CN111172290B

CN111172290B - 肝细胞癌诊断和治疗的miRNA

Info

Publication number: CN111172290B
Application number: CN202010188702.2A
Authority: CN
Inventors: 窦剑; 赵鑫; 张颖; 刘文鹏; 曾强; 王洋; 刘宝旺; 崔自强; 滕亮; 张军红; 曹经琳; 高庆军
Original assignee: Third Hospital of Hebei Medical University
Current assignee: Third Hospital of Hebei Medical University
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-03-17
Also published as: CN111172290A

Abstract

本发明公开了肝细胞癌诊断和治疗的miRNA，本发明首次发现了miR‑4772‑3p在肝癌中表达下调，并进一步验证了miR‑4772‑3p在肝癌中具有较高的诊断效能。本发明同时公开了miR‑4772‑3p在肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭中起着重要的作用，提示miR‑4772‑3p可应用于肝癌的治疗。

Description

肝细胞癌诊断和治疗的miRNA

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及肝癌诊断和治疗的miRNA。

背景技术

原发性肝癌是全球第四大癌症致死病因且在所有癌症中发病率的增长速度最快。每年约有80万人死于原发性肝癌，其死亡率仍以每年3％的速度增加(Siegel RL,MillerKD.Cancer statistics,2019[J].2019；69(1):7-34；Bertuccio P,Turati F,Carioli G,et al.Global trends and predictions in hepatocellμlar carcinoma mortality[J].Journal of hepatology.2017；67(2):302-9.)，原发性肝癌组织学类型包括肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管细胞癌(Intrahepaticcholangiocarcinoma，ICC)、肝细胞-胆管细胞混合癌，其中以HCC的发病率最高，约占原发性肝癌的90％(Wakizaka K,Yokoo H,Kamiyama T,et al.Clinical and pathologicalfeatures of combined hepatocellular-cholangiocarcinoma compared with otherliver cancers[J].Journal of gastroenterology and hepatology.2018.)。早期HCC患者一般以手术切除、肝移植和射频消融等治疗方法为主以提高HCC患者的生存率(EASL-EORTC clinical practice guidelines:management of hepatocellular carcinoma[J].Journal of hepatology.2012；56(4):908-43.)。然而，当患者被诊断为HCC时，大多数已经进入晚期阶段。HCC的5年复发率甚至高达80％-90％(Erridge S,Pucher PH.Meta-analysis of determinants of survival following treatment of recurrenthepatocellular carcinoma[J].2017；104(11):1433-42.)。许多小分子靶向治疗药物，如索拉非尼、伦瓦替尼、雷格拉非尼等适用用于晚期HCC的治疗，其中索拉非尼是唯一一种可用于晚期HCC的标准一线全身治疗药物，但报道其中位生存期仅为3个月。虽然小分子靶向治疗药物可以改善HCC患者的总体生存期，然而，由于患者的耐药性的增加，仅观察到这些治疗方法在HCC患者生存率上有轻微的改善。此外，这些药物也表现出一定的不良反应(Bruix J,Qin S,Merle P,et al.Regorafenib for patients with hepatocellularcarcinoma who progressed on sorafenib treatment(RESORCE):a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 3trial[J].Lancet(London,England).2017；389(10064):56-66.)。因此，我们迫切需要研究HCC发生发展的机制，找寻新的早期诊断方法以便HCC患者及早发现，同时探索早期治疗方法以提高HCC患者的存活时间。

microRNA是一种不编码蛋白质的，约21-25nt大小的单链小分子RNA。通过特异性的结合靶基因来调控其表达。从1993年，第一个microRNA：lin-4被发现后，在过去的几十年，大量的microRNA被发现并认为在细胞的发生、分化、增殖和凋亡起着重要的作用。据报道，miRNAs调控人类60％编码蛋白基因的表达，通过结合其目标基因mRNA的3’非翻译区而导致mRNA的降解或者翻译抑制。除了沉默作用外，某些miRNAs还被证实能激活基因的表达。在不同的肿瘤类型中，microRNA呈现两种不一样的角色：抑癌基因和癌基因。主要的作用机制包括：miRNA位点的缺失、扩增、突变，表观遗传水平改变，转录调控因子的异常表达等。

由于肝癌给人类健康带来的巨大危害，研究者们正通过各种途径寻找有效的治疗肝癌的方法。分子标志物正在被尝试应用到肝癌的诊断和治疗当中。最近的研究表明microRNA(miRNA)在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，寻找与肝癌发生发展相关的miRNA对肝癌的机制研究以及临床上的诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于肝癌诊断和治疗的miRNA，该miRNA为miR-4772-3p。

本发明的目的之二在于提供一种对肝癌进行诊断的产品。

本发明的目的之三在于提供一种对肝癌进行治疗的药物组合物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测微小RNA的试剂在制备诊断产品中的应用，所述产品用于诊断受试者是否患有肝细胞癌，通过测量来自所述受试者的测试样品中的miR-4772-3p的水平来诊断受试者是否患有肝细胞癌，其中与对照样品中miR-4772-3p的水平相比，测试样品中miR-4772-3p的水平下调，指示着受试者患有肝细胞癌。

进一步，所述试剂包括通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miR-4772-3p或其同源物的水平的试剂。

进一步，所述试剂包括特异性针对miR-4772-3p的探针或引物。

进一步，所述引物序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种诊断肝细胞癌的产品，所述产品包括检测受试者样品中的miR-4772-3p的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒或微阵列。其中，所述微阵列包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述的miR-4772-3p的部分或全部序列。所述试剂盒包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针。

进一步，针对miR-4772-3p的引物序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述样品包括血液、组织。在本发明的具体实施方式中，所述样品为组织。

本发明提供了miR-4772-3p在制备治疗肝细胞癌/肝细胞癌侵袭/肝细胞癌转移的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括促进miR-4772-3p表达或增强miR-4772-3p功能的试剂。

进一步，所述试剂包括miR-4772-3p的模拟物、miR-4772-3p的激动剂或过表达miR-4772-3p的载体。

本发明提供了一种治疗肝细胞癌/肝细胞癌侵袭/肝细胞癌转移的药物组合物，所述药物组合物包括促进miR-4772-3p表达或增强miR-4772-3p功能的试剂。

在本发明中，“miR基因产物”，“微小RNA”，“miR”，或“miRNA”可互换使用，是指来自miR基因的未加工的或加工过的RNA转录物。由于miR基因产物不翻译成蛋白，术语“miR基因产物”不包括蛋白。未加工的miR基因转录物也称作″miR前体″，通常包含长度为约70-100个核苷酸的RNA转录物。miR前体可以用RNA酶(例如，Dicer，Argonaut，或RNA酶III(例如，大肠杆菌RNA酶III))消化加工成有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。该有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称作“加工过的”miR基因转录物或“成熟的”miRNA。

所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子可以通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶，例如分离的Dicer，Argonaut，或RNA酶III)从miR前体得到。应当理解，所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也可以通过生物或化学合成直接生成，不必从miR前体加工。

应当知道，本发明的miR-4772-3p包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，“变体”是指，与对应野生型miRNA基因产物具有少于100％的同一性并且具有对应野生型miRNA基因产物的一个或多个生物活性的miRNA。此类生物活性的实例包括但不限于，与肝癌发生发展的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)的抑制。这些变体包括物种变体和由于miRNA基因的一个或多个突变(例如，置换、缺失、插入)而产生的变体。在某些实施方案中，变体与对应野生型miRNA基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。其显示完整miR-4772-3p核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。

本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-4772-3p功能的条件下，对miR-4772-3p进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

本发明的miR-4772-3p核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的miR-4772-3p主要呈单链形式，而miR-4772-3p前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

在本发明中，可以测量从受试者得到的生物样品的细胞中的至少一种miR基因产物的水平。例如，通过常规活检技术，可以从被怀疑患有肝细胞癌的受试者取出组织样品。在另一个实施方案中，可以从受试者取出血液样品，并通过标准技术，分离白细胞用于DNA提取。优选地，在放疗、化疗或其它治疗性处理之前，从受试者得到血液或组织样品。相应的对照组织或血液样品或对照参照样品，可以从受试者的未受影响的组织、从正常人个体或正常个体的群体、或从与受试者样品中大多数细胞相对应的培养细胞得到。然后与来自受试者的样品一起，加工处理对照组织或血液样品，从而可以将来自受试者样品的细胞中从给定miR基因产生的miR基因产物的水平与来自对照样品的细胞的相应miR基因产物水平相对比。或者，可以与测试样品单独分开地得到和加工处理参照样品(例如在不同时间)，并将来自测试样品的细胞中从给定miR基因产生的miR基因产物的水平与来自参照样品的相应的miR基因产物水平相对比。

在本发明中，使用适用于检测生物样品中的RNA表达水平的任意技术，可以测量样品中miR基因产物的水平。用于测定生物样品(例如，细胞，组织)中RNA表达水平的合适技术(例如，RNA印迹分析，RT-PCR，原位杂交)是本领域技术人员众所周知的。

在本发明中，芯片(即微阵列)包含针对miR-4772-3p特异性的一组寡核苷酸(如寡脱氧核苷酸)探针。通过使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，然后使其与微阵列上的探针寡脱氧核苷酸杂交，从而产生杂交或表达谱，来测定生物样品中多种微小RNA的表达水平。miRNA特异性的探针寡核苷酸或对miRNA特异性的探针寡核苷酸是指具有经选择与特定miRNA基因产物杂交或与该特定miRNA基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。

本发明所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断肝癌的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断肝癌的情况也包含在本发明的保护范围之内。上面所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断肝癌miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断肝癌的情况也包含在本发明的保护范围之内。

如本文所用的，“治疗”、“医治”和“医疗”是指改善与疾病或病症例如实体癌相关的症状，包括阻止或延迟疾病症状的发作和/或减少疾病或病症的症状的严重度或频率。术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限于，灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛族动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物或鼠类物种。在优选实施方案中，动物是人。

在本发明中，可通过适合将药物组合物递送至受试者的癌细胞的任何方法对受试者施用促进miR-4772-3p表达的药物组合物。例如，可通过适合于用这些药物组合物或用包含编码miR-4772-3p的序列的核酸转染受试者的细胞的方法来施用促进miRNA的试剂。在一个实施方案中，用包含编码miR-4772-3p的序列的质粒或病毒载体转染细胞。

用于真核细胞的转染方法在本领域内是熟知，包括例如核酸至细胞的细胞核或前核的直接注射、电穿孔、脂质体转移或通过亲脂材料介导的转移、受体介导的核酸递送、bioballistic或粒子加速；磷酸钙沉淀和通过病毒载体介导的转染。

例如，可用脂质体转移化合物DOTAP(甲基硫酸N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基-铵，Boehringer-Mannheim)或等同物例如LIPOFECTIN转染细胞。使用的核酸的量对于本发明的实践不是至关重要的。

还可通过任何合适的肠内或胃肠外给药途径对受试者施用促进miR-4772-3p的试剂，用于本方法的合适的肠内给药途径包括例如口服、直肠或鼻内递送。合适的胃肠外给药途径包括例如血管内给药(例如，至脉管系统的静脉内快速注射、静脉输注、动脉内快速浓注、动脉内输注和导管滴注)；组织外周和组织内注射(例如，瘤周和瘤内注射、视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通过渗透泵)；对目的组织的直接施用，例如通过导管或其它安置装置(例如，视网膜弹丸剂或栓剂或包含多孔、无孔或凝胶状材料的植入体)；以及吸入。特别适合的给药途径是注射、输注和直接注射至肿瘤中。

在本发明中，可将促进miR-4772-3p表达的试剂作为裸RNA与递送试剂一起或作为核酸(例如，重组质粒或病毒载体)给受试者施用，所述核酸包含表达miR基因产物表达的化合物的序列。合适的递送试剂包括例如Mirus Transit TKO亲脂试剂、LIPOFECTIN、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子(例如，多聚赖氨酸)和脂质体。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了miR-4772-3p在肝细胞癌患者中表达下调，通过检测miR-4772-3p的水平，可以判断患者是否患有肝细胞癌或者患肝细胞癌的风险。

本发明提供了一种诊断肝癌的产品，该产品可以实现肝癌的早期诊断，为降低肝癌患者的死亡率提供基础。

本发明提供了一种治疗肝癌的药物组合物，该组合物可以降低肝癌细胞的增殖，迁移和侵袭，为肝细胞癌的个性化治疗提供分子手段。

附图说明

图1是miR-4772-3p在组织中的表达情况图；

图2是验证miR-4772-3p的诊断效能的ROC曲线图；

图3是miR-4772-3p在不同细胞系中的表达情况图；

图4是miR-4772-3p转染情况图；

图5是miR-4772-3p对细胞增殖能力的影响图；

图6是miR-4772-3p对细胞迁移和侵袭的影响图，其中图A是细胞迁移的影响图，图B是对细胞侵袭的影响图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 QPCR检测miR-4772-3p在肝细胞癌中的表达

一、实验材料

1、实验试剂和仪器

miRNA第一链cDNA合成，生工，货号B532451-0020，

miRNA荧光定量PCR试剂盒，生工，货号B532461-0002，

NanoVue Plus，BIOCHROM LTD，型号28956057，

荧光定量PCR仪，Applied Biosystems，型号ABI7300

2、实验样本

收集32例病理组织学确诊为原发性肝癌患者的癌组织及相对应>3cm的癌旁组织样本，所有的样本均在手术切除离体30min内装入冻存管内，迅速放进液氮罐中，转移至实验室-80℃超低温冰箱。

排除标准：术前经过抗肿瘤治疗，患有其他脏器恶性肿瘤疾病史。

二、实验方法

1、引物设计

在博迈德公司设计合成miR-4772-3p的引物，在天根公司购买U6内参引物，具体引物序列如下：

CCTGCAACTTTGCCTGATCAGA(SEQ ID NO.1)

2、RNA的提取

使用TRIzol法提取组织总RNA。

1)将1mL TRIzol在超净台里加入至玻璃匀浆瓶中，将匀浆瓶按到仪器上，称取50-100mg的组织放入玻璃匀浆瓶内，将转速调至1500转左右，开始在冰水浴中进行匀浆，每研磨30s，停止30s，反复3-4次即可。样品体积不应超过TRIzol体积10％。

2)将加入TRIzol的样品在室温放置10min，使核酸蛋白复合物完全分离。

3)1mL TRIzol加入200μL氯仿，剧烈振荡2min，每隔1min再晃动两下，5-6次后，再静止7min。

4)4℃，12000rpm，离心15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol的60％。

5)把上层水相转移到新的EP管中(约400μL，尽量不要吸取到中间层以免污染)。加入500μL异丙醇，室温放置10min。

6)4℃，12000rpm，离心15min，离心后在管底出现白色沉淀。用移液器小心移去上清。

7)加入1mL 75％冷乙醇，震荡洗涤沉淀。4℃，7500rpm，离心5min，小心弃掉上清。

9)将EP管倒扣于滤纸上吸去多余的水分，并用10μL枪头小心吸取管内的液体(枪头不要接触RNA)，将EP管室温放置5min，RNA变透明；

10)加入40μL无RNase的水(DEPC水)，用naodrop检测OD值与浓度，在管上做好标记。

2、逆转录合成miRNA cDNA

采用miRNA第一链cDNA合成(货号：B532451-0020)进行miRNA cDNA反转录，在试管中分别加入ToTal RNA 2μg，2×miRNA RT SoluTion Mix 10μL，miRNA RT Enzyme Mix 2μL，RNase-Free water补至20μL，移液器轻轻混匀上述配制的反应液，在水浴锅中37℃加热60min，85℃加热5min。短暂离心后-20℃冰箱中保存。

3、荧光定量检测

将各样品micDNA 50倍稀释后取1μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

1)按表1配置PCR反应体系

表1反应体系

2)按表2设置PCR反应程序

表2反应条件

3)相对定量

根据RealTimePCR原始检测结果，按照2^-△△ct相对定量计算公式，即

计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品，目的基因miRNA转录水平的差异。

三、结果

QPCR结果如图1所示，与癌旁组织相比，miR-4772-3p在肝癌组织中表达显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

具体的，呈现miR-4772-3p显著的样本有32例，其中在癌组织中显著下调的样本有28例，在癌旁组织中显著下调的样本有4例。

实施例2验证生物标志物的诊断效能

1、数据收集

从TCGA数据库中收集342例肝癌组织和50例癌旁组织的miRNA表达谱数据，分析miR-4772-3p在肝癌组织和癌旁组织中的表达水平。

2、ROC曲线分析

使用R语言中的pROC包分析miR-4772-3p的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制ROC曲线。

3、结果

miR-4772-3p的ROC分析结果如图2所示，miR-4772-3p作为检验结果变量的AUC值为0.746，具有较高的曲线下面积，说明使用miR-4772-3p进行肝癌的诊断具有较高的敏感性和特异性，具有较好的诊断效能。

实施例3检测miRNA在肝癌细胞中的表达水平

1、细胞培养

培养人类正常肝细胞株L-02，低侵袭转移能力肝癌细胞系HepG2，和高侵袭转移能力肝癌细胞系Huh7，细胞常规培养于含10％的FBS、100units/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素的1640细胞培养基中，在37℃、5％CO₂以及饱和湿度的条件下培养。细胞每2d换液，按1:3传代。

2、细胞RNA的提取

使用TRIzol法提取细胞总RNA。

收取对数期的细胞，加入1ml TRIzol，混匀；用1ml注射器反复抽取以破裂细胞及剪切DNA，室温静置5min，剩余步骤同实施例1。

3、逆转录和荧光定量检测

实验过程同实施例1。

4、统计学处理

所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图，以P<0.05为检验水准，当P<0.05为差异有统计学意义。

5、结果

结果如图3所示，与对照组L-02相比，miR-4772-3p在肝癌细胞株HepG2、Huh7表达显著降低，且在Huh7细胞中的表达量最低。因此选择Huh7细胞进行后续实验。

实施例4 miR-4772-3p对肝癌细胞的影响

1、细胞转染

实验中所用的mimics NC(阴性对照)和miR-4772-3p mimics均由上海吉玛公司合成。

培养Huh7细胞，镜下观察细胞生长接近80-90％时，用胰蛋白酶进行消化传代。根据转染试剂Lipofectamine^TM 3000说明书转染Huh7细胞。具体步骤如下:

1)转染前24h，在装有培养基的6孔板中接种3.0×10⁵个细胞，转染时细胞融合度达到50％；

2)配制转染物:9u1 miR-4772-3p mimics及NC中加入125μl无血清无抗生素的RMPI1640培养基，每孔加入5μl的Lipofectamine^TM 3000试剂，充分吹打混匀，后静置5min；

3)用吸管吸去6孔板中的培养液，然后在每孔中加入提前配好的800μl含10％胎牛血清的培养液和转染物；

4)轻轻晃动培养板，使试剂充分混合，置于培养箱中继续培养，6h后，更换新鲜的培养液。

2、CCK8实验

1)实验分为3组，分别为阴性对照NC组、miR-4772-3p mimics组和空白对照组，每组均设5个复孔；

2)转染后的Huh7细胞培养72h，用0.25％胰酶消化进行细胞计数，将细胞接种于96孔板中，浓度为1×10⁴/ml，每孔加100μl；

3)避光条件下，96孔板中每孔加入10μl的CCK8试剂，晃动培养板3min,然后将培养板放入培养箱中继续培养，2h后取出，在酶标仪450nm波长处测定OD值。

3、Transwell迁移和侵袭实验

1)Transwell小室制备

无菌条件下Matrigel冰浴融化后按1:8比例稀释Matrigel胶，在Transwell上室内部缓慢加入上室底部，铺胶后迅速移入37℃的细胞培养箱中温育至其凝固成胶状；

2)实验分为3组，分别为阴性对照NC组、miR-4772-3p组及未转染RNA的空白组，每组均设3个复孔，上室加入数量为2×10⁴个细胞的悬液，下室加入600μl含10％胎牛血清培养基，37℃下恒温培养箱内培养48h；

3)染色

取出Transwell用PBS洗3遍，使用多聚甲醛固定30min后用PBS洗3遍，加入结晶紫染色30min用纯净水终止染色，放入荧光显微镜下观察并计数。

4、统计学分析

所有数据采用均数±标准差表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图，以P<0.05为检验水准，当P<0.05为差异有统计学意义。

5、结果

细胞转染结果如图4所示，转染miR-4772-3p mimics实验组的miR-4772-3p的表达水平显著上调，而阴性对照NC组和空白对照之间则无显著差异。

CCK8检测结果如图5所示，转染miR-4772-3p mimics的实验组同阴性对照NC组及空白对照组相比，细胞增殖受到明显的抑制(P<0.05)，提示miR-4772-3p对Huh7细胞增殖能力有明显的抑制作用。

Transwell小室检测结果如图6所示，实验组细胞的迁移和侵袭能力明显降低，提示miR-4772-3p对Huh7细胞的迁移和侵袭有明显的抑制作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 河北医科大学第三医院

<120> 肝细胞癌诊断和治疗的miRNA

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctgcaactt tgcctgatca ga 22

Claims

1.检测微小RNA的试剂在制备诊断产品中的应用，其特征在于，所述微小RNA为miR-4772-3p，所述产品用于诊断受试者是否患有肝细胞癌，通过测量来自所述受试者的测试样品中的miR-4772-3p的水平来诊断受试者是否患有肝细胞癌，其中与对照样品中miR-4772-3p的水平相比，测试样品中miR-4772-3p的水平下调，指示着受试者患有肝细胞癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miR-4772-3p的水平的试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性针对miR-4772-3p的探针或引物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒或微阵列。

5.促进miR-4772-3p表达的试剂在制备治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用。

6.促进miR-4772-3p表达的试剂在制备治疗肝细胞癌侵袭的药物组合物中的应用。

7.促进miR-4772-3p表达的试剂在制备治疗肝细胞癌转移的药物组合物中的应用。

8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂包括过表达miR-4772-3p的载体。