CN108753969B

CN108753969B - 长链非编码rna在肝细胞癌诊疗中的应用

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Publication number: CN108753969B
Application number: CN201810604529.2A
Authority: CN
Inventors: 杨承刚; 吴东; 舒慧君; 张改英; 陈丽媛
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date: 2018-06-13
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2038-06-13
Also published as: CN108753969A

Abstract

本发明公开了长链非编码RNA在肝细胞癌诊疗中的应用，所述长链非编码RNA为HRAT92，本发明通过实验证明了HRAT92在肝癌患者中表达上调，且参与肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的过程中，提示HRAT92可作为生物标志物应用于肝细胞癌的诊断和治疗中。

Description

长链非编码RNA在肝细胞癌诊疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及长链非编码RNA在肝细胞癌诊疗中的应用，具体的该长链非编码RNA为HRAT92。

背景技术

肝癌是全世界常见的恶性肿瘤之一，且男性发病率明显高于女性，男性HCC死亡率在所有癌症中位列第二位(Torre LA,Bray F,Siegel RL,Ferlay J,Lortet-Tieulent J,Jemal A:Global cancer statistics,2012.CA Cancer J Clin 2015,65(2):87-108.)。肝癌中，肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)约占85％-90％(Llovet JM,Zucman-Rossi J,Pikarsky E,Sangro B,Schwartz M,Sherman M,Gores G:Hepatocellularcarcinoma..Nat Rev Dis Primers 2016,2:16018.)，虽然HCC的危险因素已经十分明确：主要包括HBV、HCV、过度饮酒、吸烟等，流行病学调查显示超重及代谢疾病也与肝细胞癌的发生密切相关(Calle EE,Rodriguez C,Walker-Thurmond K,Thun MJ:Overweight,obesity,and mortality from cancer in a prospectively studied cohort ofU.S.adults.N Engl J Med 2003,348(17):1625-1638.)，但在肝细胞癌预防方面仍然面临着巨大挑战；肝细胞癌治疗方面，临床上缺乏有效的治疗靶标，且肝细胞癌病人治疗之后预后差、易复发，主要原因是HCC极易发生肝内及肝外转移(Budhu A,Forgues M,Ye QH,JiaHL,He P,Zanetti KA,Kammula US,Chen Y,Qin LX,Tang ZY et al:Prediction ofvenous metastases,recurrence,and prognosis in hepatocellular carcinoma basedon a unique immune response signature of the liver microenvironment.CancerCell 2006,10(2):99-111)，而癌细胞转移是一个复杂的过程，细胞内及肿瘤微环境因子均可影响肿瘤细胞的转移能力，然而介导转移的分子机制大部分尚不清楚，因此，进一步开展HCC发生发展及侵袭和转移分子机制的研究，不仅有助于对HCC及其转移进行早期诊断，亦有利于为HCC临床治疗寻找更好的药物作用靶点。

研究表明，虽然人类基因组中90％以上的序列是可以被转录的，但只有1％-2％的转录产物可以被翻译成蛋白质(Maher B:ENCODE:The human encyclopaedia.Nature2012,489(7414):46-48.)，其余的主要是非编码RNA，除去rRNA，tRNA，我们对这些非编码RNA的作用研究不充分，越来越多的研究表明在肝癌的发生、发展过程中这些非编码RNA也参与其中，并发挥重要作用，比如小非编码RNA(Small noncoding RNA)、长链非编码RNA(Long nonconding RNA，lncRNA)及各种因素通过表观遗传调控可以引起基因的表达改变。之前的大部分研究一直是以蛋白质编码基因为中心，然而随着非编码RNA研究的逐渐深入及高通量测序技术的不断发展和完善，近十年来，人们发现基因组编码的大量lncRNA也在生命活动及疾病发生过程中发挥着重要作用。LncRNAs是一类长度大于200个核苷酸但不编码蛋白质的RNA。其表达具有组织特异性，在生命过程中发挥重要作用，几乎参与到细胞生命活动的各个方面:其可以在表观遗传水平、转录水平、转录后水平等多个层面参与调控细胞增殖、细胞分化等生命活动(Fatica A,Bozzoni I:Long non-coding RNAs:new playersin cell differentiation and development.Nat Rev Genet 2014,15(1):7-21.)，因此1ncRNA的表达异常与人类的许多疾病包括肿瘤的发生、发展有着密切的联系，有许多研究证明了lncRNAs可以通过与蛋白质或RNA互作调控基因表达，进而调控细胞增殖、凋亡和转移参与HCC的发生、发展(Huang JL,Zheng L,Hu YW,Wang Q:Characteristics of longnon-coding RNA and its relation to hepatocellularcarcinoma.CarcinoQenesis2014,35(3):507-514.)。且肝癌在组织中差异表达的1ncRNA可以区分癌组织和癌旁组织，说明在癌组织中lncRNA有特征性表达谱，可以从中寻找肝癌诊断、治疗及预后判断的分子标志物(CN201710404209.8、CN201710404203.0)。到目前为止，临床上仍缺少有效的诊断或预后的分子标志物，研究lncRNA与肝癌的关系，寻找与可应用于肝癌诊断和治疗的分子标志物具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种可应用于肝细胞癌诊断和治疗的分子标志物。

本发明的目的之二在于提供一种筛选治疗肝细胞癌的候选药物的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测HRAT92基因的表达水平。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别HRAT92的探针；或

特异性扩增HRAT92的引物。

进一步，特异性扩增HRAT92的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第三方面提供了一种芯片，所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第四方面提供了一种核酸膜条，所述核酸膜条包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第五方面提供了一种组合物，所述组合物包括有效量的HRAT92的抑制剂，和/或药学上可接受的载体和/或辅料。其中，所述HRAT92的抑制剂选自：以HRAT92或其转录本为靶序列、且能够抑制HRAT92基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

药学上可接受的载体包括(但不限于)缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂、消泡剂。

优选的，所述抑制剂为siRNA。

更为优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.9～10所示。

本发明的第六方面提供了一种筛选治疗肝细胞癌的候选药物的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有HRAT92基因的体系；和

检测所述体系中HRAT92基因的表达；

其中，若所述待筛选的物质可以抑制HRAT92基因的水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该待筛选物质是治疗肝细胞癌的候选药物。

所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

所述候选药物包括(但不限于)：针对HRAT92基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明的第七方面提供了如下任一项所述的应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用；

b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用；

c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用；

d.本发明第四方面所述的核酸膜条在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用；

e.本发明第五方面所述的组合物在制备治疗肝细胞癌的药物中的应用；

f.本发明第五方面所述的组合物在制备治疗肝细胞癌侵袭的药物中的应用；

g.本发明第五方面所述的组合物在制备治疗肝细胞癌转移的药物中的应用；

h.HRAT92在筛选治疗肝细胞癌的候选药物中的应用；

i.HRAT92在制备治疗肝细胞癌的药物中的应用；

j.HRAT92在制备治疗肝细胞癌侵袭的药物中的应用；

k.HRAT92在制备治疗肝细胞癌转移的药物中的应用。

附图说明

图1是利用QPCR检测HRAT92在肝细胞癌患者中的表达情况图；

图2是利用QPCR检测HRAT92在肝细胞癌细胞中的表达情况图；

图3是检测转染siRNA对肝细胞癌细胞中HRAT92的表达影响图；

图4是利用CCK8检测HRAT92对肝癌细胞增殖的影响图；

图5是检测HRAT92基因对肝细胞癌细胞迁移的影响图；

图6是检测HRAT92基因对肝细胞癌细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测肝细胞癌组织和癌旁组织中lncRNA的表达水平，发现其中具有明显表达差异的lncRNA片段，探讨其与肝细胞癌的发生之间的关系，从而为肝细胞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肝细胞癌中HRAT92显著性上调。实验证明，siRNA干扰沉默HRAT92，能够有效地抑制肝细胞癌细胞的增殖，为肝细胞癌的个性化治疗提供了新途径。

HRAT92基因

HRAT92基因位于7号染色体短臂2区2带上，本发明中的HRAT92包括野生型、突变型或其片段。在本发明的实施例中，一种代表性的人HRAT92基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中HRAT92基因(NR_033963.1)所示。本发明的HRAT92核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

检测技术

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。

试剂盒、芯片、核酸膜条

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测HRAT92的表达。所述试剂盒包括用于扩增HRAT92的特异性引物对；标准DNA模板；PCR反应液。在一个优选的实施方案中，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，序列如SEQ ID NO.1～2所示。

作为更优选的实施方案，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。

在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并一步包含荧光染料。

在一个更优选的实施方案中，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶及buffer缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶为热启动酶。

本发明中的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于HRAT92所示的部分或全部序列。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

本发明中针对HRAT920基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片或核酸膜条可用于检测包括HRAT92基因在内的多个基因(例如，与肝细胞癌相关的多个基因)的表达水平，将肝细胞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肝细胞癌诊断的准确率。

抑制剂和药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种HRAT92的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制HRAT92基因的功能性表达即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以HRAT92基因为靶序列、且能够抑制HRAT92基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调HRAT92有用的物质，可用于治疗肝细胞癌。

作为本发明的一种优选方式，所述HRAT92的抑制剂是一种HRAT92特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，在本发明的具体实施例中，该siRNA的序列如SEQ IDNO.9～10所示，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中HRAT92基因的表达水平，以及肝癌细胞的增殖。

作为本发明的一种可选方式，所述的HRAT92的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，表达载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的HRAT92的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制肝细胞癌。任何前述的HRAT92的抑制剂均可用于药物组合物的制备。

所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。药学上可接受的载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂(timedelayagent)。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄耆树胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、柑橘或树莓调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯类的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞(宿主细胞)转染试剂。

本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将HRAT92的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带HRAT92的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA或shRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的HRAT92抑制剂，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明的药物组合物还可与其他治疗肝细胞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肝细胞癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集50例HBV感染的肝细胞癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织样本，从中随机选取8例进行高通量测序，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

3、RNA样品的质量分析

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5ug，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

5、构建cDNA文库

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

6、上机测序

使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

7、高通量转录组测序数据分析

对测序结果使用R-3.3.3工具包中的DESeq2进行生物信息学分析，通过构dds矩阵、标准化，进行差异分析，差异表达lncRNA的筛选标准：FDR<0.05，abs(log₂FC)>2。

8、结果

RNA-seq结果显示，HRAT92基因在肝细胞癌组织中的表达量显著高于对照组(癌旁组织)，P值为5.02E-25，提示HRAT92可能作为检测靶标应用于肝细胞癌的诊断。

实施例2 QPCR测序验证HRAT92基因的差异表达

1、利用前面收集的50例患者癌组织样本和癌旁组织样本对HRAT92基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

将1μg的总RNA模板与2μl 10×缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl polyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h；然后向反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min，立即置冰上孵育至少2min，然后将反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1h。

4、QPCR扩增检验

根据Genebank中HRAT92基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

1)引物设计：

HRAT92基因的引物序列为：

正向引物：5’-TAGTAGTAACGGCTGACA-3’(SEQ ID NO.1)

反向引物：5’-TCTTCGCTTAGAGTTGATG-3’(SEQ ID NO.2)

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’(SEQ ID NO.3)

反向引物：5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’(SEQ ID NO.4)

2)反应体系

SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA 2.0μl，ddH₂O 8.5μl。各项操作均于冰上进行。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

3)反应条件

95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以GAPDH作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，HRAT92基因在肝细胞癌组织中表达水平上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；其中表达上调的患者为45例，低表达1例，正常表达3例，阳性检出率＝45/50×100％＝90％；提示HRAT92可作为检测指标应用于肝细胞癌的诊断。

实施例3 HRAT92基因在肝细胞癌细胞系中的差异表达

1、细胞培养

人肝细胞癌细胞株HepG2、Huh7和正常肝细胞系HL-7702，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、RNA的提取

使用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，具体操作参照说明书。

3、逆转录具体步骤同实施例2

4、QPCR扩增检验具体步骤同实施例2

5、结果

结果如图2所示，与正常肝细胞系相比，HRAT92基因在肝细胞癌细胞HepG2、Huh7中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例4 HRAT92基因的沉默

1、细胞培养

人肝细胞癌细胞株HepG2，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、siRNA设计

针对HRAT92基因的序列设计siRNA，设计的siRNA序列如下所示：

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)，

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)；

siRNA1：

正义链：5’-AGUUUGAAUGGAAACGAAGGC-3’(SEQ ID NO.7)，

反义链：5’-CUUCGUUUCCAUUCAAACUCC-3’(SEQ ID NO.8)；

siRNA2：

正义链：5’-UUUCAACUUCAUUUCGAGGUU-3’(SEQ ID NO.9)，

反义链：5’-CCUCGAAAUGAAGUUGAAAAU-3’(SEQ ID NO.10)；

siRNA3：

正义链为5’-UCAUUCACAAAAUGUUCACAC-3’(SEQ ID NO.11)，

反义链为5’-GUGAACAUUUUGUGAAUGAAG-3’(SEQ ID NO.12)

将细胞按2×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h；在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂3000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。

实验分为空白对照组(HepG2)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，其中阴性对照组siRNA与HRAT92基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

3、QPCR检测HRAT92基因的表达水平

1)细胞总RNA的提取具体步骤同实施例4。

2)逆转录步骤同实施例2。

3)QPCR扩增步骤同实施例2。

4、结果

结果如图3显示，相比HepG2、转染空载siRNA-NC组，实验组能够降低HRAT92的表达水平，而siRNA2组的降低水平最为显著，因此选择siRNA2进行后续的实验。

实施例5 CCK8检测细胞增殖实验

1、细胞培养与转染步骤同实施例4

2、CCK8检测细胞增殖

将对数增殖期的HepG2细胞接种于96孔板，每孔2×10³个细胞，将细胞分为三组，分别是空白对照组、转染siRNA-NC组和转染siRNA2，每组设6个复孔；分别在转染0h、24h、48h、72h、96h后加入10μl/孔CCK8试剂，放入培养箱中孵育1h后使用酶标仪检测A450的吸光值。

3、结果

图4所示的结果显示：空白对照组同空载组无明显差异，而转染siRNA2组的细胞生长速度明显低对照组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明HRAT92与肝癌细胞的增殖有关。

实施例6细胞迁移实验

1、各组细胞转染后24h，常规消化、离心，用含有10g/L的无血清DMEM培养液重悬，调整细胞浓度为1×10⁵/ml；

2、取200μ1的细胞悬液接种至不铺Matrigel胶的Transwell小室上室中；

3、在24孔板下室加1ml含10％胎牛血清的DMEM培养液，将Transwell小室置于24孔板孔内，避免培养液与小室之间形成气泡；37℃，5％CO₂，常规培养48h；

4、取出小室，PBS淋洗，棉签小心擦净小室上室面的细胞，下室面用甲醇固定15min，1％结晶紫染色5min；200倍倒置显微镜下随机选取10个视野，计数穿过微孔膜下层的细胞数，取平均值，每组3个小室，重复3次。

5、结果

结果如图5所示，在肝细胞癌细胞转染干扰RNA之后，与对照组相比，实验组的穿膜细胞数显著减少，说明改变HRAT92的表达水平可以改变肝癌细胞的迁移能力，提示HRAT92参与肝癌细胞的转移过程。

实施例7细胞侵袭实验

1、包被基底膜：将Matrigel胶置于4℃冰箱过夜液化，在冰上用预冷的枪头将Matrigel胶按1:3比例稀释于无血清的DMEM培养液，按50μl/孔均匀地覆盖在Transwell小室膜上，室温自然风干；

2、吸出培养板中残余液体，然后每孔加入50μl含有l0g/L BSA的无血清培养液，37℃孵育30min；

3、各组细胞转染后24h，常规消化、离心，用含有10g/L BSA的无血清DMEM培养液重悬。调整细胞浓度为1×l 0⁵ml；

4、取200μl的细胞悬液接种至包被有Matrigel胶的Transwell小室上室中；在24孔板下室加1ml含10％胎牛血清的DMEM培养液，将Transwell小室置于24孔板内，避免培养液与小室之间形成气泡；37℃，5％CO₂，常规培养48h；

5、取出小室，PBS淋洗，棉签小心擦净小室上室面的Matrigel胶和细胞，下室面用甲醇固定15min，1％结晶紫染色5min；用PBS漂洗2遍，200倍倒置显微镜下随机选取10个视野，计数穿过微孔膜下层的细胞数，取平均值，每组3个小室，重复3次。

6、结果

结果如图6所示，与对照组相比，实验组的穿膜细胞数减少，说明改变HRAT92的表达水平改变了肝癌细胞的侵袭能力，提示在肝癌的发生发展过程中，HRAT92可能参与了肝癌的浸润过程。

实施例8 HRAT92基因对肝细胞癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测HRAT92基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养步骤同实施例4。

2、细胞转染步骤同实施例5。

3、细胞凋亡检测

1)收集细胞样本并用预冷的PBS清洗，将细胞加入lml 1×上样缓冲液，300g离心10min，吸出缓冲液；

2)再次加入1×上样缓冲液，将细胞悬液中细胞浓度调整为1×10⁶个/ml；

3)将细胞悬液取出100μ1，加入EP管中；将5μl的Annexin V FITC加入EP管中，混匀EP管中的液体，在室温下避光孵育10min；

4)继续加入5μ1PI染液，在室温下避光5min；

5)加入500μl的PBS溶液，轻轻混匀，1h内上流式细胞仪进行检测。

4、结果：

结果显示，实验组与对照组相比，对照组之间的细胞凋亡率无显著差异(HepG2组：4.2±0.27；siRNA-NC组：4.3±0.45)，而实验组(siRNA2：8.4±0.14)则显著增加，说明改变HRAT92的表达水平可以改变肝癌细胞的凋亡率，提示HRAT92参与肝癌细胞的凋亡过程。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

中国医学科学院北京协和医院

<120> 长链非编码RNA在肝细胞癌诊疗中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagtagtaac ggctgaca 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tagtagtaac ggctgaca 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgggaaact gtggcgtgat gg 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aguuugaaug gaaacgaagg c 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cuucguuucc auucaaacuc c 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uuucaacuuc auuucgaggu u 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccucgaaaug aaguugaaaa u 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ucauucacaa aauguucaca c 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gugaacauuu ugugaaugaa g 21

Claims

1.如下任一项所述的应用：

a. 检测肝组织中HRAT92基因的表达水平的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用；

b.试剂盒在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测肝组织中HRAT92基因的表达水平的试剂；

c.芯片在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用，其特征在于，所述芯片包括检测肝组织中HRAT92基因的表达水平的试剂；

d.核酸膜条在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用，其特征在于，所述核酸膜条包括测肝组织中HRAT92基因的表达水平的试剂；

e.组合物在制备治疗肝细胞癌的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括有效量的降低HRAT92表达水平的抑制剂，和/或药学上可接受的载体，所述抑制剂为siRNA；

f.组合物在制备治疗肝细胞癌侵袭的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括有效量的降低HRAT92表达水平的抑制剂，和/或药学上可接受的载体，所述抑制剂为siRNA；

g.组合物在制备治疗肝细胞癌转移的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括有效量的降低HRAT92表达水平的抑制剂，和/或药学上可接受的载体，所述抑制剂为siRNA。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，a、b、c、d中所述的试剂包括：

特异性识别HRAT92的探针；或

特异性扩增HRAT92的引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，特异性扩增HRAT92的引物序列如SEQ IDNO.1~2所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.9~10所示。