CN111020026A - 特异性引物探针组合及其适于血液直接扩增结合荧光pcr法检测叶酸代谢能力基因的应用 - Google Patents

特异性引物探针组合及其适于血液直接扩增结合荧光pcr法检测叶酸代谢能力基因的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种特异性引物探针组合及其适于血液直接扩增结合荧光PCR法检测叶酸代谢能力基因的应用。针对MTHFR基因C677T位点，该特异性引物探针组合包括：目的基因ARMS引物、通用引物及荧光探针；具体有：C基因型特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATC；T基因型特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATT；通用引物：GGGACGATGGGGCAAGTG；荧光探针：5'‑HEX‑TTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGC‑BHQ1‑3'；对于抗凝全血样本，通过在反应体系中加入核酸释放剂、扩增酶、以及所述特异性引物探针组合进行荧光PCR程序即可得出相应基因型。

Description

特异性引物探针组合及其适于血液直接扩增结合荧光PCR法 检测叶酸代谢能力基因的应用
技术领域
本申请属于基因诊断领域，涉及一种针对叶酸代谢能力基因分型(MTHFR基因C677T位点多态性)的检测方法。
背景技术
亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydmfolatereductase,MTHFR)是人体叶酸代谢的关键酶，其中C677T位点突变是MTHFR基因最常见的多态性，该突变会导致酶活性差异，影响机体叶酸代谢。研究表明，C677T多态性与高同型半胱氨酸所致的心脑血管疾病、妊娠期妇女习惯性流产、胎儿出生缺陷如神经管缺陷、先天性心脏病等明显相关。我国《高血压合理用药指南》(第二版)和《围受孕期增补叶酸预防神经管缺陷指南(2017)》均明确指出应基于MTHFR基因C677T检测结果进行个体化干预，合理补充叶酸，防止高血压并发症和出生缺陷。
而针对MTHFR基因C677T位点多态性的检测，目前市场上采用最多的方法大多是在抗凝全血的基础上提取、纯化出核酸物质(DNA)，运用Sanger测序、荧光法或TaqMan探针实时PCR等方法进行基因分型，通过检测基因型对相应的疾病进行用药指导和早期预防。但以上方法都存在自身的局限性，DNA提取是必不可少的环节，但是基于DNA的PCR方法实验流程耗时较长，易造成污染，在增加了实验步骤的基础上还增加了成本。另外，Sanger测序虽然是基因检测金标准，但成本高昂，通量不足，不适于临床大规模分析。
发明内容
本申请的目的是针对MTHFR基因C677T位点多态性，解决现有检测方法需要进行血液DNA提取环节、流程耗时较长、易造成污染且成本较高等问题。
本申请的设计思路是：血液直接扩增结合荧光PCR方法，其核心是利用核酸释放剂让DNA从抗凝全血的有核细胞中释放出来，在一个反应体系中加入核酸释放剂MIX，扩增酶、并设计特定的ARMS引物、修饰探针；选择合适的扩增程序，采集荧光信号，根据荧光信号图得出相应基因型。
本申请的具体解决方案如下：
第一方面，一种适用于血液直接扩增结合荧光PCR方法的特异性引物探针组合，其针对叶酸代谢能力基因，具体是MTHFR基因C677T位点；该特异性引物探针组合包括：目的基因ARMS引物、通用引物及荧光探针；所述目的基因ARMS引物分为C基因型特异性引物和T基因型特异性引物；
C基因型特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATC；
T基因型特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATT；
通用引物：GGGACGATGGGGCAAGTG；
荧光探针：5'-HEX-TTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGC-BHQ1-3'；
其中，HEX为荧光修饰基团，BHQ1为荧光淬灭基团；
所述血液直接扩增结合荧光PCR方法是针对抗凝全血样本，在反应体系中加入核酸释放剂、扩增酶、以及所述特异性引物探针组合进行荧光PCR程序得出相应基因型。
第二方面，上述的特异性引物探针组合在制备针对MTHFR基因C677T位点多态性检测的试剂盒方面的用途。
第三方面，一种针对MTHFR基因C677T位点多态性检测的试剂盒，包括：上述的特异性引物探针组合、内参基因的引物探针组合、核酸释放剂、扩增酶和超纯水，所述内参基因的引物探针组合中的荧光探针与所述特异性引物探针组合中的荧光探针采用不同的荧光修饰基团(FAM修饰)。
进一步优选的，所述内参基因的引物探针组合的序列信息如下：
上游引物：CAGCAGATGTGGATCAGCAAG
下游引物：GCATTTGCGGTGGACGAT
荧光探针：5'-FAM–AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ1--3'。
第四方面，一种针对MTHFR基因C677T位点多态性的血液直接扩增结合荧光PCR检测方法，用于非疾病诊断目的，包括以下步骤：
(1)获取待测抗凝全血样本，并用超纯水稀释；
(2)配置两组PCR反应体系，其中：第一组PCR反应体系包括：
677C特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATC；
677通用引物：GGGACGATGGGGCAAGTG；
677荧光探针：5'-HEX-TTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGC-BHQ1-3'；
ACTB上游引物：CAGCAGATGTGGATCAGCAAG；
ACTB下游引物：GCATTTGCGGTGGACGAT；
ACTB荧光探针：5'-FAM–AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ1--3'；
以及核酸释放剂、扩增酶和超纯水；
第二组PCR反应体系与第一组PCR反应体系的区别仅在于将677C特异性引物替换为：
677T特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATT，其他均相同；
两组PCR反应体系分别充分混匀；
(3)在两组PCR反应体系中分别加入步骤(1)得到的抗凝全血样本，运行实时荧光PCR扩增程序；
(4)根据两组PCR反应体系的扩增情况判断样本基因型；判读标准如下：
a)若该样本在第一组PCR反应体系和第二组PCR反应体系中的FAM通道、HEX通道均表现出正常扩增，且两个反应Ct的值差的绝对值<3，则该样本为基因型为CT杂合型；
b)若该样本在第二组PCR反应体系中的FAM通道呈现正常扩增，而在第一组PCR反应体系中的HEX通道呈现正常扩增,则表明该样本基因型为CC纯合型；
c)若该样本在第一组PCR反应体系中的FAM通道呈现正常扩增，而在第二组PCR反应体系中的HEX通道呈现正常扩增,则表明该样本基因型为TT纯合型。
进一步优选地，步骤(3)运行实时荧光PCR扩增程序，具体如下：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，共40个循环；72℃延伸1分钟；仪器降温到4℃。
第五方面，上述的特异性引物探针组合在构建针对MTHFR基因C677T位点多态性检测的智能检测设备方面的用途，所述智能检测设备支持上述的血液直接扩增结合荧光PCR检测方法的执行(例如配置控制算法、输入输出参数等)。
该检测MTHFR的C677T基因型的新方法，具有快速简便，经济和高通量的优点。相对与传统方法，此方法少了血液DNA的提取环节，从时间和成本上都有了显著的改善。
本发明的血液直接扩增结合荧光PCR方法，样本量需求少(仅仅需要10ul血液)，节省了核酸物质的提取和纯化步骤，简便、快捷、准确、节省成本。
目前POCT市场在全球范围内稳定发展，该方法具有转化的优势，可以通过指尖采血，仅用一滴血液就可实现准确的检测，临床应用时即减少了患者因静脉采血造成的恐慌，也降低了医疗器械资源的浪费。
附图说明
图1为现有的Sanger法的流程简图。
图2为现有的基于DNA的荧光探针法的流程简图。
图3为本发明的血液直扩PCR法的流程简图。
图4为本发明一个实施例的杂合CT基因型实验结果图。
图5为本发明一个实施例的纯合CC基因型实验结果图。
图6为本发明一个实施例的纯合TT基因型实验结果图。
图7为采用本发明的血液直扩荧光PCR法完成30例样本整体实验结果图。
具体实施方式
以下通过一个实施例结合附图，详细介绍本发明及其与现有技术的实施效果对比。
本发明的一个实施例：
一、前期准备：
引物设计：根据MTHFR基因C677T位点附近的核酸序列信息，设计ARMS引物及检测探针，同时设计内参基因引物及探针，引物委托上海生工生物合成。
位点序列信息：
>gnl|dbSNP|rs1801133|allelePos＝501|totalLen＝1001|taxid＝9606|snpclass＝1|alleles＝'C/T'|mol＝Genomic|build＝151
CAGGCTGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTGCAAGATCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTCTCTCTGCCCAGTCCCTGTGGTCTCTTCATCCCTCGCCTTGAACAGGTGGAGGCCAGCCTCTCCTGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAG
Y
CGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCATCACTTGCCCCATCGTCCCCGGGATCTTTCCCATCCAGGTGAGGGGCCCAGGAGAGCCCATAAGCTCCCTCCACCCCACTCTCACCGCACCGTCCTCGCACAG
目的基因ARMS引物序列信息：
C基因型特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATC
T基因型特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATT
通用引物：GGGACGATGGGGCAAGTG
荧光探针：TTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGC 5'HEX 3'BHQ1
内参基因引物序列信息：
上游引物：CAGCAGATGTGGATCAGCAAG
下游引物：GCATTTGCGGTGGACGAT
荧光探针：AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC 5'FAM 3'BHQ1
样本准备：选取EDTA抗凝全血，需要在使用前混匀，让其中的白细胞均匀分布。
试剂准备：
引物(生工生物合成)
核酸释放剂MIX2×Superstart Direct Premix(Probe qPCR)(宝锐生物)
扩增酶FastStart Essential DNA Probes Master(Roche)
超纯水。
二、血液直扩PCR法实验流程(如图3所示)：
1、按4倍比例用超纯水稀释抗凝全血。
2、配制PCR反应MIX(两孔/样本)，在PCR反应管中分别加入核酸释放剂MIX、引物、探针和水，充分混匀，MIX体系如表1(以单管总体积20ul计)。
表1血液直扩PCR反应体系
引物 反应体系1/ul 反应体系2/ul
核酸释放剂MIX 8 8
FastStart Essential DNA Probes Master(Roche) 2 2
677C特异性引物(5um) 1 /
677T特异性引物(5um) / 1
677通用引物 1 1
677荧光探针(5um) 0.5 0.5
ACTB上游引物(5um) 1 1
ACTB下游引物(5um) 1 1
ACTB荧光探针(5um) 0.5 0.5
超纯水 4 4
稀释的抗凝全血 1 1
在对应两MIX管中分别加入1ul稀释好的全血样本，在ABI Viia7运行程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒(收集信号)，40个循环；72℃延伸1分钟；仪器降温到4℃(约1.5小时)。
3、结果分析：
结果判读标准：
a)若该样本在反应体系1和反应体系2中的FAM通道、HEX通道均表现出正常扩增，且两个反应Ct的值差的绝对值<3，则该样本为基因型为CT杂合型；
b)若该样本在反应体系2中的FAM通道呈现正常扩增，而在反应体系1中的HEX通道呈现正常扩增,则表明该样本基因型为CC纯合型；
c)若该样本在反应体系1中的FAM通道呈现正常扩增，而在反应体系2中的HEX通道呈现正常扩增,则表明该样本基因型为TT纯合型；
根据标准对结果进行判读，给出最终的基因型，如图4、图5、图6所示。
该检测方法整体实验约耗时2～3h。
以下简要介绍Sanger法和基于DNA的荧光探针的实时PCR法。
Sanger测序(如图1所示)：
1、准备EDTA抗凝全血(至少500ul)。
2、从抗凝血中提取全基因组DNA(普通试剂盒提取约需要2小时)。
3、DNA质检，合格后继续后续实验步骤。
4、配制PCR反应MIX在PCR反应管中按反应体系分别加入PCR酶MIX、引物和水，充分混匀，在对应MIX管加入1ul的DNA样本，在ABI Veriti 96孔PCR仪运行程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒(收集信号)，40个循环；72℃延伸1分钟；仪器降温到4℃(约2.5小时)。
5、进行上一步PCR产物的纯化，测序(3500仪器整个流程约需要5h)。
6、结果分析：根据结果判读标准，对结果进行判读，给出最终的基因型。
该检测方法整体实验约耗时9～10小时。
基于DNA的荧光探针的实时PCR法(如图2所示)：
1、准备EDTA抗凝全血(至少500ul)。
2、从抗凝血中提取全基因组DNA(普通试剂盒提取约需要2小时)。
3、DNA质检，合格后继续后续实验步骤。
4、配制PCR反应MIX在PCR反应管中分别加入荧光PCR酶MIX、引物、探针和水，充分混匀，在对应MIX管加入1ul的DNA样本，在ABI Viia7运行程序：95℃预变性5分钟；变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒(收集信号)，40个循环；72℃延伸1分钟；仪器降温到4℃(约2.5小时)
5、结果分析：根据结果判读标准，对结果进行判读，给出最终的基因型。
该检测方法整体实验约耗时5～6小时。
经多例样本实验，本实施例的血液直扩荧光PCR法与另两种检测方法检测结果比对，优势显著：
准确：血液直扩荧光PCR法完成与荧光PCR法的100例样本、Sanger测序的30例样本的比对，结果完全一致。图7为采用血液直扩荧光PCR法完成30例样本整体实验结果图。
省时：三者对比在时间上，血液直扩荧光PCR法完成单样本的时间约3小时，相比荧光法的5h，Sanger测序的9h更短，效率得到大大提高。
降低成本：成本上，相比荧光PCR法，血液直扩荧光PCR法省去了提取DNA步骤，至少要节约DNA提取试剂盒的成本(天根的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒约8元/每样本)，而Sanger测序的成本更高。另一方面，实验流程精简的同时也节省了人力消耗。
<110>陕西佰美基因股份有限公司
<120>特异性引物探针组合及其适于血液直接扩增结合荧光PCR法检测叶酸代谢能力基因的应用
<160>8
<210>1
<211>401
<212>DNA
<213> 人（Human）
<400> 1
CAGGCTGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTGCAAGATCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTCTCTCTGCCCAGTCCCTGTGGTCTCTTCATCCCTCGCCTTGAACAGGTGGAGGCCAGCCTCTCCTGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGYCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCATCACTTGCCCCATCGTCCCCGGGATCTTTCCCATCCAGGTGAGGGGCCCAGGAGAGCCCATAAGCTCCCTCCACCCCACTCTCACCGCACCGTCCTCGCACAG
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
AGAAGGTGTCTGCGGGATC
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>3
AGAAGGTGTCTGCGGGATT
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>4
GGGACGATGGGGCAAGTG
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>5
TTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGC
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>6
CAGCAGATGTGGATCAGCAAG
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>7
GCATTTGCGGTGGACGAT
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>8
AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC

Claims (7)

1.一种适用于血液直接扩增结合荧光PCR方法的特异性引物探针组合，其针对叶酸代谢能力基因，具体是MTHFR基因C677T位点；该特异性引物探针组合包括：目的基因ARMS引物、通用引物及荧光探针；所述目的基因ARMS引物分为C基因型特异性引物和T基因型特异性引物；
C基因型特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATC；
T基因型特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATT；
通用引物：GGGACGATGGGGCAAGTG；
荧光探针：5'-HEX-TTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGC-BHQ1-3'；
其中，HEX为荧光修饰基团，BHQ1为荧光淬灭基团；
所述血液直接扩增结合荧光PCR方法是针对抗凝全血样本，在反应体系中加入核酸释放剂、扩增酶、以及所述特异性引物探针组合进行荧光PCR程序得出相应基因型。
2.权利要求1所述的特异性引物探针组合在制备针对MTHFR基因C677T位点多态性检测的试剂盒方面的用途。
3.一种针对MTHFR基因C677T位点多态性检测的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的特异性引物探针组合、内参基因的引物探针组合、核酸释放剂、扩增酶和超纯水，所述内参基因的引物探针组合中的荧光探针与所述特异性引物探针组合中的荧光探针采用不同的荧光修饰基团(FAM修饰)。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述内参基因的引物探针组合的序列信息如下：
上游引物：CAGCAGATGTGGATCAGCAAG
下游引物：GCATTTGCGGTGGACGAT
荧光探针：5'-FAM–AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ1--3'。
5.一种针对MTHFR基因C677T位点多态性的血液直接扩增结合荧光PCR检测方法，用于非疾病诊断目的，包括以下步骤：
(1)获取待测抗凝全血样本，并用超纯水稀释；
(2)配置两组PCR反应体系，其中：第一组PCR反应体系包括：
677C特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATC；
677通用引物：GGGACGATGGGGCAAGTG；
677荧光探针：5'-HEX-TTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGC-BHQ1-3'；
ACTB上游引物：CAGCAGATGTGGATCAGCAAG；
ACTB下游引物：GCATTTGCGGTGGACGAT；
ACTB荧光探针：5'-FAM–AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ1--3'；
以及核酸释放剂、扩增酶和超纯水；
第二组PCR反应体系与第一组PCR反应体系的区别仅在于将677C特异性引物替换为：
677T特异性引物：AGAAGGTGTCTGCGGGATT，其他均相同；
两组PCR反应体系分别充分混匀；
(3)在两组PCR反应体系中分别加入步骤(1)得到的抗凝全血样本，运行实时荧光PCR扩增程序；
(4)根据两组PCR反应体系的扩增情况判断样本基因型；判读标准如下：
a)若该样本在第一组PCR反应体系和第二组PCR反应体系中的FAM通道、HEX通道均表现出正常扩增，且两个反应Ct的值差的绝对值<3，则该样本为基因型为CT杂合型；
b)若该样本在第二组PCR反应体系中的FAM通道呈现正常扩增，而在第一组PCR反应体系中的HEX通道呈现正常扩增,则表明该样本基因型为CC纯合型；
c)若该样本在第一组PCR反应体系中的FAM通道呈现正常扩增，而在第二组PCR反应体系中的HEX通道呈现正常扩增,则表明该样本基因型为TT纯合型。
6.根据权利要求5所述的血液直接扩增结合荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤(3)运行实时荧光PCR扩增程序，具体如下：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，共40个循环；72℃延伸1分钟；仪器降温到4℃。
7.权利要求1所述的特异性引物探针组合在构建针对MTHFR基因C677T位点多态性检测的智能检测设备方面的用途，所述智能检测设备支持权利要求5所述的血液直接扩增结合荧光PCR检测方法的执行。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112538528A (zh) * 2020-12-25 2021-03-23 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 一种检测aldh2基因多态性的引物组及试剂盒
CN114107488A (zh) * 2021-12-28 2022-03-01 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 一种检测mthfr基因多态性的引物组及试剂盒
CN111996244B (zh) * 2020-10-28 2022-05-06 浙江绍兴鼎晶生物医药科技股份有限公司 一种单核苷酸多态性检测用组合物及其应用
CN116179658A (zh) * 2023-03-29 2023-05-30 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种荧光引物扩增阻滞突变系统及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120024205A (ko) * 2010-09-06 2012-03-14 주식회사 파나진 Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｍｔｈｆｒ 유전자의 유전형 분석 방법 및 키트
CN105256019A (zh) * 2015-10-14 2016-01-20 武汉海吉力生物科技有限公司 Mthfr和mtrr基因多态性检测引物组及试剂盒
CN107630073A (zh) * 2017-10-30 2018-01-26 厦门基源医疗科技有限公司 一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法及试剂盒
CN110004215A (zh) * 2018-01-04 2019-07-12 江苏正大天创生物工程有限公司 人类mthfr基因多态性检测试剂盒
CN110423801A (zh) * 2019-09-06 2019-11-08 北京协和洛克生物技术有限责任公司 Mthfr和mtrr基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070134709A1 (en) * 2005-12-14 2007-06-14 Xiping Xu Usages of MTHFR gene polymorphisms in predicting homocysteine level, disease risk, and treatment effects and related methods and kit
CN101613749A (zh) * 2009-08-11 2009-12-30 中国人民解放军第二军医大学 Papolb基因甲基化定量检测方法
CN105624296A (zh) * 2016-01-28 2016-06-01 屈强 基于arms荧光pcr法检测基因多态性的通用型荧光发夹引物
CN110272987A (zh) * 2019-06-11 2019-09-24 中山大学达安基因股份有限公司 一种mthfr基因c677t位点快速分型检测试剂盒及方法
CN110272988A (zh) * 2019-06-19 2019-09-24 江苏正大天创生物工程有限公司 人类mthfr基因多态性检测试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120024205A (ko) * 2010-09-06 2012-03-14 주식회사 파나진 Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｍｔｈｆｒ 유전자의 유전형 분석 방법 및 키트
CN105256019A (zh) * 2015-10-14 2016-01-20 武汉海吉力生物科技有限公司 Mthfr和mtrr基因多态性检测引物组及试剂盒
CN107630073A (zh) * 2017-10-30 2018-01-26 厦门基源医疗科技有限公司 一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法及试剂盒
CN110004215A (zh) * 2018-01-04 2019-07-12 江苏正大天创生物工程有限公司 人类mthfr基因多态性检测试剂盒
CN110423801A (zh) * 2019-09-06 2019-11-08 北京协和洛克生物技术有限责任公司 Mthfr和mtrr基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERIHA FATIMA KHIDRI ET AL.: ""MTHFR and F5 genetic variations have association with preeclampsia in Pakistani patients: a case control study"", 《BMC MEDICAL GENETICS》, vol. 20, 23 October 2019 (2019-10-23), pages 1 - 12 *
RIZWAN MASUD ET AL.: ""Tetra primer ARMS-PCR relates folate/homocysteine pathway genes and ACE gene polymorphism with coronary artery disease"", 《MOL CELL BIOCHEM》, vol. 355, 13 May 2011 (2011-05-13), pages 289 - 297 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111996244B (zh) * 2020-10-28 2022-05-06 浙江绍兴鼎晶生物医药科技股份有限公司 一种单核苷酸多态性检测用组合物及其应用
CN112538528A (zh) * 2020-12-25 2021-03-23 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 一种检测aldh2基因多态性的引物组及试剂盒
CN114107488A (zh) * 2021-12-28 2022-03-01 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 一种检测mthfr基因多态性的引物组及试剂盒
CN116179658A (zh) * 2023-03-29 2023-05-30 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种荧光引物扩增阻滞突变系统及其应用
CN116179658B (zh) * 2023-03-29 2023-12-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种荧光引物扩增阻滞突变系统及其应用

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