CN108374048B - 一种用于诊断和治疗肝细胞癌的lncRNA标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于诊断和治疗肝细胞癌的lncRNA标志物，具体的所述lncRNA为LINC01694。本发明公开了LINC01694在制备诊断肝细胞癌的产品以及治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用。本发明同时公开了一种诊断肝细胞癌的试剂盒以及治疗肝细胞癌的药物组合物。

Description

一种用于诊断和治疗肝细胞癌的lncRNA标志物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种用于诊断和治疗肝细胞癌的lncRNA标志物，具体的所述lncRNA为LINC01694。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)作为世界上最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率居第六位，死亡率居第二位，而死于HCC的患者的一半出现在我国，成为我国人民健康的重大威胁(CHEN W,ZHENG R,BAADE P D,et al.Cancer statistics in China,2015[J]CA:a cancer iournal for clinicians.2016.66(21:115-32.)。探索与HCC相关的关键基因，并将其作为HCC早期诊疗指标以及治疗的干预靶点，不仅具有重要的临床应用价值，也为HCC发病机制研究提供新思路。

HCC的致病因素包括长期酗酒、慢性病毒性肝炎、脂肪肝、代谢性或遗传性疾病等，在我国，由慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染而导致的肝硬化是目前已知的引起HCC最主要的危险因素(WANG M,XI D,NING Q.Virus-induced hepatocellularcarcinoma with special emphasis on HBV[J].Hepatology international,2017,11(2):171-80.)。近年来，针对HCC的治疗方式多样且发展迅速，包括手术治疗(肝叶切除、肝移植)，物理疗法(射频消融)，化学疗法(介入化疗、化疗泵化疗)，以及最近逐渐发展的分子靶向治疗，基因治疗，免疫治疗等(MAUER K,O'KELLEY R,PODDA N,et al.New treatmentmodalities for hepatocellular cancer[J].Current gastroenterology reports,2015,17(5):442.)。但HCC病人的总体疗效及生存时间仍无明显改观，主要是因为起病隐匿，组织浸润性强并容易发生早期转移；晚期复发转移率高(ZHONG J H,RODRIGUEZ AC,KEY,et al.Hepatic resection as a safe and effective treatment forhepatocellular carcinoma involving a single large tumor,multiple tumors,ormacrovascular invasion[J].Medicine,2015,94(3):e396.)。由此可见，肿瘤的高复发转移性是HCC治疗失败和病人死亡的主要原因。寻找和研究与HCC的发生发展和侵袭转移密切相关的关键分子，对于理解HCC发生发展和转移的完整机制，筛选可靠的早期诊断指标，以及针对关键靶点建立有效的基因治疗策略均具有深远意义，也是HCC诊治研究领域发展的当务之急。随着基因芯片和高通量测序等方法的开展应用，相关文献指出，长链非编码RNA(long noncoding RNAs,LncRNAs)在HCC侵袭转移的形成过程中发挥着重要作用(CN201710522694.9、CN201710522693.4)。

LncRNAs是一类转录本长度超过200个核苷酸的不具备蛋白编码能力的RNA分子，可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控基因的表达，广泛参与机体的生理和病理过程(LI C,CHEN J,ZHANG K,et al.Progress and Prospects of Long Noncoding RNAs(1ncRNAs)in Hepatocellular Carcinoma[J].Cellular physiology and biochemistry:international journal of experimental cellular physiology,biochemistry,andpharmacology,2015,36(2):423-34.)。针对全基因组序列分析发现，LncRNAs中特定的超保守元件在肿瘤细胞中广泛表达，并且多分布在染色体的脆性位点和肿瘤相关区域，这类超保守元件异常表达会促使正常细胞发生恶性转化。随着研究不断深入，一些肿瘤相对特异性的1ncRNAs也陆续被发现。这些1ncRNAs的表达紊乱参与调控肿瘤细胞多种恶性表型的产生，如肿瘤生长、上皮-间质表型转化、侵袭、放化疗耐药表型形成等，有望成为未来肿瘤早期诊断及临床疗效判断的新靶标。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于肝细胞癌诊断和治疗的lncRNA标志物。

本发明的目的之二在于提供lncRNA标志物在筛选治疗肝细胞癌的候选药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测LINC01694表达水平的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别LINC01694的探针；或

特异性扩增LINC01694的引物。

进一步，特异性扩增LINC01694的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明提供了一种诊断早期肝细胞癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测LINC01694表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括特异性识别LINC01694的探针；或特异性扩增LINC01694的引物。

进一步，所述特异性扩增LINC01694的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明提供了一种LINC01694基因的用途，用于筛治疗肝细胞癌的候选药物。

进一步，筛选治疗肝细胞癌的候选药物的步骤如下：

用待筛选物质处理表达或含有LINC01694基因的培养体系；和

检测所述体系中LINC01694基因的表达；

其中，若所述待筛选的物质可以抑制LINC01694基因的水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该待筛选物质是治疗肝细胞癌的候选药物。

进一步，所述的步骤还包括：对上面步骤获得的候选药物进一步测试其抑制肝癌的效果，若测试化合物对肝癌有显著的抑制效果，则说明该化合物为治疗肝癌的候选药物。

所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

本发明提供了一种LINC01694基因的用途，用于制备治疗肝细胞癌、和/或肝细胞癌浸润、和/或肝细胞癌转移的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包括LINC01694基因的抑制剂。

其中，所述LINC01694的抑制剂选自：以LINC01694或其转录本为靶序列、且能够抑制LINC01694基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

优选的，所述抑制剂为siRNA；更为优选的所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。

本发明提供了一种治疗肝细胞癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括LINC01694基因的抑制剂。

优选的，所述抑制剂为siRNA。

更为优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～10所示。

更为优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。

进一步，所述组合物还包括与所述抑制剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

药学上可接受的载体和/或辅料包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

附图说明

图1是利用QPCR检测LINC01694在肝细胞癌患者中的表达情况图；

图2是利用QPCR检测LINC01694在肝细胞癌细胞中的表达情况图；

图3是检测转染siRNA对肝细胞癌细胞中LINC01694的表达影响图；

图4是利用CCK8检测LINC01694对肝癌细胞增殖的影响图；

图5是检测LINC01694基因对肝细胞癌细胞迁移的影响图；

图6是检测LINC01694基因对肝细胞癌细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测肝细胞癌组织和癌旁组织中lncRNA的表达水平，发现其中具有明显表达差异的lncRNA片段，探讨其与肝细胞癌的发生之间的关系，从而为肝细胞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肝细胞癌中LINC01694显著性上调，并且通过大样本实验证明，采用该lncRNA具有较高的阳性检出率；进一步的细胞实验证明，改变LINC01694的表达水平可以影响肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示LINC01694可以作为药物靶标应用于肝细胞癌的精准治疗。

标志物

“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。

在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与肝细胞癌相关联的基因、基因的片段或变体。

LINC01694基因

LINC01694基因位于21号染色体长臂2区2带上，本发明中的LINC01694包括野生型、突变型或其片段。在本发明的实施例中，一种代表性的人LINC01694基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LINC01694基因(NR_146912.1)所示。本发明的LINC01694核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

试剂盒

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LINC01694的表达。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。

这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。所述生物样品可以是例如细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物液体、血液样品、尿液样品或皮肤抑制剂和药物(组合物)

抑制剂和药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种LINC01694的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制LINC01694基因的功能性表达即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以LINC01694基因为靶序列、且能够抑制LINC01694基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调LINC01694有用的物质，可用于治疗肝细胞癌。

作为本发明的一种优选方式，所述LINC01694的抑制剂是一种LINC01694特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，在本发明的具体实施例中，该siRNA的序列如SEQ IDNO.9～10所示，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中LINC01694基因的表达水平，以及肝癌细胞的增殖。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

药物组合物

作为可选择的实施方案中，药物组合物包括LINC01694基因的抑制剂以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。

其中，稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。

在本发明中，术语“有效量”是指其用量足以治疗疾病，以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比率。组合物的有效剂量水平可以根据受试者的类型、疾病的严重程度、受试者的年龄和性别、药物活性、对药物的敏感性、给药时间，给药途径、排泄率、治疗时间、与组合物联用的药物和医疗领域中其他已知因素来确定。本发明的药物组合物可单独使用或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规的治疗剂依次或同时给药。可采用一种或多种剂型中施用组合物。考虑所有上述因素，在能够表现出最大效果而不引起副作用的最小量下施用组合物至关重要，该最小量可由本领域技术人员容易地确定。

本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

本发明的药物组合物还可与其他治疗肝细胞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肝细胞癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集50例HBV感染的肝细胞癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织样本，从中随机选取8例进行高通量测序，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

3、RNA样品的质量分析

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5ug，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

5、构建cDNA文库

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

6、上机测序

使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

7、高通量转录组测序数据分析

对测序结果使用R-3.3.3工具包中的DESeq2进行生物信息学分析，通过构dds矩阵、标准化，进行差异分析，差异表达lncRNA的筛选标准：FDR<0.05，abs(log₂FC)>2。

8、结果

RNA-seq结果显示，LINC01694基因在肝细胞癌组织中的表达量显著高于对照组(癌旁组织)，P值为1.00E-10，提示LINC01694可以作为可能的检测靶标应用于肝细胞癌的诊断。

实施例2 QPCR测序验证LINC01694基因的差异表达

1、利用前面收集的50例患者癌组织样本和癌旁组织样本对LINC01694基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

1)将1μg的总RNA模板与2μl 10×缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl polyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h；

2)向反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min，立即置冰上孵育至少2min；

3)将反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase freewater)混合，42℃孵育1h。

4、QPCR扩增检验

1)引物设计

根据Genebank中LINC01694基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成，其中，LINC01694、GAPDH的引物序列分别如SEQ ID NO.1～2、SEQ IDNO.3～4所示。

2)反应体系

SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA 2.0μl，ddH₂O 8.5μl。各项操作均于冰上进行。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

3)反应条件

95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以GAPDH作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，LINC01694基因在肝细胞癌组织中表达水平上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；其中表达上调的患者为48例，非差异表达的有2例，阳性检出率＝48/50×100％＝96％；提示LINC01694可作为检测指标应用于肝细胞癌的辅助诊断。

实施例3 LINC01694基因在肝细胞癌细胞系中的差异表达

1、细胞培养

人肝细胞癌细胞株HepG2、Huh7和正常肝细胞系HL-7702，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、RNA的提取

使用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，具体操作参照说明书。

3、逆转录具体步骤同实施例2

4、QPCR扩增检验具体步骤同实施例2

5、统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图2所示，与正常肝细胞系相比，LINC01694基因在肝细胞癌细胞

HepG2、Huh7中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4 LINC01694基因的沉默

1、细胞培养

人肝细胞癌细胞株HepG2，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、siRNA设计

针对LINC01694基因的序列设计siRNA，设计的阴性对照siRNA-NC、siRNA1～4序列分别如SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～14所示。

将细胞按2×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h；在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂3000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。

实验分为空白对照组(HepG2)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)，其中阴性对照组siRNA与LINC01694基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

3、QPCR检测LINC01694基因的表达水平

1)细胞总RNA的提取具体步骤同实施例4。

2)逆转录步骤同实施例2。

3)QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图3显示，与对照组HepG2、转染空载siRNA-NC组相比，实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA4)能够降低LINC01694的表达水平，而siRNA3则无显著变化，而siRNA1组的干扰效果最为显著，因此选择siRNA1进行后续的实验。

实施例5 CCK8检测细胞增殖实验

1、细胞培养与转染步骤同实施例4

2、CCK8检测细胞增殖

将对数增殖期的HepG2细胞接种于96孔板，每孔2×10³个细胞，将细胞分为三组，分别是空白对照组、转染siRNA-NC组和转染siRNA2，每组设6个复孔；分别在转染0h、24h、48h、72h、96h后加入10μl/孔CCK8试剂，放入培养箱中孵育1h后使用酶标仪检测A450的吸光值。

3、统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

图4所示的结果显示：空白对照组同转染空载组无明显差异(P>0.05)，而转染siRNA1组的增殖细胞明显低于对照组的增殖细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明LINC01694与肝癌细胞的增殖有关，提示抑制LINC01694可能会抑制肝癌的发展。

实施例6细胞迁移实验

1、各组细胞转染后24h，常规消化、离心，用含有10g/L的无血清DMEM培养液重悬，调整细胞浓度为1×10⁵/ml；

2、取200μ1的细胞悬液接种至不铺Matrigel胶的Transwell小室上室中；

3、在24孔板下室加1ml含10％胎牛血清的DMEM培养液，将Transwell小室置于24孔板孔内，避免培养液与小室之间形成气泡；置于37℃，5％CO₂中，常规培养48h；

4、取出小室，PBS淋洗，棉签小心擦净小室上室面的细胞，下室面用甲醇固定15min，1％结晶紫染色5min；

5、200倍倒置显微镜下随机选取10个视野，计数穿过微孔膜下层的细胞数，取平均值，每组3个小室，重复3次。

6、统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图5所示，与对照组相比，在肝细胞癌细胞转染干扰RNA之后，实验组下室中的细胞数显著减少，说明改变LINC01694的表达水平可以影响肝癌细胞的迁移，LINC01694参与了肝癌细胞的迁移过程，提示LINC01694可作为药物靶标应用于肝细胞癌转移的治疗。

实施例7细胞侵袭实验

1、包被基底膜：将Matrigel胶置于4℃冰箱过夜液化，在冰上用预冷的枪头将Matrigel胶按1:3比例稀释于无血清的DMEM培养液，按50μl/孔均匀地覆盖在Transwell小室膜上，室温自然风干；

2、吸出培养板中残余液体，然后每孔加入50μl含有l0g/L BSA的无血清培养液，37℃孵育30min；

3、各组细胞转染后24h，常规消化、离心，用含有10g/L BSA的无血清DMEM培养液重悬。调整细胞浓度为1×l 0⁵ml；

4、取200μl的细胞悬液接种至包被有Matrigel胶的Transwell小室上室中；在24孔板下室加1ml含10％胎牛血清的DMEM培养液，将Transwell小室置于24孔板内，避免培养液与小室之间形成气泡；37℃，5％CO₂，常规培养48h；

5、取出小室，PBS淋洗，棉签小心擦净小室上室面的Matrigel胶和细胞，下室面用甲醇固定15min，1％结晶紫染色5min；用PBS漂洗2遍，200倍倒置显微镜下随机选取10个视野，计数穿过微孔膜下层的细胞数，取平均值，每组3个小室，重复3次。

6、统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图6所示，与对照组相比，实验组的下室的细胞数减少，说明改变LINC01694的表达水平改变了肝癌细胞的侵袭能力，LINC01694可能参与了肝癌的浸润过程，提示LINC01694可作为治疗肝癌浸润的药物靶标。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 一种用于诊断和治疗肝细胞癌的lncRNA标志物

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttggatgga atggtctgt 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacactgtca gccttcaa 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgggaaact gtggcgtgat gg 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agaauuggaa uggaaauaca c 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

guauuuccau uccaauucug g 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uuauagcagu gugagaaugg a 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cauucucaca cugcuauaaa g 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ucaugauagu gaguuaucgu u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgauaacuca cuaucaugag a 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

auagaaguga cacugauagc a 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cuaucagugu cacuucuaua a 21

Claims (7)

1.检测LINC01694表达水平的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：

特异性识别LINC01694的探针；或

特异性扩增LINC01694的引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增LINC01694的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。

4.一种LINC01694基因的用途，其特征在于，用于筛治疗肝细胞癌的候选药物。

5.LINC01694的抑制剂在制备治疗肝细胞癌的药物组合物中的用途，其特征在于，所述抑制剂降低LINC01694的表达水平。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述抑制剂为siRNA。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7~8所示。

Images