CN102628087A

CN102628087A - 肝癌早期预警和筛查试剂

Info

Publication number: CN102628087A
Application number: CN2012101245098A
Authority: CN
Inventors: 覃扬; 黄文庆; 魏玲; 沈文燕; 李冉; 刘秋英
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2032-04-25
Also published as: CN102628087B

Abstract

本发明要解决的技术问题是提供一种检测离体样本中抑癌基因启动区启动区CpG岛甲基化情况的试剂。本发明解决该技术问题的技术方案是提供了一种肝癌早期预警和筛查试剂盒。该试剂盒包括有能检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂。本发明该试剂盒，如果单独检查ELF基因的甲基化，其检出率可达64.70％。而本发明进一步地将其与其余的抑癌基因的启动区CpG岛甲基化检测试剂合用得到新的复合检测试剂盒，检出率可达93.55％。实践中还可将本发明试剂盒与血清AFP400检查的试剂盒连用，以获得更准确的效果。

Description

肝癌早期预警和筛查试剂

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种可用于肝癌早期预警和筛查的试剂及以其为组成部分制成制备的试剂盒。

背景技术

人原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，由于其预后非常差，成为癌症死亡的第三大原因。HCC在非洲的西部和中部、亚洲的东部和南部发病率最高，其中仅中国发病患者占55％，近年在美国的发病率也逐渐升高。中国高发的主要危险因素是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的慢性感染，大多数患者的发病进展过程表现为慢性肝炎(chronic hepatitis，CH)、肝硬化(liver cirrhosis，LC)到HCC的发展进程。中国每年大约有25万人死于肝癌，位居癌症死亡原因的第二位，是严重威胁人类健康的恶性疾病。

HCC患者，通常由于诊断较晚而预后很差，事实上80％以上肝癌患者被诊断时肿瘤已进入中晚期而失去手术机会，而HCC首选的治疗方案就是肝癌切除和肝脏移植手术，因此早期诊断就显得尤为重要。然而。目前临床上早期筛查HCC的主要指标是血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平和影像学B超监测，但是一部分HCC患者血清AFP长期保持低水平(＜20ng/ml)，而B超在检测和进一步判断结节的特征时有一定的局限性，从而影响到肝癌早期诊断的灵敏性。

尽管HCC发病的分子机制尚未明确，已证实表观遗传学改变，尤其是DNA的甲基化在其发生发展中发挥重要作用。抑癌基因的基因沉默，也被认为是HCC发生的早期事件，并且有文献报道在LC中也发现抑癌基因的基因沉默。有研究认为，部分抑癌基因的异常甲基化与肝癌的发展进程密切相关，部分抑癌基因的异常甲基化在正常肝和慢性肝炎阶段未发现，肝硬化(liver cirrhosis，LC)开始出现，到HCC阶段有累加的趋势。

RASSF相关区域家族1A基因(ras-association domain family 1A，RASSF1A)是在Ras信号通路中发挥调节作用的抑癌基因。RASSF1A基因的表达可以调节细胞增殖，诱导凋亡，并能够在细胞周期中和微管相结合，增加微管蛋白的稳定性。p16是在细胞周期检测点G1-S起调节作用的抑癌基因，其表达蛋白能够结合到周期素依赖性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)从而抑制CDK4发挥作用，阻止细胞由G1期进入S期，抑制细胞过度增殖，在体内能够抑制肿瘤细胞的增殖³⁰。GSTP1(glutathione S-transferase p1)基因是一种重要的DNA损伤修复基因，属于抑癌基因，其编码的蛋白GST(谷光甘肽转移酶)π类酶属于体内II相代谢解毒酶家族，参与代谢、解毒和消除潜在具有基因毒性的外来复合物，起到保护细胞、避免DNA损伤和癌细胞形成的作用。GSTP1的表观遗传性沉默在乙肝病毒相关的肝癌中起到重要作用。E型钙粘附分子(E-cadherin)基因是一种关键的细胞粘附分子，属于抑癌基因，其表达蛋白能够与细胞骨架结合，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。已证实HCC癌组织中存在以上四个基因启动子区启动区CpG岛异常甲基化，这些基因甲基化所致的基因沉默在肝癌的发生发展中可能起着重要作用。

胚肝血影蛋白(embryonic liver fodrin，ELF)是一种新发现的β血影蛋白(3Spectrin)，在TGF-β信号通路中与Smad3/4相互作用，缺失ELF则Smad3/4不能定位。文献报道，抑癌基因ELF在正常肝组织中表达，而肝癌干细胞及肝癌组织中表达下调，并且在敲除ELF基因的小鼠中，40％自发产生肝癌，表明ELF在肝癌发生的早期发挥重要作用，但ELF在肝癌组织中表达下调的原因尚未明确。

正常人循环血液中存在少量游离DNA(约10ng/ml)，而肿瘤患者血浆DNA水平远远高于正常人(超过100ng/ml)。肿瘤患者循环血中游离DNA主要是肿瘤细胞凋亡或组织坏死后释放，并且保持有肿瘤细胞DNA的生物学特征改变。检测外周血游离DNA中基因甲基化的状态可能反应出患者肿瘤细胞的甲基化状态。鉴于理想的分子标志物应该出现在疾病发生的早期并且在无创性标本中可被检测，所以有研究致力于检测外周血浆或血清游离DNA的表观遗传学改变，但是目前关于肝癌从正常肝组织、CH、LC到HCC发展各阶段患者血浆游离DNA甲基化状态的系统性信息非常有限。肝组织活检虽为HCC诊断的金标准，但是会给患者带来较大创伤和风险，所以迫切需要寻找高灵敏度和无创性的早期检测手段。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测离体样本中抑癌基因启动区启动区CpG岛甲基化情况的试剂。

本发明解决该技术问题的技术方案是提供了一种肝癌早期预警和筛查试剂。该试剂包括有能检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述的检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括独立包装的扩增甲基化的人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述的扩增甲基化的人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物为：

正义链引物：5’-GGCGAGTGGTTTTTGATAAAATTATAAAT-3’；

反义链引物：5’-ACATACCACGATTACCGAACCCGAA-3’。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述的检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂还包括独立包装的扩增非甲基化的人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述的扩增非甲基化的人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物：

正义链引物：5’-GGTGAGTGGTTTTTGATAAAATTATAAATT-3’；

反义链引物：5’-ACATACCACAATTACCAAACCCAAA-3’。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述的检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂还包括独立包装的预扩增人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述的预扩增人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物：

正义链引物：5’-GGAGGGAAGGAAGGGTAAG-3’；

反义链引物：5’-CAACTCAATAAACTCAAACTCCC-3’。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述的检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂还包括独立包装的分离血浆游离DNA的试剂。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述的检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂还包括将DNA链上的胞嘧啶转变成尿嘧啶的试剂。优选为亚硫酸氢钠。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中还包括能检测人RASSF1A基因、人p16基因、人GSTP1基因、人E-cadherin基因中至少3种基因的启动区CpG岛甲基化状态的试剂。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述能检测人RASSF1A基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括甲基化特异引物：上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述能检测人p16基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括甲基化特异引物：上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.15所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.16所示。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述能检测人GSTP1基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括甲基化特异引物：上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.21所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.22所示。

其中，上述的早期预警和筛查试剂中所述能检测人E-cadherin基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括甲基化特异引物：上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.27所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.28所示。

在上述发明的基础上，本发明还提供了一种更为优化的肝癌早期预警和筛查试剂。该肝癌早期预警和筛查试剂含有检测人胚肝血影蛋白启动区CpG岛甲基化状态的试剂，以及含有检测人RASSF1A基因、人p16基因、人GSTP1基因、人E-cadherin基因等4种基因中至少3种基因的启动区CpG岛的甲基化状态的试剂。

其中，检测所述各基因的启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括如表1所示的预扩增各基因启动区CpG岛的PCR引物、针对各基因启动区CPG岛的甲基化特异性PCR引物和针对各基因启动区CPG岛的非甲基化特异性PCR引物：

表1

表中的PAN，表示为预扩增启动区CPG岛的PCR引物。

表中的MSP，即methylation-specific PCR，表示针对启动区CPG岛的甲基化特异性PCR引物。

表中的USP，即unmethylation-specific PCR，表示针对启动区CPG岛的非甲基化特异性PCR引物。

进一步的，上述的肝癌早期预警和筛查试剂盒还包括有将DNA链上的胞嘧啶转变成尿嘧啶的试剂。

上述将DNA链上的胞嘧啶转变成尿嘧啶的试剂可以使用本领域常用试剂，并按常用的已经报道的方法将胞嘧啶转变成尿嘧啶。最常用的试剂亚硫酸氢钠。

进一步的，上述的肝癌早期预警和筛查试剂盒还包括独立包装的制取离体血浆中游离DNA的试剂。可以使用本领域的常规试剂或商品试剂盒，按现有方法即可完成离体血浆中游离DNA的制取。

本发明还提供了上述的肝癌早期预警和筛查试剂盒在制备肝癌预警或筛查试剂盒、或在制备肝硬化预警或筛查试剂盒中的用途。

本发明也还提供了，由上述的肝癌早期预警和筛查试剂为主要成分制备而成的肝癌或肝硬化预警或筛查试剂盒。

本发明的有益效果在于：本发明创造性地提供了能有效进行肝癌尤其是早期肝癌以及肝硬化预警和筛查的试剂盒，该试剂盒如果单独检查ELF基因的甲基化，其检出率为64.70％左右，明显高于目前通用的AFP₄₀₀检查(检出率为48.39％左右)。而本发明进一步的将其与其余的抑癌基因的启动区CPG岛甲基化检测试剂合用得到新的复合检测试剂盒，该试剂盒的检出率可达93.55％，明显高于AFP₄₀₀检查和其他的复合检测试剂。实践中还可将本发明试剂盒与血清AFP₄₀₀检查的试剂盒连用，以获得更准确的效果。本发明为本领域早期肝癌以及肝硬化预警和筛查提供了新的有效选择，且成本低，使用起来也非常方便，避免了给患者带来痛苦，具有很好的应用前景。

附图说明

图1、ELF基因启动子PCR产物。M，DNA分子量标准DL2000；W，阴性对照的水；N1，N4，ELF启动子PCR产物。

图2、重组载体PMD19-T-vector-FLFpro.的限制性酶切图谱分析。M，DL2000；1，Pst I和Xba I双酶切的PMD19-T-vector-ELF；2，Pst I和Xba I双酶切的PMD19-T-vector做对照。

图3、重组载体PMD19-T-vector-ELFpro的Hpa II酶切分析。M，DL2000；1，重组载体PMD19-T-vector-ELFpro；2，重组载体PMD19-T-vector-ELFpro+Hpa II；3M.SssI甲基化酶修饰后的重组载体PMD19-T-vector-ELFpro^m+Hpa II。

图4、代表性的细胞、肝癌组织、肝硬化组织和血浆基因组DNA电泳图。Huh-7，Huh-7细胞系；T47D，T47D细胞系；MCF-7，MCF-7细胞系；435，MDA-MB-435细胞系；HCC，人肝癌；T，肿瘤，Non，肺肿瘤，LC，肝硬化；Pla，血浆标本.M，λ-Hind III DNA分子量标准。

图5、MSP分析人肝癌和肝硬化患者的肝组织和血浆标本中RASSF1A，p16，GSTP1，E-cadherin和ELF基因的甲基化状态。M，分质量标准；W，水阴性对照；Pos，DNA甲基化阳性细胞系的MSP产物或甲基化阳性的质粒MSP产物作为阳性对照(Huh-7为RASSF1A阳性，T47D为p16阳性，MCF-7为GSTP1阳性以及MDA-MB-435为E-cadherin阳性，PMD19-T-vector-ELFpro^m为ELF阳性)；Neg，正常人肝的非甲基化PCR产物作为阴性对照；m，甲基化；u，非甲基化。(A)具有代表性的2个HCC患者的肿瘤、非肿瘤以及相应配对的血浆标本的DNA甲基化状态。T，肿瘤，Non，非肿瘤，P，血浆.(B)代表性的2个肝硬化患者、1个意外死亡的正常肝以及良性病变的肝组织和相应配对的血浆标本的DNA甲基化状态。C，肝硬化；N2，，正常肝；N5，良性病变肝；Tis，组织。(m)：甲基化；(u)：非甲基化；MSP产物在2.0％琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色观察。

图6、肝组织和血浆标本RASSF1A，p16，GSTP1，E-cadherin and ELF基因甲基化分析总结。黑色框代表甲基化，白色框代表非甲基化。T：肿瘤组织；N：配对癌旁非肿瘤组织；P：血浆；No^*：甲基化例数；CDH1，E-cadherin；nd.：未检测。其中A为肝癌患者的肿瘤、非肿瘤组织以及血浆的MSP结果；B为肝硬化患者的肝硬化组织和血浆的MSP结果；C为正常肝组织和良性病患者血浆的MSP结果。

图7、肝癌组织结构。HCC，肝癌；Non，非癌组织；LC，肝硬化。左边均为HE 10×10，右边均为HE 10×40。

具体实施方式

本发明的基础研究中首次发现ELF基因第一外显子上游启动子区存在CpG岛，并首次发现其可能参与ELF的基因表达调控，进而深入研究确定了ELF基因沉默对癌症的影响是与其启动区CPG岛的甲基化成正相关。关于肝癌中ELF基因启动区启动区CpG岛甲基化状态及其与ELF表达下降的关系尚未见文献报道；关于ELF基因启动子区完全甲基化的细胞系也未见报道。

故本发明构建了ELF启动子区完全甲基化的模板，为进一步研究ELF甲基化/去甲基化奠定实验基础。然后作为本发明采用了巢式甲基化特异性PCR(nested methylation-specificPCR，nested-MSP)检测了34例HCC的癌组织、对应远癌组织及10例LC患者的肝硬化组织，31例HCC患者血浆及10例LC患者血浆中ELF、RASSF1A、p16、GSTP1和E-cadherin基因启动子区启动区CpG岛的甲基化状态，并分析基因的甲基化状态与患者临床病理参数的相关性。研究了HCC发生发展进程各阶段患者的肝组织及血浆DNA甲基化状态。寻找灵敏性较高的无创性血浆生物分子标志物，用于HCC早期诊断及LC患者的监测以对早期肝癌进行高危预警。

经过试验证明，人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态与肝硬化及肝癌的早期发生具有很大的相关性，是一种灵敏性较高的无创性血浆生物分子标志物，可以用于HCC早期诊断及LC患者的监测以对早期肝癌进行高危预警。

在本发明披露的信息基础上，本领域技术人员能够通过本领域现有的技术得到和实施本发明要求保护的各个技术方案。即获得包括有能检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的肝癌早期预警和筛查试剂。所述的早期预警和筛查试剂中包括独立包装的扩增甲基化的人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物。

上述的早期预警和筛查试剂中还包括独立包装的扩增非甲基化的人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物。

上述的早期预警和筛查试剂中还可包括独立包装的预扩增人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物。

当然，上述的早期预警和筛查试剂中还包括独立包装的分离血浆游离DNA的试剂。或者也可以包括将DNA链上的胞嘧啶转变成尿嘧啶的试剂。优选为亚硫酸氢钠。而这些试剂都是本领域的常规试剂，其使用方法也都是大家所知晓的。本发明的实施例中也对这些试剂的配合使用进行了详细的说明。

使用上述试剂，其检出率为64.70％左右，明显高于我们使用目前通用的AFP₄₀₀得到48.39％左右的检出率。在上述技术方案的基础上，本发明还进一步的提供了一种更为优化的试剂。该试剂是在上述的早期预警和筛查试剂中还包括了单独包装的，能检测人RASSF1A基因、人p16基因、人GSTP1基因、人E-cadherin基因中至少3种基因的启动区CpG岛甲基化状态的试剂。

进一步的，分别的能检测上述4种基因各自的启动区CpG岛的甲基化状态的试剂，主要包括各自的甲基化特异引物。进而还可包括各自的非甲基化特异性引物。更进一步的是还可分别包括预扩增各个基因启动区CpG岛的引物。

当然，本领域技术人员这些改进的试剂中同样可以还包括独立包装的分离血浆游离DNA的试剂。或者也可以包括将DNA链上的胞嘧啶转变成尿嘧啶的试剂。其优选为亚硫酸氢钠。而这些试剂都是本领域的常规试剂，其使用方法也都是大家所知晓的。本发明的实施例中也对这些试剂的配合使用进行了详细的说明。这些试剂当然也可以是另外购买，与本发明上述提供的试剂进行配合使用的。

而使用这样的改进所获得的试剂，能够使得检出率达93.55％，明显高于AFP₄₀₀检查和其他的复合检测试剂。

故本领域技术人员根据现有的试剂盒的制备要求和规范，可以容易地以上述提供的试剂为基础，进行相应的组合和包装，制得能达到上述效果的相应的肝癌或肝硬化预警或筛查试剂盒，。这是本领域技术人员在本发明披露的信息的基础上，根据现有技术能够完成的，无需在此赘述。

主要实验仪器设备与器材：恒温空气摇床(Ampere chart MultitronII)；隔水式恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；-80℃低温冰箱(SANYO)；凝胶成像系统(Bio-Rad)；台式高速离心机(Hettich)；TG16-W微量台式离心机(湘仪离心机有限公司)；3-18K冷冻台式离心机(Sigma)、J2-21冷冻离心机(Beckman)；Smart Spec紫外分光光度仪(Bio-Rad)；Mygene 25型PCR仪(LongGene)：电泳槽、电泳仪(PHARMACIA)；Type 16700漩涡振荡器(Thermolyne)；PH计(pH meter345 Corin)；LH506-2恒温水浴箱(上海科乐理化机械公司)；DHG-9030电热恒温鼓风干燥箱(上海鸿都电子科技公司)；ECLPS E600倒置显微镜(Nikon)；倒置荧光显微镜：Olympus；SW-CJ-IF超净工作台(苏净公司)；MCO-15A型CO2培养箱(SANYO)。

实施例一甲基化ELF基因启动子调控区的克隆和鉴定

抑癌基因ELF在正常肝组织中表达，而肝癌干细胞及肝癌组织中表达下调，并在小鼠敲除ELF基因导致自发产生肝癌，说明ELF在肝癌发生的早期起着重要作用。自然条件下ELF基因沉默的调控机制尚不清楚。本发明从DNA甲基化的角度探讨ELF基因启动子区启动区CpG岛的甲基化状态与HCC的关系，为进一步分析肿瘤组织及体液标本中ELF基因启动子区甲基化状态奠定实验基础。

本实施例通过PCR方法扩增ELF基因启动子区调控序列(ELFpro，435bp)，然后将扩增的序列克隆到pMD19-T载体上，转化DH5α细菌。经鉴定的重组质粒用CpG甲基化酶M.SssI进行甲基化修饰，使核苷酸序列中所有启动区CpG岛发生甲基化，构建含有ELF基因启动子区完全甲基化的重组质粒(pMD19-T-vector-ELFprom)，为进一步进行ELF基因甲基化/去甲基化的研究奠定实验基础。

1、实验方法

1.1引物设计

确定ELF基因启动子区CpG序列，参照ELF基因组全序列(GeneBank number：NC_000002)及引物设计原则，利用引物软件Primer 5.O设计扩增ELF基因启动子区启动区CpG岛的引物，扩增基因启动子片段435bp(SEQ ID No.31)，PCR产物全长不包括限制性内切酶Xba I及Pst I的酶切位点。引物序列如下：

5’-TCTGTTTGGGAAGGCACTAC-3’(Sense)，Tm：57.2，GC(％)：50％；

5’-TTCTTGCTTTCCCTTCTTCC-3’(Atisense)，Tm：55.6，GC(％)：45％。

1.2ELF基因PCR扩增、鉴定、纯化、克隆及鉴定

以来自意外死亡健康成人肝组织DNA为模板进行PCR扩增。每个PCR反应体系组成：300ng DNA模板、1×PCR反应液buffer、dNTP各0.1mmol/L、上下游引物各0.4μmol/L、1.5mmol/L MgCl₂、2.0U的Taq DNA聚合酶，用灭菌双蒸水补足总体积50μl，混匀后瞬时离心去除管盖内壁水珠。PCR反应条件为：

制备10g/L琼脂糖凝胶，10μl PCR反应产物上样电泳，EB染色凝胶成像系统拍照观察。上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(购于康迪生物公司纯化)，连接于pMD19-T载体，转化DH5α菌，提取质粒DNA，用限制性内切酶Xba I及Pst I鉴定重组克隆。

1.3重组体的甲基化及鉴定

重组质粒pMD19-T-vector-ELFpro经测序鉴定正确以后，用CpG甲基化酶M.SssI甲基化修饰(购于NEB公司)，20μl反应体系如下：2μl M.SssI酶(4U/μl)，1μl质粒DNA(120ng/μl)，2μl 10×buffer，1μl 20×SAM(3.2mM)，14μl ddH₂O，37℃孵箱4h后补加20×SAM1μl，继续置于37℃4h，然后65℃水浴20min灭活。经甲基化敏感的HpaII酶切鉴定ELF启动子区DNA的甲基化程度，20μl酶切体系如下：2μl HpaII酶(10U/μl)，1μl甲基化质粒DNA(120ng/μl)，2μl 10×buffer 15μl ddH₂0，37℃反应16小时，然后65℃水浴20min灭活。酶切产物经10g/L琼脂糖凝胶分离电泳鉴定。

2结果

2.1 ELF基因启动子区PCR扩增

以正常人肝组织基因组DNA为模板扩增ELF基因启动子启动区CpG岛序列，目的片段全长435bp。10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像系统拍照可见单一清晰的扩增条带，片段大小与预计相符，见图1。

2.2 重组质粒(pMD 19-T-vector-ELFpro)的鉴定

2.2.1电泳鉴定

重组质粒pMD19-T-vector-ELFpro 3127bp (ELF启动子区PCR产物435bp作为插入片段，pMD19-T vector 2692bp为载体)，经限制性内切酶Pst I and Xba I双切之后，经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定，得到片段449bp，初步鉴定重组质粒有小片段插入，见图2。因pMD19-T载体的序列插入位点上游10bp为Pst I酶切位点，下游4bp为Xba I酶切位点，故双酶切所得片段增加了14bp，为439bp。

2.2.2测序鉴定

重组质粒测序结果与ELF基因启动子区PCR扩增序列比对，序列完全相符合，证实ELF启动子区PCR产物435bp成功插入pMD19-T vector载体。

2.3 PMD 19-T-vector-ELFprom的鉴定

重组质粒PMD19-T-vector-ELFpro含有若干甲基化敏感的内切酶Hpa II酶切位点，能够被其切成大小不等的小片段，而M.SssI甲基化酶修饰之后的重组质粒，经Hpa II处理之后，质粒大小仍为3127bp，与未酶切片段大小一样。经甲基化修饰及未经甲基化修饰的重组质粒PMD19-T-vector-ELFpro经10g/L琼脂糖凝胶分离结果如图3所示，与预期结果一致，说明重组质粒完全发生甲基化，即PMD19-T-vector-ELFpro^m构建成功。

本实施例构建了包含ELF基因启动子区启动区CpG岛的重组质粒，为使其发生完全甲基化，采用CpG甲基化酶M.SssI修饰。CpG甲基化酶M.SssI在合适的条件下能识别双链DNA上的二核苷酸序列“5’-CG-3’”，并甲基化所有胞嘧啶残基(C⁵)，模拟体内甲基化状态。体外甲基化DNA时，需注意甲基供体SAM的浓度和底物DNA中CpG二核苷酸受体位点的浓度之间的平衡。SAM浓度大于受体位点浓度的8倍是保证甲基化反应正向进行的关键因素，而且能减少反应中的S-腺苷-L-同型半胱氨酸(AdoHcy)发挥潜在的抑制作用。另外SAM在37℃条件下不稳定，当反应超过4小时，应添加SAM。为鉴定重组质粒是否不存在非甲基化的CG二核苷酸序列，采用甲基化敏感的HpaII内切酶处理验证。HpaII识别没有发生甲基化的序列“5’-CCGG-3’”，如果其中的CG二核苷酸发生甲基化，则无法识别酶切位点。

本实验成功构建重组质粒pMD19-T-vector-ELFpro^m，制备了ELF基因启动子区完全甲基化的阳性模板，为进一步研究肿瘤ELF基因甲基化/去甲基化奠定了实验基础。

实施例二 ELF基因启动区CpG岛甲基化状态与肝癌关系研究

1材料与方法

11细胞系

本实验中使用的均为本领域已经报道的常规细胞系，本实验中使用这些细胞系的目的是作为CpG岛甲基化的阳性对照细胞系，对本发明进行说明，本发明技术方案的实施并不依赖于这些细胞系。不使用这些细胞系，使用其他已经报导过的相应基因CpG岛已经甲基化的细胞系也可以担任上述作用，甚至可以使用已经报导过的相应基因的CpG岛的序列，参照实施例一的方法，制备得到基因启动子区完全甲基化的阳性模板，或制备得到启动子区CpG岛甲基化的阳性模板。而要强调的是，在本发明要求保护的各个技术方案中，这些阳性模板并不是必须的。

为了节约成本和时间，充分利用现有的报道，本实施例使用了以下公开报道和销售的细胞系制备阳性模板：其中人肝癌细胞系Huh-7购于中国典型培养物保藏中心，为已报道的RSSF1A基因启动子区启动区CpG岛完全甲基化的细胞(参见文献：DiGioia S，Bianchi P，DestroA，Grizzi F，Malesci A，Laghi L，et al.Quantitative evaluation of RASSF1A methylation inthe non-lesional，regenerative and neoplastic liver.BMC Cancer.2006；6：89.)；人乳腺癌细胞系T47D购于中国科学院上海细胞所，为已报道的p16基因启动子区启动区CpG岛完全甲基化的细胞系(文献：徐丹，覃扬，孙芝琳，等.CDP抑制乳腺癌细胞T47D生长及逆转p16基因甲基化的研究[J].四川大学学报(医学版)，2004；35(6)：792-796.)；人乳腺癌细胞系MCF-7与MDA-MB-435均购于四川大学华西医院移植免疫实验室，分别对应为已报道的GSTP1和E-cadherin基因启动子区启动区CpG岛完全甲基化的细胞系(参见文献：Yang X，Yan L，Davidson NE.DNAmethylation in breast cancer.Endocr Relat Cancer.2001 Jun；8(2)：115-27.和文献：Graff JR，Herman JG，Lapidus RG，Chopra H，Xu R，Jarrard DF，et al.E-cadherin expression is silenced byDNA hypermethylation in human breast and prostate carcinomas.Cancer Res.1995 Nov15；55(22)：5195-9.)。

1.2临床标本

本实施例中采用的标本均在签署知情同意书前提下，于2008年11月至2009年5月期间收集自四川大学华西第一医院的患者，包括在普外科接受手术治疗的原发性肝癌患者、肝硬化患者和肝血管瘤患者，内分泌科的代谢性疾病患者，及意外死亡的健康成人。

组织标本共82例，分别来自34例原发性肝癌(HCC)患者的癌组织和相应的远癌组织(距离癌灶边缘＞3cm)，其中男28例，女6例；年龄27～70岁，平均年龄48.00岁。10例未并发肝癌的肝硬化(LC)患者的肝硬化组织，其中男7例，女3例，年龄39-69岁，平均年龄45.40岁。4例来自意外死亡健康成人的正常肝组织。组织标本离体后分两部分，一部分立即投入液氮中冷冻过夜，然后保存于-80℃冰箱用于提取DNA；另外一部分10％中性福尔马林固定、石蜡包埋HE切片后用于病理诊断。

血浆标本共47例，分别收集自31例原发性肝癌患者、10例肝硬化患者及6例肝血管瘤患者术前，其中26例HCC血浆与肝癌组织标本、8例LC血浆与肝硬化组织标本的患者是一一对应的，1例血浆标本来自无肝脏病变的脂代谢性疾病患者。每例患者取4ml外周静脉血于EDTA抗凝的真空管中，30min之内低速离心取上层血浆，分装后储存于-80℃冰箱用于提取DNA。每一例组织标本均经过临床病理确诊，所有患者的临床病理资料见表2。

表2 HCC患者、肝硬化患者的临床病理特征以及对照病例资料

HBsAg，乙肝表面抗原；HCVAb，丙型肝炎病毒抗原；AFP，甲胎蛋白；HCC，肝癌；LC，肝硬化；NA，没被应用的；Benign lesions，良性病变。

1.3方法

1.3.1甲基化特异性PCR检测

1.3.1.1细胞基因组DNA提取

取用普通方法培养的贴壁细胞，根据TIANamp Genomic DNA试剂盒(购于北京天根生化科技有限公司)关于细胞基因组DNA提取的操作说明稍作进行细胞基因组DNA提取。所得DNA溶液，经琼脂糖电泳鉴定、紫外分光光度法检测纯度及浓度后，用于后续实验模板或置于-20℃储存。

1.3.1.2组织基因组DNA提取

根据TIANamp Genomic DNA试剂盒关于组织基因组DNA提取的操作说明进行新鲜或冷冻人肝组织标本的组织基因组DNA提取。

1.3.1.3外周血标本血浆游离DNA提取

采用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒分离纯化血浆游离DNA，按照试剂盒操作说明进行外周血标本血浆游离DNA提取。所得DNA溶液紫外分光光度法定量，立即用于后续实验模板或置于-20℃储存。

1.3.1.4基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰

其基本原理是利用高浓度亚硫酸氢钠能将DNA链上的碱基C转变成碱基U；而当C碱基被甲基化后，这一转变则不能进行。因此，序列特异性引物能够区分开亚硫酸氢钠修饰之后甲基化序列中的未变的C和非甲基化序列中转变的U。

按Herman等的方法稍作修改进行的具体步骤如下：取1.5μg细胞或组织基因组DNA，在含终浓度为0.2M NaOH的50μl反应体系中于37℃变性15min。对于血浆DNA，100ng血浆DNA中需要加入1μg鲱鱼精DNA(购自美国Sigma公司)作为载体。加入新鲜配制的3M亚硫酸氢钠(pH5.0)520μl、10mM对苯二酚30μl，混匀后，以矿物油覆盖，锡箔纸避光，瞬时离心后置于50℃孵育16h。取出离心管冷却至室温，用Wizard DNA Clean-up System试剂盒(购于Promega公司)；回收、纯化修饰后的DNA，操作步骤按试剂盒说明进行。回收的DNA溶于100μl dH₂O，加入等体积的0.6M NaOH，室温静置5min以终止反应；再加入20μl3M醋酸钠(pH5.2)和440μL预冷的无水乙醇，-20℃沉淀DNA 1-2小时或过夜，10,000g离心10min，用70％乙醇洗涤ssDNA沉淀3次后溶解于60μl dH₂O，用于PCR或保存于-20℃。

1.3.1.5甲基化特异性PCR引物设计

甲基化PCR方法参照Herman等的报道，使用RASSFLA、p16、GSTP1、E-cadherin基因的巢式甲基化PCR引物。并针对亚硫酸氢钠修饰过的DNA中ELF基因启动子区启动区CpG岛序列设计巢式PCR的引物，第一轮外部PCR反应的上下游引物的序列中不包含CpG位点，扩增出引物之间包含若干CpG位点的序列。第二轮内部PCR包含CpG位点，针对第一轮扩增序列分别设计甲基化特异性引物M和非甲基化特异性引物U。与Genebank中的DNA序列比较、核实，找到引物的位置。每个基因的引物序列、PCR退火温度、PCR循环数、PCR产物长度及参考文献如表3所示。

表3 甲基化特异性PCR(MSP)的引物序列和PCR反应条件

基因组DNA在亚硫酸氢钠修饰过程中碱基发生变化，双链不再互补，设计甲基化特异性引物及非甲基化特异性引物分别针对的双条DNA两条单链，在PCR第一个循环以其中一条引物扩增出互补链之后，另一条引物才开始在PCR循环反应中起作用。如果仅扩增出甲基化PCR产物，说明模板DNA完全发生甲基化；如果仅扩增出非甲基化PCR产物，说明模板DNA完全非甲基化；如果甲基化与非甲基化PCR产物均扩增出，说明基因启动区CPG岛DNA发生部分甲基化。

1.3.1.6巢式甲基化特异性PCR (nested-MSP)

采用巢式甲基化特异性PCR检测ELF、RASSF1A、p16、GSTP1及E-cadherin基因的启动区CpG岛甲基化状态。RASSF1A基因的CpG岛序列如SEQ ID No.32所示，p16基因的CpG岛序列如SEQ ID No.33所示，GSTP1基因的CpG岛序列如SEQ ID No.34所示，E-cadherin基因的CpG岛序列如SEQ ID No.35所示。由于巢式甲基化PCR灵敏性极高，为了避免假阳性，每次PCR设有空白对照、阳性对照和阴性对照，另外模板、引物与产物严格分区，模板、引物与酶各自使用固定的移液枪，所有PCR加样用的枪尖均塞入适量脱脂棉后高压灭菌，烘干备用。

第一轮PCR，每个反应体系组成为：50-80ng经亚硫酸氢钠修饰后的DNA、1×PCR反应液buffer、dNTP各0.1mmol/L、上下游引物各0.4μmol/L、1.5mmol/L MgCl₂、1.5U的TaqDNA聚合酶，用灭菌双蒸水补足总体积25μl，混匀后瞬时离心去除管盖内壁水珠。ELF基因采用降落PCR扩增，反应条件如下：

RASSF1A、p16、GSTP1及E-cadherin基因PCR反应条件如下：

第二轮PCR，第一轮PCR产物ELF不稀释，RASSF1A、p16及GSTP1均稀释50倍，E-cadherin稀释20倍作为模板。ELF基因，直接取第一轮PCR产物1μl进行甲基化特异性PCR(MSP)，5μl进行非甲基化特异性PCR(USP)。对于RASSF1A、p16、GSTP1及E-cadherin基因，分别取稀释液1μl进行第二轮MSP扩增，5μl进行USP扩增。PCR反应体系的其余成分与第一轮反应相同。5个基因对应表2-2中的退火温度，反应条件如下：

对于基因RASSF1A、p16、GSTP1及E-cadherin每个PCR反应的阳性对照是采用阳性细胞系Huh-7(RASSF1A)、T47D(p16)、MCF-7(GSTP1)及MDA-MB-435(E-cadherin)提取的DNA修饰纯化之后做模板，对于ELF基因则采用第一部分构建的质粒重组体PMD19-T-vector-ELFpro^m修饰纯化之后做模板；阴性对照用正常人肝组织修饰纯化之后做模板，同时用不含DNA的灭菌水代替模板用于证明无污染。制备20g/L琼脂糖凝胶，10μl PCR反应产物上样电泳，EB染色凝胶成像系统拍照观察。

1.3.2病理学观察

用中性甲醛固定的肝脏组织标本，24小时之后流水洗涤；组织块放入包埋盒中，经过不同浓度梯度的乙醇脱水，常规方法透明、浸蜡、包埋成蜡块。修整蜡块之后，按3μm厚度切片，贴于载玻片，于45℃温箱中干燥，脱蜡之后即可HE染色。苏木精染液染细胞核3min；去离子水洗；0.1％盐酸乙醇分化液处理20s，用去离子水脱去细胞胞质的着色；随后，去离子水中返蓝15min；1％的伊红染液染色30s；去离子水洗；不同浓度的梯度乙醇脱水；二甲苯透明两次；中性树胶封片，显微镜下观察并照像。

1.4统计学方法

用χ2检验统计分析了Nested-MSP方法检测ELF、RASSF1A、p16、GSTP1和E-cadherin基因甲基化在癌组织、远癌组织和肝硬化组织中的差别；采用Fisher’s Exact Test进行癌组织与相应的远癌组织，癌组织与对应血浆的基因甲基化状态相关性，癌组织特定基因的甲基化、CIMP分别与患者临床病理生理特征的相关性分析；并用Simple Kappa coefficient检验对癌组织和远癌组织以及癌组织与血浆标本甲基化状态的一致性进行了分析。在术后2010年3月31号之前随访肝癌患者，统计肝癌的转移和复发及死亡率的资料。标本平均甲基化的基因个数差异性分析采用的是One-way ANOVA检验。双侧P＜0.05，κ＞0.40视为具有统计学意义，统计学处理均采用SPSS13.0软件完成。

2结果

2.1基因组DNA提取纯化

人肝癌细胞系Huh-7，人乳腺癌细胞系T47D、MCF-7与MDA-MB-435及34例肝癌组织、对应的远癌组织、10例肝硬化组织基因组DNA的提取，采用TIANamp Genomic DNA试剂盒；31例肝癌患者血浆，10例肝硬化及良性病变患者血浆DNA血浆DNA游离DNA分离纯化采用AxyPrep体液病毒DNA试剂盒。所有标本DNA经8g/L的琼脂糖凝胶电泳均可见清晰条带，DNA无降解，没有混杂RNA，见图2-2。紫外分光光度法鉴定OD260/OD280，比值介于1.8-2.0之间，表明DNA纯度较高，无污染RNA和蛋白质等。由于血浆游离DNA OD260测定后计算每毫升介于100ng-500ng，提取之后需浓缩后进行电泳才可清晰，见图4。

2.2肝癌、远癌与肝硬化组织中特定基因及累加的基因甲基化状态

2.2.1单个基因的甲基化状态

我们检测了34例HCC患者的癌组织及对应的远癌组织，10例LC患者的肝硬化组织和4例正常肝组织中，ELF、RASSF1A、p16、GSTP1及E-cadherin基因启动子区启动区CpG岛的甲基化状态，代表性的标本电泳结果见图5，五个基因在每个标本的甲基化检测结果详见图6。肝癌、远癌及肝硬化组织中五个基因的甲基化阳性率总结于表2-3。ELF，RASSF1A，p16，GSTP1和E-cadherin基因启动子区CpG甲基化阳性率，在34例肝癌中分为64.70％(22/34)，92.12％(32/34)，73.52％(25/34)，67.65％(23/34)与61.76％(21/34)，在34例远癌组织中分别为38.24(13/34)，73.52％(25/34)，50％(17/34)，41.17％(14/34)及29.41％(10/34)在10例肝硬化组织中分别为20％(2/10)，80％(8/10)，70％(7/10)，60％(6/10)和50％(5/10)。本课题的4例正常肝组织均未检出基因的甲基化，并均检出非甲基化。每个基因在癌组织的甲基化阳性高于对应远癌组织(P＜0.05)；每个基因在癌组织的甲基化阳性高于肝硬化组织，但差异无统计学意义。

RASSF1A基因发生甲基化的远癌组织25例，对应的癌组织均甲基化阳性。ELF、p16和GSTP1基因在癌组织和对应远癌组织的甲基化频率具有一致性(分别对应κ＝0.554，κ＝0.529，κ＝0.502)和相关性(分别对应P＜0.001，P＜0.001，P＝0.001)。E-cadherin基因在远癌组织检出甲基化阳性的标本有一例在癌组织是甲基化阴性，检出阳性率在远癌组织与癌组织具有相关性(P＝0.029)，一致性不明显(κ＝0.303)。

2.2.2累加的基因甲基化状态

为了解ELF、RASSF1A、p16、GSTP1及E-cadherin五个基因甲基化累加在肝癌、远癌、肝硬化及正常肝组织中的差异，我们分析了五个基因在以上标本中的甲基化阳性的基因个数情况，如表2-4所示。所有的34例肝癌组织均有一个或者多个基因的异常甲基化，而34例远癌中有32例检出至少一个基因异常甲基化，但二者无统计学差异(P＝0.473)。五个基因中比较两个基因以上异常甲基化，癌组织与远癌组织发生频率具有统计学差异(P＝0.001)，三个基因以上(P＜0.001)及四个基因以上(P＝0.013)发生甲基化仍均具有统计学差异。

有趣的是，我们发现当比较甲基化的基因个数时(n＝5)，平均甲基化的基因个数呈现递增的趋势，正常肝0、远癌2.29、癌3.53，且每步之间均具有显著性差异(P＜0.001)，如表2-4所示。但是，肝硬化组织平均甲基化的基因个数(2.90)分别与肝癌组织和远癌组织比较无统计学差异(P＞0.05)。癌组织和远癌组织分别与肝硬化组织比较至少一个基因、两个基因以上、三个基因以上及四个基因以上发生甲基化的阳性率，均无统计学差异(P＞0.05)。

2.3肝癌与肝硬化患者血浆DNA中特定基因及累加的基因甲基化状态

2.3.1单个基因的甲基化状态

检测了31例HCC患者的血浆、10例LC患者(无并发肝癌)的血浆、6例肝血管瘤及1例脂代谢疾病患者的血浆，抑癌基因ELF、RASSF1A、p16、GSTP1和E-cadherin启动子区启动区CpG岛甲基化的状态，代表性的标本电泳结果见图5，每个血浆标本的抑癌基因甲基化状态详细总结于图6。31例HCC患者的血浆及10例肝硬化患者血浆中五个基因启动子区启动区CpG岛甲基化的阳性率总结于表4。ELF，RASSF1A，p16，GSTP1和E-cadherin基因启动子区CpG甲基化阳性率，在31例HCC患者血浆中分别为58.06％(18/34)，51.61％(16/31)，41.94％(13/31)，38.70％(12/31)与16.13％(5/31)在10例LC患者血浆中分别为20％(2/10)，20％(2/10)，30％(3/10)，40％(4/10)及10％(1/10)。本研究的7例良性病变患者(6例血管瘤及1例脂代谢患者)的血浆中未检出以上基因的甲基化，并均检出非甲基化。在本实验中未发现每一个基因在HCC患者和LC患者血浆中甲基化频率差异具有统计学意义。

2.3.2特定基因甲基化在血浆与对应癌组织的相关性

检测的HCC标本中26例的组织与血浆标本是一一对应的，详细的甲基化状态请参见表4、表5和图6。RASSF1A基因在26例癌组织全部检出异常甲基化，远癌检出22例，对应血浆检出16例，并且这16例血浆阳性的标本所对应的癌组织均是发生异常甲基化的。p16在26例HCC患者检出异常甲基化癌组织19例、血浆11例，血浆与癌组织的甲基化阳性率具有相关性(P＝0.008)和一致性(κ＝0.425)。GSTP1在26例HCC患者检出异常甲基化分别癌组织18例、血浆10例，血浆与癌组织具有相关性(P＝0.007)和一致性(κ＝0.435)。E-cadherin癌组织检出19例，血浆检出率比较低，仅5例，未发现血浆和癌组织的甲基化阳性有统计学相关性(P＝0.698)和一致性(κ＝0.041)。

2.3.3累加的基因甲基化状态

为了探明五个抑癌基因在血浆标本中甲基化状态联合检测能否用于HCC的早期辅助诊断和LC患者监测以早期预警肝癌，分析了不同患者血浆标本中至少一个基因甲基化及甲基化的基因个数状况，主要参见表7。至少一个基因检出异常甲基化的频率在良性病变患者、LC到HCC的血浆标本中是逐级增加的，良性病变患者(肝血管瘤和代谢性疾病患者)0/7，LC患者6/10，HCC患者29/31，并且每一步之间差异均具有统计学意义(P＜0.05)。血浆标本中平均甲基化的基因个数在肝癌患者(2.097)与肝血管瘤和脂代谢性疾病患者血浆(0)具有统计学差异(P＝0.001)，而肝癌与肝硬化、肝硬化与良性病变患者血浆的差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表4.HCC和肝硬化病例中5种基因甲基化频率分析

P-value：P值；χ²：卡方检验。

表5 HCC患者肿瘤和非肿瘤启动区CpG岛甲基化频率以及肝硬化患者的启动区CpG岛甲基化频率

^*卡方或Fisher检验；

one-way ANOVA检验。

^aP＝0.001，^bP＜0.001，^cP＝0.013。肿瘤vs.非肿瘤组织。

^dP＜0.001，肿瘤vs.非肿瘤组织，非肿瘤vs.正常肝组织。

其它实验的P值没有显著性差异。

表6 HCC患者和肝硬化患者血浆标本基因高甲基化频率

^*卡方或Fisher检验；

one-way ANOVA检验。

^a良性病患者的良性病变。

^bP＜0.05，肝癌患者血浆/肝硬化患者血浆，肝硬化患者血浆/正常人血浆。

^cP＝0.001，肝癌患者血浆/正常人血浆。

2.4肝癌患者血浆DNA甲基化检测与血清AFP水平检测的比较

临床上血清甲胎蛋白水平广泛应用于肝癌高危人群的筛查，目前仍认为高于AFP₄₀₀(血清甲胎蛋白为400ng/mL)可用于肝癌的初步诊断。而在我们的实验中31例HCC血浆至少一个基因甲基化阳性率(93.55％)高于AFP₄₀₀(48.39％)，差异具有统计学意义(P＜0.001)，并且具有相关性(P＜0.001)和一致性(κ＝0.452)。表明31例肝癌患者的血浆至少一个基因甲基化检出阳性联合AFP₄₀₀阳性的检出率可达93.55％。

2.5基因甲基化与肝癌患者临床病理参数的相关性

目前启动区CpG岛甲基化表型(CpG Island Methylator Phenotype，CIMP)依照癌组织的平均甲基化的基因个数定义。根据这一标准，我们检测的34例HCC可分为CIMP+组(有4个以上基因发生甲基化)和CIMP-组(有3个或更少的基因发生甲基化)，因为肝癌平均甲基化的基因个数是3.53。34例HCC有29例(85.29％)属于CIMP+组，5例(14.71％)属于CIMP-组。我们分析了HCC患者和临床病例特征之间的关系，包括年龄、性别、乙肝表面抗原、血清AFP水平、肿瘤大小、有无门静脉癌栓、分化程度、有无卫星灶、转移和复发及术后一年生存率。未发现癌组织中特定基因的甲基化状态、CIMP+分别与HCC患者的临床病理特征具有统计学相关性(P＞0.05)(表7)。

表7 CIMP与34例HCC的临床病理特征的相关性分析

使用的Fisher检验

AFP，α-fetoprotein甲胎蛋白；HBsAg，hepatitis B virus surface antigen乙肝表面抗原；HCVAb，hepatitis C virus antibody丙型肝炎抗体；

本发明创造性地探明，人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态与肝硬化及肝癌的早期发生具有很大的相关性，是一种灵敏性较高的无创性血浆生物分子标志物，可以用于HCC早期诊断及LC患者的监测以对早期肝癌进行高危预警。使用本发明提供的试剂盒能有效进行肝癌尤其是早期肝癌以及肝硬化预警和筛查的试剂盒，该试剂盒如果单独检查ELF基因的甲基化，其检出率为64.70％左右，明显高于我们使用目前通用的AFP₄₀₀得到48.39％左右的检出率。而本发明复合检测试剂盒，该试剂盒的检出率可达93.55％，也明显高于AFP₄₀₀检查和其他的复合检测试剂。而在本发明披露的信息基础上，本领域技术人员能够通过本领域现有的技术得到和实施本发明要求保护的各个技术方案。即获得包括有能检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的肝癌早期预警和筛查试剂。

Claims

1.肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于包括有能检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂。

2.根据权利要求1所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述的检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括独立包装的扩增甲基化的人胚肝血影蛋白启动区CpG岛的引物。

3.根据权利要求2所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述的扩增甲基化的人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物为：

正义链引物：5’-GGCGAGTGGTTTTTGATAAAATTATAAAT-3’；

反义链引物：5’-ACATACCACGATTACCGAACCCGAA-3’。

4.根据权利要求2所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述的检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂还包括独立包装的扩增非甲基化的人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物。

5.根据权利要求4所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述的扩增非甲基化的人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物：

正义链引物：5’-GGTGAGTGGTTTTTGATAAAATTATAAATT-3’；

反义链引物：5’-ACATACCACAATTACCAAACCCAAA-3’。

6.根据权利要求2所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述的检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂还包括独立包装的预扩增人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物。

7.根据权利要求6所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述的预扩增人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛的引物：

正义链引物：5’-GGAGGGAAGGAAGGGTAAG-3’；

反义链引物：5’-CAACTCAATAAACTCAAACTCCC-3’。

8.根据权利要求2～7任一项所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述的检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂还包括独立包装的分离血浆游离DNA的试剂。

9.根据权利要求2～7任一项所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述的检测人胚肝血影蛋白基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂还包括将DNA链上的胞嘧啶转变成尿嘧啶的试剂。

10.根据权利要求2～7任一项所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述将DNA链上的胞嘧啶转变成尿嘧啶的试剂为亚硫酸氢钠。

11.根据权利要求1～10任一项所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：还包括能检测人RASSF1A基因、人p16基因、人GSTP1基因、人E-cadherin基因中至少3种基因的启动区CpG岛甲基化状态的试剂。

12.根据权利要求11所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述能检测人RASSF1A基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括甲基化特异引物：上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示。

13.根据权利要求11所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述能检测人p16基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括甲基化特异引物：上游引物的核苷酸序列为SEQID No.15所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.16所示。

14.根据权利要求11所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述能检测人GSTP1基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括甲基化特异引物：上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.21所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.22所示。

15.根据权利要求11所述的肝癌早期预警和筛查试剂盒，其特征在于：所述能检测人E-cadherin基因启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括甲基化特异引物：上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.27所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.28所示。

16.肝癌早期预警和筛查试剂，其特征在于：含有检测人胚肝血影蛋白启动区CpG岛甲基化状态的试剂，以及含有分别包装的检测人RASSF1A基因、人p16基因、人GSTP1基因、人E-cadherin基因中至少3种基因的启动区CpG岛甲基化状态的试剂；

检测所述各基因的启动区CpG岛甲基化状态的试剂包括如下表所示的预扩增各基因启动区CpG岛的PCR引物、针对各基因启动区CpG岛的甲基化特异性PCR引物和针对各基因启动区CpG岛的非甲基化特异性PCR引物：

其中PAN为预扩增启动区CpG岛的PCR引物，MSP为针对启动区CPG岛的甲基化特异性PCR引物；USP为针对启动区CpG岛的非甲基化特异性PCR引物。

17.如权利要求16所述的肝癌早期预警和筛查试剂，其特征在于：还包括有将DNA链上的胞嘧啶转变成尿嘧啶的试剂。

18.根据权利要求16所述的肝癌早期预警和筛查试剂，其特征在于：还包括独立包装的制取离体血浆中游离DNA的试剂。

18、如权利要求16所述的肝癌早期预警和筛查试剂，其特征在于：还包括有检测血清甲胎蛋白水平的试剂。

19.权利要求1～18任一项所述的肝癌早期预警和筛查试剂在制备肝癌预警或筛查试剂盒、或在制备肝硬化预警或筛查试剂盒中的用途。

20.肝癌或肝硬化预警或筛查试剂盒，由权利要求1～18任一项所述的肝癌早期预警和筛查试剂制备而成。