CN110229908B

CN110229908B - 用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN110229908B
Application number: CN201910596928.3A
Authority: CN
Inventors: 刘亚宝; 刘春晖; 李佳
Original assignee: Sichuan Orienter Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Sichuan Orienter Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-07-03
Filing date: 2019-07-03
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2039-07-03
Also published as: CN110229908A

Abstract

本发明公开了一种用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针，包括用于检测CDO1基因甲基化的引物对和探针，引物对为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示序列，探针为SEQ ID No：3所示序列。其临床检测的敏感性大于77.6％，特异性大于98％，本发明还公开基于上述引物、探针的试剂盒，该试剂盒操作简单，试剂成本低。

Description

用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒。

背景技术

肺癌(lung cancer)是原发性支气管肺癌的简称，是临床常见恶性肿瘤之首位。据《Cancer Statistics in China,2015》报道，我国每年新发肺癌患者超过60万人，死亡人数超过50万，而总体五年生存率仅为16.1％，是死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌患者中男性约占71％，女性约占29％。肺癌主要分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，非小细胞肺癌又分鳞癌、腺癌、大细胞癌等，在我国非小细胞肺癌患者约占肺癌病例总数的85％。肺癌发生从45岁开始上升明显，肺癌的发生与遗传、环境、生活方式等因素息息相关，包括吸烟、空气污染、不良饮食习惯等。

DNA甲基化已成为公认的肿瘤发生的机制之一，DNA甲基化是在未改变DNA序列的情况下在CpG岛5'端胞嘧啶加上甲基基团，从而使该DNA的表达沉默，导致病变的发生。研究表明，肺癌可有多种基因的异常甲基化相关，这些基因的启动子发生高甲基化后被沉默，进而促进肺癌的形成与发展。研究显示，ANKRD18B、APC、DAPK、DACT2、FHIT、FOXL2、SHOX2、HOXA9、MPDZ、MFY6、MGMT、P16、PTGE4、PITX2、PCDHGB16、PCDHGA12、RASS1FA、SOX17、TAC1、TBX5、ZMYND10、ZAR1等基因甲基化与肺癌密切相关，因此可通过检测这类基因甲基化状态来判断是否有肺癌的发生。

目前业内公认早期检查肺癌的方法是低剂量螺旋CT，可以筛查几个毫米的肺部结节，辐射剂量低于普通CT，略高于传统X线胸片。低剂量螺旋CT筛查是收益与风险并存：首先是长期的每年CT复查不可避免地增加了辐射暴露风险；其次是高检出率意味着大量的肺小结节被发现，早期肺部结节并不全是肺癌，肺小结节肺癌恶性概率为0.5％～3.6％，发现并手术可能造成过度干预；最后CT检查也有自己的“盲区”，尤其是早期中央型肺癌、肺门增厚、肺结核疤痕等难以判断。2018年NCCN指南推荐50岁重度吸烟高危人群行肺癌CT筛查，而中低危患者不常规推荐CT筛查。基因甲基化检测可作为肺癌CT筛查的补充方法之一用于鉴别肺小结节良恶性和早期肺癌。

目前很多研究检测血液、痰液、肺泡灌洗液中的DNA是否发生甲基化的改变，从而判断是否有肺癌发生。尽管现有技术发现一些基因甲基化与肺癌具有相关性，但目前尚未有具有较高敏感性、特异性的诊断试剂可以提高肺癌的早期检出率。

肺癌基因甲基化检测的现有方法较多，如专利CN201610913371.8是检测SHOX2、RASS1FA、ANKRD18B和MPDZ基因甲基化的方法，专利CN201510203539.1是检测SHOX2和RASSF1A基因甲基化的方法，专利CN201510870528.9是用于检测与肺癌相关的SHOX2基因启动子区甲基化程度，专利CN201610298820.2是检测SHOX2、PTGE4和FOXL2基因中至少一个甲基化的方法，专利CN201510831357.9是检测PCDHGB16、HOXA9、MGMT基因甲基化和microRNA126的方法，专利CN200980108952.2是检测PCDHGA12基因甲基化的方法，专利CN201210009162.2是检测DACT2基因启动子区DNA甲基化状态方法，专利CN201710054973.7是加测SHOX2、PTGER4、PCDHGA12、HOXA9、FOXL2这5个基因甲基化的方法，专利CN201610740963.4是检测HOXA9、TBX5、PITX2、MFY6、ZMYND10、TAC1等基因甲基化的方法，专利CN201810886500.8是检测APC、DAPK、FHIT、FOXL2、P16、、HOXA9、MGMT、PTGE4、RASSF1A、SHOX2、SOX17、ZAR1中两种或两种以上基因甲基化的方法。这些方法联合检测的基因数量较多，虽然可以增加肺癌的检出率，但也会降低检测的特异性，同时多基因检测在实验操作上繁琐不便，试剂成本偏高。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明公开一种用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针，其临床检测的敏感性大于77.6％，特异性大于98％，本发明还公开基于上述引物、探针的试剂盒，该试剂盒操作简单，试剂成本低。

本发明通过下述技术方案实现：

用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针，包括用于检测CDO1基因甲基化的引物对和探针，引物对为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示序列，探针为SEQ ID No：3所示序列。

进一步的，还包括用于检测内参ACTB基因甲基化的引物对和探针，引物对为SEQID No：4和SEQ ID No：5所示序列，探针为SEQ ID No：6所示序列。

进一步的，还包括用于检测RASSF1A基因和/或SHOX2基因甲基化的引物对和探针，用于检测RASSF1A基因甲基化的引物对为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示序列，探针为SEQID No：9所示序列；用于检测SHOX2基因甲基化的引物对为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11所示序列，探针为SEQ ID No：12所示序列。

上述引物及探针的核苷酸序列如下表所示：

表1引物和探针序列表

进一步的，各所述探针的5'端标记有荧光报告染料，3'端标记有淬灭荧光染料，所述荧光报告染料选自FAM、HEX、VIC、JOE、TET、Cy3、Texas red、TEX-615和Cy5中的一种，所述淬灭荧光染料选自BHQ1、BHQ2、BHQ3和TAMRA中的一种。

一种用于早期检测肺癌基因甲基化的PCR扩增反应试剂盒，包括上述用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针。

进一步的，引物对的各引物的终浓度为100～300nM，探针的终浓度为100～150nM，DNA聚合酶为1～2U，镁离子浓度为2～4mM，dNTPs为50～200uM。

本发明提供的CDO1基因引物对/探针可用于单独检测。

本发明提供的CDO1、RASSF1A和SHOX2基因引物对/探针可用于联合检测。

本发明提供用于检测的阳性对照品、阴性对照品：其中阳性对照品采用肺癌细胞系基因组与健康人基因组DNA按照1:9比例混合；阳性对照品采用健康人基因组DNA。

本发明提供一种用于早期检测肺癌基因甲基化的方法，其特征在于，包括如下四个检测步骤：

步骤1，收集痰液或肺泡灌洗液样本，并提取DNA；

步骤2，对步骤1提取的DNA样本进行亚硫酸盐转化；

步骤3，采用说明书9～11段任一项所述的引物对和探针对步骤2亚硫酸盐转化后的DNA样本进行实时荧光PCR扩增反应；

步骤4，对步骤3荧光信号的结果判定。

所述步骤3中PCR扩增的反应条件是：采用实时荧光PCR仪，95℃变性15min；95℃变性3～30s，55～60℃退火和延伸10～30s，45个循环。

所述步骤4中，结果判定方法如下：

当CDO1基因单独检测时，ACTB的CT值≦37，本次检测有效；如果ACTB的CT值>37，视为无效样本。在检测有效情况下，若CDO1基因CT值≦40，则样本的测试结果为“阳性”；若CDO1基因CT值>40或出现非典型扩增曲线，则样本的测试结果为“阴性”。

当CDO1、RASSF1A和SHOX2基因联合检测时，ACTB的CT值≦37，本次检测有效；如果ACTB的CT值>37，视为无效样本。在检测有效情况下，若CDO1、RASSF1A和SHOX2基因中任何一个基因的CT值≦40，则样本的测试结果为“阳性”；若CDO1、RASSF1A和SHOX2基因的CT值均>40或出现非典型扩增曲线，则样本的测试结果为“阴性”。

本发明的样本为患者痰液或肺泡灌洗液，取样方便、无创，并具有QPCR高灵敏度和特异性的优点，结果直观检测PCR过程中的变化。

本发明方法采用多重荧光PCR检测技术，只需要一个PCR管即可完成检测。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针，可利用CDO1基因引物对和探针进行单独检测，其临床检测的敏感性大于77.6％，特异性大于98％，相比现有肺癌基因甲基化检测试剂而言，灵敏度和特异性更高、试剂种类少，简化了操作流程，节约试剂成本；

2、本发明用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针，可利用CDO1、RASSF1A和SHOX2基因引物对和探针进行联合检测，其临床检测的敏感性大于83.6％，特异性大于98％，敏感性更好，特异性具有优势，适合用于肺癌早筛；

3、本发明一种用于早期检测肺癌基因甲基化的PCR扩增反应试剂盒，基于荧光PCR方法，采用Taqman探针法定性检测人痰液或肺泡灌洗液中CDO1等基因的甲基化状态，对肺癌的早期辅助诊断提供参考，为肺癌高风险人群提供了一种无创检测肺癌的选择，检测速度快，步骤简单。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

本实施例提供各检测探针所标记荧光报告染料和有荧光淬灭染料的描述信息，具体如下：

当CDO1单独检测时，用于检测CDO1基因甲基化的引物对为SEQ ID No：1和SEQ IDNo：2所示序列，探针为HEX-TTTGCGACGATATTTTTACGTTTCGGTATTT-BHQ1；用于检测内参ACTB的引物对为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5所示序列，探针为FAM-ATATTGGTTCGTGTGATAAGGTTATGAGGTTG-BHQ1。

当CDO1、RASSF1A和SHOX2联合检测时，用于检测CDO1基因甲基化的引物对为SEQID No：1和SEQ ID No：2所示序列，探针为HEX-TTTGCGACGATATTTTTACGTTTCGGTATTT-BHQ1；用于检测内参ACTB的引物对为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5所示序列，探针为FAM-ATATTGGTTCGTGTGATAAGGTTATGAGGTTG-BHQ1；用于检测RASSF1A基因甲基化的引物对为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示序列，探针为Texas red-TTTCGTTCGGTTCGCGTTTGTTAGC-BHQ2；用于检测SHOX2基因甲基化的引物对为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11所示序列，探针为Cy5-ACGTGCGGCGGCGATG-BHQ3；

实施例2

本实施例提供含有实施例1所述的引物对和探针的PCR扩增反应试剂、阳性对照品和阴性对照品：

1.PCR扩增反应试剂：引物对的各引物的终浓度均为200nM，探针的终浓度均为150nM，DNA聚合酶为1U，镁离子浓度为2mM，dNTPs为100uM。

2.阳性对照品：浓度10ng/ul，采用肺癌细胞系MSTO-211H基因组DNA与健康人基因组DNA按照1:9比例混合；

3.阴性对照品：浓度10ng/ul的健康人基因组DNA。

实施例3

本实施例为采用实施例2所述的PCR扩增反应试剂进行早期检测肺癌的方法。

1.样本的收集

1.1阴性样本的收集：取年龄在20～35间，无肺癌家族史、肺癌疾病史的健康人群20例肺泡灌洗液样本。

1.2肺癌患者样本的收集：取临床上经细胞学鉴定为肺癌患者的肺泡灌洗液样本67例，其中，男性31例，女性36，年龄范围45～87岁，中位年龄62岁；其中鳞癌19例、腺癌23例、细支气管肺泡癌21例、小细胞肺癌4例。

2.肺泡灌洗液样本DNA的提取

2.1将新鲜的肺泡灌洗液放入50ml离心管中，以3000rpm离心5-10分钟，弃上清液，留取沉淀。

2.2按照血液组织细胞基因组提取试剂盒(天根生化)操作说明的方法提取沉淀中的DNA。

2.3提取完成后，样本DNA收集于1.5ml EP管中待用。

3.样本DNA的亚硫酸盐转化

按照EZ DNA甲基化试剂盒((TheEZDNAMethylationKit，ZYMO Research，USA)操作说明的方法进行亚硫酸盐转化。具体如下：

3.1阴性对照品、阳性对照品和肺泡灌洗液样本DNA按照相同的方法进行亚硫酸盐转化。

3.2在PCR管中加入20ul提取的样本DNA(或阴、阳对照品)和130ul亚硫酸盐转化液(现配现用)，混匀后盖紧盖子。

3.3在PCR仪器上进行反应。反应条件为95度10分钟，65度150分钟，然后降温至室温。

3.4在核酸纯化柱上加入600ul结合液，再将反应后溶液加入纯化柱中，盖紧盖子混匀，12000rpm离心30秒，弃废液。

3.5加入500ul洗涤液，12000rpm离心30秒，弃废液。

3.6加入200ul脱硫试剂，室温静置20分钟。12000rpm离心30秒，弃废液。

3.7加入500ul洗涤液，12000rpm离心30秒，弃废液。重复本步骤一次。

3.8将纯化柱转移至1.5ml EP管中，向纯化柱膜中央加入20ul洗脱液，静置2分钟。

3.9 12000rpm离心30秒，弃纯化柱，转化后DNA样本收集于1.5ml EP管中待用。

4.样本DNA的PCR扩增

4.1样本加样：取2ul亚硫酸盐转化后的DNA模版加入到18ul的PCR扩增反应试剂中，其中引物对的各引物的终浓度均为200nM，探针的终浓度均为150nM。DNA聚合酶为1U，镁离子浓度为2mM，dNTPs为100uM。

4.2 QPCR反应条件：QPCR扩增的反应条件是95℃变性15min；95℃变性3s，57℃退火和延伸20s，共45个循环。

4.3.检测的结果判定：

当CDO1单独检测时，ACTB的CT值≦37，本次检测有效；如果ACTB的CT值>37，视为无效样本。在检测有效情况下，若CDO1基因CT值≦40，则样本的测试结果为“阳性”；若CDO1基因CT值>40或出现非典型扩增曲线，则样本的测试结果为“阴性”。

当CDO1、RASSF1A和SHOX2联合检测时，ACTB的CT值≦37，本次检测有效；如果ACTB的CT值>37，视为无效样本。在检测有效情况下，若CDO1、RASSF1A和SHOX2基因中任何一个基因的CT值≦40，则样本的测试结果为“阳性”；若CDO1、RASSF1A和SHOX2基因的CT值均>40或出现非典型扩增曲线，则样本的测试结果为“阴性”。

5.临床样本的检测结果统计

对20例健康人肺泡灌洗液样本、67例肺癌患者肺泡灌洗液样本的检测结果进行统计：当CDO1单独检测时，本发明试剂盒对肺癌样本的敏感性为77.6％，特异性为100％；当CDO1、RASSF1A和SHOX2联合检测时，本发明试剂盒对肺癌样本的敏感性为83.6％，特异性为100％。

表二：CDO1检测的结果统计

表三：CDO1、RASSF1A和SHOX2检测的结果统计

由上述实施例可知，本发明提供一种可定性检测人痰液或肺泡灌洗液样本中CDO1基因甲基化状态的引物、探针及其方法，为肺癌的早期辅助诊断提供参考。与常规的肺癌诊断方法相比，本发明充分利用了DNA提取、DNA甲基化处理和QPCR甲基化检测技术，开发出具有无创的、高灵敏度性、高特异性的检测方法，可对肺癌进行早期无创筛查。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川沃文特生物技术有限公司

<120> 用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> CDO1基因甲基化的正向引物(1)

<400> 1

gttgttaggg gtttgggg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> CDO1基因甲基化的反向引物(2)

<400> 2

aaacacacac gcacaaac 18

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> CDO1基因甲基化的探针(3)

<400> 3

tttgcgacga tatttttacg tttcggtatt t 31

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> ACTB基因甲基化的正向引物(4)

<400> 4

agtgttgtgg gtgtaggta 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> ACTB基因甲基化的反向引物(5)

<400> 5

cacctactta atacacactc caa 23

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> ACTB基因甲基化的探针(6)

<400> 6

atattggttc gtgtgataag gttatgaggt tg 32

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> RASSF1A基因甲基化的正向引物(7)

<400> 7

gtttagtttg gattttgggg g 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> RASSF1A基因甲基化的反向引物(8 )

<400> 8

caactcaata aactcaaact ccc 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> RASSF1A基因甲基化的探针(9)

<400> 9

tttcgttcgg ttcgcgtttg ttagc 25

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> SHOX2 基因甲基化的正向引物(10 )

<400> 10

gttttgttgg tagaggttga g 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> SHOX2基因甲基化的反向引物(11)

<400> 11

cctccttctt ctccttcac 19

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> SHOX2基因甲基化的探针(12)

<400> 12

acgtgcggcg gcgatg 16

Claims

1.用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针，其特征在于，包括用于检测CDO1基因甲基化的引物对和探针，引物对为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示序列，探针为SEQ ID No：3所示序列。

2.根据权利要求1所述的用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针，其特征在于，还包括用于检测内参ACTB基因甲基化的引物对和探针，引物对为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5所示序列，探针为SEQ ID No：6所示序列。

3.根据权利要求1或2所述的用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针，其特征在于，还包括用于检测RASSF1A基因和/或SHOX2基因甲基化的引物对和探针，用于检测RASSF1A基因甲基化的引物对为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示序列，探针为SEQ ID No：9所示序列；用于检测SHOX2基因甲基化的引物对为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11所示序列，探针为SEQID No：12所示序列。

4.根据权利要求3所述的用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针，其特征在于，各所述探针的5'端标记有荧光报告染料，3'端标记有淬灭荧光染料，所述荧光报告染料选自FAM、HEX、VIC、JOE、TET、Cy3、Texas red、TEX-615和Cy5中的一种，所述淬灭荧光染料选自BHQ1、BHQ2、BHQ3和TAMRA中的一种。

5.一种用于早期检测肺癌基因甲基化的PCR扩增反应试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～4中任一项所述的用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针。

6.根据权利要求5所述的一种用于早期检测肺癌基因甲基化的PCR扩增反应试剂盒，其特征在于，引物对的各引物的终浓度为100～300nM，探针的终浓度为100～150nM，DNA聚合酶为1～2U，镁离子浓度为2～4mM，dNTPs为50～200uM。