CN108660211B - 一种与肝细胞癌相关的生物标志物linc01549及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与肝细胞癌相关的生物标志物LINC01549及其应用，本发明首次发现了LINC01549在肝细胞癌患者中表达上调，且通过大样本做了进一步验证，结果显示使用LINC01549作为检测物质具有较高的阳性检出率；本发明通过实验进一步证明了LINC01549肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭相关，提示LINC01549可作为药物靶标应用于肝细胞癌的临床治疗。

Description

一种与肝细胞癌相关的生物标志物LINC01549及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种与肝细胞癌相关的生物标志物LINC01549及其应用。
背景技术
肝癌是一种致死率较高的常见恶性肿瘤疾病，世界范围内肝癌发生率在所有癌症中排第六位，其致死率则排第二(Torre LA,Bray F,Siegel RL,Ferlay J,Lortet-Tieulent J,Jemal A.Global cancer statistics,2012.CA:a cancerjournal forclinicians.2015；65:87-108.)。我国是肝癌大国，每年新发病患者数十万，占世界肝癌患者的半数以上。目前先进的肝癌外科手术治疗方式及索拉菲尼等靶向药物的应用明显改善了肝癌患者的生活质量，然而由于多数患者在确诊时已经处于中晚期且肝癌异质性较大，大多数患者治疗效果不良、预后较差(McGlynn KA,Petrick JL,London WT.Globalepidemiology of hepatocellular carcinoma:an emphasis on demographic andregional variability.Clinics in liver disease.2015；19:223-38.)。因此，揭示肝癌的发病机制、探寻有效的治疗方式是目前肝癌研究领域的焦点。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，1ncRNA)通常是指一类片段长度在200bp以上、没有蛋白编码产物的成熟体RNA分子(Ponting CP,Oliver PL,Reik W.Evolutionand functions of long noncoding RNAs.Cell.2009；136:629-41)。大量的研究已经证实1ncRNA是生命体内调控分子网络中非常重要的一环，其参与生物体发育、生殖、死亡以及各种疾病的多个生理病理过程(Yang L,Lin C,Jin C,Yang JC,Tanasa B,Li W,etal.IncRNA-dependent mechanisms of androgen-receptor-regulated gene activationprograms.Nature.2013；500:598-602.)。探讨1ncRNA分子在肿瘤发生过程中促癌/抑癌作用、揭示其相关分子调控机制及作为肿瘤治疗靶点潜能是目前肿瘤研究领域中较为重要的一个部分。关于1ncRNA分子在肝癌发生及转移中的作用已有研究报道(201710522694.9、201710522693.4)。但是目前尚缺乏有效的生物标志物应用于肝细胞癌的临床诊断和治疗，因此，寻找与肝细胞癌发生发展相关的lncRNA具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种与肝细胞癌发生发展相关的lncRNA生物标志物及其在肝细胞癌诊断和治疗中的应用。
本发明的目的之二在于提供一种筛选治疗肝细胞癌的候选药物的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种检测试剂，所述试剂为检测LINC01549水平的试剂。
进一步，所述试剂包括：
特异性识别LINC01549的探针；或
特异性扩增LINC01549的引物。
进一步，特异性扩增LINC01549的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明的第二方面提供了一种产品，所述产品包括本发明第一方面所述的试剂。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。
本发明的第三方面提供了一种组合物，所述组合物包括有效量的LINC01549的抑制剂。其中，所述LINC01549的抑制剂选自：以LINC01549或其转录本为靶序列、且能够抑制LINC01549基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
优选的，所述抑制剂为siRNA。
更为优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.9～10所示。
进一步，所述组合物还包括与所述抑制剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
药学上可接受的载体和/或辅料包括(但不限于)缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂、消泡剂。
本发明的第四方面提供了一种筛选治疗肝细胞癌的候选药物的方法，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有LINC01549基因的体系；和
检测所述体系中LINC01549基因的表达；
其中，若所述待筛选的物质可以抑制LINC01549基因的水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该待筛选物质是治疗肝细胞癌的候选药物。
所述候选药物包括(但不限于)：针对LINC01549基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。
本发明的第五方面提供了如下任一项所述的应用：
a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断肝细胞癌的工具中的应用；
b.本发明第二方面所述的产品在制备诊断肝细胞癌的工具中的应用；
c.本发明第三方面所述的组合物在制备治疗肝细胞癌的药物中的应用；
d.本发明第三方面所述的组合物在制备治疗肝细胞癌侵袭的药物中的应用；
e.本发明第三方面所述的组合物在制备治疗肝细胞癌转移的药物中的应用；
f.LINC01549在筛选治疗肝细胞癌的候选药物中的应用；
g.LINC01549在制备治疗肝细胞癌的药物中的应用；
h.LINC01549在制备治疗肝细胞癌侵袭的药物中的应用；
i.LINC01549在制备治疗肝细胞癌转移的药物中的应用。
进一步，g-i任一项所述的应用中的药物包括LINC01549的抑制剂，优选的，所述抑制剂包括以LINC01549或其转录本为靶序列、且能够抑制LINC01549基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
优选的，所述抑制剂为siRNA；更为优选的所述siRNA的序列如SEQ ID NO.9～10所示。
进一步，e中所述的筛选治疗肝细胞癌的候选药物的步骤包括：
用待筛选物质处理表达或含有LINC01549基因的体系；和
检测所述体系中LINC01549基因的表达；
其中，若所述待筛选的物质可以抑制LINC01549基因的水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该待筛选物质是治疗肝细胞癌的候选药物。
附图说明
图1是利用QPCR检测LINC01549在肝细胞癌患者中的表达情况图；
图2是利用QPCR检测LINC01549在肝细胞癌细胞中的表达情况图；
图3是检测转染siRNA对肝细胞癌细胞中LINC01549的表达影响图；
图4是利用CCK8检测LINC01549对肝癌细胞增殖的影响图；
图5是检测LINC01549基因对肝细胞癌细胞迁移的影响图；
图6是检测LINC01549基因对肝细胞癌细胞侵袭的影响图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测肝细胞癌组织和癌旁组织中lncRNA的表达水平，发现其中具有明显表达差异的lncRNA片段，探讨其与肝细胞癌的发生之间的关系，从而为肝细胞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肝细胞癌中LINC01549显著性上调，并且通过大样本实验证明，采用该lncRNA具有较高的阳性检出率；进一步的细胞实验证明，改变LINC01549的表达水平可以改变肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示LINC01549可以作为药物靶标应用于肝细胞癌的精准治疗。
生物标志物
“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。
在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与肝细胞癌相关联的基因、基因的片段或变体。
LINC01549基因
LINC01549基因位于21号染色体长臂2区1带上，本发明中的LINC01549包括野生型、突变型或其片段。在本发明的实施例中，一种代表性的人LINC01549基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LINC01549基因(NR_037585.1)所示。本发明的LINC01549核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。
试剂盒、芯片、核酸膜条
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LINC01549的表达。
作为优选的实施方案，所述试剂盒包含与生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针或引物。
作为更为优选的实施方案，所述试剂盒还包含洗涤溶液。
作为更为优选的实施方案，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。
作为进一步优选的实施方案，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。
所述试剂盒包括用于扩增LINC01549的特异性引物对；标准DNA模板；PCR反应液。
本发明中的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LINC01549所示的部分或全部序列。
本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的LINC01549芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的lncRNA芯片。
在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
本发明中基因检测试剂盒或基因芯片或核酸膜条可用于检测包括LINC01549基因在内的多个基因(例如，与肝细胞癌相关的多个基因)的表达水平，将肝细胞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肝细胞癌诊断的准确率。
抑制剂和药物(组合物)
基于发明人的发现，本发明提供了一种LINC01549的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制LINC01549基因的功能性表达即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以LINC01549基因为靶序列、且能够抑制LINC01549基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调LINC01549有用的物质，可用于治疗肝细胞癌。
作为本发明的一种优选方式，所述LINC01549的抑制剂是一种LINC01549特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，在本发明的具体实施例中，该siRNA的序列如SEQ IDNO.9～10所示，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中LINC01549基因的表达水平，以及肝癌细胞的增殖。
本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
如本文所用，本文所用术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的LINC01549基因的抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
本发明的药物组合物还可与其他治疗肝细胞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
候选药物的筛选
本发明提供了一种筛选治疗肝细胞癌的候选药物的方法，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有LINC01549基因的培养体系；和
检测所述体系中LINC01549基因的表达；
其中，若所述待筛选的物质可以抑制LINC01549基因的水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该待筛选物质是治疗肝细胞癌的候选药物。
在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的潜在物质进一步测试其抑制肝癌的效果，若测试化合物对肝癌有显著的抑制效果，则说明该化合物为治疗肝癌的潜在物质。
所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。
当将通过本发明的筛选方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物，其包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、羊、猪、牛、猴子、狒狒、黑猩猩时，分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法配制成各种剂型。例如，根据需要，所述药物可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶囊口服施用；或者用水或任何其它药物可接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将化合物以一般接受的药物施用方式所需的单位剂型(unit dose)、与药学可接受的载体或介质混合在一起，所述载体或介质包括但不限于无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、媒介物(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。根据这些制剂中有效成分的含量，可以获得在指定范围内的合适的给药量。
统计学分析
在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
下面的实施例使用标准技术进行，所述标准技术对本领域技术人员来说除了另外详细描述的以外都是众所周知的和常规的。这些实施例仅仅是用于举例说明目的，而不限制本发明。
实施例1筛选与肝细胞癌相关的基因标志物
1、样品收集
各收集50例HBV感染的肝细胞癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织样本，从中随机选取8例进行高通量测序，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。
3、RNA样品的质量分析
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5ug，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
4、去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。
5、构建cDNA文库
利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。
6、上机测序
使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。
7、高通量转录组测序数据分析
对测序结果使用R-3.3.3工具包中的DESeq2进行生物信息学分析，通过构dds矩阵、标准化，进行差异分析，差异表达lncRNA的筛选标准：FDR<0.05，abs(log2FC)>2。
8、结果
RNA-seq结果显示，LINC01549基因在肝细胞癌组织中的表达量显著高于对照组(癌旁组织)，P值为1.28E-11，提示LINC01549可以作为可能的检测靶标应用于肝细胞癌的诊断。
实施例2 QPCR测序验证LINC01549基因的差异表达
1、利用前面收集的50例患者癌组织样本和癌旁组织样本对LINC01549基因差异表达进行大样本QPCR验证。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录：
1)将1μg的总RNA模板与2μl 10×缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl polyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h；
2)向反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min，立即置冰上孵育至少2min；
3)将反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase freewater)混合，42℃孵育1h。
4、QPCR扩增检验
1)引物设计
根据Genebank中LINC01549基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成，其中，LINC01549的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，GAPDH的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。
2)反应体系
SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA 2.0μl，ddH2O 8.5μl。各项操作均于冰上进行。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
3)反应条件
95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以GAPDH作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、结果
结果如图1所示，与癌旁组织相比，LINC01549基因在肝细胞癌组织中表达水平上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；其中表达上调的患者为44例，低表达2例，正常表达4例，阳性检出率＝44/50×100％＝88％；提示LINC01549可作为检测指标应用于肝细胞癌的辅助诊断。
实施例3 LINC01549基因在肝细胞癌细胞系中的差异表达
1、细胞培养
人肝细胞癌细胞株HepG2、Huh7和正常肝细胞系HL-7702，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、RNA的提取
使用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，具体操作参照说明书。
3、逆转录具体步骤同实施例2
4、QPCR扩增检验具体步骤同实施例2
5、结果
结果如图2所示，与正常肝细胞系相比，LINC01549基因在肝细胞癌细胞HepG2、Huh7中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 LINC01549基因的沉默
1、细胞培养
人肝细胞癌细胞株HepG2，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、siRNA设计
针对LINC01549基因的序列设计siRNA，设计的阴性对照siRNA-NC的序列如SEQ IDNO.5～6所示，siRNA1的序列如SEQ ID NO.7～8所示，siRNA2的序列如SEQ ID NO.9～10所示，siRNA3的序列如SEQ ID NO.11～12所示，siRNA4的序列如SEQ ID NO.13～14所示。
将细胞按2×105/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h；在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂3000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。
实验分为空白对照组(HepG2)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)，其中阴性对照组siRNA与LINC01549基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。
3、QPCR检测LINC01549基因的表达水平
1)细胞总RNA的提取具体步骤同实施例4。
2)逆转录步骤同实施例2。
3)QPCR扩增步骤同实施例2。
4、结果
结果如图3显示，与对照组HepG2、转染空载siRNA-NC组相比，实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3)能够降低LINC01549的表达水平，而siRNA2组的干扰效果最为显著，因此选择siRNA2进行后续的实验。
实施例5 CCK8检测细胞增殖实验
1、细胞培养与转染步骤同实施例4
2、CCK8检测细胞增殖
将对数增殖期的HepG2细胞接种于96孔板，每孔2×103个细胞，将细胞分为三组，分别是空白对照组、转染siRNA-NC组和转染siRNA2，每组设6个复孔；分别在转染0h、24h、48h、72h、96h后加入10μl/孔CCK8试剂，放入培养箱中孵育1h后使用酶标仪检测A450的吸光值。
3、结果
图4所示的结果显示：空白对照组同转染空载组无明显差异(P>0.05)，而转染siRNA2组的增殖细胞明显低于对照组的增殖细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明LINC01549与肝癌细胞的增殖有关。
实施例6细胞迁移实验
1、各组细胞转染后24h，常规消化、离心，用含有10g/L的无血清DMEM培养液重悬，调整细胞浓度为1×105/ml；
2、取200μ1的细胞悬液接种至不铺Matrigel胶的Transwell小室上室中；
3、在24孔板下室加1ml含10％胎牛血清的DMEM培养液，将Transwell小室置于24孔板孔内，避免培养液与小室之间形成气泡；置于37℃，5％CO2中，常规培养48h；
4、取出小室，PBS淋洗，棉签小心擦净小室上室面的细胞，下室面用甲醇固定15min，1％结晶紫染色5min；
5、200倍倒置显微镜下随机选取10个视野，计数穿过微孔膜下层的细胞数，取平均值，每组3个小室，重复3次。
6、结果
结果如图5所示，在肝细胞癌细胞转染干扰RNA之后，与对照组相比，实验组的穿膜细胞数显著减少，说明改变LINC01549的表达水平可以影响肝癌细胞的迁移，提示LINC01549参与了肝癌细胞的迁移过程。
实施例7细胞侵袭实验
1、包被基底膜：将Matrigel胶置于4℃冰箱过夜液化，在冰上用预冷的枪头将Matrigel胶按1:3比例稀释于无血清的DMEM培养液，按50μl/孔均匀地覆盖在Transwell小室膜上，室温自然风干；
2、吸出培养板中残余液体，然后每孔加入50μl含有l0g/L BSA的无血清培养液，37℃孵育30min；
3、各组细胞转染后24h，常规消化、离心，用含有10g/L BSA的无血清DMEM培养液重悬。调整细胞浓度为1×l 05ml；
4、取200μl的细胞悬液接种至包被有Matrigel胶的Transwell小室上室中；在24孔板下室加1ml含10％胎牛血清的DMEM培养液，将Transwell小室置于24孔板内，避免培养液与小室之间形成气泡；37℃，5％CO2，常规培养48h；
5、取出小室，PBS淋洗，棉签小心擦净小室上室面的Matrigel胶和细胞，下室面用甲醇固定15min，1％结晶紫染色5min；用PBS漂洗2遍，200倍倒置显微镜下随机选取10个视野，计数穿过微孔膜下层的细胞数，取平均值，每组3个小室，重复3次。
6、结果
结果如图6所示，与对照组相比，实验组的穿膜细胞数减少，说明改变LINC01549的表达水平影响了肝癌细胞的侵袭，在肝癌的发生发展过程中，LINC01549可能参与了肝癌的浸润过程。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 一种与肝细胞癌相关的生物标志物LINC01549及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgagacta cagatacag 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaatgaatag cccttgag 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgggaaact gtggcgtgat gg 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uuuucagucu guuucacaca g 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gugugaaaca gacugaaaag a 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
uuccuuuucu caagcauuga g 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caaugcuuga gaaaaggaau u 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
uaucuguagu cucaacuacc c 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
guaguugaga cuacagauac a 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
auuucucucu uuuucucucu c 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagagaaaaa gagagaaauu a 21

Claims (7)

1.一种筛选治疗肝细胞癌的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有LINC01549 基因的体系；和
检测所述体系中LINC01549 基因的表达；
其中，若所述待筛选的物质可以抑制LINC01549基因的表达水平，则表明该待筛选物质是治疗肝细胞癌的候选药物。
2.如下任一项应用：
a.试剂在制备诊断肝细胞癌的工具中的应用，其特征在于，所述试剂为检测肝组织中LINC01549表达水平的试剂；
b.产品在制备诊断肝细胞癌的工具中的应用，其特征在于，所述产品包括检测肝组织中LINC01549表达水平的试剂；
c.组合物在制备治疗肝细胞癌的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括有效量的LINC01549的抑制剂，所述抑制剂降低LINC01549的表达水平；
d. 检测LINC01549表达水平的试剂在筛选治疗肝细胞癌的候选药物中的应用；
e. LINC01549的抑制剂在制备治疗肝细胞癌的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂降低LINC01549的表达水平。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，a、b中所述试剂选自：
特异性识别LINC01549的探针；或
特异性扩增LINC01549的引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增LINC01549的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，b中所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，c、e中所述的抑制剂为siRNA。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，siRNA的序列如SEQ ID NO.9~10所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113201590B (zh) * 2020-08-05 2024-05-07 上海健康医学院 用于评估肝细胞癌早期复发风险的lncRNA、评估方法及装置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gene expression profiling of breast cancer in Lebanese women;Joelle Makoukji等;《Scientific Reports》;20161118;第6卷;第1页摘要，第9页第1段 *
Identification of potential long non-coding RNA biomarkers associated with the progression of colon cancer;Jingwen Li等;《Oncotarget》;20170517;第8卷(第44期);第75834-75843页 *

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