CN105177149B - miRNA在肝硬化诊断和治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种miRNA在肝硬化诊断和治疗中的应用,所述miRNA是miRNA‑548a‑3p。通过检测miRNA‑548a‑3p的表达水平可用于诊断病人是否患有肝硬化或处于肝硬化的风险中。经实验证明,miRNA‑548a‑3p在肝硬化患者中表达水平明显低于健康人。在此基础上,miRNA‑548a‑3p还可以用于制备治疗肝硬化的药物。本发明大大提高了肝硬化诊断的敏感性和特异性,同时为肝硬化的基因治疗提供了新的靶点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种miRNA在肝硬化诊断和治疗的应用,具体地涉及miRNA-548a-3p在肝硬化诊断和治疗的应用。
背景技术
肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病,由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。在我国大多数为肝炎后肝硬化,少部分为酒精性肝硬化和血吸虫性肝硬化。肝硬化是肝细胞发生坏死及炎症刺激时,肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程;过度纤维化使肝脏萎缩变硬,最终引起肝硬化失代偿或肝功能衰竭而导致患者死亡。早期由于肝脏代偿功能较强可无明显症状,后期则以肝功能损害和门脉高压为主要表现,并有多系统受累,晚期常出现上消化道出血、肝性脑病、继发感染、脾功能亢进、腹水、癌变等并发症。
microRNAs(miRNAs)是一类含量丰富的非蛋白编码小分子RNA,miRNAs主要是与靶mRNA的3’-UTR区域结合,能够抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解,调节多种生物功能。据估计,生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。
检测miRNA的表达水平可以为癌症的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常,诱发癌症的发生。已有报道证明miRNA可以通过调控靶基因mRNA的表达,在肝硬化中起重要作用。在未来临床治疗中,miRNA不仅可以成为新的肝硬化早期诊断和疾病进程相关的标记物,而且也有望通过改变miRNA的表达或者其靶基因的表达治疗肝硬化等疾病。寻找和鉴定与肝硬化发生相关的miRNA及其靶基因为miRNA的临床治疗提供基础。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的在于提供miRNA-548a-3p在肝硬化诊断和治疗中的应用。相比传统的肝硬化的诊断方法,使用miRNA来诊断肝硬化具有及时性、灵敏性、特异性,从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险,从而采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
本发明提供了miRNA-548a-3p在制备诊断患者是否患有肝硬化或处于肝硬化的风险中的产品中的应用,所述产品包括能够检测miRNA-548a-3p的表达水平的试剂。
进一步,所述核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示。
进一步,上面所述的产品包括芯片或试剂盒;其中,所述芯片包括固相载体;以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针;所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-548a-3p的部分或全部序列;所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断肝硬化的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断肝硬化的情况也包含在本发明的保护范围之内。
其中,所述试剂盒包括用于检测上面所述的miRNA-548a-3p的表达水平的试剂,所述试剂包括针对miRNA-548a-3p的引物和/或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断肝硬化miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断肝硬化的情况也包含在本发明的保护范围之内。
进一步,所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料,例如但不限于尼龙膜,经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法,例如,如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片,探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串,可将寡核苷酸探针配制成溶液,然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上,排列成预定的序列或阵列,然后通过放置过夜来固定,就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰,则其制备方法也可参照:王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》;J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science,1997;278:680和马立人,蒋中华主编.生物芯片.北京:化学工业出版社,2000,1-130。
本发明提供了一种诊断患者是否患有肝硬化或处于肝硬化的风险中的产品,所述产品能够通过检测miRNA-548a-3p的表达水平来诊断肝硬化。所述产品包括上面所述的芯片或试剂盒。其中,所述芯片包括固相载体;以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针;所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-548a-3p的部分或全部序列。所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断肝硬化的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断肝硬化的情况也包含在本发明的保护范围之内。所述试剂盒包括用于检测上面所述的miRNA-548a-3p的表达水平的试剂。
进一步,所述检测miRNA-548a-3p表达水平的试剂包括针对miRNA-548a-3p的引物和/或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断肝硬化miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断肝硬化的情况也包含在本发明的保护范围之内。
本发明提供了miRNA-548a-3p在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能获知待检测样本中miRNA-548a-3p的表达水平,将待测样本的结果同对照组样本相比,容易判断待测样本是否患有肝硬化以及患肝硬化的风险。因此,通过高通量测序获得miRNA-548a-3p表达水平与肝硬化相关性的应用同样包含在本发明的保护范围之内。
本发明提供了miRNA-548a-3p在制备治疗肝硬化药物中的应用。
进一步,所述药物包含促进miRNA-548a-3p表达或增强miRNA-548a-3p功能的试剂。
进一步,促进miRNA-548a-3p表达或增强miRNA-548a-3p功能的试剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。
进一步,所述的试剂包括:miRNA-548a-3p的模拟物、miRNA-548a-3p的前体、miRNA-548a-3p的激动剂、携带miRNA-548a-3p的载体。
根据miRNA-548a-3p序列设计出它的模拟物或激动剂,miRNA-548a-3p的模拟物是化学合成的小RNA,miRNA-548a-3p的激动剂是经过特殊标记和化学修饰的双链小RNA,将miRNA-548a-3p模拟物或者激动剂转移到人体内后,它们能够明显上调miRNA-548a-3p的表达。
本发明提供了一种治疗肝硬化的药物,所述药物包括上面所述的促进miRNA-548a-3p表达或增强miRNA-548a-3p功能的试剂。
进一步,所述的试剂包括:miRNA-548a-3p的模拟物、miRNA-548a-3p的前体、miRNA-548a-3p的激动剂、携带miRNA-548a-3p的载体。
本发明的治疗肝硬化的药物还包含药物学上可以接受的载体,所述载体包括但不限于:稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
所述药物可以单独施用或者与其他能够抑制肝硬化的药物进行组合施用。
所述药物可以离体施用:将miRNA-548a-3p的模拟物、miRNA-548a-3p的激动剂、miRNA-548a-3p的前体或者miRNA-548a-3p的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞(或异种细胞),经体外细胞扩增后,输回人体。
所述药物可以体内施用:将miRNA-548a-3p的模拟物、miRNA-548a-3p的激动剂、miRNA-548a-3p的前体或者miRNA-548a-3p的表达载体直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性,甚至是裸DNA或RNA。
所述的受试者可以是人类或者其他哺乳动物。更具体地,受试者是器官、组织、细胞。
本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
本发明提供了上面所述的试剂在制备治疗肝硬化药物中的应用。
应当知道,本发明的miRNA-548a-3p包括组成型核酸分子的功能等同物,即变体,其显示完整miRNA-548a-3p核酸分子相同的功能,它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
本领域人员熟知,为了保证miRNA的稳定性,可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基,如TT,也可对miRNA碱基进行修饰,但是不影响miRNA的功能。因此,本领域技术人员熟知,在不影响miRNA-548a-3p功能的条件下,对miRNA-548a-3p进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
本发明的miRNA-548a-3p可以是天然的或是人工合成的,或者使用可以表达miRNA-548a-3p的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
病毒载体可以是任何适当的载体,包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体,包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体,比如pBin438、pCAMBIA1301等。
可以表达miRNA-548a-3p的DNA片段可以通过如下方式获取:从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找miRNA-548a-3p在基因组上的位置及具体序列信息,根据基因组序列确定miRNA-548a-3p初始miRNA的位置,在miRNA-548a-3p初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物,扩增引物中间的序列即可获得表达miRNA-548a-3p的DNA片段。
本发明的优点和有益效果:
本发明首次发现了miRNA-548a-3p表达水平与肝硬化的发生发展相关,通过检测受试者miRNA-548a-3p的表达水平,可以判断受试者是否患有肝硬化或者判断受试者是否存在患有肝硬化的风险,从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
附图说明
图1显示利用QPCR检测miRNA-548a-3p在肝硬化患者活检组织中的表达情况;
图2显示miRNA-548a-3p模拟物对miRNA-548a-3p表达的促进作用。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明,本发明的实施例仅用于解释本发明,并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1与肝硬化相关的miRNA的筛选
1、样本获取:各收集10例健康人的活检组织和肝硬化患者的活检组织样本。上述所有样本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、样本总RNA的提取
使用QIAGEN公司的组织RNA提取试剂盒提前总RNA。具体步骤如下:
1)在较少RNase干扰的清洁区,使用含适量液氮的研钵称取活检组织样本约20mg,用杵棒研磨至粉末状;
2)将样本转移到一个不含RNA酶的2ml的离心管中;
3)加入300μl Lysis solution,置于匀浆器内,充分研磨1-5min;
4)12000g,4℃,离心10min,转移上清至新的1.5ml的离心管中;
5)加入600μl RNase-Free Water,用漩涡器混匀;
6)加入20μl蛋白酶K,在55℃水浴锅中温浴15min,不断涡旋混匀;
7)14000g,室温,离心1min,使细胞碎片沉淀于离心管底部,取上清转移到另外一个不含RNA酶1.5ml的离心管中;
8)加入450μl的95%乙醇,涡旋混匀;
9)取650μl含乙醇的裂解液加到离心柱中,14000g离心1min;弃下层,将柱子重新置于收集管中;
10)依照裂解液的容量,重复步骤9);
11)加入400μl Wash solution,14000g离心2min;弃下层,将柱置于一新的收集管中;
12)加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I,14000g离心1min,将收集管中的溶液重新移入柱中,室温放置15min;
13)加入400μl Wash solution,14000g离心1min,弃下层,将柱子重新置于收集管中;
14)加入400μl Wash solution,14000g离心2min,弃收集管,把柱子放入1.7mlElution管中;
15)加入30μl Elution Buffer,200g离心2min,使溶液充分与柱结合;
16)14000g离心1min,将RNA使用无RNA去离子水溶解,待用。
3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品,RNA-seq测序的样品要求:OD260/OD280为1.8-2.2。
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳,Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量,在凝胶成像仪上观测、拍照,保存图像,一般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。
4、miRNA的提取和标记
1)用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA,具体操作按照相应说明书。样品用T4RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。miRNA标记方法大致如下:1.4μg miRNA和500ng 5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶cy3-3’(Dharmacon,Chicago,USA)及2单位T4RNAligase(NEB,Ipswich,USA),于4℃孵育2小时。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。
2)标记的RNA用0.3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇进行沉淀,再用15μl含3×SSC、0.2%SDS和15%甲酰胺的杂交液重悬,所有的杂交重复两次,杂交用LifterSlipTM(Erie,PA USA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。
3)将杂交室放在杂交仪BioMixerTMII上(CapitalBio Corp,Beijing,China)于42℃水浴过夜,用洗液洗两遍。
5、miRNA芯片操作:
miRNA芯片,采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片(单通道芯片),按照说明书的指示进行miRNA表达谱的检测。
6、结果:
分析miRNA芯片表达谱的检测结果,可知miRNA-548a-3p在肝硬化患者活检组织中和健康人的活检组织中的表达存在显著差异,与健康人的活检组织相比,在肝硬化活检组织中miRNA-548a-3p的水平显著降低。
实施例2 QPCR验证差异表达的miRNA-548a-3p
1、根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-548a-3p进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择肝硬化患者活检组织本和健康人活检组织样本各80例。
2、RNA提取过程同实施例1。
3、逆转录:
1)按照表1配制反应体系
表1反应体系
RNA模板 | 1μg |
10×缓冲液 | 2μl |
dATP(10mM) | 2μl |
polyA多聚酶 | 0.5μl |
RNase抑制剂 | 0.5μl |
ddH<sub>2</sub>O | 补足到20μl |
37℃孵育1h。
2)反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物,70℃孵育5min。
3)立即冰上孵育2min,打断RNA和引物的二级结构。
4)将上述20μl反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM),0.5μl M-MLV逆转录酶,0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂,10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合,42℃孵育1h。
4、QPCR反应:
1)引物设计
扩增miRNA-548a-3p的引物
正向引物:CAAAACTGGCAATTACTTTTGC(SEQ ID NO.2)
反向引物:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.3)
扩增U6snRNA的引物
正向引物:CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID NO.4)
反向引物:AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO.5)
2)按照表2配制PCR反应体系:
其中,SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表2PCR反应体系
体积 | |
SYBR Green聚合酶链式反应体系 | 12.5μl |
正向引物 | 1μl |
反向引物 | 1μl |
cDNA模板 | 2μl |
ddH<sub>2</sub>O | 8.5μl |
总体积 | 25μl |
3)PCR反应条件:95℃10min,(95℃15s,56℃60s)×40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物,在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应,以U6snRNA作为参照基因,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。
5、结果
如图1所示,与健康人组织样本相比,肝硬化患者组织中miRNA-548a-3p的表达水平显著降低,与miRNA芯片结果一致。
实施例3研究miRNA-548a-3p对肝硬化细胞增殖能力的影响
1、设计合成针对miRNA-548a-3p的模拟物
根据miRNA-548a-3p的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成miRNA-548a-3p模拟物和随机对照序列。
2、细胞培养
将肝星状细胞LX-2用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3、细胞转染
将LX-2细胞分为两组,分别为对照组、miRNA-548a-3p模拟物组。将对照组及模拟物组分别转染随机对照序列和miRNA-548a-3p模拟物,运用转染试剂LipofectamineTM2000进行转染,转染方法参照说明书。对照组和miRNA-548a-3p模拟物组的工作浓度均为5μM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。
4、QPCR实验
1)细胞总RNA提取:利用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取,按照说明书指示进行。
2)QPCR:步骤同实施例2。
结果如图2所示,与对照组相比,miRNA-548a-3p模拟物组的miRNA-548a-3p的水平显著上升,表明miRNA-548a-3p模拟物能够有效促进miRNA-548a-3p的表达。
5、细胞增殖实验
将转染48h的LX-2细胞使用0.25%胰酶消化成细胞悬液,以5×104个/ml接种于96孔细胞培养板,每孔0.1ml,60min后,MTT法测各孔490nm波长光吸收值。用光吸收值大小代表活细胞的相对数量。
6、结果
miRNA-548a-3p模拟物组相对光密度值为0.237±0.011,对照组相对光密度值为1.328±0.043。与对照组相比,miRNA-548a-3p模拟物组光吸收值显著下降(P<0.05)。上述实验结果表明miRNA-548a-3p模拟物能够显著抑制LX-2细胞增殖,同时表明miRNA-548a-3p不利于LX-2细胞增殖。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (5)
1.miRNA-548a-3p在制备诊断患者是否患有肝硬化或处于肝硬化的风险中的产品中的应用,其特征在于,所述产品包括能够检测miRNA-548a-3p的表达水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品包括芯片或试剂盒;其中,所述芯片包括固相载体;以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-548a-3p的部分或全部序列;所述试剂盒包括用于检测miRNA-548a-3p表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的检测miRNA-548a-3p表达水平的试剂包括针对miRNA-548a-3p的引物和/或探针。
4.促进miRNA-548a-3p表达或增强miRNA-548a-3p功能的试剂在制备治疗肝硬化药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的试剂包括:miRNA-548a-3p的模拟物、miRNA-548a-3p的前体、miRNA-548a-3p的激动剂、携带miRNA-548a-3p的载体。
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MicroRNA Profiling of Laser-Microdissected Hepatocellular Carcinoma Reveals an Oncogenic Phenotype of the Tumor Capsule;Jan Peveling-Oberhag,et al;《Jan Peveling-Oberhag》;20141231;第7卷(第6期);672-680页 |
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肝细胞癌外周血淋巴细胞中参与关键HBV变异选择的关键分子预测及网络构建;邓阳等;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20150415(第4期);E072-166页 |
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