CN116179658B - 一种荧光引物扩增阻滞突变系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光引物扩增阻滞突变系统及其应用。本发明提供了检测核酸的待测突变位点的成套引物，由通用荧光引物和等位基因特异性荧光引物组成，所述通用荧光引物与待测核酸结合，且所述通用荧光引物的3’末端靠近且不为突变位点，且在所述通用荧光引物上距离3’端最近的一个胸腺嘧啶进行淬灭基团修饰或荧光基团修饰；所述等位基因特异性荧光引物为1条或多条，每条对应待测突变位点的1种多态性；本发明的实验证明，本发明具有敏感性高、特异性强、简单快捷的特点，特别适用于极短片段核酸检测，不依赖于Taq酶外切活性。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种荧光引物扩增阻滞突变系统及其应用。
背景技术
目前在传染病等的分子诊断和个体化伴随诊断等疾病诊断应用中一般采用荧光探针PCR法进行检测。目前的荧光探针PCR技术主要是基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)的原理，当能量供体(donor)与能量受体(acceptor)在空间上相互接近到一定距离(1～10nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。
目前所用的荧光探针主要有两种：一种是TaqMan探针，一种是分子信标探针。TaqMan探针是一个与模板特异性结合的双标记荧光探针，在PCR进行时，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’-3’外切酶活性会切割探针，释放的5’端报告基团游离于反应体系中，发出的荧光信号可以被仪器检测，积累荧光，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成同步。该技术目前应用较为广泛，包括人或动物病原体检测、生物制品鉴定等领域。分子信标(molecular beacon，MB)探针由两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团的单链DNA分子组成，分子信标的环部分和靶核酸互补，而探针的两头由于互补而成为茎。当分子信标为茎环结构时，淬灭基团和荧光基团距离很近，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收，从而抑制报告基团产生荧光。在PCR变性阶段，该探针的茎部打开形成一条单链，当溶液中存在特异性模板时，在复性阶段该探针即可与模板杂交，使得5’端荧光基团和3’端淬灭基团分离，荧光信号得以释放。该方法可以用于基因定量分析、疾病基因检测和诊断等。
但上述探针仍存在很多缺陷，如TaqMan探针淬灭难以彻底，本底较高；探针的水解依赖于Taq的酶外切活性，故定量时受酶性能和试剂质量影响；检测点突变能力相对不足。MB探针结构较为复杂，受影响因素较多，不易设计，靶序列与探针存在错配时，两者杂交效率很低等。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的至少一个问题，提供一种新的荧光引物扩增阻滞突变系统、使用方法及其在基因荧光定性、定量分析，医学诊断，尤其是基因突变或多态性等生命科学研究等领域的应用。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了检测核酸的待测突变位点的成套引物，由通用荧光引物和等位基因特异性荧光引物组成，
所述通用荧光引物与待测核酸结合，且所述通用荧光引物的3’末端靠近且不为突变位点，且在所述通用荧光引物上距离3’端最近的一个胸腺嘧啶进行淬灭基团修饰或荧光基团修饰；
所述等位基因特异性荧光引物为1条或多条，每条对应待测突变位点的1种多态性；
每条等位基因特异性荧光引物与所述核酸结合，且其3’末端碱基落在所述待测突变位点上，且在距离3’端的第3或4位点引入特定的错配，且在所述等位基因特异性荧光引物上距离3’端最近的一个胸腺嘧啶进行对应的荧光或淬灭基团修饰；
所述通用荧光引物和所述等位基因特异性荧光引物上的用于荧光基团修饰或淬灭基团修饰的碱基均不为3’端第1个碱基。
上文中的所述成套引物中，所述通用荧光引物和所述等位基因特异性荧光引物大小均为15～30个寡核苷酸，Tm在50～60℃，两条荧光引物的Tm之间的差异最好控制3℃以内。
上文中的所述成套引物中，在可选实施方式中，所述通用荧光引物上进行淬灭基团修饰或荧光基团修饰的最近的一个胸腺嘧啶距离3’末端碱基的距离为2～7bp；
在可选实施方式中，所述等位基因特异性荧光引物上的进行淬灭基团修饰或荧光基团修饰的最近的一个胸腺嘧啶距离3’末端碱基的距离为2～7bp。
上文中的所述成套引物中，在可选实施方式中，若在所述通用荧光引物上距离3’端碱基2～7bp区域无胸腺嘧啶，则在距离3’端的第7个位点处引入胸腺嘧啶错配，用于标记相应的淬灭或荧光基团。
上文中的所述成套引物中，在可选实施方式中，若在所述等位基因特异性荧光引物上距离3’末端碱基倒数第2位碱基不是胸腺嘧啶，则在距离3’端的第3或4位点引入的错配碱基为胸腺嘧啶，并对该胸腺嘧啶进行对应的荧光或淬灭基团修饰。
上文中的所述成套引物中，在可选实施方式中，所述通用荧光引物上3’末端碱基距离所述突变位点的距离为1～7bp。
上文中的所述成套引物中，在可选实施方式中，荧光基团可以是FAM、HEX、TET、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE、SIMA、Alexa Fluor 488、TexasRed或Quasar 670中的一种或多种；
或，在可选实施方式中，所述淬灭基团为TAMRA、Dabcyl、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB或Eclipse中的一种或多种。
第二方面，本发明提供了含有第一个方面所述的成套引物的PCR试剂或试剂盒；
所述PCR试剂根据待测突变位点的多态性种类分为不同的PCR试剂组，每组PCR试剂中包括第一个方面所述的成套引物中的通用荧光引物和1种待测突变位点的多态性对应的等位基因特异性荧光引物。
上文所述的PCR试剂中，每组PCR试剂中，所述荧光基团标记的荧光引物和所述淬灭基团标记的荧光引物的摩尔比为1：1～5；
进一步地，所述荧光基团标记的荧光引物和所述淬灭基团标记的荧光引物的摩尔比为1：2。
第三方面，本发明提供了第一个方面所述的成套引物在制备核酸检测产品中的应用；
或本发明提供了第一个方面所述的成套引物或第二方面所述PCR试剂或试剂盒在核酸检测中的应用；
或，本发明提供了第一个方面所述的成套引物或第二方面所述PCR试剂或试剂盒在以核酸为基础的诊断或检测中的应用；
或，本发明提供了一种检测核酸待测突变位点的方法，包括如下步骤：
1)根据核酸的待测突变位点设置第一个方面所述的成套引物，得到通用荧光引物，和待测突变位点的不同多态性对应的等位基因特异性荧光引物；
2)以待测核酸为模板，分别用含有待测突变位点的不同多态性对应的等位基因特异性荧光引物和所述通用荧光引物进行PCR扩增，
3)检测扩增产物，实现对待测核酸中突变位点多态性的检测。
上文应用中，所述核酸检测为检测基因突变或多态性；
所述核酸检测包括实时荧光PCR、基因芯片以及膜杂交中的一种或多种；
或，所述以核酸为基础的诊断与检测包括临床疾病医学诊断、病原体检测、基因突变、基因分型或生命科学实验研究；
上文所述方法中，所述PCR扩增的退火温度为52～58℃。
上文待测核酸可为极短片段核酸检测，特别适用于复杂、微量或降解等特殊样本检材。
本发明提供的荧光引物扩增阻滞突变系统，其结构原理图如图1所示，由上下游荧光引物组成，若用于基因突变或多态性检测，则需要一条与荧光引物配对进行PCR扩增的下游或上游等位基因特异性荧光引物，其均独立地由15～30个寡核苷酸组成。对于基因突变或多态性检测，荧光引物3’端靠近突变位点，在其距离3’端最近(第2～7位点)的一个胸腺嘧啶进行淬灭或荧光基团修饰。等位基因特异性荧光引物3’端碱基必须落在突变的位置上，在距离3’端的第3或4位点引入特定的错配，在其距离3’端最近(第2～7位点)的一个胸腺嘧啶进行对应的荧光或淬灭基团修饰。上下游荧光引物修饰碱基均不能为3’端第1个位点。
本发明的实验证明，本发明具有敏感性高、特异性强、简单快捷的特点，特别适用于极短片段核酸检测，不依赖于Taq的酶外切活性。
附图说明
图1为本发明的荧光引物扩增阻滞突变系统PCR法原理图。
图2为检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)E484A突变的突变型和野生型扩增曲线及熔解曲线结果。
图3为人MTHFR(C677T)基因多态性三种基因型扩增曲线及熔解曲线。
图4为检测MTHFR(C677T)基因多态性灵敏度结果。
图5为rs139530962三种基因型扩增曲线及熔解曲线结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。此外，术语“第一”和“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
实施例1、FP ARMS-PCR法的引物设计及方法的建立
一、FP ARMS-PCR法的引物设计
FP ARMS-PCR法(荧光引物扩增阻滞突变系统-PCR法)的引物由通用荧光引物和等位基因特异性荧光引物组成，
通用荧光引物大小为15～30个寡核苷酸，且与靶序列结合，且通用荧光引物的3’末端靠近且不为待检测突变位点(与待检测突变位点距离为1～7bp)，且通用荧光引物上距离3’端最近的一个胸腺嘧啶进行淬灭或荧光基团修饰；
上述通用荧光引物上距离3’端最近的一个胸腺嘧啶位于距离3’端碱基第2～7位点的区域内；若在距离3’端的第2～7位点区域内无胸腺嘧啶，可在距离3’端的第7位点引入胸腺嘧啶错配，用于标记相应的荧光或淬灭基团。
上述等位基因特异性荧光引物可以为1条或多条，每条等位基因特异性荧光引物对应待检测突变位点的1种多态性，每条等位基因特异性荧光引物标记不同荧光或淬灭基团修饰。
上述等位基因特异性荧光引物大小均为15～30个寡核苷酸，且每条等位基因特异性荧光引物与靶序列结合，且其3’末端落在待检测突变位点的位置上，且在每条等位基因特异性荧光引物中距离3’端的第3或4位点引入特定的错配(A、T、C、G任一种)，且在每条等位基因特异性荧光引物中距离3’端最近的一个胸腺嘧啶进行对应的荧光或淬灭基团修饰。
上述等位基因特异性荧光引物3’末端落在待检测突变位点的位置上具体如下：
若待检测突变位点为点突变，则等位基因特异性荧光引物包括等位基因特异性野生型荧光引物和等位基因特异性突变型荧光引物，所述等位基因特异性突变型荧光引物的3’末端落在待检测突变位点上(与待检测突变位点的突变碱基相同)，所述等位基因特异性野生型荧光引物的3’末端落在待检测突变位点对应的野生型位点上(与待检测突变位点对应的野生型位点的碱基相同)；
若待检测突变位点为插入/缺失突变，则等位基因特异性荧光引物包括等位基因特异性插入型荧光引物和等位基因特异性缺失型荧光引物，所述等位基因特异性插入型荧光引物的3’末端落在插入突变所插入片段中的任一碱基(与所插入片段中的任一碱基相同)；所述检测等位基因特异性缺失型荧光引物的3’末端落在越过缺失突变所缺失片段的第一个碱基的位置(与越过缺失突变所缺失片段的第一个碱基相同)。
上述等位基因特异性荧光引物上距离3’端最近的一个胸腺嘧啶位于距离3’端碱基2～7个碱基区域内；若上述等位基因特异性荧光引物上距离3’端碱基倒数第2位不是胸腺嘧啶，则在距离3’端的第3或4位点引入的错配碱基为胸腺嘧啶，并对该胸腺嘧啶进行对应的荧光或淬灭基团修饰。
上述通用荧光引物和上述等位基因特异性荧光引物上的修饰碱基均不能为3’端第1个位点。
二、FP ARMS-PCR法
1、检测原理
如图1所示，通用荧光引物3’端靠近突变位点(相距1～7bp)，在其距离3’端最近(第2～7位点)的一个胸腺嘧啶进行淬灭或荧光基团修饰。等位基因特异性荧光引物3’端碱基必须落在突变的位点上，在距离3’端的第3或4位点引入特定的错配，在其距离3’端最近(第2～7位点)的一个胸腺嘧啶进行对应的荧光或淬灭基团修饰。
当体系中含有目的基因时，通用荧光引物和等位基因特异性荧光引物作为上下游荧光引物与其互补结合，在聚合酶的作用下进行延伸，生产新的互补双链核酸，由于双链上的淬灭和荧光基团极为靠近，荧光信号被淬灭，信号强度显著降低。通过记录信号变化而获得扩增曲线。另外，通过熔解曲线分析，可以判断扩增产物的特异性。
2、检测方法
若待测样本为RNA，则反应体系为TAKARA公司的One Step PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒(货号：RR064A)，包括：2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μL，TaKaRa Ex Taq HS0.5μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μL，通用荧光引物浓度为0.2μmol/L(BHQ1)，等位基因特异性荧光引物为0.1μmol/L，制备的野生型或突变型RNA作为模板2μL，无DNA/RNA酶水补充至25μL。不同的等位基因特异性荧光引物在不同反应体系中。
在CFX96荧光定量PCR仪上运行，扩增程序：42℃20min，95℃2min，95℃10s，52℃30s，40个循环，退火时采集FAM、HEX通道荧光信号。在熔解曲线分析时，起始45℃，每秒上升0.5℃，升至90℃，每0.05℃收集一次FAM、HEX通道荧光信号。
若待测样本为DNA，则反应体系(购自广东菲鹏生物有限公司的AK Taq MasterPCR Mix试剂盒(货号：MD099M))包括：5×AK Taq buffer(with Mg2+)5μL，AK Taq MasterPCR Mix(25×)1μL，通用荧光引物(BHQ1)为0.2μmol/L、等位基因特异性荧光引物均为0.1μmol/L，以及经核酸提取试剂盒提取的DNA模板2μL，补ddH2O至总反应体积25μL；不同的等位基因特异性荧光引物在不同反应体系中。
反应条件：50℃，2min；95℃，3min；95℃，30s，52℃，30s，共40或45个循环，退火时采集FAM、HEX通道荧光信号。在熔解曲线分析时，起始45℃，每秒上升0.5℃，升至90℃，每0.05℃收集一次FAM、HEX通道荧光信号。
若某条等位基因特异性突变型荧光引物的扩增产物具有其对应荧光基团的荧光信号(如FAM或HEX)，则待测样本中的待测突变位点为该等位基因特异性突变型荧光引物对应的多态性。
实施例2、FP ARMS-PCR法检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)E484A突变
一、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)E484A突变的引物的设计
根据实施例1中荧光引物设计原理，依照待测靶分子SARS-CoV-2RNA序列，设计合成用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)E484A突变的通用荧光引物484FQ(BHQ1)，等位基因特异性荧光引物484Afam(FAM)，等位基因特异性荧光引物484Ehex(HEX)，并委托通用生物系统(安微)有限公司合成并纯化，序列见表1。
表1
注：下横线加粗T表示荧光/淬灭修饰的胸腺嘧啶碱基的位置，斜体碱基为特定错配。
二、一步法RT-PCR反应
反应体系购自TAKARA公司的One Step PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒(货号：RR064A)包括：2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μL，通用荧光引物484FQ浓度为0.2μmol/L，等位基因特异性荧光引物484Afam或等位基因特异性荧光引物荧光引物484Ehex均为0.1μmol/L，制备的野生型SARS-CoV-2的RNA(Genbank：MN908947，引物为484Ehex)或新型冠状病毒(SARS-CoV-2)E484A的RNA(Genbank：OM858820，引物为484Afam)作为模板2μL，无DNA/RNA酶水补充至25μL。
在CFX96荧光定量PCR仪上运行，扩增程序：42℃20min，95℃2min，95℃10s，52℃30s，40个循环，退火时采集FAM、HEX通道荧光信号。在熔解曲线分析时，起始45℃，每秒上升0.5℃，升至90℃，每0.05℃收集一次FAM、HEX通道荧光信号。
突变型和野生型扩增曲线及熔解曲线见图2，左边上下图分别为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)E484A突变型样本的扩增曲线及熔解曲线，右边上下图分别为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)野生型样本的扩增曲线及熔解曲线，可以看出，两个待测样本的扩增曲线特异性强，无非特异曲线产生，熔解曲线为单峰，表明该方法具有良好的特异性。
实施例3、检测人MTHFR(C677T)基因多态性
样本收集与DNA提取：在知情同意基础上，收集242名志愿者的血液。所有样本均使用杭州博日科技有限公司的全血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA作为模板。且用武汉友芝友医疗科技股份有限公司的人类MTHFR基因检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(产品批号：22040803)鉴定242名待测样本的MTHFR(C677T)基因型为CC基因型、TT基因型和CT基因型。
试剂与仪器：5×AK Taq buffer(with Mg2+)和AK Taq Master PCR Mix(25×)购自广东菲鹏生物有限公司，使用伯乐荧光定量PCR仪CFX96进行检测分析。
一、检测人MTHFR(C677T)基因多态性荧光引物设计
根据荧光引物设计原理，依照待测靶分子人MTHFR(C677T)(rs1801133)DNA序列，设计合成通用荧光引物677FQ，等位基因特异性荧光引物677C(记作荧光引物677RCFAM)，等位基因特异性荧光引物677T(记作荧光引物677RTHEX)，并委托通用生物系统(安微)有限公司合成并纯化，序列见表2。
表2
注：下横线加粗T表示荧光标记的胸腺嘧啶碱基的位置，斜体碱基为特定错配。
二、FP ARMS-PCR法检测人MTHFR(C677T)基因多态性
(1)配制PCR反应体系，反应体系购自广东菲鹏生物有限公司的AK Taq MasterPCR Mix试剂盒(货号：MD099M)，包括：5×AK Taq buffer(with Mg2+)5μL，AK Taq MasterPCR Mix(25×)1μL，上、下游荧光引物分别为0.2μmol/L、0.1μmol/L，已经鉴定为MTHFR(C677T)基因型为CC的待测样本DNA(引物为677FQ/677RCFAM)、已经鉴定为MTHFR(C677T)基因型为TT的待测样本DNA(引物为677FQ/677RTHEX)或已经鉴定为MTHFR(C677T)基因型为CT的待测样本(引物分别为677FQ/677RCFAM和677FQ/677RTHEX)作为模板2μL，补ddH2O至总反应体积25μL；
(2)反应条件：50℃，2min；95℃，3min；95℃，30s，52℃，30s，共40或45个循环，退火时采集FAM、HEX通道荧光信号。在熔解曲线分析时，起始45℃，每秒上升0.5℃，升至90℃，每0.05℃收集一次FAM、HEX通道荧光信号。
三种基因型分别取1例样本的扩增曲线及熔解曲线结果举例见图3，左边上下图分别为已经鉴定为MTHFR(C677T)基因型为CC的待测样本的扩增曲线及熔解曲线，中间上下图分别为已经鉴定为MTHFR(C677T)基因型为TT的待测样本的扩增曲线及熔解曲线，右边上下图分别为已经鉴定为MTHFR(C677T)基因型为CT的待测样本的扩增曲线及熔解曲线，可以看出，扩增曲线特异性强，无非特异曲线产生，熔解曲线为单峰，表明该方法具有良好的特异性。
三、FP ARMS-PCR法检测MTHFR(C677T)基因多态性灵敏度分析
将已经鉴定为MTHFR(C677T)基因型为CC的待测样本(图中记作677C)和已经鉴定为MTHFR(C677T)基因型为TT的待测样本(图中记作677T)提取的人DNA(20ng/μl)分别稀释浓度至50pg/μl、20pg/μl，分别对这2个浓度的DNA进行重复检测20次，方法与上述二相同，计算其检出率。
结果如图4所示，对于50pg/μl、20pg/μl DNA，677C的检出率分别为100％、55％，677T的检出率分别为100％、65％，表明本发明检测MTHFR(C677T)基因多态性具有较高的灵敏性。
四、与上市MTHFR(C677T)基因多态性检测试剂盒对照分析
使用武汉友芝友医疗科技股份有限公司的人类MTHFR基因检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(产品批号：22040803)对上述242例样本进行检测，并与本发明二的检测结果进行一致性分析，分析结果见表3，可以看出，本发明可准确检测MTHFR(C677T)基因多态性。
表3
实施例4、检测人InDel(rs139530962)基因多态性
一、检测人InDel(rs139530962)基因多态性荧光引物设计
根据荧光引物设计原理，依照待测靶分子人InDel(rs139530962)DNA序列，设计合成通用荧光引物962FQ，等位基因特异性插入型(Ins型)荧光引物962RFAM，等位基因特异性缺失型(Del)荧光引物962RHEX，并委托通用生物系统(安微)有限公司合成并纯化，序列见表4。
表4
注：下横线加粗T表示荧光标记的胸腺嘧啶碱基的位置，斜体碱基为特定错配。
二、检测
以已经确定的人InDel(rs139530962)为Ins型的待测样本(2条染色体上均为人InDel(rs139530962)Ins型，引物为962FQ/962RFAM)、已经确定的人InDel(rs139530962)为Del型的待测样本(2条染色体上均为人InDel(rs139530962)Del型，引物为962FQ/962RHEX)和已经确定的人InDel(rs139530962)为杂合型的待测样本(1条染色体上为人InDel(rs139530962)Del型，且另一条染色体上为人InDel(rs139530962)Ins型，引物分别为962FQ/962RFAM和962FQ/962RHEX)的DNA为模板，按照实施例3方法检测人待测血液样本DNA的rs139530962三种基因型。
扩增曲线及熔解曲线如图5所示，可以看出，扩增曲线特异性强，无非特异曲线产生，熔解曲线为单峰，表明该方法具有良好的特异性。
Claims (7)
1.检测人MTHFR基因C677T基因突变的成套引物，由通用荧光引物和等位基因特异性荧光引物组成，
所述等位基因特异性荧光引物为2条，每条对应待测突变位点的1种多态性；
所述通用荧光引物的核苷酸序列为序列表中序列4，且序列4自3’末端起第3位T标记淬灭基团；
1条所述等位基因特异性荧光引物的核苷酸序列为序列表中序列5，且序列5自3’末端起第3位T标记荧光基团；
另1条所述等位基因特异性荧光引物的核苷酸序列为序列表中序列6，且序列6自3’末端起第3位T标记荧光基团。
2.含有权利要求1所述的成套引物的PCR试剂或试剂盒；
所述PCR试剂根据待测突变位点的多态性种类分为不同的PCR试剂组，每组PCR试剂中包括权利要求1所述的成套引物中的通用荧光引物和1种待测突变位点的多态性对应的等位基因特异性荧光引物。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂，其特征在于：
每组PCR试剂中，所述通用荧光引物和所述等位基因特异性荧光引物的摩尔比为1：1-5。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于：所述通用荧光引物和所述等位基因特异性荧光引物的摩尔比为1：2。
5.权利要求1所述的成套引物在制备人MTHFR基因C677T基因突变检测产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述应用中，所述检测包括实时荧光PCR。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述应用中，所述实时荧光PCR的扩增的退火温度为52-58 ℃。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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