CN104293920A

CN104293920A - 一种用于快速检测人类vkorc1和cyp2c9基因多态性的试剂盒及其使用方法

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Publication number: CN104293920A
Application number: CN201410474967.3A
Authority: CN
Inventors: 叶伦; 王宁; 刘金水; 李雪梅; 李倩; 陈刚
Original assignee: WUHAN HEALTHCHART BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Wuhan Connecticut Biotechnology Limited by Share Ltd
Priority date: 2014-09-17
Filing date: 2014-09-17
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2034-09-17
Also published as: CN104293920B

Abstract

本发明属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术，具体涉及一种用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒及其使用方法。本发明所述试剂盒包括3对引物、3条探针、6条PNA序列，1对β-Actin内标引物及1条内标探针，还包括Mg²⁺的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH₂O。利用本发明试剂盒能够对VKORC1和CYP2C9基因多态性位点进行定性检测，根据SNP位点进行两管PNA-PCR荧光扩增反应，只需根据两管荧光曲线是否起线就能进行结果判断，不会产生人为误差，假阳性和假阴性率低；本发明试剂盒更容易实现高通量检测，更能满足临床使用。

Description

一种用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术，具体涉及一种用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒及其使用方法。

背景技术

华法林是目前广泛应用的香豆素类口服抗凝药，用于预防和治疗血栓栓塞性疾病的口服抗凝治疗。但是华法林的剂量窗口较窄，不同病人的所需用量可以相差十倍以上。目前研究发现，CYP2C9和维生素K环氧化物还原酶(VKOR)基因多态性对华法林治疗剂量的影响逐渐被认识，其中VKORC1(-1639G/A)，CYP2C9*2(430C/T)和CYP2C9*3(1075A/C)多态性位点与华法林治疗剂量关系最为密切，这些位点多态性都与华法林代谢酶的损伤有关，从而导致个体间和民族间华法林用量的差异。目前，国际华法林实施协会根据VKORC1和CYP2C9基因多态性制定了详细的华法林剂量计算公式，从而可以实现患者个体化给药。

目前，用于基因分型的检测方法分为四类：测序法，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、芯片法、荧光定量PCR法(qPCR)四种方法。

测序法：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后纯化PCR产物，再对其进行测序，根据测序峰图判读基因型。优点：结果准确，测序法是基因多态性位点检测的金标准。但是其成本较高，操作繁琐，试验周期长，限制了其在临床使用。

PCR-RFLP技术：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后对PCR产物进行酶切，电泳检测酶切条带，根据酶切条带进行判读。优点：成本低，结果比较直观；缺点：有的多态性位点所在位置没有合适的限制性酶切位点，需要人工引入突变，另外容易造成产物污染，导致假阳性结果，同时操作繁琐，试验周期长。

芯片法：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后将PCR产物与突变探针、野生探针杂交，通过比较两个探针杂交的信号强度判断样品基因型。缺点：PCR产物需要进行后续分析，操作繁琐；另外结果不好判读，容易出现假阳性。

qPCR法：又分为ARMS-PCR法、HRM法和Taqman探针法。qPCR的优点是操作简单，试验周期短，PCR产物无需进行后续分析即可判断结果，因全过程在封闭的管内进行，减少产物交叉污染。同时该方法操作简单，检测周期短。目前该方法已成为临床常用的检测方法。

ARMS-PCR法又叫等位基因特异PCR，TaqDNA聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，在一定条件下PCR引物3′末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，分别设计突变引物、野生引物，2个引物主要是3′末端碱基不同。由于3′末端不配对的引物产物量减少或不扩增，突变引物和野生引物的Ct值会有显著差异，通过设定区分野生型和突变型的阈值，当突变引物与野生引物Ct值差值(ΔCt)大于阈值时即为突变型。缺点：引物设计困难，对于多态性位点还有大量GC或AT序列时，往往束手无策，同时结果判断较为困难。

HRM法:高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting，HRM)，有染料法和荧光共振能量转移(FRET)双探针法等。染料法对荧光染料、PCR仪器要求较高，临床检测比较少用。FRET(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针比较常用，罗氏专利的FRET探针又称为双杂交探针。在SNP位点设计两条FRET探针，当两条探针和模版互补、且相邻的特异探针组成，上游探针的3′端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5′端标记Red640受体荧光基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Red640受体基团紧密相邻，激发供体产生的荧光能量被Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到Red640发出波长为640的荧光。当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到640波长的荧光。FRET探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线进行SNP检测。优点：一个SNP位点基因型，只需要一管PCR完成检测；缺点：根据HRM溶解曲线Tm值差异不容易判读，不同基因型溶解曲线峰图差异不明显。

MGB-Taqman探针法：Taqman探针是一种经典的定量PCR技术，现阶段得到广泛应用，在PCR反应体系中加入一对引物的和一个特异性荧光探针，探针只与两条引物之间特异性模板结合，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。探针的5′端连接报告荧光，3′端连接淬灭荧光，随后进行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA聚合酶5′到3′端的外切酶活性会将探针序列上5′端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，使得报告荧光发光。针对SNP位点分别设计两个不同荧光标记突变探针、野生探针，根据突变探针、野生探针荧光信号强度进行SNP位点基因型判读。缺点：Taqman探针需要采用MGB-Taqman探针，当SNP位点的上游和下游含有大量GC或AT碱基时，MGB-Taqman探针的设计和合成非常困难，且价格非常昂贵。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒及其使用方法，本发明提供的是一种基于PNA-PCR方法的基因多态性检测试剂盒，该试剂盒成本低廉、操作简单、特异性和敏感性好，能够快速灵敏地检测待测位点基因类型，从而准确对人类VKORC1和CYP2C9基因多态性进行基因分型。

为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

一种用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，包括3对引物、3条探针、6条PNA序列，1对β-Actin内标引物及1条内标探针序列，具体的包括：

用于检测VKORC1基因-1639G位点的引物序列如SEQ NO.1、SEQ NO.2所示，探针序列如SEQ NO.7所示，PNA序列如SEQ NO.10所示；

用于检测VKORC1基因-1639A位点的引物序列如SEQ NO.1、SEQ NO.2所示，探针序列如SEQ NO.7所示，PNA序列如SEQ NO.11所示；

用于检测CYP2C9基因430C位点的引物序列如SEQ NO.3、SEQ NO.4所示，探针序列如SEQ NO.8所示，PNA序列如SEQ NO.12所示；

用于检测CYP2C9基因430T位点的引物序列如SEQ NO.3、SEQ NO.4所示，探针序列如SEQ NO.8所示，PNA序列如SEQ NO.13所示；

用于检测CYP2C9基因1075A位点的引物序列如SEQ NO.5、SEQ NO.6所示，探针序列如SEQ NO.9所示，PNA序列如SEQ NO.14所示；

用于检测CYP2C9基因1075C位点的引物序列如SEQ NO.5、SEQ NO.6所示，探针序列如SEQ NO.9所示，PNA序列如SEQ NO.15所示；

用于β-Actin内标扩增的引物序列如SEQ NO.16、SEQ NO.17所示，内标探针序列如SEQ NO.18所示。

按上述方案，所述的用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒还包括Mg²⁺的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH₂O。

按上述方案，所述的用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒还包括6个不同的阳性对照品和1个阴性对照品，所述阳性对照品为包含有VKORC1基因-1639G、VKORC1基因1639A、CYP2C9基因430C、CYP2C9基因430T、CYP2C9基因1075A或CYP2C9基因1075C的重组质粒和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性对照品为不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。

按上述方案，所述3条探针为Taqman探针，探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为BHQ1。

按上述方案，所述1条内标探针为Taqman探针，探针5’端的荧光基团为ROX，3’端的淬灭基团为BHQ1。

一种用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)提取待测人的基因组DNA作为检测样品；

(2)取1个PCR8联管，在其中A～F 6个管中分别加入检测样品，另取一个PCR8联管，在A～F 6个管中分别加入6个不同的阳性对照品，再取一个PCR8联管，在A～F 6个管中分别加入阴性对照品；

(3)将PCR8联管置于荧光PCR仪器中进行荧光PCR扩增反应，采集FAM和ROX荧光信号；

(4)结果判断：a.当阳性对照均有FAM和ROX荧光信号起线，阴性对照均无FAM和ROX荧光信号起线，检测样品均有ROX荧光信号起线时，判断试验成功；b.根据检测样品A管和B管的FAM荧光信号是否起线判断VKORC1基因-1639的分型，根据检测样品C管和D管的FAM荧光信号是否起线判断CYP2C9基因430的分型，根据检测样品E管和F管的FAM荧光信号是否起线判断CYP2C9基因1075的分型。

按上述方案，所述PCR 8联管中A和B管内含有与检测人类VKORC1基因-1639分型相关的PCR反应液，所述C管和D管内含有与检测人类CYP2C9基因430分型相关的PCR反应液，所述E管和F管中含有与检测人类CYP2C9基因1075分型相关的PCR反应液，所述PCR反应液包含与检测基因位点相对应的引物、探针、PNA序列、内标引物及内部探针、Taq酶、dNTP混合液、Mg²⁺的PCR反应缓冲液和ddH₂O。

按上述方案，所述阳性对照品为包含有VKORC1基因-1639G、VKORC1基因1639A、CYP2C9基因430C、CYP2C9基因430T、CYP2C9基因1075A或CYP2C9基因1075C的重组质粒和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性对照品为不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。

本发明试剂盒是基于PNA-PCR方法的基因多态性检测试剂盒，其技术原理是：肽核酸是(peptide nucleic acids，PNA)一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA与互补DNA具有1个碱基不匹配时，其溶解温度会下降8℃～20℃，2个碱基不匹配时则完全不能杂交，当PNA与互补DNA完全匹配时，因其PNA为肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键，所以能够阻止DNA扩增。本试剂盒利用PNA的这些特性进行人类VKORC1和CYP2C9基因多态性位点分型，此处以VKORC1基因-1639分型为例说明本发明试剂盒的工作原理：首先根据VKORC1基因-1639G设计PNA序列1(序列如SEQ ID NO.10所示)，根据VKORC1基因-1639A设计PNA序列2(序列如SEQ ID NO.11所示)，然后对待测基因同时进行两管PNA-PCR荧光PCR反应(即在进行荧光PCR反应时加入PNA序列)，其中一管PNA-PCR荧光PCR反应中加入PNA序列1，另一管PNA-PCR荧光PCR反应中加入PNA序列2，当PNA与待测基因的DNA序列相匹配时，荧光PCR反应被阻断，荧光PCR反应无起线；当PNA与待测基因的DNA序列不相匹配时，荧光PCR反应顺利进行，荧光PCR反应有起线，因此可以根据两管荧光PCR反应是否起线来判断VKORC1基因-1639的分型，所述分型为纯合野生型(仅一管PCR反应起线)、杂合型(二管PCR反应同时起线)或纯合突变型(仅一管PCR反应起线)。

本发明的有益效果：

(1)利用本发明试剂盒能够对人类VKORC1和CYP2C9基因多态性位点进行定性检测，根据SNP位点进行两孔PNA-PCR荧光扩增反应，只需根据两孔荧光曲线是否起线就能进行结果判断，不会产生人为误差，假阳性和假阴性率低，客服了传统ARMS-PCR方法需要根据Δct值进行结果判断，结果判定困难的缺点；

(2)本发明试剂盒所使用的荧光检测探针为Taqman探针，该探针费用低廉；同时本发明所有的反应全程闭管操作，PCR反应后不需要进行PCR产物纯化、电泳、酶切、杂交等，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率，另外降低了PCR产物污染引起假阳性的风险。

(3)本发明试剂盒中包括内标引物和探针，通过检测内标基因，减少了因样本提取问题导致的假阴性。

(4)本发明中使用的PNA设计简单，不需要进行特殊的修饰就可以满足人类VKORC1和CYP2C9基因多态性检测分析。

(5)本发明试剂盒是采用PNA钳夹荧光定量PCR技术平台，相对于测序法、PCR-RFLP、芯片法更容易实现高通量检测，更能满足临床使用。

附图说明

附图1是VKORC1基因-1639纯合野生型扩增曲线。

附图2是VKORC1基因-1639杂合型扩增曲线。

附图3是VKORC1基因-1639纯合突变型扩增曲线。

附图4是CYP2C9基因430纯合野生型扩增曲线。

附图5是CYP2C9基因430杂合型扩增曲线。

附图6是CYP2C9基因430纯合突变型扩增曲线。

附图7是CYP2C9基因1075纯合野生型扩增曲线。

附图8是CYP2C9基因1075杂合型扩增曲线。

附图9是CYP2C9基因1075纯合突变型扩增曲线。

附图10是内标β-Actin基因扩增曲线。

具体实施方案

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

一种用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，试剂盒中包括以下多态性检测的3对引物，3条探针、6条PNA序列、1对β-Actin内标引物和1条内标探针。

用于VKORC1基因-1639G位点检测的引物、探针和PNA序列：

上游引物：AGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAAC(SEQ ID NO.1)

下游引物：TGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT(SEQ ID NO.2)

PNA序列：ATTGGCCAGGTGC(SEQ ID NO.10)

探针：FAM-CCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGA-BHQ1(SEQ ID NO.7)

用于VKORC1基因-1639A位点检测的引物、探针和PNA序列：

上游引物：AGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAAC(SEQ ID NO.1)

下游引物：TGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT(SEQ ID NO.2)

PNA序列：ATTGGCCGGGTGC(SEQ ID NO.11)

探针：FAM-CCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGA-BHQ1(SEQ ID NO.7)

用于CYP2C9基因430C位点检测的引物、探针和PNA序列：

上游引物：GACGCTGCGGAATTTTGG(SEQ ID NO.3)

下游引物：CTACTCCATATCACTGACCTTAC(SEQ ID NO.4)

PNA序列：AGCATTGAGGACTGTG(SEQ ID NO.12)

探针：FAM-TCCACAAGGCAGCGGGCTTCC-BHQ1(SEQ ID NO.8)

用于CYP2C9基因430T位点检测的引物、探针和PNA序列：

上游引物：GACGCTGCGGAATTTTGG(SEQ ID NO.3)

下游引物：CTACTCCATATCACTGACCTTAC(SEQ ID NO.4)

PNA序列：AGCATTGAGGACCGTG(SEQ ID NO.13)

探针：FAM-TCCACAAGGCAGCGGGCTTCC-BHQ1(SEQ ID NO.8)

用于CYP2C9基因1075A位点检测的引物、探针和PNA序列：

上游引物：TGCAAGACAGGAGCCACATG(SEQ ID NO.5)

下游引物：CATGGAGTTGCAGTGTAGGAGAA(SEQ ID NO.6)

PNA序列：TCCAGAGATACCTTGAC(SEQ ID NO.14)

探针：FAM-CTGCCCCATGCAGTGACCTGTGAC-BHQ1(SEQ ID NO.9)

用于CYP2C9基因1075C检测的引物和PNA序列：

上游引物：TGCAAGACAGGAGCCACATG(SEQ ID NO.5)

下游引物：CATGGAGTTGCAGTGTAGGAGAA(SEQ ID NO.6)

PNA序列：TCCAGAGATACATTGAC(SEQ ID NO.15)

探针：FAM-CTGCCCCATGCAGTGACCTGTGAC-BHQ1(SEQ ID NO.9)

用于β-Actin内标扩增的引物和探针序列：

上游引物：TTTTCGGGCCAGCTTTCAG(SEQ NO.ID 16)

下游引物：TTTCACACGTGCAATCAAAGG(SEQ ID NO.17)

探针序列：AACCTGACTGAGTTAGATATGCGCTTT(SEQ ID NO.18)

所述人类VKORC1和CYP2C9基因多态性检测剂盒还包括含Mg²⁺的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH₂O。

所述人类VKORC1和CYP2C9基因多态性检测剂盒还包括6个阳性对照品和1个阴性对照品，所述阳性对照品为包含有VKORC1基因-1639G、VKORC1基因1639A、CYP2C9基因430C、CYP2C9基因430T、CYP2C9基因1075A或CYP2C9基因1075C的重组质粒和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性对照品为不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。

所述的3条探针为Taqman探针，该探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为BHQ1。

所述的内标探针为Taqman探针，该探针5’端的荧光基团为ROX，3’端的淬灭基团为BHQ1。

实施例1 探针，引物和PNA合成

本发明所述探针、引物和PNA均在上海生工工程股份有限公司合成。

实施例2 试剂盒组成

试剂盒的配置采用PCR8联管形式配置，使用时仅需加入样本/对照品和ddH₂O即可完成实验配置，此种配置更为方便快捷，为优选配置。

本实施例中试剂盒采用PCR8联管形式配置，试剂盒配置及PCR8联管的组成如下表1、表2所示。

表1 试剂盒组成

表2 PCR8联管的组成

上述PCR8联管A和B中含有与检测人类VKORC1基因-1639分型相关的PCR反应液，PCR8联管C和D中含有与检测人类CYP2C9基因430分型相关的PCR反应液，PCR8联管E和F中含有与检测人类CYP2C9基因1075分型相关的PCR反应液，所述PCR反应液包含与检测基因位点相对应的引物、探针、PNA序列、内标引物及内部探针、Taq酶、dNTP混合液、Mg²⁺的PCR反应缓冲液和ddH₂O。

实施例3 使用试剂盒的操作步骤

1.人类外周血总DNA提取，提取试剂盒使用天根生化生物技术公司全血DNA提取试剂盒，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，提取结束后得到人类总DNA模板(即检测样品)；

2.取出试剂盒内的一个PCR8联管，在A～F管中各加入2μL检测样品，另取一个PCR8联管，在A～F各管中加入与之相对应的阳性对照品2μL，再取一个PCR8联管，在A～F管中各加入2μL阴性对照，最后在所有PCR8联管的A～F管中加入ddH₂O补足20μL。

3.将PCR8联管放入荧光PCR仪器中，进行荧光PCR扩增检测；反应条件为：94℃3分钟变性；94℃30秒变性；62℃30秒退火；72℃30分钟延长，循环45次。62℃阶段同时采集FAM和ROX荧光信号。所使用的仪器需要有FAM和ROX双重荧光信号采集通道，包括但不仅限于：罗氏LightCycler480型实时荧光定量PCR仪、ABI 7500实时荧光定量PCR仪、Slan-96P实时荧光定量PCR仪等。

4.结果分析

加入阴性对照品的PCR8联管A～F管中，FAM和ROX信号应无曲线升起，或线型不呈S型且Ct值大于32；若FAM或ROX升起，则考虑阴性对照品被污染。

加入阳性对照品的PCR8联管A～F管中，FAM和ROX信号应都有S型平滑曲线升起，Ct值一般小于32。

加入检测样品的PCR8联管A～F管中，内标ACTB的ROX信号应有曲线升起，且Ct值小于32，否则实验失败，原因为样本DNA提取不合格、实验操作误差。

综上所述，确定试验是否成功可信的判断依据：①阳性对照管的FAM均应该升起；每个检测样品管中内标ACTB基因的ROX信号应该升起，上述两者的Ct值应小于32，且扩增曲线呈S型平滑曲线；②若能满足①的要求，则继续进行分析。

5.各基因位点分型的判断

根据检测样品A管和B管的FAM荧光PCR曲线，判断VKORC1基因-1639的分型，分型的具体依据见下表3。

表3 VKORC1基因-1639的分型依据

PCR反应管扩增曲线结果	A管(VKORC1-1639G)	B管(VKORC1-1639A)
			VKORC1-1639纯合野生型	阳性(起线)	阴性(不起线)
VKORC1-1639杂合型	阳性(起线)	阳性(起线)
			VKORC1-1639纯合突变型	阴性(不起线)	阳性(起线)

附图1是VKORC1基因-1639纯合野生型扩增荧光定量PCR曲线(仅A管起线，即1条PCR荧光曲线)；附图2是VKORC1基因-1639杂合型扩增荧光定量PCR曲线(A管和B管均起线，即2条PCR荧光曲线)；附图3是VKORC1基因-1639纯合突变型扩增荧光定量PCR曲线(仅B管起线，即1条PCR荧光曲线)。

根据检测样品C管和D管的FAM荧光PCR曲线，判断CYP2C9基因430的分型，分型的具体依据见下表4。

表4 CYP2C9基因430的分型依据

PCR反应管扩增曲线结果	C管(CYP2C9430C)	D管(CYP2C9430T)
			CYP2C9430纯合野生型	阳性(起线)	阴性(不起线)
CYP2C9430杂合型	阳性(起线)	阳性(起线)
			CYP2C9430纯合突变型	阴性(不起线)	阳性(起线)

附图4是CYP2C9基因430纯合野生型扩增荧光定量PCR曲线(仅C管起线，即1条PCR荧光曲线)；附图5是CYP2C9基因430杂合型扩增荧光定量PCR曲线(C管和D管均起线，即2条PCR荧光曲线)；附图6是CYP2C9基因430纯合突变型扩增荧光定量PCR曲线(仅D管起线，即1条PCR荧光曲线)。

根据检测样品E管和F管的FAM荧光PCR曲线，判断CYP2C9基因1075的分型，分型的具体依据见下表5。

表5 CYP2C9基因1075的分型依据

PCR反应管扩增曲线结果

E管(CYP2C91075A)

F管(CYP2C91075C)

CYP2C91075纯合野生型	阳性(起线)	阴性(不起线)
			CYP2C91075杂合型	阳性(起线)	阳性(起线)
CYP2C91075纯合突变型	阴性(不起线)	阳性(起线)

附图7是CYP2C9基因1075纯合野生型扩增荧光定量PCR曲线(仅E管起线，即1条PCR荧光曲线)；附图8是CYP2C9基因1075杂合型扩增荧光定量PCR曲线(E管和F管均起线，即2条PCR荧光曲线)；附图9是CYP2C9基因1075纯合突变型扩增荧光定量PCR曲线(仅F管起线，即1条PCR荧光曲线)。

附图10是检测样品A～F管中内标β-Actin基因荧光定量PCR曲线，从图中可以看出，6个检测样品管都有起线，说明检测样品的DNA的提取是合格的。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims

1.一种用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括3对引物、3条探针、6条PNA序列，1对β-Actin内标引物及1条内标探针，所述3对引物的序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.6所示，所述3条探针的序列如SEQ ID NO.7~ SEQ ID NO.9所示，所述6条PNA序列如SEQ ID NO.10~15所示，所述1对β-Actin内标引物的序列如SEQ ID NO.16~ SEQ ID NO.17所示，所述1条内标探针的序列如SEQ ID NO.18所示。

2.根据权利要求1所述的用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，其特征在于，还包括Mg²⁺的PCR 反应缓冲液、dNTP 混合物、Taq 酶和ddH₂O。

3.根据权利要求1所述的用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，其特征在于，还包括6个不同的阳性对照品和1个阴性对照品，所述阳性对照品为包含有VKORC1基因-1639G、VKORC1基因1639A、CYP2C9基因430C、CYP2C9基因430T、CYP2C9基因1075A或CYP2C9基因1075C的重组质粒和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性对照品为不包含内标基因、VKORC1和CYP2C9基因多态性位点的重组质粒。

4.根据权利要求1所述的用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述3条探针为Taqman探针，探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为BHQ1。

5.根据权利要求1所述的用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述1条内标探针为Taqman探针，探针5’端的荧光基团为ROX，3’端的淬灭基团为BHQ1。

6.权利要求1所述的用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取待测人的基因组DNA作为检测样品；

（2）取1个PCR8联管，在其中A~F 6个管中分别加入检测样品，另取一个PCR8联管，在A~F 6个管中分别加入6个不同的阳性对照品，再取一个PCR8联管，在A~F 6个管中分别加入阴性对照品；

（3）将PCR8联管置于荧光PCR仪器中进行荧光PCR扩增反应，采集FAM和ROX荧光信号；

（4）结果判断：a. 当阳性对照品均有FAM和ROX荧光信号起线，阴性对照品均无FAM和ROX荧光信号起线，检测样品均有ROX荧光信号起线时，判断试验成功；b. 根据检测样品A管和B管的FAM荧光信号是否起线判断VKORC1基因-1639的分型，根据检测样品C管和D管的FAM荧光信号是否起线判断CYP2C9基因430的分型，根据检测样品E管和F管的FAM荧光信号是否起线判断CYP2C9基因1075的分型。

7.根据权利要求6所述的用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述PCR 8联管中A管和B管内含有与检测人类VKORC1基因-1639分型相关的PCR反应液，所述C管和D管内含有与检测人类CYP2C9基因430分型相关的PCR反应液，所述E管和F管中含有与检测人类CYP2C9基因1075分型相关的PCR反应液，所述PCR反应液包含与检测基因位点相对应的引物、探针、PNA序列、内标引物及内部探针、Taq酶、dNTP混合液、Mg²⁺的PCR反应缓冲液和ddH₂O。

8.根据权利要求6所述的用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述阳性对照品为包含有VKORC1基因-1639G、VKORC1基因1639A、CYP2C9基因430C、CYP2C9基因430T、CYP2C9基因1075A或CYP2C9基因1075C的重组质粒和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性对照品为不包含内标基因、VKORC1和CYP2C9基因多态性位点的重组质粒。