CN114672568B - 一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒,所述试剂盒含有核酸引物组合,所述核酸引物组合含有第一引物集至第六引物集中的至少一种引物集。本发明筛选出PCR扩增效率高、特异性强且稳定性好的引物探针对,显著提高宫颈癌前病变检测的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒。
背景技术
宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一。据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担数据显示,全球宫颈癌新发病例604,127例,死亡病例341,831例。在我国宫颈癌新发病例109,741例,占全球发病率的18.2%,死亡病例59,060例。作为唯一一个病因明确的肿瘤,目前已形成了“HPV疫苗+筛查+早诊早治”的“三级预防”措施进行宫颈癌的防治。2021年7月6日,发布的第二版《宫颈癌前病变筛查和治疗指南》明确提出:推荐将HPV-DNA检测作为首选的筛查方式。已有的检测技术主要分为:
细胞学:包含传统子宫颈刮片、液基细胞学TCT检查及p16/Ki-67免疫组织化学染色。此类方法能够明显提高癌病细胞的检测率,但取材、制片、阅片水平的参差不齐。样本中含有很多正常宫颈细胞,可能检测不到相对较少的异常细胞,容易造成假阴性,漏检率高。
目视检查:包含传统的醋酸和卢戈氏碘液染色肉眼观察法(VIA/VILI)及人工智能AI筛查技术。VIA/VILI肉眼观察发结果评价较为主观,敏感性、特异性较低,诊断准确性需要依赖熟练的操作和丰富的观察经验,存在较高的误诊、漏诊率。人工智能AI筛查技术依赖大量样本积累的数据库及定期的数据回顾更新。
分子生物学:除了推荐的HPV-DNA检测外,基于分子水平的检测技术还包含mRNA/HPV抗体及DNA甲基化。宫颈癌的诱发与人类乳头瘤病毒(HPV)的病原体有关。感染高危型别HPV后经3~5年可以进展为高级别病变的CIN2期和CIN3期,而进一步发展为浸润癌则需20~30年。癌前病变及宫颈癌早期可以没有任何症状。癌前病变时间很长,如果在这个阶段通过筛查早发现,尽早采取有效的干预治疗措施,则可以较好的避免癌前病变进一步发展成癌症,大大降低宫颈癌的发生率和死亡率,从而达到预防宫颈癌的目的。
DNA甲基化作为一种重要的表观修饰,是肿瘤发生过程中的早期事件,是细胞的遗传本质和外界环境共同影响作用的结果。利用基因的甲基化来早期诊断肿瘤已经成了分子检验的一个热点领域。目前基于DNA甲基化检测技术在其他癌症早诊领域如肠癌、胃癌、肺癌等已有广泛应用。在宫颈癌筛查领域,大量研究结果显示,DNA甲基化检测宫颈癌及宫颈癌前病变有较高的特异性及灵敏度。国内已有湖南宏雅基因技术有限公司开发的PAX1基因甲基化的检测,是采用甲基化特异性PCR技术对PAX1基因的甲基化水平进行检测分析,其在CIN2期及以上检测灵敏度为78.6%,特异性为97.8%。该方法是单独在一个反应体系中只检测某一基因甲基化指标,检测效率较低,对于宫颈癌的敏感度较低。现有技术中使用三种靶基因联检,相较于单靶标在灵敏度性能方面有所提升。根据《2019ASCCP基于风险的子宫颈癌筛查结果异常的管理共识》中提出,病理结果为CIN1中发生隐匿CIN 2+(1%~7%)和CIN3(<1%)的风险较低,不建议进行无目标性(随机)活检,首选随访观察,而非治疗;活检病理CIN2及以上的病变建议采用宫颈局部切除治疗。同时近年来的流行病学研究调查发现,CIN2在年轻女性(<30岁)发病率逐年升高,宫颈癌前病变的进展在一定程度上影响生育功能,因而提高CIN2期的检出性能显得尤为重要。但现有的三靶标的联合在筛查宫颈上皮内瘤变的不同阶段的性能方面仍存在灵敏度、特异性较低的问题。
发明内容
根据第一方面,在一实施例中,提供一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒,所述试剂盒含有核酸引物组合,所述核酸引物组合含有第一引物集至第六引物集中的至少一种引物集;
所述第一引物集含有如下引物对中的至少一种:
第一引物对:如SEQ ID No:1所示的上游引物;如SEQ ID No:2所示的下游引物;
第二引物对:如SEQ ID No:4所示的上游引物;如SEQ ID No:5所示的下游引物;
第三引物对:如SEQ ID No:7所示的上游引物;如SEQ ID No:8所示的下游引物。
所述第二引物集含有如下引物对中的至少一种:
第四引物对:如SEQ ID No:10所示的上游引物;如SEQ ID No:11所示的下游引物;
第五引物对:如SEQ ID No:13所示的上游引物;如SEQ ID No:14所示的下游引物;
第六引物对:如SEQ ID No:16所示的上游引物;如SEQ ID No:17所示的下游引物;
所述第三引物集含有如下引物对中的至少一种:
第七引物对:如SEQ ID No:19所示的上游引物;如SEQ ID No:20所示的下游引物;
第八引物对:如SEQ ID No:22所示的上游引物;如SEQ ID No:23所示的下游引物;
第九引物对:如SEQ ID No:25所示的上游引物;如SEQ ID No:26所示的下游引物;
所述第四引物集含有如下引物对中的至少一种:
第十引物对:如SEQ ID No:28所示的上游引物;如SEQ ID No:29所示的下游引物;
第十一引物对:如SEQ ID No:31所示的上游引物;如SEQ ID No:32所示的下游引物;
第十二引物对:如SEQ ID No:34所示的上游引物;如SEQ ID No:35所示的下游引物;
所述第五引物集含有如下引物对中的至少一种:
第十三引物对:如SEQ ID No:37所示的上游引物;如SEQ ID No:38所示的下游引物;
第十四引物对:如SEQ ID No:40所示的上游引物;如SEQ ID No:41所示的下游引物;
第十五引物对:如SEQ ID No:43所示的上游引物;如SEQ ID No:44所示的下游引物;
所述第六引物集含有如下引物对中的至少一种:
第十六引物对:如SEQ ID No:46所示的上游引物;如SEQ ID No:47所示的下游引物;
第十七引物对:如SEQ ID No:49所示的上游引物;如SEQ ID No:50所示的下游引物;
第十八引物对:如SEQ ID No:52所示的上游引物;如SEQ ID No:53所示的下游引物。
根据第二方面,在一实施例中,提供一种检测宫颈细胞基因甲基化的方法,包括:
转化步骤,对提取自待测样本的核酸进行转化,获得转化后的核酸;
扩增步骤,包括以转化后的核酸为模板,使用第一方面所述试剂盒进行PCR扩增,同时进行荧光采集。
根据第三方面,在一实施例中,提供一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的核酸引物组合,所述核酸引物组合含有第一引物集至第六引物集中的至少一种引物集。
根据第四方面,在一实施例中,提供一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的探针组合,所述探针组合含有至少一种以下探针集:
第一探针集:含有SEQ ID No:3、SEQ ID No:6、SEQ ID No:9所示序列或其互补序列中的至少一种;
第二探针集:含有SEQ ID No:12、SEQ ID No:15、SEQ ID No:18所示序列或其互补序列中的至少一种;
第三探针集:含有SEQ ID No:21、SEQ ID No:24、SEQ ID No:27所示序列或其互补序列中的至少一种;
第四探针集:含有SEQ ID No:30、SEQ ID No:33、SEQ ID No:36所示序列或其互补序列中的至少一种;
第五探针集:含有SEQ ID No:39、SEQ ID No:42、SEQ ID No:45所示序列或其互补序列中的至少一种;
第六探针集:含有SEQ ID No:48、SEQ ID No:51、SEQ ID No:54所示序列或其互补序列中的至少一种。
依据上述实施例的一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒,筛选出PCR扩增效率高、特异性强且稳定性好的引物探针对,显著提高宫颈癌前病变检测的灵敏度和特异性。
附图说明
图1所示为不同病变级别ΔCt值分布图。
图2所示为实施例4中三种目标基因检测的ΔCt值的ROC曲线分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中,很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而,本领域技术人员可以毫不费力的认识到,其中部分特征在不同情况下是可以省略的,或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下,本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述,这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没,而对于本领域技术人员而言,详细描述这些相关操作并不是必要的,他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外,说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时,方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此,说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例,并不意味着是必须的顺序,除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身,例如“第一”、“第二”等,仅用于区分所描述的对象,不具有任何顺序或技术含义。
术语解释
CIN:cervical intraepithelial neoplasm,子宫颈上皮内瘤样病变。
CIN1:cervical intraepithelial neoplasia,grade1,低级别上皮内瘤变。
CIN2:cervical intraepithelial neoplasia,grade2,中度上皮内瘤变。
CIN3:cervical intraepithelial neoplasia,grade3,高度上皮内瘤变。
SCC:squamous carcinoma of the cervix,宫颈鳞状癌。
BisDNA:Bisulfite DNA,经亚硫酸盐处理后DNA。
本文中,如无特别说明,“CIN 2期及以上”包括CIN 2、CIN 3、SCC三种分期。
根据第一方面,在一实施例中,提供一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒,所述试剂盒含有核酸引物组合,所述核酸引物组合含有第一引物集至第六引物集中的至少一种引物集;
所述第一引物集含有如下引物对中的至少一种:
第一引物对:如SEQ ID No:1所示的上游引物;如SEQ ID No:2所示的下游引物;
第二引物对:如SEQ ID No:4所示的上游引物;如SEQ ID No:5所示的下游引物;
第三引物对:如SEQ ID No:7所示的上游引物;如SEQ ID No:8所示的下游引物。
所述第二引物集含有如下引物对中的至少一种:
第四引物对:如SEQ ID No:10所示的上游引物;如SEQ ID No:11所示的下游引物;
第五引物对:如SEQ ID No:13所示的上游引物;如SEQ ID No:14所示的下游引物;
第六引物对:如SEQ ID No:16所示的上游引物;如SEQ ID No:17所示的下游引物;
所述第三引物集含有如下引物对中的至少一种:
第七引物对:如SEQ ID No:19所示的上游引物;如SEQ ID No:20所示的下游引物;
第八引物对:如SEQ ID No:22所示的上游引物;如SEQ ID No:23所示的下游引物;
第九引物对:如SEQ ID No:25所示的上游引物;如SEQ ID No:26所示的下游引物;
所述第四引物集含有如下引物对中的至少一种:
第十引物对:如SEQ ID No:28所示的上游引物;如SEQ ID No:29所示的下游引物;
第十一引物对:如SEQ ID No:31所示的上游引物;如SEQ ID No:32所示的下游引物;
第十二引物对:如SEQ ID No:34所示的上游引物;如SEQ ID No:35所示的下游引物;
所述第五引物集含有如下引物对中的至少一种:
第十三引物对:如SEQ ID No:37所示的上游引物;如SEQ ID No:38所示的下游引物;
第十四引物对:如SEQ ID No:40所示的上游引物;如SEQ ID No:41所示的下游引物;
第十五引物对:如SEQ ID No:43所示的上游引物;如SEQ ID No:44所示的下游引物;
所述第六引物集含有如下引物对中的至少一种:
第十六引物对:如SEQ ID No:46所示的上游引物;如SEQ ID No:47所示的下游引物;
第十七引物对:如SEQ ID No:49所示的上游引物;如SEQ ID No:50所示的下游引物;
第十八引物对:如SEQ ID No:52所示的上游引物;如SEQ ID No:53所示的下游引物。
在一实施例中,所述核酸引物组合含有第一引物集至第六引物集中的至少两种引物集。
在一实施例中,所述核酸引物组合含有第一引物集至第六引物集中的至少三种引物集。
在一实施例中,所述核酸引物组合含有所述第三引物集、第四引物集、第六引物集。
在一实施例中,所述核酸引物组合用于多重PCR检测。
在一实施例中,所述试剂盒还含有探针组合,所述探针组合含有至少一种以下探针集:
第一探针集:含有SEQ ID No:3、SEQ ID No:6、SEQ ID No:9所示序列或其互补序列中的至少一种;
第二探针集:含有SEQ ID No:12、SEQ ID No:15、SEQ ID No:18所示序列或其互补序列中的至少一种;
第三探针集:含有SEQ ID No:21、SEQ ID No:24、SEQ ID No:27所示序列或其互补序列中的至少一种;
第四探针集:含有SEQ ID No:30、SEQ ID No:33、SEQ ID No:36所示序列或其互补序列中的至少一种;
第五探针集:含有SEQ ID No:39、SEQ ID No:42、SEQ ID No:45所示序列或其互补序列中的至少一种;
第六探针集:含有SEQ ID No:48、SEQ ID No:51、SEQ ID No:54所示序列或其互补序列中的至少一种。
在一实施例中,所述探针组合含有第一探针集至第六探针集中的至少两种探针集。
在一实施例中,所述探针组合含有第一探针集至第六探针集中的至少三种探针集。
在一实施例中,所述探针组合含有第三探针集、第四探针集及第六探针集。
在一实施例中,所述试剂盒含有如下第一引物探针组合至第六引物探针组合中的至少一种:
第一引物探针组合含有如下引物探针集中的至少一种:
第一引物探针集:如SEQ ID No:1所示的上游引物;如SEQ ID No:2所示的下游引物;如SEQ ID No:3所示的探针;
第二引物探针集:如SEQ ID No:4所示的上游引物;如SEQ ID No:5所示的下游引物;如SEQ ID No:6所示的探针;
第三引物探针集:如SEQ ID No:7所示的上游引物;如SEQ ID No:8所示的下游引物;如SEQ ID No:9所示的探针;
第二引物探针组合含有如下引物探针集中的至少一种:
第四引物探针集:如SEQ ID No:10所示的上游引物;如SEQ ID No:11所示的下游引物;如SEQ ID No:12所示的探针;
第五引物探针集:如SEQ ID No:13所示的上游引物;如SEQ ID No:14所示的下游引物;如SEQ ID No:15所示的探针;
第六引物探针集:如SEQ ID No:16所示的上游引物;如SEQ ID No:17所示的下游引物;如SEQ ID No:18所示的探针;
所述第三引物探针组合含有如下引物探针集中的至少一种:
第七引物探针集:如SEQ ID No:19所示的上游引物;如SEQ ID No:20所示的下游引物;如SEQ ID No:21所示的探针;
第八引物探针集:如SEQ ID No:22所示的上游引物;如SEQ ID No:23所示的下游引物;如SEQ ID No:24所示的探针;
第九引物探针集:如SEQ ID No:25所示的上游引物;如SEQ ID No:26所示的下游引物;如SEQ ID No:27所示的探针;
所述第四引物探针组合含有如下引物探针集中的至少一种:
第十引物探针集:如SEQ ID No:28所示的上游引物;如SEQ ID No:29所示的下游引物;如SEQ ID No:30所示的探针;
第十一引物探针集:如SEQ ID No:31所示的上游引物;如SEQ ID No:32所示的下游引物;如SEQ ID No:33所示的探针;
第十二引物探针集:如SEQ ID No:34所示的上游引物;如SEQ ID No:35所示的下游引物;如SEQ ID No:36所示的探针;
所述第五引物探针组合含有如下引物探针集中的至少一种:
第十三引物探针集:如SEQ ID No:37所示的上游引物;如SEQ ID No:38所示的下游引物;如SEQ ID No:39所示的探针;
第十四引物探针集:如SEQ ID No:40所示的上游引物;如SEQ ID No:41所示的下游引物;如SEQ ID No:42所示的探针;
第十五引物探针集:如SEQ ID No:43所示的上游引物;如SEQ ID No:44所示的下游引物;如SEQ ID No:45所示的探针;
所述第六引物探针组合含有如下引物探针集中的至少一种:
第十六引物探针集:如SEQ ID No:46所示的上游引物;如SEQ ID No:47所示的下游引物;如SEQ ID No:48所示的探针;
第十七引物探针集:如SEQ ID No:49所示的上游引物;如SEQ ID No:50所示的下游引物;如SEQ ID No:51所示的探针;
第十八引物探针集:如SEQ ID No:52所示的上游引物;如SEQ ID No:53所示的下游引物;如SEQ ID No:54所示的探针。
在一实施例中,所述试剂盒含有第一引物探针组合至第六引物探针组合中的至少两种。
在一实施例中,所述试剂盒含有第一引物探针组合至第六引物探针组合中的至少三种。
在一实施例中,所述试剂盒含有第三引物探针组合、第四引物探针组合、第六引物探针组合。
在一实施例中,各探针的一个末端的核苷酸上修饰有荧光基团,另一个末端的核苷酸上修饰有淬灭基团,所述荧光基团与所述淬灭基团物理靠近时荧光淬灭,物理远离时,荧光基团发出可以被检测到的荧光。PCR扩增前,探针上的荧光基团与淬灭基团物理靠近,荧光淬灭,PCR扩增过程中,探针从模板链上解离后,荧光基团可以发出荧光,荧光PCR仪可以检测到该荧光。
在一实施例中,每种探针上的荧光基团发出的荧光波长互不相同。
在一实施例中,各探针的5’末端核苷酸上修饰有荧光基团,3’末端核苷酸上修饰有淬灭基团。
在一实施例中,所述荧光基团包括但不限于HEX、CY5、FAM、VIC、Texas Red、Tamara、JOE中的至少一种。
在一实施例中,所述淬灭基团包括但不限于BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种。
在一实施例中,所述试剂盒还含有用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂。
在一实施例中,所述试剂包括PCR反应液。
在一实施例中,所述试剂包括PCR反应液含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+中的至少一种。
在一实施例中,所述试剂盒还包括质控品。
在一实施例中,所述质控品包括阳性质控品、阴性质控品中的至少一种。
在一实施例中,所述阳性质控品包括人甲基化基因组DNA。
在一实施例中,所述阴性质控品包括人非甲基化基因组DNA。
在一实施例中,所述阳性质控品包括人甲基化细胞系基因组DNA。
在一实施例中,所述阴性质控品包括人非甲基化细胞系基因组DNA。
在一实施例中,所述试剂盒还含有内参基因以及用于扩增所述内参基因的引物、可特异性结合至所述内参基因的探针。
在一实施例中,所述内参基因包括但不限于β-Actin、GAPDH、U6、HMBS、B2M、TUBB、SDHA、18S rRNA、RPL4、PPIA,HPRT1、YWHAZ、RPP30、ERG中的至少一种。
在一实施例中,所述试剂盒包括检测β-Actin的试剂。
在一实施例中,β-Actin引物序列包括上游引物F:SEQ ID No:55所示核苷酸序列;下游引物R:SEQ ID No:56所示核苷酸序列;探针序列为SEQ ID No:57所示核苷酸序列。
在一实施例中,所述试剂盒还包括以下组的一种或多种组分:dNTP、热启动Taq酶、反应液Buffer。
根据第二方面,在一实施例中,提供一种检测宫颈细胞基因甲基化的方法,包括:
转化步骤,对提取自待测样本的核酸进行转化,获得转化后的核酸;
扩增步骤,包括以转化后的核酸为模板,使用第一方面所述试剂盒进行PCR扩增,同时进行荧光采集。
在一实施例中,转化步骤中,所述转化包括重亚硫酸盐转化。重亚硫酸盐包括但不限于亚硫酸氢钠。
在一实施例中,转化步骤中,所述核酸为DNA。
在一实施例中,转化步骤中,所述待测样本包括但不限于如下细胞中的至少一种:1)人宫颈脱落细胞;2)从阴道分泌物、尿液、宫颈组织切片、血浆、血清、血液中分离的细胞。
在一实施例中,转化步骤中,所述PCR扩增包括依次进行预变性、变性、退火。
在一实施例中,扩增步骤中,PCR扩增反应程序如下:95℃~98℃预变性5min~15min;95℃~98℃变性10s~20s,55℃~60℃退火延伸40s~50s,45~50个循环。
在一实施例中,扩增步骤中,在退火时收集荧光信号。
在一实施例中,扩增步骤中,根据所述荧光信号,预测宫颈癌前病变发生的风险;
在一实施例中,扩增步骤中,PCR扩增后,通过ROC曲线对阳性判断值进行预测,如果至少一种靶标基因发生甲基化,则预测宫颈癌前病变CIN 2期及以上的发生为高风险;如果没有靶基因发生甲基化,则预测宫颈癌前病变CIN2期及以上的发生为低风险。
在一实施例中,所述靶基因包括如下基因中的至少一种:ATP10A、EPB41L3、PAX1、SOX1、ZNF582、HAS1;
在一实施例中,所述靶基因包括如下基因中的至少三种:ATP10A、EPB41L3、PAX1、SOX1、ZNF582、HAS1。
在一实施例中,所述靶基因包括如下三种:PAX1、SOX1、HAS1。
根据第三方面,在一实施例中,提供一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的核酸引物组合,所述核酸引物组合含有第一引物集至第六引物集中的至少一种引物集:
第一引物集含有如下引物对中的至少一种:
第一引物对:如SEQ ID No:1所示的上游引物;如SEQ ID No:2所示的下游引物;
第二引物对:如SEQ ID No:4所示的上游引物;如SEQ ID No:5所示的下游引物;
第三引物对:如SEQ ID No:7所示的上游引物;如SEQ ID No:8所示的下游引物。
第二引物集含有如下引物对中的至少一种:
第四引物对:如SEQ ID No:10所示的上游引物;如SEQ ID No:11所示的下游引物;
第五引物对:如SEQ ID No:13所示的上游引物;如SEQ ID No:14所示的下游引物;
第六引物对:如SEQ ID No:16所示的上游引物;如SEQ ID No:17所示的下游引物;
第三引物集含有如下引物对中的至少一种:
第七引物对:如SEQ ID No:19所示的上游引物;如SEQ ID No:20所示的下游引物;
第八引物对:如SEQ ID No:22所示的上游引物;如SEQ ID No:23所示的下游引物;
第九引物对:如SEQ ID No:25所示的上游引物;如SEQ ID No:26所示的下游引物;
第四引物集含有如下引物对中的至少一种:
第十引物对:如SEQ ID No:28所示的上游引物;如SEQ ID No:29所示的下游引物;
第十一引物对:如SEQ ID No:31所示的上游引物;如SEQ ID No:32所示的下游引物;
第十二引物对:如SEQ ID No:34所示的上游引物;如SEQ ID No:35所示的下游引物;
第五引物集含有如下引物对中的至少一种:
第十三引物对:如SEQ ID No:37所示的上游引物;如SEQ ID No:38所示的下游引物;
第十四引物对:如SEQ ID No:40所示的上游引物;如SEQ ID No:41所示的下游引物;
第十五引物对:如SEQ ID No:43所示的上游引物;如SEQ ID No:44所示的下游引物;
第六引物集含有如下引物对中的至少一种:
第十六引物对:如SEQ ID No:46所示的上游引物;如SEQ ID No:47所示的下游引物;
第十七引物对:如SEQ ID No:49所示的上游引物;如SEQ ID No:50所示的下游引物;
第十八引物对:如SEQ ID No:51所示的上游引物;如SEQ ID No:52所示的下游引物。
在一实施例中,所述核酸引物组合含有第一引物集至第六引物集中的至少两种引物集。
在一实施例中,所述核酸引物组合含有第一引物集至第六引物集中的至少三种引物集。
在一实施例中,所述核酸引物组合含有所述第三引物集、第四引物集、第六引物集。
根据第四方面,在一实施例中,提供一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的探针组合,所述探针组合含有至少一种以下探针集:
第一探针集:含有SEQ ID No:3、SEQ ID No:6、SEQ ID No:9所示序列或其互补序列中的至少一种;
第二探针集:含有SEQ ID No:12、SEQ ID No:15、SEQ ID No:18所示序列或其互补序列中的至少一种;
第三探针集:含有SEQ ID No:21、SEQ ID No:24、SEQ ID No:27所示序列或其互补序列中的至少一种;
第四探针集:含有SEQ ID No:30、SEQ ID No:33、SEQ ID No:36所示序列或其互补序列中的至少一种;
第五探针集:含有SEQ ID No:39、SEQ ID No:42、SEQ ID No:45所示序列或其互补序列中的至少一种;
第六探针集:含有SEQ ID No:48、SEQ ID No:51、SEQ ID No:54所示序列或其互补序列中的至少一种。
在一实施例中,所述探针组合含有第一探针集至第六探针集中的至少两种探针集。
在一实施例中,所述探针组合含有第一探针集至第六探针集中的至少三种探针集。
在一实施例中,所述探针组合含有第三探针集、第四探针集及第六探针集。
在一实施例中,所述探针组合用于多重PCR检测。
根据第五方面,在一实施例中,提供基因在制备疾病检测试剂中的用途,所述基因包括但不限于如下基因中的至少一种:ATP10A、EPB41L3、PAX1、SOX1、ZNF582、HAS1。
在一实施例中,所述基因包括如下基因中的至少三种:ATP10A、EPB41L3、PAX1、SOX1、ZNF582、HAS1。
在一实施例中,所述基因包括如下三种:PAX1、SOX1、HAS1。
在一实施例中,所述疾病包括但不限于癌症。
在一实施例中,所述疾病包括但不限于宫颈癌或宫颈癌前病变。
在一实施例中,提供一种检测宫颈细胞基因甲基化的方法,所述方法包括步骤:
步骤一:对待检测样本提取DNA;
步骤二:对待检测样本的DNA进行重亚硫酸盐转化,得到转化后的BisDNA;
步骤三:以所转化后待测样本BisDNA为模板,利用第一方面所述检测宫颈癌前病变及宫颈癌的试剂盒进行荧光定量PCR反应,得到检测结果。
在一实施例中,步骤一中,所述待检测样本为保存在细胞保存液中的女性宫颈脱落细胞或宫颈组织的石蜡切片。
在一实施例中,步骤二中,所述的待检测样本DNA,参与转化的模板体积为20μL。
在一实施例中,步骤三中,所述的待测样本BisDNA样本及阴性质控品和阳性质控品进行实时荧光定量PCR扩增反应,反应条件为:95℃变性15min;95℃变性15s,58℃退火和延伸45s,45个循环。
在一实施例中,筛选出一组检测宫颈细胞独特性的甲基化靶标基因组合,提高宫颈癌及宫颈癌前病变早期诊断的灵敏度和特异性。
在一实施例中,提供上述检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合在制备检测细胞基因甲基化的试剂盒中的应用。
在一实施例中,提供一种用于宫颈癌前病变及宫颈癌检测的诊断试剂或试剂盒,包括甲基化特异性荧光定量PCR反应液1和反应液2。采用多重qPCR技术提高检测效率高,可在2小时内出结果,结果客观易判读。
在一实施例中,本发明通过深入挖掘公共数据库资源,筛选中国人群宫颈癌前病变相关性大的靶标基因,且针对每种靶标基因设计多对引物探针。筛选出PCR扩增效率高、特异性强且稳定性好的引物探针对,最终得到3对可用于检测宫颈癌前病变的引物及对应探针序列。
在一实施例中,通过特异性的DNA甲基化生物标记物组合,配制成使用方便、检测结果可靠的试剂盒,设计出科学合理的PCR反应体系,使得本发明具有检测速度快的优势,直接针对样本进行荧光定量检测,操作简单;因此该方法特别适合在临床检验工作中普及应用。
在一实施例中,本发明提供的试剂盒采用多基因联合检测技术,可在一管反应液中检测多种靶标基因,避免了单基因检测的灵敏度和特异性低的特点;同时设置阴性质控品及阳性质控品,外控反应,监测反应是否成功,确保反应的有效性;设置内参基因的检测,防止因模板量不足造成的假阴性结果,也能监测因模板量过高可能造成的假阳性,最终确保试剂盒检测结果准确无误。
在一实施例中,本发明提供了一种检测宫颈癌前病变的方法,结合本发明提供的检测试剂盒,本方法检测CIN2及以上病例样本的灵敏度为88.21%,特异性为95.04%;显著提高了宫颈高级别病变及宫颈癌的检测灵敏度和特异性,充分显示了本发明在宫颈高级别病变及宫颈癌的预测能力方面的优势。
以下实施例中,宫颈脱落细胞样本的提取所用试剂盒为亚能生物公司生产的核酸提取试剂,操作流程为亚能生物公司所提供的操作流程,但用于宫颈脱落细胞提取的试剂及流程并不局限于上述。
以下实施例中,所用的甲基化修饰试剂盒为美国Zymo Res earch公司提供的EZDNA Methylation GoldTM Kit,但用于DNA的甲基化修饰的转化试剂及流程并不局限于上述。
以下实施例中,用于检测宫颈癌前病变检测试剂盒的实验方法为qPCR,但检测基因的甲基化表达水平的方法并不局限于qPCR。
实施例1
本实施例筛选了多个基因标志物和核酸片段,研究基因甲基化位点分布情况。本实施例中用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物对和探针,是根据美国国立生物技术信息中心NCBI公开的人类全基因组序列,使用Primer Express 3.0及MethylPrimer Expressv1.0设计,由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。本实施例筛选的6个核酸片段设计的引物探针序列如表1所示。
表1
实施例2:临床样本不同宫颈癌相关基因核酸片段的检测
本实施例的材料、试剂、仪器及检测步骤如下:
一、材料、试剂、仪器
本实施例采用的DNA提取试剂盒来自于亚能公司(产品名称:核酸提取试剂;厂家:亚能生物技术(深圳)有限公司);亚硫酸盐转化试剂盒购自于Zymo公司;PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶;荧光定量PCR仪为ABI7500。
二、样本收集
采集经金标准(阴道镜或组织病理)确定分期的96例宫颈脱落细胞样本,由宫颈刷采样拭子刷落的宫颈细胞保存在细胞保存液中(健康人37例;CIN 1期:11例;CIN 2期:14例;CIN 3期:19例;宫颈癌SCC:15例)。
本实施例使用的耗材及保存液为豪洛捷公司提供的Hologic-TCT保存液(20mL)+宫颈刷采样拭子。
三、DNA提取
取300μL~500μL的宫颈脱落细胞样本,用核酸提取试剂进行DNA提取及纯化。按照厂家操作说明书进行操作。
四、DNA转化及纯化流程
采用经第三步骤提取DNA为样本,用重亚硫酸盐转化试剂盒对基因组DNA进行重亚硫酸盐转化和纯化。经过处理后,DNA中发生了甲基化的CpG岛上的C碱基仍然保持为C碱基,而没有发生甲基化的CpG岛上的C碱基则变成了U碱基,最后得到转化后的BisDNA。本实施例中选择采用美国Zymo Research公司提供的的EZ DNA Methylation GoldTM Kit。
甲基化特异性荧光定量PCR
以转化得到的DNA溶液作为模板,以β-Actin作为内参基因;检测核酸组合进行PCR反应;PCR反应体系为20μL,具体组成如下;2μL模板DNA、10μL qPCR master mix、0.6μL正向引物(10μM)、0.6μL反向引物(10μM)、0.4μL探针(10μM)。上述PCR反应程序包括:95℃预变性15min;95℃变性15s,58~65℃退火延伸30s,45个循环。
五、检测结果
不同引物探针组合检测的6个靶标基因在不同分期的检出率如下。从检测的数据可知,所选择的6种核酸片段在宫颈癌症病人中均能较好的检出。结合多基因核酸片段联检,在CIN2及以上性能均优于单基因核酸片段检测性能(表2~表7)。
表2引物探针组1对应的不同病理分期不同核酸片段检出率(%)
表3引物探针组1对应的不同核酸片段针对CIN2期及以上的灵敏度及特异性(%)
靶标基因 | 灵敏度(%) | 特异性(%) |
PAX1 | 79.17 | 94.59 |
SOX1 | 54.17 | 94.59 |
HAS1 | 62.50 | 97.30 |
ZNF582 | 62.50 | 97.30 |
ATP10A | 58.33 | 100.00 |
EPB41L3 | 60.42 | 97.30 |
PAX1+SOX1 | 79.17 | 91.89 |
PAX1+ZNF582 | 81.25 | 91.89 |
PAX1+SOX1+ZNF582 | 81.25 | 91.89 |
PAX1+SOX1+HAS1 | 87.50 | 91.89 |
引物探针组1是指表1中SEQ ID No:1~3、SEQ ID No:13~15、SEQ ID No:22~24、SEQ ID No:28~30、SEQ ID No:37~39、SEQ ID No:52~54、SEQ ID No:55~57所示序列。
CIN2期及以上的病例包括CIN 2、CIN 3、SCC三种分期病例。
表4引物探针组2对应的不同病理分期不同核酸片段检出率(%)
靶标基因 | CIN1 | CIN2 | CIN3 | SCC |
PAX1 | 27.27 | 57.14 | 78.95 | 100.00 |
SOX1 | 36.36 | 7.14 | 57.89 | 93.33 |
HAS1 | 27.27 | 42.86 | 57.89 | 86.67 |
ZNF582 | 27.27 | 28.57 | 68.42 | 100.00 |
ATP10A | 18.18 | 35.71 | 52.63 | 86.67 |
EPB41L3 | 27.27 | 57.14 | 68.42 | 86.67 |
PAX1+SOX1 | 36.36 | 57.14 | 78.95 | 100.00 |
PAX1+ZNF582 | 27.27 | 57.14 | 84.21 | 100.00 |
PAX1+SOX1+ZNF582 | 27.27 | 57.14 | 84.21 | 100.00 |
PAX1+SOX1+HAS1 | 27.27 | 71.43 | 84.21 | 100.00 |
表5引物探针组2对应的不同核酸片段针对CIN2期及以上的灵敏度及特异性(%)
靶标基因 | 灵敏度(%) | 特异性(%) |
PAX1 | 79.17 | 89.58 |
SOX1 | 54.17 | 87.50 |
HAS1 | 62.50 | 91.67 |
ZNF582 | 66.67 | 89.58 |
ATP10A | 58.33 | 93.75 |
EPB41L3 | 70.83 | 87.50 |
PAX1+SOX1 | 79.17 | 85.42 |
PAX1+ZNF582 | 81.25 | 89.58 |
PAX1+SOX1+ZNF582 | 81.25 | 87.50 |
PAX1+SOX1+HAS1 | 85.42 | 87.50 |
引物探针组2是指表1中SEQ ID No:4~6、SEQ ID No:10~12、SEQ ID No:19~21、SEQ ID No:31~33、SEQ ID No:40~42、SEQ ID No:46~48、SEQ ID No:55~57所示序列。
表6引物探针组3对应的不同病理分期不同核酸片段检出率(%)
靶标基因 | CIN1 | CIN2 | CIN3 | SCC |
PAX1 | 18.18 | 50.00 | 78.95 | 100.00 |
SOX1 | 18.18 | 28.57 | 57.89 | 93.33 |
HAS1 | 27.27 | 42.86 | 57.89 | 86.67 |
ZNF582 | 9.09 | 21.43 | 63.16 | 100.00 |
ATP10A | 18.18 | 42.86 | 52.63 | 86.67 |
EPB41L3 | 27.27 | 50.00 | 68.42 | 86.67 |
PAX1+SOX1 | 27.27 | 57.14 | 78.95 | 100.00 |
PAX1+ZNF582 | 27.27 | 57.14 | 84.21 | 100.00 |
PAX1+SOX1+ZNF582 | 27.27 | 57.14 | 84.21 | 100.00 |
PAX1+SOX1+HAS1 | 27.27 | 71.43 | 78.95 | 100.00 |
表7引物探针组3对应的不同核酸片段针对CIN2期及以上的灵敏度及特异性(%)
靶标基因 | 灵敏度(%) | 特异性(%) |
PAX1 | 77.08 | 91.67 |
SOX1 | 60.42 | 91.67 |
HAS1 | 62.50 | 87.50 |
ZNF582 | 62.50 | 95.83 |
ATP10A | 60.42 | 87.50 |
EPB41L3 | 68.75 | 91.67 |
PAX1+SOX1 | 79.17 | 87.50 |
PAX1+ZNF582 | 81.25 | 87.50 |
PAX1+SOX1+ZNF582 | 81.25 | 87.50 |
PAX1+SOX1+HAS1 | 87.50 | 87.50 |
引物探针组3是指表1中SEQ ID No:7~9、SEQ ID No:16~18、SEQ ID No:25~27、SEQ ID No:34~36、SEQ ID No:43~45、SEQ ID No:49~51、SEQ ID No:55~57所示序列。
实施例3:一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒
本实施例为含有实施例1所设计的引物对和探针(实施例2中引物探针组1)、用于宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒。其中宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒组分表如表8。
表8试剂盒组分表
其中,引物探针混合液的配制见表9。
表9引物探针混合液组分表
实施例4:一种检测宫颈细胞基因甲基化的方法
本实施例采用实施例3所制备的试剂盒进行410例临床样本的检测。临床样本为已知明确病理信息结果且年龄不小于25岁女性的宫颈脱落细胞样本或组织蜡块;其中病理分期分类参照《2020年WHO第五版子宫颈肿瘤组织学分类》。健康样本(HV)为采集自未见上皮内病变及恶性病变的受试者的样本。样本详情见表10。
表10临床样本明确病理分期
分期 | HV | CIN 1 | CIN 2 | CIN 3 | SCC | 共计 |
样本量 | 112 | 45 | 35 | 16 | 202 | 410 |
本实施例的步骤如下:
步骤一:DNA提取参照实施例2进行。
步骤二:DNA转化及纯化均参照实施例2进行。
步骤三:甲基化特异性荧光定量PCR为使用BisDNA为模板,按照下表11配制反应体系。
表11反应液配制
组分 | 加入量(μL)/人份 |
反应液Ⅰ | 19 |
反应液Ⅱ | 1 |
BisDNA | 5 |
在ABI7500荧光定量PCR仪上运行如表12所示的荧光定量PCR反应条件。
表12荧光定量PCR反应程序
其中,在58℃设置荧光信号的收集;荧光通道设置为Texas Red、FAM、VIC、CY5,分别对应β-Actin、PAX1、SOX1及HAS1。参比荧光(Passive Reference)设置为none。
步骤四:结果分析
反应结束后自动保存结果,使用仪器配套软件自动分析结果,如果PCR扩增中三个靶标基因中的任一基因有扩增曲线,则计算其ΔCt值,ΔCt值为三个基因中的任一靶标基因的Ct值与β-Actin的Ct值之间的差值,差值的大小反映所检基因与β-Actin之间的相对定量。
步骤五:检测结果
根据样本病理结果,使用本甲基化检测试剂盒三种靶标基因片段在CIN 2期及以上有显著性差异。且随着病变级别升高,相对甲基化水平更高。
图1所示为采用引物探针组合1检测不同病变级别ΔCt值分布图。
图2所示为实施例4中三种目标基因检测的ΔCt值的ROC曲线分析图。
从图2可见,对比临床病理结果,使用实施例3的检测试剂盒得到的三个基因联合ROC曲线面积为0.9498,用于预测宫颈高级别病变(CIN2期及以上)的灵敏度为88.21%(95%CI 83.14%-91.95%),特异性为95.04%(95%CI 89.65%-97.80%)。从以上结果可以看出,本试剂盒能很好的助力宫颈高级别病变以及宫颈癌的诊断,实现与低级别病变以及炎症的分流,在一定程度上能减少患者不必要的阴道镜转诊。
在一实施例中,凡是涉及到提取人宫颈脱落细胞、从阴道分泌物、尿液、宫颈组织切片、血浆、血清、血液中分离的细胞DNA,并对DNA中的PAX1、SOX1及HAS1基因的甲基化水平进行检测,从而预测宫颈癌前病变的甲基化检测方法和检测试剂盒,都属于本发明保护的范围。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述,只是用于帮助理解本发明,并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员,依据本发明的思想,还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 亚能生物技术(深圳)有限公司
<120> 一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒
<130> 22I33457
<160> 57
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgcgttttg gggattgc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacgaaaacc gcgatcaa 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgcctaacc gacccaacgc 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgagtgatga taatttaaga ggtc 24
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctccataacc gcgtatcg 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgactcctc cgccgctcac 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcgttttaat ttgttgtcgt tttc 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcgaccaaat actaaacaca cc 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tcgccgctcg cccttaaccg 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcggttttac gaggtgcg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcgtcaaccc cactatcc 18
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgccccaaac ctcgaactct tcct 24
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcgagaggcg gaaaagtta 19
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgaacctaat ccccacgc 18
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgcccgaact ccctactaat ccca 24
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggcgtgggga ttaggttc 18
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
caaccctaaa ctacgacttc ctc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgaatctcct acgcaccgcc g 21
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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cggcggtagg ttttggag 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gacccaaccg cgaactaa 18
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cgctatacgc gacaacgaaa cgc 23
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gggcgtggag agtgttttg 19
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
caacgaaacg cgctaccg 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aacctaccgc cgccgctact a 21
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gtagcgcgtt tcgttgtc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cccgaaaacc gaaaaccg 18
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ggatcgagcg taggaggaa 19
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<213> 人工序列
<400> 30
tactatctcc tcgccgaccg cc 22
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
aagcggagtt gtaatttggt ta 22
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gatcgaaatc gccgtcttc 19
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ccgcaaccca aacgccctcg 20
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
cgatgtatag tatgatgatg gagatcg 27
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cccgacgaaa cccgaaaa 18
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
aaacctaaac gccgccgaac gaatac 26
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cggttttaag gtcgggttg 19
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cacaccgata ctacgccata 20
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
aaccgacgcc gcaatatctt ccg 23
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cggtgtgttt tgtgcgtttg 20
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ccccgacaac ccaaaacg 18
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tccaccacga taccgataaa ttcgccg 27
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ggtcggcggg aaatgtag 18
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
cgaaccgatt aaatctcaaa cctaaa 26
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
aacgtctcgc ctcatcgtcg ct 22
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ggggtgtcgt tggttttc 18
<210> 47
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<212> DNA
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cgccgatact ccaaatacg 19
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
aaactctacg ccaccaaata cgctaaa 27
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gcgttgatta ttttcgttta ttagga 26
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gcgcgaatac aacaaaacg 19
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
acgaacgcca aacactaacg caaatacg 28
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
tgggcgtcgg agtttatc 18
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
cgcacctacg aatcctca 18
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
caacgcctcc actaccaacc gc 22
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ggaggtaggg agtatatagg ttg 23
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
cacacaataa caaacacaaa ttcac 25
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
aaacttacta aacctcctcc atcaccaccc 30
Claims (15)
1.一种用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含有如下核酸引物探针组合:如SEQ ID No:22所示的上游引物;如SEQ ID No:23所示的下游引物;如SEQ ID No:24所示的探针;如SEQ ID No:28所示的上游引物;如SEQ ID No:29所示的下游引物;如SEQ ID No:30所示的探针;如SEQ ID No:52所示的上游引物;如SEQ ID No:53所示的下游引物;如SEQ ID No:54所示的探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸引物探针组合用于多重PCR检测。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,各探针的一个末端的核苷酸上修饰有荧光基团,另一个末端的核苷酸上修饰有淬灭基团。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,每种探针上的荧光基团发出的荧光波长互不相同。
5.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,各探针的5’末端核苷酸上修饰有荧光基团,3’末端核苷酸上修饰有淬灭基团。
6.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述荧光基团包括HEX、CY5、FAM、VIC、Texas Red、Tamara、JOE中的至少一种。
7.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种。
8.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还含有用于检测宫颈细胞基因甲基化的试剂;
所述试剂包括PCR反应液。
9.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR反应液含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+中的至少一种。
10.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括质控品。
11.如权利要求10所述的试剂盒,其特征在于,所述质控品包括阳性质控品、阴性质控品中的至少一种。
12.如权利要求11所述的试剂盒,其特征在于,所述阳性质控品包括人甲基化细胞系基因组DNA。
13.如权利要求11所述的试剂盒,其特征在于,所述阴性质控品包括人非甲基化细胞系基因组DNA。
14.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还含有内参基因以及用于扩增所述内参基因的引物、可特异性结合至所述内参基因的探针。
15.如权利要求14所述的试剂盒,其特征在于,所述内参基因包括β-Actin、GAPDH、U6、HMBS、B2M、TUBB、SDHA、18S rRNA、RPL4、PPIA,HPRT1、YWHAZ、RPP30、ERG中的至少一种。
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