CN101613749A - Papolb基因甲基化定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域。基因的异常甲基化参与肿瘤的发生发展，本发明的目的在于克服甲基化敏感性限制性内切酶法、重亚硫酸盐测序法和甲基化特异性PCR法的缺点，提供一种操作简便、敏感性高的PAPOLB基因甲基化定量检测方法。本发明取胰腺癌组织，提取DNA制备ACTB的标准曲线样品，利用全甲基化模板，制备PAPOLB的标准曲线样品；提取待测组织DNA，并进行化学修饰，针对人PAPOLB基因启动子区CPG岛设计甲基化引物及探针，针对人参照基因ACTB启动子区CPG岛设计BSP引物及探针，采用Taqman－MGB实时定量PCR方法对亚硫酸盐处理后的DNA进行实时定量PCR，计算出PAPOLB基因甲基化程度的定量值。本发明方法快速、准确、灵敏度高。

Description

PAPOLB基因甲基化定量检测方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及PAPOLB基因甲基化定量检测的方法。

背景技术

基因的异常甲基化参与肿瘤的发生发展，据文献报道，在胰腺癌组织或胰液中可检测出多个胰腺癌相关基因发生异常甲基化，而在正常组织中发生甲基化的比例很低。异常甲基化的基因包括：P16(Virmani AK，et al.Clin Cancer Res2001；7：584-9)、MUC2(Ho JJ，et al.Int J Oncol 2003；22：273-9)、RASSF1A(Dammann R，et al.Oncogene 2003；22：3806-12；)、SOCS-1(Fukushima N，etal.Br J Cancer 2003；89：338-43；)、ppENK(Fukushima N，et al.Am J Pathol2002；160：1573-81)、NPTX2(Sato N，et al.Cancer Res，2003，63：3735-3742)、SOD2(Hurt，E.M.，S.B.Thomas，et al.2007.Br J Cancer 97(8)：1116-23.)、ECT2(Zhang，M.L.，S.Lu，et al.2008.Hepatobiliary Pancreat Dis Int 7(5)：533-8.)、SFRP(Bu，X.M.，C.H.Zhao，et al.2008.World J Gastroenterol 14(21)：3421-4.)、CCND2，SOCS 1，THBS 1，PLAU，and VHL(Melnikov，A.A.，D.Scholtens，et al.2009.JSurg Oncol 99(2)：119-22.)、hTERT(Kumari，A.，R.Srinivasan，et al.2009.AnnSurg Oncol 16(4)：1051-9.)等。

对基因异常DNA甲基化的检测方法很多，其中甲基化敏感性限制性内切酶法和重亚硫酸盐测序法(BSP)和甲基化特异性PCR(MSP)法是应用最普遍的方法中的三种。

甲基化敏感性限制性内切酶法，是经典的甲基化分析方法，主要根据一些限制性内切酶不能切开甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳动物DNA中，只有CG相连的胞嘧啶能够被甲基化，因此，在酶切位点内包含CG序列的限制性内切酶就会遇到问题。这种方法所使用的两个经典酶对是HPa II一Msp I(CCGG)和Sma I一Xma I(CCCGGG)。由于第二对限制酶识别序列非常罕见，所以一般都用HPa II一Msp I(CCGG)。两个酶都识别CCGG序列，而当其中的胞嘧啶甲基化时，HPa II不能够将其切开，利用Hpa II-Msp I的这种属性处理DNA，这就使得HPa II一Msp I能够作为快速甲基化分析的工具，随后进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态。该方法存在下列缺点：(1)由于CG不仅仅限于CCGG序列中，因此非该序列中的CG将被忽略；(2)只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义；(3)相对而言，Southern方法较复杂，且需要样本的量大；(4)存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题；(5)不适用于混合样本。

重亚硫酸盐测序(BSP)法，是根据重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变。基因组DNA经亚硫酸盐处理后，设计BSP引物并扩增目的的片段，此时尿嘧啶(U)全部转化成胸腺嘧啶(T)，最后对PCR产物进行克隆测序，从而判断CpG位点是否发生甲基化。该方法的优点是可靠性及精确度都很高，能检测到目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，缺点是需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，费用也比较高。

甲基化特异性PCR(MSP)法，亚硫酸氢盐可以氧化去除基因组DNA中胞嘧啶的氨基，在此反应中除m5C外其余胞嘧啶均可被转变为尿嘧啶。然后将这些靶序列用特异引物进行扩增，经过扩增的DNA，所有尿嘧啶均转化为可检测的胸腺嘧啶，只有m5C以胞嘧啶形式被扩增。这种方法是目前所使用的在给定基因组靶序列中分析m5C最常用的方法。可以检测到每个CpG位点的甲基化情况。基于此原理，发展出亚硫酸氢盐去氨基反应后，结合PCR扩增的快速方法来检测m5C，称为甲基化特异PCR(MSP)，这种MSP方法运用，特别设计的针对甲基化的和非甲基化序列的引物，从而得到特异扩增的甲基化或非甲基化靶序列。目前已经被广泛应用到CpG岛甲基化检测。此方法适用范围很广，可以检测包括已知的、接近PCR引物的及限制性酶切范围的CpG双核昔酸序列的甲基化状况。MSP是目前应用最广泛的CpG岛甲基化检测方法，可检出比例为千分之一的甲基化片段。可靠的MSP，关键在于引物，其引物设计需两个已知的、包含多个完全甲基化或非甲基化CpG位点的区域，但具有上述区域的CpG岛并不多，限制了MSP的使用。该方法存在下列缺点：(1)这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在甲基化；若要求定量，则需用其他的方法进行进一步检测；(2)若要区分甲基化引物与非甲基化引物扩增产物量的不同，需要严格控制PCR反应的条件及循环数。

发明内容

本发明的目的在于为克服上述各种方法的缺点，提供一种操作简便、敏感性高的PAPOLB基因甲基化定量检测方法。

本申请人通过高通量甲基化芯片检测胰腺癌组织中基因组DNA包含的CpG岛甲基化状态，发现PAPOLB基因(GeneID：56903)在胰腺癌组织中高甲基化状态。

为定量检测PAPOLB基因甲基化程度，本发明具体采用如下技术方案：设定ACTB基因(GeneID：60)为参照基因，PAPOLB基因为检测靶基因。首先，用QIAGEN EpiTect Bisufite kit试剂盒对待检样品DNA进行重亚硫酸盐处理，用作扩增模板；设计扩增参照基因ACTB的BSP引物和扩增靶基因PAPOLB的MSP引物；将PCR产物分别纯化、连接、转化、测序、挑选合适样品制备参照基因ACTB和扩增靶基因PAPOLB的质粒标准品。然后，分别设计BSP引物实时定量PCR检测ACTB参照基因Taqman-MGB探针，同时，设计MSP引物实时定量PCR检测PAPOLB靶基因的Taqman-MGB探针。对重亚硫酸盐处理的待检样品DNA，分别同时进行实时荧光定量PCR检测ACTB和PAPOLB基因的拷贝数。待检样品DNA中PAPOLB基因的拷贝数除以ACTB基因的拷贝数，即为待检样本中PAPOLB靶基因甲基化程度的定量值，从来实现定量检测的目的。

本发明提供一种PAPOLB基因甲基化定量检测方法，具体包括如下步骤：

1.样本处理：用QIAGEN EpiTect Bisufite Kit^TM试剂盒对来自于个体样本的DNA进行重亚硫酸盐处理，用作扩增模板；

2.标准品制备：分别制备ACTB参照基因的标准品和PAPOLB靶基因的标准品

设计ACTB的BSP引物及PAPOLB的MSP引物

(1)ACTB-BSP引物

ACTB BF：5′TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT 3′(SEQ ID NO：1)

ACTB BR：5′AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA 3′(SEQ ID NO：2)

(2)其中PAPOLB的MSP引物：

PAPOLB MF：5′GCGTTGAAAGATGATGTCGTTTTC 3′(SEQ ID NO：3)

PAPOLB MR：5′ATAAACGAAAAAACGCCGTAACG 3′(SEQ ID NO：4)

ACTB的BSP反应条件如下：95℃预变性10min；95℃变性30s.60℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环。

PAPOLB的MSP反应条件如下：95℃预变性10min；95℃变性30s.61℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环。

PCR产物进行纯化，连接入pMD18-T Vector(按说明书进行)，然后电击法转化至E.coli DH5α、工程菌，挑选多个重组克隆菌进行测序(见图1)，测序正确的重组菌进行大量扩增，应用试剂盒抽提纯化质粒，分别制备出ACTB参照基因的标准品和PAPOLB靶基因的标准品。

3、PAPOLB基因甲基化的定量检测：

(1)设计ACTB的探针和PAPOLB的探针

ACTB探针：FAM-TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG-MGB

(FAM-SEQ ID NO：5-MGB)

PAPOLB探针：FAM-ATAATCCCTAAATTATC-MGB

(FAM-SEQ ID NO：6-MGB)

(2)反应条件如下：①95℃10min②95℃15s，70℃15s，60℃1min，共50个循环。

本发明的待检样本DNA可以来自多种临床样品，包括胰液、全血、血清、粪便、胰腺穿刺物等。

该方法通过对靶基因的CpG岛进行MSP引物及Taqman-MGB探针设计，对参照基因ACTB设计BSP引物及Taqman-MGB探针，采用Taqman-MGB实时定量PCR方法，同时对亚硫酸盐处理后的样品DNA分别检测出ACTB和PAPOLB基因的拷贝数。计算出PAPOLB基因甲基化程度的定量值。

本发明的检测方法操作简便，敏感性高，准确性强。

附图说明

图1是BSP菌液测序曲线。其中A为ACTB的单克隆；B为PAPOLB的单克隆。

图2是标准品甲基化定量PCR检测扩增曲线。其中A/B图为ACTB扩增曲线和标准曲线；C/D图为PAPOLB扩增曲线和标准曲线。图3是组织HE染色显微照片。其中A是胰腺癌组织HE染色；B是癌旁组织HE染色。

图4是胰腺癌组织与癌旁组织甲基化定量PCR检测扩增曲线。其中A图为ACTB的扩增曲线；B图为PAPOLB的扩增曲线。

图5是胰腺癌组织和癌旁组织甲基化程度的比较。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明，但本发明的实施并不仅于此。实施例1：定量检测PAPOLB基因在胰腺癌患者临床样品中的甲基化程度

主要试剂及仪器来源：

CpGenome Universal Methylated DNA和QIAGEN EpiTect Bisufite KitTM及纯化试剂盒购于吉泰公司、pMD18-T Vector、EX-taq酶购买于宝生物工程(大连)有限公司，ABI Taqman Gene Expression Master Mix购买于美国应用生物系统公司，ABI 7500Real Time PCR仪购买于美国应用生物系统公司，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成、B型质粒小样快速提取试剂盒购自北京博大泰克公司。

操作步骤：

一、利用ACTB的BSP引物和PAPOLB的MSP引物分别PCR扩增制备标准品。

1.基因组DNA提取

按常规酚/氯仿法抽提DNA

(1)鲜组织用冰生理盐水清洗去血水。

(2)每克组织加2ml裂解缓冲液制成匀浆。

(3)取3ml匀浆于离心管中，加等体积苯酚-氯仿，旋紧盖，缓缓来回颠倒5min，离心2500rpm 10min。

(4)取水相置另一干净离心管中，重复步骤3。

(5)吸取水相，加等体积氯仿-异戊醇，旋紧盖后缓缓摇匀5min，离心2500rpm10min。

(6)吸取水相，加5mol/L NaCl至终浓度为0.3mol/L，加2.5倍体积的冰无水乙醇，旋紧盖后缓缓摇匀，见白色絮状沉淀DNA出现。

(7)用玻棒捞起DNA沉淀置于一干净离心管中，加1ml 70％乙醇混匀，2500rpm离心5min，弃去上清。

(8)DNA沉淀溶解于2ml TE中。

(9)加RNase(10mg/ml)40ml，37℃保温1h。

(10)加20％SDS 50ul，蛋白酶K20u1，37℃保温2h。

(11)重复步骤3.4.5.6.7。

(12)用1ml TE溶解沉淀，得DNA溶液

2.DNA浓度测定

应用NanoDrop ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计测出浓度。

3.亚硫酸盐转化

参照QIAGEN EptiTect Bisulfite Kit^TM说明书，将抽提的DNA进行亚硫酸盐处理。

(1)在0.2ml EP管中配制85ul Bisulfite Mix、35ul DNA Protect Buffer、500ngDNA、补水至140ul体系

(2)在PCR仪上采用如下程序反应99℃变性5min、60℃孵育25min、99℃变性5min、60℃孵育85min、99℃变性5min、60℃孵育175min。

(3)反应结束0.2ml EP管取出，将反应液转移至1.5ml EP管中

(4)加入560ul新鲜配制的BL缓冲液，漩涡振荡

(5)将混合液加入离心吸附柱中，套上收集管、最大转速离心1min，弃收集管中液体

(6)加入500ulBW洗脱液于离心吸附柱中，最大转速离心1min，弃收集管中液体

(7)加入500ul BD缓冲液于离心吸附柱中，室温静置15min

(8)最大转速离心1min，弃收集管中液体

(9)重复步骤62次

(10)将离心吸附柱放置于新收集管内，最大转速空甩1min

(11)将离心吸附柱放置于干净1.5ml EP管，加入20ul EB缓冲液至柱基质中，12000rpm/min洗脱DNA，-20℃保存

4.标准品制备

(1)设计ACTB-BSP引物

ACTB F：TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT

ACTB R：AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA

扩增片段长度：133bp，该序列如GeneID：60所示

(2)设计PAPOLB-MSP引物

PAPOL，B MF：5′GCGTTGAAAGATGATGTCGTTTTC 3′

PAPOLB MR：5′ATAAACGAAAAAACGCCGTAACG 3′

扩增片段长度：90bp，该序列如GeneID：56903所示。

反应体系为25μl，反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s.60℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环。2.0％琼脂糖凝胶电泳确定了产物正确性。

4.2T载体连接及转化

PCR产物进行纯化，连接入pMD18-T Vector(按说明书进行)，然后电击法(分子克隆实验指南第三版Page 1296)转化至E.coli DH5α、工程菌。

4.3菌液测序

DNA测序由invitrogen公司承接完成。

4.4测序结果

DNA测序结果，与预期碱基序列一致的选用作为标准品，发生甲基化的CpG经亚硫酸盐处理后保持不变，而未发生甲基化的CpG中的C则转化为T(结果见图1)。

5.标准品的制备步骤如下：用北京博大泰克公司的“B型质粒小样快速提取试剂盒”对挑选出的ACTB和PAPOLB单克隆进行质粒抽提。

按说明书操作：①用接种环挑甘油菌于5ml LB培养基中，37℃、225rpm/min摇床培养过夜；②收集1.5-3ml菌液的沉淀于1.5ml Eppendorf离心管中，12000rpm/min离心5min；弃上清，加入100ul溶液1(已事先加好RnaseA)，震荡至彻底悬浮；③加入150ul溶液2，立即轻柔颠倒离心管数次；④冰上放置2min⑤加入150ul溶液3，立即轻柔颠倒离心管数次；⑥室温放置5min，12000rpm/min离心12min⑦将420ul结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤4中的上清加入离心吸附柱中，混匀，12000rpm/min离心30s，弃收集管中废液；⑧加入750ul漂洗液于离心吸附柱中，静置1min，12000rpm/min离心30s，弃收集管中的废液；重复一次，弃废液，12000rpm/min离心2min；⑨将吸附柱置入一干净的离心管中，在吸附膜中央加入50ul洗脱缓冲液；⑩室温静置2-5min后，12000rpm/min离心2min，-20℃保存备用。取2ulDNA用于紫外分光光度仪定量检测。

模板拷贝数换算：拷贝数＝质量/分子量×6.02×10²³

质粒分子量计算：MW＝(A碱基数×312)+(C碱基数×288)+(G碱基数×328)+(T碱基数×303)-61≈碱基数×324.5

本实验中1ng质粒拷贝数约为3×10⁸。根据公式将标准品依次稀释成5×10⁶拷贝/μl，5×10⁵拷贝/μl，5×10⁴拷贝/μl，5×10³拷贝/μl，5×10²拷贝/μl，5×10¹拷贝/μl。

6.对标准品进行甲基化定量检测。

6.1引物设计：

ACTB-BSP引物及探针：

ACTB BF：5′TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT 3′

ACTB BR：5′AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA 3′

ACTB-probe：FAM-TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG-MGB

PAPOLB的甲基化引物及探针：

PAPOLB MF：5′GCGTTGAAAGATGATGTCGTTTTC 3′

PAPOLB MR：5′ATAAACGAAAAAACGCCGTAACG  3′

PAPOLB-probe：FAM-ATAATCCCTAAATTATC-MGB

6.2实时定量PCR反应

分别取2μl标准品和样本为模板，运用Taqman-MGB实时定量PCR方法进行定量扩增，反应体系25μl，反应条件为：①95℃10min；②95℃15s.70℃15s、60℃1min.共50个循环。其扩增曲线和标准曲线如图2所示。

二、对胰腺癌组织及癌旁组织的检测

1.组织标本收集

取自第二军医大学附属长海医院胰腺外科手术切除标本66例，在手术切除病灶后用锋利刀片迅速切取原发肿瘤和切缘癌旁正常组织各1块，立即冷冻于液氮中保存，取材时间不超过10min。所有胰腺癌经H-E染色病理学证实均为导管源性，代表性切片HE染色如图3所示，并用冰冻切片进行粗分离。男性39例，女性27例，年龄35～77岁，平均59.95岁。

2.基因组DNA提取、DNA浓度测定、亚硫酸盐转化

方法同前。

3.实时荧光定量MSP

(1)荧光定量MSP扩增体系/总体积为25ul：ABI Taqman Gene ExpressionMaster Mix 12.5ul，H₂O 9.7ul，上下游引物(5P)0.5ul，探针(10P)0.3ul，样本模版投入2ul

(2)荧光定量MSP扩增条件：①95℃10min②95℃15s，70℃15s，60℃1min，共50个循环。

(3)采用具有FAM检测通道的定量PCR仪，进行检测。

4待测胰腺组织样本、标准品进行荧光定量MSP扩增，按常规方法，制定出标准曲线，按照标准曲线公式定量计算待测样本中甲基化的PAPOLB基因的定量值，定量计算公式为

其中：

Ct为待检样本扩增荧光信号强度达到阈值时所需的循环数，E为扩增效率，T为阈值，R为常数/即一个扩增子产生的荧光信号强度。

4.数据分析

(1)检测ACTB标准品包括：6个标准品，浓度分别为5×10⁷拷贝/μl，5×10⁶拷贝/μl，5×10⁵拷贝/μl，5×10⁴拷贝/μl，5×10³拷贝/μl，5×10²拷贝/μl

(2)检测PAPOLB标准品包括：6个标准品，浓度分别为5×10⁶拷贝/μl，5×10⁵拷贝/μl，5×10⁴拷贝/μl，5×10³拷贝/μl，5×10²拷贝/μl，5×10¹拷贝/μl注：①5×10⁶拷贝/μl，②5×10⁵拷贝/μl，③5×10⁴拷贝/μl，④5×10³拷贝/μl，⑤5×10²拷贝/μl，⑥5×10¹拷贝/μl

(3)设定基线和阈值后，得到标准曲线，同时得到标准曲线方程为Ct＝-3.25lgC₀+44.8，斜率为-3.25，截距为44.8，

(4)胰腺癌患者样本扩增Ct值为36.09，根据定量计算公式，算出该样本中甲基化PAPOLB基因的浓度为2.39×10²拷贝/ul

(5)经过检测及数据转换，得到胰腺癌组织、癌旁组织的甲基化定量值。运用SPSS15.0for Windows软件，甲基化程度不成正态分布，采用非参检验中的Wilcoxon检验得到两组有显著差异(P＜0.05)，两组的比较如图5所示。证实胰腺癌组织中PAPOLB基因的甲基化程度高于癌旁组织.更进一步证实对于PAPOLB基因甲基化定量检测的方法在现实实际中有可操作性，同时具有科学性。

本实施例仅以胰腺癌组织为检测样本，对本发明的技术方案进行了验证，但是根据本发明的公开，也可以采集患者的胰液、粪便、全血、血清、胰腺穿刺物等为DNA样本，也同样运用本实施例公开的方法准确、简便地定量检测PAPOLB基因或其它基因的甲基化程度。

SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>PAPOLB基因甲基化定量检测方法

<130>说明书，权利要求书

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tggtgatgga ggaggtttag taagt      25

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aaccaataaa acctactcct cccttaa    27

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gcgttgaaag atgatgtcgt tttc       24

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ataaacgaaa aaacgccgta acg        23

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tttgttattg tgtgttgggt g      21

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ataatcccta aattatc           17

Claims (2)

1、一种PAPOLB基因甲基化定量检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

A、待检样本处理：用QIAGEN EpiTect Bisufite Kit^TM试剂盒对待检样本的DNA进行重亚硫酸盐处理，用作扩增模板；

B、分别制备ACTB参照基因的标准品和PAPOLB靶基因的标准品：

设计并合成ACTB参照基因的BSP引物：

ACTB BF：5′TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT 3′

ACTB BR：5′AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA 3′

设计并合成PAPOLB靶基因的MSP引物：

PAPOLB MF：5′GCGTTGAAAGATGATGTCGTTTTC 3′

PAPOLB MR：5′ATAAACGAAAAAACGCCGTAACG 3′

ACTB参照基因进行BSP反应的条件：95℃预变性10min；95℃变性30s.60℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；

PAPOLB靶基因进行MSP反应的条件：95℃预变性10min；95℃变性30s.61℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；

PCR产物进行纯化，连接入pMD18-T Vector，然后电击法转化至E.coliDH5α、工程菌，测序正确的重组菌进行扩增，应用试剂盒抽提纯化质粒，分别制备出ACTB参照基因的标准品和PAPOLB靶基因的标准品；

C、PAPOLB基因甲基化的定量检测：

设计并合成ACTB的探针和PAPOLB的探针：

ACTB探针：FAM-TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG-MGB

PAPOLB探针：FAM-ATAATCCCTAAATTATC-MGB

对重亚硫酸盐处理过的待检样本DNA，分别同时进行实时荧光定量PCR、条件是：①95℃10min②95℃15s，70℃15s，60℃1min，共50个循环；检测ACTB和PAPOLB基因的拷贝数；待检样本DNA中PAPOLB基因的拷贝数除以ACTB基因的拷贝数，即为待检样本中PAPOLB基因甲基化程度的定量值。

2、根据权利要求1所述的一种PAPOLB基因甲基化定量检测方法，其特征在于其中的待检样本是胰液、全血、血清、粪便或胰腺穿刺物。

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