CN111593105A - 检测SOD2基因rs4880位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SOD2基因rs4880位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明采用SOD2基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增SOD2基因片段，同时在SOD2基因特异性的引物界定的扩增区域内设计SOD2基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3‑FAM和SEQ4‑VIC。本发明提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断SOD2基因rs4880位点多态性的方法不仅准确率高，而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点，非常适合于在临床中大规模开展。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及SOD2基因rs4880位点多态性的分型检测方法与试剂盒。
背景技术
糖尿病是一种由于胰岛素分泌作用紊乱引起的具有复杂病因的代谢疾病，其特征是碳水化合物、脂肪和蛋白质出现代谢功能障碍。血脂异常与胰岛素抵抗一起发生，是导致心血管疾病重要的危险因素之一。脂蛋白性质的定量和定性变化，脂蛋白代谢降解，遗传易感性和环境因素是糖尿病性血脂异常的主要病因机制。最近的研究表明，编码参与脂蛋白代谢的酶和蛋白质的基因多态性可能在糖尿病性血脂异常的发展中起重要作用。因此，确定与糖尿病性血脂异常相关的遗传谱在降低微血管和大血管并发症的风险方面变得越来越重要。
锰依赖性超氧化物歧化酶（SOD2）是最重要的超氧化物歧化酶家族成员，存在于线粒体基质中，可以清除由线粒体中发生的多种氧化还原和电子传递反应产生的氧自由基。防止活性氧诱导的高血糖，氧化应激和电离辐射的损害。最近研究表明，SOD2中rs4880（C/T）位点的基因多态性与糖尿病性血脂异常有关。在糖尿病患者中，C等位基因携带者（CC/CT）血脂异常的风险较高。因此，rs4880（C/T）可作为早期检测标志物判断糖尿病性血脂异常的风险。
目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成非特异荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。
分子信标（Molecular Beacon）在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团（F），3′端标记淬灭基团（Q）。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近（约为7-10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比（图1）。因此，理想的分子信标比Taqman水解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变（包括单碱基的错配、缺失或插入突变）效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。
针对碱基的修饰改造也就是人工模拟的非天然核苷酸对的研究发展至今已有近40年的历史，这其中异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）及其衍生物5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoMeC-isoG）中的人工核苷酸对堪称经典。有关isoC-isoG中的核苷酸对的研究工作最早是由美国著名合成生物学家Benner SA开展的，其团队实现了异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）的人工扩展核酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。如图2所示，isoC和isoG分别是天然核苷酸C和G的异构体，它们自身可以完美配对，但无法与天然核苷酸之间形成配对。
除了以上人工对碱基结构的改造，还有一大类基于对碱基糖环的改造的非天然核酸，如锁核酸（LNA）。LNA泛指含有一个或多个LNA单体（锁核苷酸）的寡核苷酸序列，是一类近年来迅速发展起来的并且已经在分子诊断、基因治疗等领域得到广泛应用的人工模拟核酸。如图3所示，LNA单体的戊糖环的2’-O和4’-C之间形成了一个亚甲基桥。LNA不改变天然核酸的碱基配对，但相对于天然核酸有着更强的亲和力以及更强的错配识别能力。
发明内容
本发明的目的是基于人工模拟核酸的分子信标提供一种新型的SOD2基因rs4880多态性位点的分型检测方法与试剂盒。
为实现上述目的，本发明首先提供了用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的分子信标。
本发明提供的用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的分子信标由分子信标甲和分子信标乙组成；
所述分子信标甲的序列为序列表中序列2，其中，序列2第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基；
所述分子信标乙的序列为序列表中序列3，其中，序列3第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。
所述分子信标甲和所述分子信标乙的第7-25位均为环状区序列，第1-6位及第26-31位均为茎干区序列。
所述分子信标甲和所述分子信标乙的环状区均靶向SOD2基因rs4880位点。其中，所述分子信标甲靶向SOD2基因rs4880位点的“T”；所述分子信标乙靶向SOD2基因rs4880位点的“C”。
进一步的，所述分子信标甲和所述分子信标乙的两端还标记有荧光基团和淬灭基团，且所述分子信标甲和所述分子信标乙标记的荧光基团不同。所述分子信标甲和所述分子信标乙标记的淬灭基团可以相同也可以不同。
每个分子信标中，所述荧光基团发出的荧光可被所述淬灭基团吸收。所述荧光基团和所述淬灭基团可分别位于基础分子信标的5’末端和3’末端，所述荧光基团和所述淬灭基团的位置也可以交换，只要满足自由状态下的基础分子信标中的荧光基团发出的荧光可被淬灭基团淬灭即可。
更进一步的，所述荧光基团可为FAM、Hex、TET、Cy3、JOE；所述淬灭基团可为Dabcyl、TAMRA。在本发明中，所述分子信标甲的5’末端标记有FAM荧光基团，3’末端标记有Dabcyl淬灭基团；所述分子信标乙的5’末端标记有VIC荧光基团，3’末端标记有Dabcyl淬灭基团。
为了实现上述目的，本发明又提供了用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的成套试剂。
本发明提供的用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的成套试剂由上述分子信标与能从人基因组中扩增得到含有上述分子信标环状区识别序列的引物对组成。
上述成套试剂中，所述引物对由序列表中序列4所示的单链DNA和序列表中序列5所示的单链DNA组成。
上述成套试剂中，所述分子信标与所述引物对均独立包装。所述分子信标中的分子信标甲和所述分子信标乙的摩尔比可为1:1；所述引物对中的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。所述成套试剂中的分子信标甲、分子信标乙与所述引物对的两条单链DNA的摩尔比可为2:2:5:5。
为了实现上述目的，本发明还提供了用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的试剂盒。
本发明提供的用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的试剂盒包括上述分子信标或上述成套试剂。
所述试剂盒还可包括阳性质控、阴性质控及其他试剂。所述其他试剂可为反应缓冲液、dNTPs、MgCl2溶液、DNA聚合酶和/或无核酸酶水等试剂。所述阳性质控包括重组质粒1、重组质粒2和重组质粒3。所述重组质粒1为将大肠杆菌克隆载体pUC57中的EcoRV和SmaI识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的DNA片段（序列1中的SOD2基因rs4880位点为“T”）得到的重组质粒；所述重组质粒2为将大肠杆菌克隆载体pUC57中的EcoRV和SmaI识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的DNA片段（序列1中的SOD2基因rs4880位点为“C”）得到的重组质粒；所述重组质粒3为所述重组质粒1与所述重组质粒2按照摩尔比为1:1的比例混合得到的。所述阴性质控具体可为无核酸酶水。所述DNA聚合酶具体可为EX Taq DNA聚合酶。
为了实现上述目的，本发明还提供了上述分子信标或上述成套试剂的新用途。
本发明提供了上述分子信标或上述成套试剂在检测人SOD2基因rs4880位点多态性中的应用。
本发明还提供了上述分子信标或上述成套试剂在预测或辅助预测糖尿病性血脂异常风险中的应用。
为了实现上述目的，本发明最后提供了用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的方法。
本发明提供的用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的方法包括如下步骤：利用上述分子信标或上述成套试剂检测待测样本，根据待测样本中荧光信号的变化确定所述待测样本中SOD2基因rs4880位点多态性。
上述方法中，利用所述分子信标或所述成套试剂检测待测样本为利用所述分子信标或所述成套试剂检测所述待测样本的DNA。
所述根据待测样本中荧光信号的变化确定所述待测样本中SOD2基因rs4880位点多态性的方法如下：
若待测样本释放FAM荧光信号，不释放VIC荧光信号，且FAM荧光信号值不断升高，则待测样本SOD2基因rs4880位点的基因型为或候选为TT基因型；
若待测样本释放VIC荧光信号，不释放FAM荧光信号，且VIC荧光信号值不断升高，则待测样本SOD2基因rs4880位点的基因型为或候选为CC基因型；
若待测样本释放VIC荧光信号和FAM荧光信号，且FAM荧光信号值和VIC荧光信号值均不断升高，则待测样本SOD2基因rs4880位点的基因型为或候选为CT基因型。
所述TT基因型是指待测样本DNA的两条同源染色体上的SOD2基因rs4880位点的碱基均为T的纯合体；
所述CC基因型是指待测样本DNA的两条同源染色体上的SOD2基因rs4880位点的碱基均为C的纯合体；
所述CT基因型是指待测样本DNA的两条同源染色体上的SOD2基因rs4880位点的碱基为C和T的杂合体。
上述方法中，所述待测样本具体可为待测者的血液样本。
上述分子信标或成套试剂或试剂盒或应用或方法中，所述SOD2基因rs4880位点位于序列1第51位。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断SOD2基因rs4880位点多态性的方法不仅准确率高，而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点，非常适合于在临床中大规模开展。
附图说明
图1是分子信标工作原理图。
图2是非天然核苷酸异鸟嘌呤核苷酸残基（isoG）与非天然核苷酸5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基（isoMeC）的结构图。
图3是锁核苷酸残基的结构图。
图4是本发明实施例2中人SOD2基因rs4880位点TT基因型特异性扩增曲线示意图。
图5是本发明实施例2中人SOD2基因rs4880位点CC基因型特异性扩增曲线示意图。
图6是本发明实施例2中人SOD2基因rs4880位点CT基因型特异性扩增曲线示意图。
图7是利用SEQ1和SEQ2引物对、普通Taqman探针SEQ5-FAM和SEQ6-VIC检测标准品样本1的扩增曲线示意图。
图8是利用SEQ1和SEQ2引物对、普通Taqman探针SEQ5-FAM和SEQ6-VIC检测标准品样本2的扩增曲线示意图。
序列表
<110>
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaccgggctg tgctttctcg tcttcagcac cagcaggcag ctggctccgg ytttggggta 60
tctgggctcc aggcagaagc acagcctccc cgacctgccc t 101
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgacatggc tccggttttg gggtatgtcg g 31
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgacatggc tccggctttg gggtatgtcg g 31
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaccgggctg tgctttct 18
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agggcaggtc gggga 15
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctggctccg gttttggggt atc 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gctggctccg gctttggggt atc 23
Claims (8)
1.用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的分子信标，其由分子信标甲和分子信标乙组成；
所述分子信标甲的序列为序列表中序列2，其中，序列2第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基；
所述分子信标乙的序列为序列表中序列3，其中，序列3第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。
2.根据权利要求1所述的分子信标，其特征在于：所述分子信标甲和所述分子信标乙的两端均标记有荧光基团和淬灭基团，且所述分子信标甲和所述分子信标乙标记的荧光基团不同。
3.根据权利要求2所述的分子信标，其特征在于：所述分子信标甲标记有FAM荧光基团；所述分子信标乙标记有VIC荧光基团。
4.用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的成套试剂，由权利要求1-3任一所述的分子信标与能从人基因组中扩增得到含有权利要求1-3任一所述的分子信标环状区识别序列的引物对组成。
5.根据权利要求4所述的成套试剂，其特征在于：所述引物对由序列表中序列4所示的单链DNA和序列表中序列5所示的单链DNA组成。
6.用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的试剂盒，包括权利要求1-3任一所述的分子信标或权利要求4或5所述的成套试剂。
7.权利要求1-3任一所述的分子信标或权利要求4或5所述的成套试剂或权利要求6所述的试剂盒在检测人SOD2基因rs4880位点多态性中的应用；
或，权利要求1-3任一所述的分子信标或权利要求4或5所述的成套试剂或权利要求6所述的试剂盒在预测或辅助预测糖尿病性血脂异常风险中的应用。
8.用于检测人SOD2基因rs4880位点多态性的方法，包括如下步骤：利用权利要求1-3任一所述的分子信标或权利要求4或5所述的成套试剂检测待测样本，根据待测样本中荧光信号的变化确定所述待测样本中SOD2基因rs4880位点多态性。
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