CN105169393B - miRNA-548a-3p抗急性髓系白血病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miRNA‑548a‑3p在抗急性髓系白血病中的应用。miRNA‑548a‑3p可用于诊断病人是否患有急性髓系白血病。经实验证明，miRNA‑548a‑3p可以有效地区分急性髓系白血病样本和健康人的样本。miRNA‑548a‑3p还可以用于制备治疗急性髓系白血病的药物。本发明大大提高了急性髓系白血病诊断的敏感性和特异性，同时为急性髓系白血病的基因治疗提供了新的靶点。

Description

miRNA-548a-3p抗急性髓系白血病中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地涉及miRNA-548a-3p在抗急性髓系白血病中的应用。

背景技术

miRNA是天然存在于体内的21-22nt的非编码RNA分子，是一类通过转录后基因沉默对靶基因表达进行调节的RNA。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA5’-UTR或者3’-UTR中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是一种异质性髓细胞肿瘤，也称急性非淋巴细胞性白血病，常进展迅速。其特点是造血干细胞健康分化受阻，恶性肿瘤细胞克隆性增生取代健康造血，从而造成贫血、出血、感染及脏器浸润等一系列症状。近年来，AML发病率呈逐渐上升的趋势，尽管现有治疗方法使患者完全缓解率可达50％～70％，但该病病死率仍较高，对不同患者实施个体化分层治疗成为首要问题。综合研究基因对AML发生发展的作用及其预后影响，有助于探寻有效的抗白血病血管生成治疗靶点，从而进一步指导临床个体化治疗。

检测miRNA的表达水平可以为癌症的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发癌症的发生。已有报道证明miRNA可以通过调控靶基因mRNA的表达，在急性髓系白血病中起重要作用。本发明首次发现miRNA-548a-3p的在急性髓系白血病患者中的表达量远远高于对照正常组，miRNA-548a-3p的表达异常和急性髓系白血病的发生发展相关，这为急性髓系白血病的miRNA的临床治疗提供了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种miRNA-548a-3p在抗急性髓系白血病中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了miRNA-548a-3p在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用，所述miRNA-548a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的实验证明miRNA-548a-3p的表达水平与急性髓系白血病相关，在此基础上，通过抑制miRNA-548a-3p的表达来达到治疗急性髓系白血病的目的。

进一步，所述药物包含miRNA-548a-3p抑制剂。所述miRNA-548a-3p抑制剂能够抑制miRNA-548a-3p的表达或者能够抑制miRNA-548a-3p的功能。

进一步，miRNA-548a-3p抑制剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。

优选地，所述miRNA-548a-3p抑制剂是miRNA-548a-3p的反义寡核苷酸或拮抗剂。

本发明提供了一种治疗急性髓系白血病的药物，所述药物包括上述的miRNA-548a-3p抑制剂。

根据miRNA-548a-3p序列设计出它的特异性反义寡核苷酸，将反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调miRNA-548a-3p的表达。“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。

在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleicacid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2’氧原子和4’碳原子连接起来的修饰技术。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。

本发明的治疗急性髓系白血病的药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

所述药物可以单独施用或者与其他能够抑制急性髓系白血病的药物进行组合施用。

所述药物可以离体施用：将miRNA-548a-3p的反义寡核苷酸或者拮抗剂、miRNA-548a-3p反义寡核苷酸的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞(或异种细胞)，经体外细胞扩增后，输回人体。

所述药物可以体内施用：将miRNA-548a-3p的反义寡核苷酸或者拮抗剂、miRNA-548a-3p反义寡核苷酸的表达载体直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA或RNA。

所述的受试者可以是人类或者其他哺乳动物。更具体地，受试者是器官、组织、细胞。

本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

本发明提供了miRNA-548a-3p在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能获知待检测样本中miRNA-548a-3p的表达水平，将待测样本的结果同健康人的样本相比，容易判断待测样本是否患有急性髓系白血病以及患急性髓系白血病的风险。因此，通过高通量测序获得miRNA-548a-3p表达水平与急性髓系白血病相关性的应用同样包含在本发明的保护范围之内。

本发明提供了miRNA-548a-3p在制备诊断急性髓系白血病产品中的应用。

进一步，所述产品包括芯片或试剂盒。

进一步，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-548a-3p的部分或全部序列。所述试剂盒包括用于检测miRNA-548a-3p的表达水平的试剂。

进一步，所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断急性髓系白血病的miRNA的寡核苷酸探针，将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合判断急性髓系白血病的情况也包含在本发明的保护范围之内。

进一步，所述的试剂盒中的试剂包括针对miRNA-548a-3p的引物和/或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断急性髓系白血病的miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合判断急性髓系白血病的情况也包含在本发明的保护范围之内。

进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。

本发明的miRNA-548a-3p可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miRNA-548a-3p的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。

病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。

真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。

应当知道，本发明的miRNA-548a-3p包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体。

本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miRNA-548a-3p功能的条件下，对miRNA-548a-3p进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

本发明提供了一种诊断急性髓系白血病的产品，所述的产品包括上面所述的芯片或试剂盒。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了miRNA-548a-3p表达与急性髓系白血病相关，通过检测受试者血液中miRNA-548a-3p的表达水平，可以判断受试者是否患有急性髓系白血病或者判断受试者是否存在患有急性髓系白血病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

附图说明

图1显示利用QPCR检测miRNA-548a-3p在急性髓系白血病患者血液中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测miRNA-548a-3p在急性髓系白血病细胞系中的表达情况；

图3显示anti-miRNA-548a-3p对miRNA-548a-3p表达的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1与急性髓系白血病相关的miRNA的筛选

1、样本获取：各收集10例健康人血液样本和急性髓系白血病患者血液样本。上述所有样本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、样本总RNA的提取

使用U-gene公司的Blood RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：

1)每体积新鲜血液(最大1ml)加入5倍体积的1×XR-I缓冲液，例如：每1ml血液中加入5ml的XR-I缓冲液，漩涡振荡混匀；

2)冰浴15分钟，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，溶液变清表明红血细胞已裂解。如果个别样品的血细胞计容或ECR升高时，延长冰浴时间至20min；

3)4℃下450g离心10min沉淀白细胞，完全弃去含有裂解红细胞的上清液；

4)用2倍体积的XR-I缓冲液洗涤在步骤1中用到的每体积的全血，漩涡振荡以完全悬浮细胞；

5)4℃下450g离心10min，并再次去掉上清；

6)往成团的白细胞中加入XR-II溶解缓冲液/2－巯基乙醇，漩涡振荡充分混匀。500μl以下的全血就加入400μl XR-II溶解缓冲液，如果在步骤1中用到的是0.5～1.0ml的血液，则加650μl XR-II溶解缓冲液。在加入XR-II溶解缓冲液之后，样品应保存于－70℃的条件下；

7)加入等体积的70％乙醇，漩涡振荡混匀；

8)把所有的样品(包括所有的沉淀)加到一个固定在一个2ml收集试管上的Mu-PuRNA分离柱上。10,000g离心的15秒，弃去流出液体；

9)重复步骤7、8；

10)用移液枪吸750ul RNA洗涤缓冲液I直接加到自旋柱上洗涤柱子。如上方法离心并弃去2ml收集管；

11)把柱子装到提供的一干净的新2ml收集试管上，加入500μl用乙醇稀释的RNA洗涤缓冲液II，离心，弃去流出液，重复使用该收集试管；

12)加入400μl Wash solution，14000g离心2min；

13)再用500μl的RNA洗涤缓冲液II洗涤柱子，离心并弃去流出液。然后用一个空的收集试管，极速离心空柱子1min以甩干Mu-Pu柱基质；

14)洗脱RNA。把柱子转移到一干凈的1.5ml离心管(试剂盒无提供)并用50～100μl的DEPC-水(由试剂盒提供)洗脱RNA。确保加入的DEPC-水是直接加在柱基质上，极速离心1min；

15)加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I，14000g离心1min；

16)将收集管中的溶液重新移入柱，室温放置15min；

17)将收集到的RNA保存在-70^℃冰箱中，待用。

3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。

4、miRNA的提取和标记

1)用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照相应说明书。样品用T4RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。miRNA标记方法大致如下：1.4μg miRNA和500ng 5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶cy3-3’(Dharmacon，Chicago，USA)及2单位T4RNAligase(NEB，Ipswich，USA)，于4℃孵育2小时。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。

2)标记的RNA用0.3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇进行沉淀，再用15μl含3×SSC、0.2％SDS和15％甲酰胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次，杂交用LifterSlipTM(Erie，PA USA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。

3)将杂交室放在杂交仪BioMixerTMII上(CapitalBio Corp，Beijing，China)于42℃水浴过夜，用洗液洗两遍。

5、miRNA芯片操作：

miRNA芯片，采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片(单通道芯片)，按照说明书的指示进行miRNA表达谱的检测。

6、结果：

分析miRNA芯片表达谱的检测结果，可知miRNA-548a-3p在急性髓系白血病患者血液和健康人的血液中的表达存在显著差异，与健康人的血液相比，在急性髓系白血病血液中miRNA-548a-3p的水平显著升高。

实施例2QPCR验证差异表达的miRNA-548a-3p

1、根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-548a-3p进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择急性髓系白血病患者血液和健康人血液各80例。

2、RNA提取过程同实施例1。

3、逆转录：

1)将2μg的总RNA模板与1μl 2μM miRNA逆转录引物、1μl 2μM U6snRNA逆转录引物、1μl dNTP(10mM)混合物和无RNase的去离子水混合，终体积为20μl。混匀后，于65℃孵育5min。

2)立即在冰上冷却。再依次加入以下成分：4μl 5×缓冲液、2μl DTT(0.1M)、1μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，将溶液混匀，37℃温育5min。

3)加入1μl M-MLV逆转录酶，混匀后37℃反应1h。

4)置于70℃，15min，终止反应，-20℃冻存备用。miRNA逆转录引物序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，U6snRNA逆转录引物序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

4、QPCR反应：

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM)1μl，反向引物(5μM)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃20s，56℃55s)×50个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增miRNA-548a-3p的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物为如SEQ ID NO.5所示。以U6snRNA作为参照基因，其上游引物序列为SEQ ID NO.6所示；下游引物序列为SEQ ID NO.7所示。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

如图1所示，与健康人的血液相比，急性髓系白血病患者血液中miRNA-548a-3p的表达水平显著升高，与miRNA芯片结果一致。

实施例3miRNA-548a-3p在急性髓系白血病细胞系中的表达

1、细胞培养

将急性髓系白血病细胞株U937，KG-1，THP和从AML患者与健康人中分离的骨髓单个核细胞的用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养，置于37℃、5％CO₂培养箱中。

2、QPCR

2.1细胞总RNA提取：利用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，按照说明书指示进行。

2.2QPCR：步骤同实施例2。

3、结果

如图2所示，与健康人骨髓单个核细胞相比，急性髓系白血病细胞株U937，KG-1，THP及AML患者的骨髓单个核细胞中miRNA-548a-3p的表达明显升高(P<0.05)。

实施例4研究miRNA-548a-3p对急性髓系白血病细胞增殖能力的影响

1、设计合成针对miRNA-548a-3p的反义寡核苷酸(anti-miRNA-548a-3p)

根据miRNA-548a-3p的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成anti-miRNA-548a-3p和随机对照序列。

2、细胞培养：U937细胞培养方法同实施例3。

3、细胞转染

将U937细胞分为两组，分别为抑制阴性对照组(anti-NC)、miRNA-548a-3p抑制组(anti-miRNA-548a-3p)。将阴性对照组及抑制组分别转染anti-NC和anti-miRNA-548a-3p，运用转染试剂LipofectamineTM 2000进行转染，转染方法参照说明书。anti-NC和anti-miRNA-548a-3p的工作浓度均为5μM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。

4、QPCR实验

细胞总RNA提取和PCR步骤同实施例3。

结果如图3所示，与抑制阴性对照组(anti-NC)相比，miRNA-548a-3p抑制组(anti-miRNA-548a-3p)的miRNA-548a-3p的水平显著下降，表明anti-miRNA-548a-3p能够有效抑制miRNA-548a-3p的表达。

5、细胞增殖实验

将转染48h的U937细胞使用0.25％胰酶消化成细胞悬液，以5×10⁴个/ml接种于96孔细胞培养板，每孔0.1ml，60min后，MTT法测各孔490nm波长光吸收值。用光吸收值大小代表活细胞的相对数量。

6、结果

miRNA-548a-3p抑制组(anti-miRNA-548a-3p)相对光密度值为0.214±0.041，抑制阴性对照组(anti-NC)相对光密度值为1.504±0.126。与抑制阴性对照组(anti-NC)相比，miRNA-548a-3p抑制组(anti-miRNA-548a-3p)光吸收值显著下降(P<0.05)。上述实验结果表明anti-miRNA-548a-3p能够显著抑制U937细胞增殖能力，同时表明miRNA-548a-3p有利于U937细胞增殖。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.miRNA-548a-3p抑制剂在制备抗急性髓系白血病药物中的应用，其特征在于，所述miRNA-548a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的miRNA-548a-3p抑制剂能够抑制miRNA-548a-3p的表达或者能够抑制miRNA-548a-3p的功能。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miRNA-548a-3p抑制剂是miRNA-548a-3p的反义寡核苷酸或拮抗剂。

4.检测miRNA-548a-3p表达水平的试剂在制备诊断急性髓系白血病产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的产品包括芯片或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-548a-3p的部分或全部序列；所述试剂盒包括用于检测miRNA-548a-3p的表达水平的试剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中的试剂包括针对miRNA-548a-3p的引物和/或探针。