要素、実施形態、ステップ、特徴又は態様は、任意のもう一方と組み合わせて実行さすることができる。
実施例1及び2:従来型のプライマー及び3つのヌクレオチドのプライマーの一時的な相互作用
プライマー二量体形成は、完全には解明されていないが、プライマー相互作用は、予想外の増幅産物の原因となることは明白である。理論上、計算機の助けを借りると、従来型の4つのヌクレオチドのプライマーは、二次構造及びプライマー-プライマー相互作用を回避するように非常に慎重に設計することができる。このような計算は、1対のプライマーに対してはうまくいくが、マルチプレックスに関してはうまくいかない。
我々は、理論的な計算によって4つのヌクレオチドのプライマー(標準的なプライマー1-32)のセットを設計した。32個のプライマーを用いるマルチプレックスにおいて、非常に高いレベルのプライマー-プライマー相互作用を発見した。また、ランダム配列決定を用いての3-ヌクレオチドタイプのプライマーのセットでマルチプレックスを行った。プライマー相互作用は、3-ヌクレオチドタイプのプライマーでのマルチプレックスにおいては、非常に低かった。
反応において形成される任意のプライマー-プライマー相互作用を検出するために、SYBRグリーンを使用した。25ulの反応物には、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl(AmpliTaq Gold PCRバッファーIIの1:10倍希釈 (Life Technologies))、2mMのMgCl2(1:25mMストックMgCl2溶液( Life Technologies)の12.5倍希釈)、0.2mMのそれぞれのdNTP(100mMのストックdNTP溶液(Life Technologies)から作成した2.5mMのそれぞれのdNTP溶液の1:12.5希釈)、及び1X SYBRグリーンII(10000Xストック溶液( Sigma-Aldrich)から作成された100Xストック溶液の1:100倍希釈)を含また。32個の4-ヌクレオチドタイプのプライマー又は3-ヌクレオチドタイプのプライマー(IDTDNA)を、2.6uM、5.2uM、13uM、26uM、39uM及び52uMの終濃度で加えた。反応物を95℃で2分間加熱して、シグナル検出のために65℃まで冷却した。
図2Aは、4-ヌクレオチドタイプのプライマー相互作用を示している。プライマーが存在していない(0uM)場合、蛍光シグナルはゼロであった。2.6uMは、約100kの蛍光シグナルを示している。5.2uMは、約150k-180kの蛍光シグナルを示している。13.1uMは、約250k-300kの蛍光シグナルを示している。26uM及び39uMは、約300k-350kの蛍光シグナルを示している。
図2Bは、3-ヌクレオチドタイプのプライマー相互作用を示している。2.6uM、5.2uM及び13uM濃度のプライマーは、10k未満の最小蛍光レベルを示すだけであった。26uM、39uM及び52uM濃度は、約12.5kから約25kの蛍光の段階的な増加を示した。
実施例3:PCR反応の4つのヌクレオチド及び3つのヌクレオチドのプライマー二量体形成
実施例2に示すように、プライマー-プライマー相互作用は、4-ヌクレオチドタイプのプライマーでは非常に高いレベルにあり、3-ヌクレオチドタイプのプライマーでは非常に低いレベルであった。従って、PCR反応において、3-ヌクレオチドタイプのプライマーは、プライマー-二量体形成が非常に低くいはずである。我々は、PCR反応において前の実施例において使用したプライマーと同一のセットでマルチプレックスを行った。
3つのヌクレオチドのプライマーに関して、25ulのPCR反応物には、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1X SYBRグリーンII及び1.875uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(Life Technologies)を含めた。4つのヌクレオチドのプライマーに関しては、0.2mMのdCTPも加えている。3つのヌクレオチドのプライマー及び標準的な4つのヌクレオチドのプライマーは、2.6uMの合計濃度で加える。PCRサイクルは、StepOneTMリアルタイムPCRシステムで実施した。サイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒)を10サイクル、そして、(95℃15秒、65℃30秒)を50サイクルとした。両反応とも48回繰り返した。
図3Aは、3-ヌクレオチドタイプのプライマー二量体形成を示している。48回の繰り返しのうちのわずか2回は、50及び55サイクルでプライマー二量体を有していた。図3Bは、4-ヌクレオチドタイプのプライマー二量体形成を示している。全48反応で、30サイクル前に一貫してプライマー二量体を有していた。
実施例4:3-ヌクレオチドタイプのプライマー及び3-ヌクレオチドタイプのdNTPを用いたリアルタイムPCR反応
ミスマッチを有する3-ヌクレオチドタイプのプライマーは、ヒトゲノムDNAを検出するように設計した。
25ulのPCR反応物には、100ngのヒトゲノムDNA(NEB)、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1X SYBRグリーンII、0.8mMのそれぞれのプライマー(Hemo2F、Hemo2R)、1.25uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含めた。テンプレートなしのコントロール反応物には、ヒトゲノムDNAを含めなかった。PCRサイクルは、StepOneTMリアルタイムPCRシステム(Life Technologies)で実行した。サイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃15秒)を60サイクルとした。蛍光シグナルは、アニーリングステップで記録した。
図4Aは、テンプレートとしてヒトゲノムDNAを用いたPCR反応の間の蛍光を時間とともに示している。図4Bは、テンプレートコントロールなしのPCR反応の間の蛍光を時間とともに示している。
100ngのヒトゲノムDNAは、3-ヌクレオチドタイプのプライマーでのリアルタイムPCRによって、容易に検出された。テンプレートが存在しない場合、プライマー二量体は形成されなかった。
実施例5:3-ヌクレオチドタイプのプライマー及び4つのヌクレオチドのdNTPを用いたリアルタイムPCR及びエンドポイント検出
この実施例では、3-ヌクレオチドタイプのプライマーを、従来型の4-ヌクレオチドタイプのプライマーと同じ方法で用いた。プライマーの2つのセットを、HPV11の検出のために試験した。HPV11-1F及びHPV11-1Rは、ミスマッチを有していなかった。HPV11MM1Fは、位置12及び18でミスマッチを有していた。HPV11MM1Rは、位置11及び22でミスマッチを有していた。
HPVテンプレートは、105(1pg)、104(100fg)、103(10fg)、102(0.1fg)、101(0.01fg)コピー/ulに希釈した。25ulのPCR反応物には、1ulのテンプレート、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、それぞれ0.2mMのdATP、dTTP及びdGTP、1X SYBRグリーンII、0.8mMのそれぞれのプライマー、1.25uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含めた。PCRサイクルは、StepOneTMリアルタイムPCRシステムで実行した。サイクル条件は、10分95℃、 (95℃15秒、60℃15秒)を60サイクルとした。蛍光シグナルは、アニーリングステップで記録した。60サイクル後、6X DNAローディング染料を加えて、10ulのサンプルを0.8%アガロースゲルにロードした。
図8A、Bは、テンプレートコントロールなしのH2Oを含む全てのテンプレートの蛍光を時間とともに示している。わずか10コピーのHPVテンプレートを容易に検出することができる一方で、テンプレートコントロールは60サイクル以上でも増幅がなかった。図8Cは、増幅産物のゲル電気泳動イメージを示している。全てのテンプレートは、プライマー配列におけるミスマッチの存在に関係なく、適切なサイズの産物によって増幅した。
実施例6:5'Gを有する3-ヌクレオチドタイプのプライマー
テンプレート上の3-ヌクレオチドタイプのプライマーのハイブリダイゼーション領域は、通常、その3'末端でCが側面に並んでいる。そうでなければ、A、T又はGである場合、より多くの塩基を限られた組成に合わせてプライマーに含めることができる。この実施例では、テンプレート上の3'CとマッチするGを、その5'末端上に有する3-ヌクレオチドタイプのプライマーを設計した。かかるプライマーは、より高いTmを有しており、ハイブリダイゼーション効率を向上させた。
5'末端上のGの追加は、同じプライマー又は異なるプライマーのCでのペアリングを潜在的に可能にする。しかしながら、かかる組合せは、伸長が5'末端では起こり得ないため、プライマー二量体形成に影響を及ぼさない。ある極端なケースでは、プライマー二量体が形成されると、予想外の伸長産物が他のプライマーとしてその3'末端上のCで終了する。この産物は、他のプライマーと相互作用すると、3'Cがプライマー上の任意の他の塩基と対になり得ないため、3'Cは、更なる伸長が防止される。
実施例7:ミスマッチ結合試薬がプライマーテンプレートハイブリダイゼーションを安定化させる
増幅は、ミスマッチを有するプライマーによって実行することができる。より多くのミスマッチがプライマーに導入される場合、プライマー-テンプレートハイブリダイゼーションは、それほど効果的ではない。この実施例では、プライマー-テンプレートハイブリダイゼーションを安定化させ、増幅効率を上昇させるためにミスマッチ結合試薬を反応物に加える。
プライマー-テンプレートハイブリダイゼーション上のミスマッチ結合試薬の効果を試験するために、様々な程度のミスマッチを有する合成オリゴヌクレオチド対をミスマッチ結合試薬と混合する。一般的に、オリゴヌクレオチドは、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1X SYBRグリーンIIを含む0.1-1uMで提供される。ミスマッチ結合試薬は、0x、0.001x、0.01x、0.1x又は1x濃度のオリゴにて提供される。融解曲線分析は、混合物を95℃で1分間加熱して、2つのオリゴを完全に変性させ、次に、混合物を、2つのオリゴの理論的な融解温度(例えばミスマッチでないと仮定した場合の1つのオリゴヌクレオチドの融解温度よりも10-20℃低い温度)に従って修正した所望の温度にゆっくり冷却し、そして、混合物を、ステップ当たり0.1-0.3℃だけ加熱して、蛍光シグナルを各ステップで収集する条件で実施した。様々な程度のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドと様々な量のミスマッチ結合試薬の融解曲線をプロットして、融解温度を算出する。ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの融解温度を増加させるミスマッチ結合試薬を選択して増幅に用いる。
25ulの増幅反応物は、テンプレート、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1X SYBRグリーンII及び1.25uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含む。3-ヌクレオチドのプライマーは、一般的に、100nm、200nM、400nM又は800nMの濃度で加えられる。ミスマッチ結合試薬は、一般的に、プライマーの濃度に対して1:1000、1:100、1:10、1:1 10:1、100:1、1000:1の比率の濃度で反応物に加えられる。PCRサイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒)を10サイクル、そして、(95℃15秒、65℃30秒)を50サイクルとした。
実施例8:3つのヌクレオチドのプライマーと4つのヌクレオチドのプライマーとの間のプライマー二量体形成の比較
3つのヌクレオチドdNTPを有する3つのヌクレオチドのプライマーと4つのヌクレオチドdNTPを有する4つのヌクレオチドのプライマーとの間のプライマー二量体形成を比較した。この例では、もう1つの条件(4つのヌクレオチドdNTPを有する3つのヌクレオチドのプライマー)についてのプライマー二量体形成を比較した。3-ヌクレオチドタイプのプライマーは、ヘモグロビン(Hemo1F、Hemo1R、Hemo2F、Hemo2R)、PPIA(PPIAF及びPPIAR)、GAPDH(GAPDHF、GAPDHR)及びYWHZ(YWHZ1F、YWHZ1R、YWHZ2F、YWHZ2R)を標的とするヒトゲノム配列を増幅するように設計した。4-ヌクレオチドタイプのプライマー(レギュラー1-12)を、HPV検出のために設計したが、これらを用いて3つのヌクレオチドのプライマーと比較した。全ての反応には、12個のオリゴを含めた。
25ulのPCR反応物には、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1X SYBRグリーンII及び1.875uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含めた。4つのdNTPを含む反応においては、0.2mMのdCTPを加えている。3-ヌクレオチドタイプのプライマー及び標準的な4-ヌクレオチドタイプのプライマーは、合計濃度が2.62uMとなるように加えた。PCRサイクルは、StepOneTMリアルタイムPCRシステムで行った。サイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒)を10サイクル、そして、(95℃15秒、65℃30秒)を50サイクルとした。テンプレートは、なしにした。PCRの実施後、混合物を1.5%アガロースゲルで流した。任意の検出可能な産物は、プライマー二量体形成からの増幅の結果である。
図9は、アガロースゲル画像を示している。レーン1は、DNAラダーである。レーン2は、3つのヌクレオチドdNTPを有する3-ヌクレオチドタイプのプライマーである。レーン3は、4つのヌクレオチドdNTPを有する3-ヌクレオチドタイプのプライマーである。レーン4は、4つのヌクレオチドdNTPを有する4-ヌクレオチドタイプのプライマーである。3-ヌクレオチドタイプのプライマーを用いた両方の反応では任意の可視産物が見られなかったが、4つのヌクレオチドのプライマーでは、テンプレートがない場合にプライマー二量体が形成された。
実施例9:1つ又は2つの非主流ヌクレオチドを有する限定プライマーを用いたPCR
ある種のテンプレートは、3つのヌクレオチドタイプのプライマーを設計するのに適していない。例えば、プライマーは、ミスマッチが1つ又は両方のプライマーの3'末端に非常に近い場合、又は、多くのミスマッチが存在せざるを得ない場合、不適切な可能性がある。このような場合、1つ又は2つの非主流ヌクレオチドを有する限定プライマーを用いることができる。これらのプライマーは、必要に応じて、テンプレートとのミスマッチを更に有することができるが、プライマー-プライマー相互作用を最小化するために、2つ以下の非主流ヌクレオチドを有することができる。
プライマーの2つのセットは、atm及びcsf1rを標的とするヒトゲノム配列用に設計した。ATM_F及びATM_Rは、それぞれ1G及び2つのミスマッチを含む。CSF1R_F及びCSF1R_Rは、それぞれ2つのGを含む。予想される産物サイズは、301bp及び232bpである。25ulのPCR反応物には、10ngのヒトゲノムDNA、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、0.2mMのdCTP、1X SYBRグリーンII、400nMのそれぞれのプライマー及び1.25uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含めた。PCRサイクルは、StepOneTMリアルタイムPCRシステムで実施した。サイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒、72℃30秒)を10サイクル、そして、(95℃15秒、65℃30秒、72℃30秒)を35サイクルとした。PCR産物は、1.5%アガロースゲルで流した。
図10Aは、アガロースゲル画像を示している。レーン1は、DNAラダーである。レーン2は、atmPCR産物である。レーン3は、csf1rPCR産物である。
テンプレートなしのコントロール反応は、限定プライマー及び標準的な4つのヌクレオチドのプライマーのプライマー二量体形成を比較するために行った。25ulのPCR反応物には、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、0.2mMのdCTP、1X SYBRグリーンII及び1.875uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含めた。限定プライマー(ATC-1G-1からATC-1G-10、ATC-2G-1からATC-2G-10)及び標準的な4つのヌクレオチドのプライマー(レギュラー1-10)は、10個のオリゴヌクレオチドを用いてマルチプレックスを行い、合計濃度が50uMとなるように加えた。PCRサイクルは、StepOneTMリアルタイムPCRシステムで実行した。サイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒)を10サイクル、そして、(95℃15秒、65℃30秒)を50サイクルとした。蛍光シグナルは、アニーリングステップで収集した。
図10Bは、1G(非主流ヌクレオチド)を有する限定プライマーの蛍光を時間とともに示している。図10Cは、2Gを有する限定プライマーの蛍光を時間とともに示している。図7Dは、標準的な4-ヌクレオチドタイプのプライマーの蛍光を時間とともに示している。限定プライマーの両方は、プライマー二量体形成を低減して、偽陽性増幅は、40サイクルまで検出不可能であった。標準的な4つのヌクレオチドのプライマーは、強いプライマー-プライマー相互作用を有しており、偽陽性増幅は、約25サイクルで一貫して現れた。
実施例10:足場プライマー
ある種の標的配列を増幅する必要があり、充分な長さの3-ヌクレオチドタイプの配列を標的に利用可能できない場合、足場プライマーを用いることができる。足場プライマーの5'セグメント及び3'セグメントは、標的配列に結合することができるため、プライマー-テンプレートハイブリダイゼーションは、短い3-ヌクレオチドタイプのプライマーの効率よりも効率が高い。3-ヌクレオチドタイプの人工リンカーは、次に、伸長用のテンプレートとしての役割を果たし、充分なプライマー-テンプレート結合長を後のサイクルに提供する。ヌクレオチド三リン酸モノマーのうちの1つのタイプの省略によって、足場プライマーの5'セグメントの4-ヌクレオチドタイプの性質は、予想外の増幅を著しく増加させない。また、足場プライマーは、低濃度で提供して予想外の増幅の可能性を更に低下させることができる。
25ulのPCR反応物は、テンプレート、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1X SYBRグリーンII及び1.25uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含む。3-ヌクレオチドのプライマーは、一般的に、100nM、200nM、400nM又は800nMの濃度で加えられる。足場プライマーは、一般的に、1nM、10nM、100nM、200nM、400nM、800nMの濃度で加えられる。PCRサイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒)を10サイクル、そして、(95℃15秒、65℃30秒)を50サイクルとした。
実施例11:3つのヌクレオチドのプライマーのためのスリーウェイジャンクションフォーマット
図16Aは、増幅されるテンプレートを示している。図16Bにおいて、3ウェイジャンクションヘルパーの4-ヌクレオチドタイプの5'領域(配列4)は、テンプレートにハイブリダイズする。順方向プライマー(配列1)は、配列4のハイブリダイゼーション領域の次のテンプレートにハイブリダイズする。順方向プライマー(配列2)の5'末端及び3ウェイジャンクションヘルパー(配列3)の3'末端に連結した人工セグメントは、互いに相補的であり、共にハイブリダイズして完全な構造を安定化させてポリメラーゼ伸長を開始する。他のストランドにおいて、逆方向プライマーは、ハイブリダイズして、配列1がハイブリダイズする3つのヌクレオチドの領域において伸長する。図16Cにおいて、順方向プライマー伸長産物は、逆方向プライマーにハイブリダイズして、全長産物を発生させる。スリーウェイジャンクションフォーマットは、両方のプライマーにアプライすることができる。
25ulのPCR反応物は、テンプレート、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1XSYBRグリーンII及び1.25uのAmpliTaqGoldDNAポリメラーゼを含む。3-ヌクレオチドのプライマーは、一般的に、100nM、200nM、400nM又は800nMの濃度で加えられる。スリーウェイジャンクションヘルパーは、一般的に、1nM、10nM、100nM、200nM、400nM、800nMの濃度で加えられる。PCR条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒)を10サイクル、そして、(95℃15秒、65℃30秒)を50サイクルとした。
実施例12:4つのヌクレオチド一リン酸塩のうちの1つを限られた量で用いた3つのヌクレオチドのミスマッチプライマー又は限定プライマーPCR
Gがなく且つ少なくとも1つのミスマッチを有する3-ヌクレオチドタイプのプライマーが3つのヌクレオチド一リン酸塩を用いる増幅で用いられる場合、プライマー伸長は、dCTPが必要になると停止する。中間産物は、互いにハイブリダイズするか、プライマーにハイブリダイズして完全産物まで伸長する。dCTPを限られた量で提供されると、プライマー伸長におけるdCTPの組込みによってより多くのテンプレートが生じることで、3つのヌクレオチドのプライマーPCRのためのより多くの中間産物が生じ、PCR効率を上昇する。限定プライマーは、好ましくは2以下のGを含む。テンプレートが許す場合、dCTPは、PCR伸長には充分である限られた量で提供されるが、プライマー二量体の形成又はテンプレートを用いた非特異的増幅を更に制限する。
一組のプライマーを、順方向プライマーの1G及び逆方向プライマーの2G(11-1G-F、11-2G-R)を含むHPV用に設計する。25ulのPCR反応には、1pgのHPV11 DNA、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、4X SYBRグリーンII、400nMのそれぞれのプライマー及び1.875uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含めた。dCTPを用いた反応において、dCTPは、1uM(標準的な量の1/200)で加えた。PCRサイクルは、StepOneTMリアルタイムPCRシステムで実行した。サイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒)を10サイクル、そして、(95℃15秒、65℃30秒)を50サイクルとした。蛍光シグナルは、アニーリングステップで収集した。
図11Aは、1uMのdCTPを用いた限定プライマーPCRの蛍光を時間とともに示している。図11Bは、dCTPなしで、限定プライマーPCRの蛍光を時間とともに示している。図11Cは、1uMのdCTPを用いたテンプレートコントロールを含まない、限定プライマーの蛍光を時間とともに示している。限定プライマーを用いた増幅には、1uMのdCTPで充分である。dCTPが提供されない場合、プライマー伸長は、dCTPが必要な場合に停止する。従って、短い二本鎖産物だけが形成される。そして、増幅曲線が遅延して増幅シグナルが低下する。1uMのdCTPを有し且つテンプレートコントロールなしの場合、プライマー二量体は、60サイクルにおいて形成されなかった。
実施例13:ddNTPとして第4のヌクレオチド一リン酸塩を加えることによって3-ヌクレオチドタイプのプライマーを用いたマルチプレックスPCRでの非特異的増幅の低減
3-ヌクレオチドタイプのプライマーは、プライマーがdCTPなしに非特異的プライミングサイトで長い配列を伸長することができないため、非特異的テンプレート増幅を減らすこともできる。ddCTPがPCR反応に提供される場合、任意のタイミングで非特異的プライマーの伸長がテンプレート上でGと出会い、ddCTPが組み込まれて、この産物の更なる伸長が阻害される。しかしながら、特定の3つのヌクレオチドのプライマーPCRでは、ddCTPが組み込まれないため、追加したddCTPの影響を受けない。患者の頸部サンプル中でのHPV56検出のために3つのヌクレオチドのプライマーを設計した。ヒトゲノムDNAは、かなりの量が患者試料に常に存在している。HPV56 DNAが存在しない場合、HPV56プライマーは、時々、ヒトゲノムDNAと反応することができ、非特異的に増幅する。ddCTPを0.2mMで反応物に加えると、非特異的増幅率は、検出不可能なレベルに低減される。
25ulのPCR反応物には、100ngのヒトゲノムDNAテンプレート、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1X SYBRグリーンII、400nMのそれぞれのHPV56及びヒトYWHZプライマー及び1.875uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含めた。ddCTP反応のために、0.2mMのddCTPを加える。PCRサイクルは、StepOneTMリアルタイムPCRシステムで実行した。サイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒)を10サイクル、そして、(95℃15秒、65℃30秒)を50サイクルとした。
HPV56プライマー(56MM1F、56MM1R)及びヒトYWHZプライマー(YWHZF1Tmtail、YWHZR1Tmtail)をPCR反応に用いた。非特異的増幅産物を得られるように、ddCTPとの反応を繰り返した。ddCTPのない反応を繰り返した。非特異的増幅は、観察されなかった。図12は、ゲル画像を示している。レーン1は、DNAラダーである。レーン2は、ddCTPを提供しない場合の、81bpの非特異的HPV56プライマー産物及び116bpのYWHZ産物を示す。レーン3は、ddCTPを提供する場合、YWHZ産物だけが存在することを示している。
実施例14:融解曲線分析を用いたマルチテンプレートのマルチプレックス検出
実施例13に示すように、我々は、患者試料のHPVを検出する3-ヌクレオチドタイプのHPVプライマー及び内部標準としてのヒトYWHZプライマーを設計した。シグナル検出試薬としてDNAインターカレーティング染料SYBRグリーンを使用したところ、HPV及び内部標準の両方は、同じ染料で検出された。2つの反応を区別するために、HPV及び内部標準のPCR産物が異なるTmを有するようにプライマーを改変して、融解曲線分析によって分けた。ネガティブコントロールは、テンプレートとしてヒトゲノムDNAだけを用いて実行した。
25ulのPCR反応物は、10pgのHPV56 DNAテンプレート、10ngのヒトゲノムDNAテンプレート、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1X SYBRグリーンII及び1.875uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含めた。プライマー濃度は、それぞれ100nMプライマーである。ネガティブサンプルにおいては、HPV56 DNAを加えない。PCRサイクルは、StepOneTMリアルタイムPCRシステムで実行した。サイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒)を10サイクル、そして、(95℃15秒、65℃30秒)を50サイクルとした。蛍光シグナルは、アニーリングステップで記録した。融解曲線分析は、サイクルプログラム終了時に実行した。
図13Aは、HPV56及びヒトYWHZ産物に対応する、72.47℃及び79.86℃で発生する2つのよく分かれている融解曲線ピークを示している。対照的に、図13Bにおいて、ネガティブコントロールは、HPV56が存在していなかったことを示す72.47℃の融解曲線ピークを示さなかった。
実施例16:3つの蛍光ラベル化ヌクレオチドのプライマーを用いたリアルタイムPCR検出
SYBRグリーンに基づく検出に加えて、3つのヌクレオチドのプライマーを用いた蛍光に基づく検出も試験した。蛍光ラベル化プライマーは、ハイマルチプレックスを可能にし、単一のチューブ反応における多重チャネル検出を可能にする。3つの人工ヌクレオチドの尾部をヒトYWHZプライマーに加えて、5'末端にFAM蛍光体で尾部をラベル化し、消光物質を用いて、人工尾部に相補的なプローブをラベル化した。プライマーよりもTmが低い尾部/プローブ配列を慎重に設計した。その結果、伸長は、消光物質がシグナル検出のためにより低い温度で遊離蛍光プライマーにハイブリダイズする前に尾部領域への完全な伸長を確実にするためにアニーリング温度よりも高温で生じることができる。アッセイは、蛍光ラベル化プライマーによって検出されるストランドを優先して発生させるために過剰量で逆方向プライマーを提供するPCR反応での非対称プライマー濃度によって促進させることができる(図22)。シグナル生成は、プライマーの伸長に依存するため、過剰量の逆方向プライマーがシグナルを高め、それによって反応効率が向上する。
25ulのPCR反応物には、10ngのヒトゲノムDNAテンプレート、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1.25uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ、100nMの蛍光ラベル化プライマー、100nM BHQ-プローブ及び100nM逆方向プライマーを含めた。PCRサイクルは、StepOneTMリアルタイムPCRシステムで実行した。サイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒、50℃30秒及び50℃15秒)を60サイクルとした。蛍光シグナルは、二回目の50℃ステップで記録した。
図20Aは、テンプレート増幅の蛍光を時間とともに示している。図20Bは、テンプレートがないコントロール反応の蛍光を時間とともに示している。10ngのヒトゲノムDNAは、FAMラベル化プライマーを用いてうまく検出される。プライマー二量体からの増幅産物は、コントロールにおいて観察されなかった。
実施例17:汎用蛍光ラベル化プライマーを用いたマルチプレックスPCR
直前の実施例由来の直接蛍光ラベル化プライマーは、マルチプレックス及びマルチチャネルシグナル検出のレベルを高めることができる。しかしながら、プライマーの個々ラベル物質は、費用効果が低い。この実施例では、マルチプレックス反応からの複数産物を検出することができる蛍光ラベル化汎用プライマーを設計した。3つの標準的なヌクレオチドのPCRプライマーに加えて、各プライマーの5'末端に3つの汎用ヌクレオチドの尾部を導入した。反応物には、プライマー尾部と同じ配列を有する汎用プライマーが含まれる。また、汎用プライマーは、二本鎖配列を尾部として付加されている。1つのストランドは、3つのヌクレオチド配列であり且つ蛍光体でラベル化され、相補的なストランドは、消光物質でラベル化されている。このアッセイを行なうために、YWHZプライマーを使用した。汎用プライマーによって検出されるストランドを優先して発生させるために非対称PCRを用いた。蛍光ラベル化汎用プライマーを、複数標的配列を効率的に増幅させるために3つのヌクレオチドのマルチプレックスPCR反応と組み合わせることができることを証明した。
25ulのPCR反応物には、100ngのヒトゲノムDNA、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1.25uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ、100nMの蛍光ラベル化汎用プライマー、100nMのBHQ-プローブ、100nMの尾部化YWHZ順方向プライマー及び400nMのYWHZ逆方向プライマーを含めた。PCRサイクルは、BioRad CFX96リアルタイムPCR装置で実行した。サイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒、50℃30秒及び50℃15秒)を60サイクルとした。蛍光シグナルは、二回目の50℃ステップで記録した。
図21Aは、テンプレート増幅の蛍光を時間とともに示している。図21Bは、テンプレートなしのコントロール反応の蛍光を時間とともに示している。100ngのヒトゲノムDNAは、FAMラベル化汎用プライマーによって容易に検出された。プライマー二量体形成からの増幅産物は、テンプレートなしのコントロールにおいては検出されなかった。
実施例18:Taqmanプローブフォーマット
プライマー上の蛍光ラベルの代わりに、このフォーマットにおいて、Taqmanプローブフォーマットとしてプローブに蛍光をラベル化した。逆方向プライマーがTaqmanプローブで伸長すると、DNAポリメラーゼの5' exo活性がプローブを消化して、検出される遊離蛍光を放出させる。
この実施例では、3つのヌクレオチドのプライマーを、汎用人工配列を尾部として付加されている。PCR反応において、Taqmanフォーマットプローブを提供する。このプローブは、汎用人工配列に相補的であり、蛍光体及び消光物質でラベル化されている。1つのプライマーを上記フォーマットとして又は両方のプライマーを上記フォーマットとしてPCRを実行した。プライマー伸長がTaqmanプローブに出会うと、DNAポリメラーゼの5' exoヌクレアーゼ活性がプローブを消化して、蛍光体と消光物質が分離し、蛍光シグナルが生じる。
25ulのPCR反応物は、テンプレート、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP及び1.25uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含む。3-ヌクレオチドのプライマーは、一般的に、100nM、200nM、400nM又は800nMの濃度で加えられる。Taqmanプローブは、一般的に、100nM、200nM、400nMの濃度で加えられる。PCRサイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒、72℃60秒)を60サイクルとした。
実施例19:分子ビーコンフォーマット
蛍光ラベル化分子ビーコンを反応に提供する。順方向プライマーは、分子ビーコンと同じ配列を含む3つのヌクレオチドの人工配列を尾部として付加されている。逆方向プライマーが人工配列まで伸長すると、その相補体配列が生じる。分子ビーコンは、配列にハイブリダイズすると、もはや消光されなくなり蛍光が検出される。
この実施例では、3つのヌクレオチドのプライマーが、汎用人工配列を尾部として付加されている。PCR反応物において、分子ビーコンフォーマットプローブが提供される。プローブは、ヘアピン構造を有しており、蛍光体及び消光物質でラベル化されている。遊離プローブは、ヘアピン構造のままであり、蛍光体は消光されている。そのループ配列は、汎用人工配列と同じである。PCRを実行すると、プライマー伸長は、汎用人工配列の相補的な配列を発生させる。プローブは、相補的な配列にハイブリダイズして、もはやヘアピン構造とはならない。これによって、蛍光体及び消光物質の分離が引き起こされて、蛍光シグナルが生じる。
25ulのPCR反応物は、テンプレート、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP及び1.25uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含む。3-ヌクレオチドのプライマーは、一般的に、100nM、200nM、400nM又は800nMの濃度で加えられる。分子ビーコンプローブは、一般的に、100nM、200nM、400nMの濃度で加えられる。PCRサイクル条件は、10分95℃、(95℃15秒、60℃30秒、72℃60秒)を60サイクルとした。
実施例20:全ゲノム増幅
1つの非主流ヌクレオチドを含む3つの限定ランダムヌクレオチドのプライマーは、人工配列を尾部として付加されている。これらのランダムプライマーは、全ゲノムDNAを増幅するために用いる。PCR産物は、ランダムプライマーの人工配列と同じ配列である汎用プライマーを用いて更に増幅される。増幅産物は、配列決定のために用いることができる。
温度サイクルによって実施されるPCR技術と対照的に、3-ヌクレオチドタイプのプライマーは、一定の温度で実施して、サーマルサイクラーを必要としない等温増幅においても用いられる。増幅された産物は、SYBRグリーン又は蛍光ラベル化プローブの追加によって検出することができる。等温増幅は、一般的に、ストランド変位DNAポリメラーゼによって実行される。
25ulのPCR反応物は、テンプレート、10mMのTris-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdTTP、0.2mMのdGTP、1X SYBRグリーンII及び2.5uのAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを含む。ランダムプライマーは、一般的に、100nM、200nM、400nM、800nM、1uM、2uM、5uM又は10uMの濃度で加えられる。PCRサイクル条件は、95℃10分、(95℃15秒、60℃30秒、72℃60秒)を60サイクルとした。第２のPCR反応において、前の反応からの産物を、1:10、1:100、1:1000又は1:10000に希釈して、1ulの希釈物をテンプレートとして加える。汎用プライマーは、一般的に、100nM、200nM、400nM又は800nMの濃度で用いられる。他の試薬は、類似の様式で提供される。等温反応のために、増幅は、所望の期間、60℃でインキュベートされる。
実施例21:等温増幅
4種類の等温増幅をこの実施例で示す：ループ媒介等温増幅(LAMP)、切断酵素増幅反応(NEAR)、転写媒介増幅(TMA)、ローリングサークル増幅(RCA)、ヘリカーゼ依存的増幅(HDA)、指数関数増幅(EXPAR)、ハイブリダイゼーション連鎖反応法(HCR)、触媒ヘアピンアセンブリ(CHA)。
LAMPは、一般的に、それぞれ0.1-0.8mmのFIP及びBIP、それぞれ0-0.2mMのキックプライマー、それぞれ0.1-0.4mMのループプライマー、0.8-1.6mMのdNTP、0.25-1Mのベタイン、20mMのTris-HCl(pH 8.8)、10mMのKCl、10mMの(NH4)2SO4、2-4mMのMgSO4、0.1%のTriton X-100、4-8ユニットのBst DNAポリメラーゼラージフラグメント(New England Biolabs)及び特定の量の二本鎖標的DNAを含む全25-100ulの反応混合物において実行される。混合物は、60℃でインキュベートされ、リアルタイムに分析される。増幅は、SYBRグリーン又は蛍光ラベル化プローブで検出される。
NEARは、一般的に、テンプレート、45.7mMのTris、13.9mMのKCl、10mMの(NH4)2SO4、50mMのNaCl、0.5mMのDTT、15mMのMgCl2、0.1%のTriton X-100、0.008mMのEDTA、6ug/mLのBSA、3.9%のグリセロール、0.1-0.3U/uLの切断酵素、0.1-0.4U/uLのストランド変位酵素、0.1-0.8uMのそれぞれのプライマーを含む全10-100ulの反応混合物において実行される。混合物は、54-60℃でインキュベートする。増幅は、蛍光ラベル化プローブで検出する。
TMAは、一般的に、それぞれ2mMのdNTP、それぞれ8mMのrNTP、80mMのTris-HCl（25℃でpH7.5）、50mMのMgCl2、35mMのKCl、10%(w/v)のポリビニルピロリドン及びプロモーター配列及び逆方向プライマーを有する0.1-1uMのプライマーを含む合計容量25-100ulの反応混合物において実行される。反応混合物をオイル下で10分間、60℃でインキュベートするとRNAの変性が可能になる。次に、8mMのHepes(pH7.5)、50mMのN-アセチル-L-システイン、0.04mMの酢酸亜鉛、80mMのトレハロース、140mMのTris-HCl(25℃でpH8.0)、70mMのKCl、1mMのEDTA、0.01%(w/v)のフェノールレッド、10%(v/v)のTriton X-100及び20%(v/v)のグリセロール、MMLV逆転写酵素(2000のユニット/アッセイ)及びT7 RNAポリメラーゼ(2000のユニット/アッセイ)を含む酵素混合物を加える前に、混合物を42℃で5分間冷却して、42℃で60分間、更にインキュベーションした。
RCA増幅反応は、一般的に、テンプレート、8UのBst DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、100-800nMの各RCAプライマー及び400μMのdNTP混合物を含む50μlの混合物中において実行される。混合物は、65℃で60分間インキュベートして、10℃に冷却される。
増幅産物は、SYBRグリーン又は蛍光ラベル化プローブで検出され、他の用途において用いることができる。
HDA増幅反応は、一般的に、以下の試薬:1XHDA緩衝液(360mMのTris-アセテート(pH7.5)、250mMのKOAC、100mMのDTT、1mg/mlのBSA及び50mMの酢酸マグネシウム)、テンプレート、それぞれ0.1-0.8μMのプライマー、0.4mMμlのdNTP、4mMのATP、DNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ及びT4 gp32を含む50μlの反応物において実行される。増幅反応は、初期変性なしに実施される(例えば、試薬を上記の通りに加える)、又は、初期の変性及びアニーリングを行って実施される(例えば、DNAポリメラーゼ及びヘリカーゼを初期のステップの後に加える)。反応は、37℃で1時間インキュベートされる。増幅産物は、SYBRグリーン又は蛍光ラベル化プローブで検出される。EXPAR増幅反応は、一般的に、60℃で実行される。反応物は、85mMのKCl、25mMのTris-HCl(pH8.8、25℃)、2.0mMのMgSO4、5mMのMgCl2、10mMの(NH4)2SO4、0.1%(vol:vol)のTriton X-100、0.5mMのDTT、切断酵素、ベントexo-ポリメラーゼ、400uMのdNTP、10ug/mlのBSA、テンプレート及びプライマーを含む。増幅産物は、SYBRグリーン又は蛍光ラベル化プローブで検出される。
HCR反応は、一般的に、1X HBNバッファー(150mMのNa2HPO4及び1.5MのNaCl(pH6.8))、それぞれ1.0uMのヘアピンH1及びH2並びに0.1-1uMの開始剤を含む4-50uLにおいて実行される。反応は、以下の条件:5分間のウォーターバスでの沸騰と、室温で1時間の段階的冷却によって実施される。
CHA反応は、一般的に、それぞれ10-1000nMのヘアピンH1及びH2、50-1000nMレポーター二体鎖(蛍光体ラベル化オリゴ：消光物質ラベル化オリゴ=1：2、1X TNaKバッファー(20mMのTris、pH 7.5; 140mMのNaCl; 5mMのKCl)を含む5-50uL混合物において実行される。H1及びH2は、使用直前に、TNaK緩衝液において別々にリフォールディング(90℃1分間、次に、0.1℃/sで室温に冷却)させた。標的オリゴの追加後、反応は、蛍光検出のために37℃でインキュベートする。
配列表
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Claims (36)

  1. 標的核酸の所定のセグメントを増幅する方法であって、前記方法は、
    順方向及び逆方向プライマーと標的核酸を含むサンプルとを接触させる接触工程と、
    増幅反応を実行する実行工程と、を有し、
    前記標的核酸の前記所定のセグメントの増幅産物は、前記標的核酸がテンプレートとして役割を果たしつつ、前記順方向及び逆方向プライマーの伸長によって形成され、
    前記プライマーは、4つの標準ヌクレオチドタイプのうちの1又は複数が非主流のものであり、
    前記非主流ヌクレオチドタイプは、前記プライマーにおいて同じであり、
    各プライマーにおいて、前記非主流ヌクレオチドタイプは、内部位置及び/又は5'末端位置で2つ以下存在し、
    前記所定のセグメントの増幅産物は、前記順方向及び逆方向プライマーの伸長によって形成された主要な増幅産物であり、
    前記方法は、１又は複数の更なる所定のセグメントの増幅産物を形成する１又は複数の更なる順方向プライマー及び逆方向プライマー対を用いたマルチプレックスで実行され、
    前記非主流ヌクレオチドタイプは、各対で同じであり、
    各対の各プライマーにおいて、前記非主流ヌクレオチドタイプは、内部位置及び/又は5'末端位置で2つ以下存在する、
    標的核酸の所定のセグメントを増幅する方法。
  2. 前記標的核酸は、逆方向プライマー結合サイト及び順方向プライマー結合サイトの相補体を含むストランドを有する、請求項1に記載の方法。
  3. 前記所定のセグメントの増幅産物は、前記順方向及び逆方向プライマーの伸長によって形成された全ての増幅産物の少なくとも99%を構成する、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 前記順方向及び逆方向プライマーは、前記順方向及び逆方向プライマー結合サイトに対してより大きな相補性を、前記サンプルにおける増幅を支持するプライマー結合サイトの任意の他の対よりも有する、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
  5. 前記順方向及び逆方向プライマーは、4つの標準ヌクレオチドタイプのうちの1つだけが非主流である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
  6. 前記順方向プライマー結合サイト及び前記逆方向プライマー結合サイトは、前記順方向及び逆方向プライマーにおける前記非主流ヌクレオチドタイプの相補体において非主流である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
  7. 前記順方向及び逆方向プライマーは、非主流ヌクレオチドタイプのユニットを1つだけ有し、
    前記順方向プライマー結合サイト及び前記逆方向プライマー結合サイトは、前記非主流ヌクレオチドタイプの相補体のユニットを3つ以下有する、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
  8. 前記順方向及び逆方向プライマーは、非主流ヌクレオチドタイプ以外の3つの標準ヌクレオチドタイプからなり、
    前記順方向プライマー結合サイト及び前記逆方向プライマー結合サイトは、前記順方向及び逆方向プライマーにおける前記非主流ヌクレオチドタイプの相補体以外の前記3つの標準ヌクレオチドタイプからなる、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
  9. 前記順方向及び逆方向プライマーは、5'末端で前記非主流ヌクレオチドタイプのユニットを1つ有する、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
  10. 前記逆方向プライマー結合サイトと前記順方向プライマー結合サイトの相補体は、隣接している、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
  11. 前記逆方向プライマー結合サイト及び前記順方向プライマー結合サイトの前記相補体は、前記順方向及び逆方向プライマー並びにその相補体における非主流ヌクレオチドタイプを排除している領域によって分離される、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
  12. 前記逆方向プライマー結合サイト及び前記順方向プライマー結合サイトの相補体は、前記順方向及び逆方向プライマー又はその相補体又はその両方における非主流ヌクレオチドタイプを含む領域によって分離される、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
  13. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーの3'ヌクレオチドは、前記順方向及び逆方向プライマーにおける非主流ヌクレオチドタイプのうちの1の相補体である、請求項1から7及び9から12のいずれかに記載の方法。
  14. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーの3'ヌクレオチドは、C又はGである、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
  15. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、イノシン、isoC、isoG、7-デアザ-2'-デオキシグアノシン、又は、7-デアザ-2'-デオキシアデノシンである非天然ヌクレオチドを含む、請求項1から14のいずれかに記載の方法。
  16. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、前記順方向及び/又は逆方向プライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する人工オリゴヌクレオチドにその5'末端で連結される、請求項1から15のいずれかに記載の方法。
  17. 前記増幅は、前記順方向及び逆方向プライマーの非主流ヌクレオチドタイプに相補的なヌクレオチド三リン酸モノマーを除くヌクレオチド三リン酸モノマーを用いて実行される、
    又は、
    前記順方向及び逆方向プライマーにおいて非主流である前記ヌクレオチドタイプの相補的なヌクレオチド三リン酸モノマーは、他のヌクレオチド三リン酸モノマーに対して低濃度で存在する、
    請求項1から12、14及び15のいずれかに記載の方法。
  18. 前記逆方向プライマー結合サイト及び前記順方向プライマー結合サイトの相補体に関する前記標的核酸のストランドの配列をサーチするサーチ工程を更に有し、
    前記サーチ工程は、ATC領域とATG領域、ATG領域とATC領域、CGA領域とCGT領域、またはCGT領域とCGA領域を探すことにより、前記順方向プライマー結合サイトと前記逆方向プライマー結合サイトの相補体を特定するようにプログラムされたコンピューターで実行される、
    請求項1から17のいずれかに記載の方法。
  19. 前記順方向プライマー結合サイト及び/又は前記逆方向プライマー結合サイトは、前記順方向及び逆方向プライマーの前記非主流ヌクレオチドタイプの相補的なヌクレオチドタイプのユニットを少なくとも1つ含み、
    前記プライマーと前記プライマー結合サイトのハイブリダイゼーションは、少なくとも1つのミスマッチになる、請求項1から18のいずれかに記載の方法。
  20. 前記増幅は、ミスマッチ安定化剤の存在下で実行される、請求項19に記載の方法。
  21. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する人工二本鎖オリゴヌクレオチドのストランドの1つにその5'末端で連結し、
    前記人工二本鎖オリゴヌクレオチドは、前記順方向及び逆方向プライマーの伸長によって形成される主要な増幅産物とは融解温度が異なり、
    前記主要な増幅産物の形成は、融解曲線分析によって検出され、
    前記主要な融解温度は、人工二本鎖のオリゴヌクレオチドのものから前記主要な増幅産物のものへと遷移する、請求項1から20のいずれかに記載の方法。
  22. 種々の融解温度を有する種々の人工セグメントに連結する種々のプライマーを用いて実行される、請求項21に記載の方法。
  23. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する人工オリゴヌクレオチド配列にその5'末端で連結し、
    前記所定のセグメントの増幅産物は、増幅反応の間に形成された5'末端人工オリゴヌクレオチドの相補的なストランドにハイブリダイズすることによって、蛍光体と消光物質が分離し、前記所定のセグメントの増幅産物の存在を示す蛍光シグナルを発生させる、5'末端人工オリゴヌクレオチドと同じ配列を有する前記蛍光体及び消光物質ラベル化オリゴヌクレオチドによって検出される、請求項1から22のいずれかに記載の方法。
  24. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する一本鎖人工オリゴヌクレオチドにその5'末端で連結し、
    前記人工オリゴヌクレオチドは、蛍光体及び消光物質でラベル化されており、それによって、前記順方向及び逆方向プライマーの伸長によって形成された前記所定のセグメントの増幅産物は、前記蛍光体及び消光物質を分離し、前記所定のセグメントの増幅産物の存在を示す蛍光シグナルを発生させる、請求項1から22のいずれかに記載の方法。
  25. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結するプライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する蛍光ラベル化尾部にその5'末端で連結する、請求項1から24のいずれかに記載の方法。
  26. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、消光物質でラベル化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする蛍光ラベル化尾部によって供給され、
    前記オリゴヌクレオチドは、増幅の間に前記プライマーから解離して、前記蛍光ラベル化尾部から前記消光物質を分離し、蛍光シグナルを発生させる、請求項25に記載の方法。
  27. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーの複数対は、共通5'人工セグメントに連結し、
    前記増幅は、前記共通5'人工セグメントの相補体に相補的な3'セグメントを有する検出プローブを用いて実行される、請求項1から26のいずれかに記載の方法。
  28. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結する前記プライマーと同じ非主流ヌクレオチドタイプを有する人工尾部にその5'末端で連結し、
    前記プライマーは、蛍光体及び消光物質を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように供給され、前記消光物質又は蛍光体は、増幅の際にオリゴヌクレオチドから分かれて、蛍光シグナルを発生させる、請求項1から26のいずれかに記載の方法。
  29. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、連結する前記プライマーと同じヌクレオチドタイプにおいて非主流である尾部にその5'末端で連結し、
    前記5'尾部の相補体にハイブリダイズするループを有するヘアピン並びにその末端に蛍光体及び消光物質を含む分子ビーコンオリゴヌクレオチドが提供され、
    前記分子ビーコンオリゴヌクレオチドは、前記所定のセグメントの増幅産物にハイブリダイズして、前記蛍光体及び消光物質が分離し、蛍光シグナルを発生させる、請求項1から26のいずれかに記載の方法。
  30. 前記順方向及び/又は逆方向プライマーは、3'単一ストランド粘着末端及びその5'末端セグメントのヘアピンループ構造を有し、
    前記ヘアピンループ構造における5'末端の最後ヌクレオチドは、非主流ヌクレオチドタイプの相補体であり、
    前記所定のセグメントの増幅産物は、ライゲーションされて、ライゲーションされた産物を形成する、請求項1から29のいずれかに記載の方法。
  31. 前記サンプルは、互いに異なる濃度で前記順方向及び逆方向プライマーと接触する、請求項1から30のいずれかに記載の方法。
  32. 前記増幅は、温度サイクルで実行される、請求項1から31のいずれかに記載の方法。
  33. 前記増幅は、等温で実行される、請求項1から31のいずれかに記載の方法。
  34. 前記所定のセグメントの増幅産物は、融解曲線分析、キャピラリー電気泳動、質量分析、リアルタイム蛍光検出、配列決定又はマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションによって検出される、請求項1から33のいずれかに記載の方法。
  35. 前記1又は複数の更なる所定のセグメントは、前記標的核酸に存在する、請求項1に記載の方法。
  36. 前記1又は複数の更なる所定のセグメントは、前記標的核酸とは異なる標的核酸に存在する、請求項1に記載の方法。
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