CN109161543B - 用于富集低频dna突变的dna探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种用于富集低频DNA突变的DNA探针。该DNA探针与包含所述低频DNA突变的序列互补且具有LNA修饰。根据本发明实施例的探针与包含低频DNA突变的序列互补，且该探针具有LNA修饰，发明人发现，当该探针与包含低频DNA突变的序列互补配对时，如果低频DNA突变真实存在，其与DNA探针发生碱基完全互补，则其Tm值会比野生型DNA与DNA探针发生碱基错配的Tm值高，且比不含有LNA修饰的正常碱基发生错配时，Tm值升高更多，进而可以在一个合适的温度下，DNA探针与包含低频突变的DNA结合更多而较少与野生型DNA结合，使得低频DNA突变可以特异性得被富集出来。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用，更具体地，本发明涉及用于富集低频DNA突变的DNA探针、探针在制备试剂盒中的用途、试剂盒、富集低频DNA突变的方法以及检测低频DNA突变的方法。
背景技术
肺癌有很高的发病率和死亡率，它的发病率在美国是第二位，在中国是第一位，死亡率在美国和中国都是第一位。除了吸烟者，很多从未吸烟的人因为遗传和环境的因素也患有肺癌。肺癌患者中有85-90％的病例是非小细胞肺癌。近年来经大量研究，科学家对于这一类肺癌患者所携带的基因突变情况也有了更为清楚的认识。
人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)稳定表达于多种上皮组织以及间质和神经元组织中，对细胞的生长、分化的调节有重要作用。当表皮生长因子(EGF)与EGFR结合时，可以使EGFR的胞内区活化，并且激活多种媒介物质，启动繁杂的信号通路。因此，EGFR成为肿瘤尤其是非小细胞肺癌靶向治疗研究的一个重要靶点。目前，临床上针对肺癌EGFR的靶向治疗，主要包括小分子酪氨酸激酶抑制剂，如贝达药业的埃克替尼(凯美纳)，阿斯利康公司的吉非替尼(易瑞沙)等。
研究表明，肺癌患者的EGFR基因编码区，主要是在外显子18-21上会发生突变，而这些突变与埃克替尼和吉非替尼等药物的临床疗效有关，即小分子酪氨酸激酶抑制剂能够竞争性抑制ATP与EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的结合，进而影响酪氨酸残基的磷酸化，抑制EGFR下游信号转导。目前，虽然已经在EGFR基因外显子18-21上发现了不下30种突变，但85％-90％的突变都是外显子19上的缺失突变和外显子21上L858R的点突变；另外，外显子18上G719A/S/C的点突变大约占突变的5％，外显子21上L861Q的点突变大约占突变的1％。携带有上述EGFR基因突变位点的肺癌患者能够从靶向药物治疗中获益。但是，靶向药物非常昂贵，如果病人不携带有EGFR突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成严重的经济负担。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有EGFR基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。
近年来肿瘤患者血液中游离ctDNA(Cell-free Circulating Tumor DNA)的基因检测诊断已成为研究热点，医生和科学家们已经发现，由肿瘤细胞释放到血液中的ctDNA，在分子和病理水平上，能够比较准确地反映肿瘤本身的基因情况及其变化状态。检测血液中循环游离DNA中的肿瘤标志物具有区别于传统组织肿瘤标志物的检测方式，具有无创、动态监控和克服肿瘤组织异质性等优势，并且对循环游离DNA的取样检测避免了当前分子诊断需要采集癌组织作为标本来源的困难，是一种很有潜力的检测手段。相比液体活检领域的其他靶标，比如游离癌细胞、游离RNA、蛋白质和外泌体，ctDNA有着明显的优势，因为它获取更方便，结果更稳定，在临床上的使用也更为广泛。
为实现对血浆ctDNA低频突变的精确高效检测以及应用潜能的充分发掘，富集扩增技术与高灵敏的检测技术的有力结合是必须的，然而目前相关技术如Super-ARMS，数字PCR等只能一定程度实现低频变异的检测，其相关实际应用或多或少仍存在一定局限性。Super-ARMS是ARMS技术的升级产物，其检测灵敏度可以达到0.2％，而数字PCR的检测灵敏度能达到0.01％-0.1％。但它们有一个共同的缺点：一次只能检测一个突变位点，对于样本量的要求很高，限制了其对于多个位点同时检测的应用。
因此，对于低频突变的检测技术仍需要进一步开发和改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的发明人基于一种特殊设计的DNA探针，对微量血液游离DNA突变进行特异性的捕获富集，能够检测到血液中变异频率极低的肿瘤DNA变异。应用该方法通过检测患者外周血浆，在基因突变频率较低的情况下，实现了无创检测患者血浆中的基因变异分子标记物，从而可进一步应用到患者的靶向用药指导，以及靶向治疗期间的基因突变情况动态监控等。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于富集低频DNA突变的DNA探针。根据本发明的实施例，所述DNA探针与包含所述低频DNA突变的序列互补且具有LNA修饰。根据本发明实施例的探针与包含低频DNA突变的序列互补，且该探针具有LNA修饰，发明人发现，当该探针与包含低频DNA突变的序列互补配对时，如果低频DNA突变真实存在，则包含低频DNA突变的序列与DNA探针发生完全互补，其Tm值会比野生型DNA与该DNA探针发生碱基错配的Tm值高，且比不含有LNA修饰的正常碱基发生错配时，Tm值升高更多，进而可以在一个合适的温度下，DNA探针与包含低频突变的DNA序列结合更多而较少与野生型DNA结合，低频DNA突变可以被更显著地特异性地被富集出来。
根据本发明的实施例，上述DNA探针还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述DNA探针以所述低频DNA突变位点互补核苷酸为中心，向左右扩展至多10个核苷酸，优选地，至多9个核苷酸，优选地，至多8个核苷酸，优选地，至多7个核苷酸，优选地，至多6个核苷酸，优选地，至多5个核苷酸，优选地，至多4个核苷酸，优选地，至多3个核苷酸，更优选地，至多两个核苷酸，更优选地，至多一个核苷酸获得。进而根据本发明实施例的DNA探针与包含所述低频DNA突变的序列互补配对的特异性进一步增强。
根据本发明的实施例，所述DNA探针以所述低频DNA突变位点互补核苷酸为中心，向左右等距离或非等距离扩展，所述低频DNA突变位点互补核苷酸不位于所述DNA探针的两端。进而根据本发明实施例的DNA探针与包含所述低频DNA突变的序列互补配对的特异性显著增强。
根据本发明的实施例，所述LNA修饰发生在突变位点互补核苷酸或与突变位点互补核苷酸临近的1、2、3、4或5位的核苷酸上。进而当低频DNA突变真实存在时，则在低频突变位点处发生碱基完全互补的Tm值较野生型DNA与DNA探针发生碱基错配的Tm值升高更加明显，进一步有利于对低频DNA突变的富集。
根据本发明的实施例，所述互补为完全互补。进而DNA探针与包含所述低频DNA突变的序列的特异性互补性更强，对低频DNA突变的富集更加显著。
根据本发明的实施例，所述探针具有如下序列的至少之一：1)SEQ ID NO:1～3所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:1～3所示的核苷酸序列具有LNA修饰；以及2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。
GGCGGGCC(SEQ ID NO:1)。
AGCTGCATGATG(SEQ ID NO:2)。
ATGTTTTGAT(SEQ ID NO:3)。
根据本发明实施例的上述探针能够特异性结合含有EGFR敏感突变L858R、19DEL或T790M的序列，进而能够实现对EGFR敏感突变L858R、19DEL或T790M的特异性富集。
根据本发明的实施例，所述探针进一步结合有生物素。结合有生物素的探针可后续与链霉亲和素磁珠结合，进而进行磁珠纯化，进一步提高对低频DNA突变的富集。
在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的探针在制备试剂盒中的用途，所述低频DNA突变为癌症相关突变，所述试剂盒用于诊断癌症。根据本发明实施例的探针可特异性结合含有癌症相关低频DNA突变的序列，可高效实现癌症相关低频DNA突变的富集，进而利用根据本发明实施例的探针所制备的试剂盒可检测癌症相关低频DNA突变是否在样品中真实存在，来判定样品是否来源于癌症患者，进而对癌症患者的精准治疗提供指导。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述癌症包括选自肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌的至少之一。
根据本发明的实施例，所述癌症为肺癌。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所述的DNA探针。如前所述，根据本发明实施例的DNA探针与含有低频DNA突变的序列互补，可实现对低频DNA突变的高效富集。进而利用根据本发明实施例的试剂盒可实现对低频DNA突变的特异性富集。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种富集低频DNA突变的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)对DNA片段进行第一PCR扩增处理，以便获得第一PCR扩增产物；2)对第一PCR扩增产物进行变性处理，以便获得变性产物；3)将所述变性产物与前面所述的DNA探针进行杂交处理；4)将杂交处理产物进行第二PCR扩增处理，以便获得第二PCR扩增产物，所述第二PCR扩增产物构成低频DNA突变集。根据本发明实施例的富集低频DNA突变的方法，可实现对低频DNA的高效富集。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，在步骤3)之后、步骤4)之前，进一步包括：将所述杂交处理产物进行纯化处理。进而可进一步提高杂交处理产物的纯度，提高低频DNA的富集效率。
根据本发明的实施例，所述纯化处理通过链霉素亲和性磁珠纯化进行的。链霉素亲和性磁珠可特异性结合结合有生物素的上述DNA探针，而上述DNA探针又在杂交过程中与含有DNA低频突变的序列特异性结合，进而通过磁珠纯化，可进一步提高对DNA低频突变的富集效率。
根据本发明的实施例，所述DNA片段来源于血液游离ctDNA。进而可实现血液游离ctDNA中低频DNA突变的高效富集。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种检测低频DNA突变的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)根据前面所述的方法，富集预定低频DNA突变，以便获得预定低频DNA突变集；2)对所述预定低频DNA突变集进行测序，以便获得测序结果，所述测序结果由多个测序读段构成；以及3)将所述测序读段与参考序列进行比对，以便确定预定低频DNA突变位点是否存在突变。根据本发明实施例的方法，可高灵敏性和特异性地实现对低频DNA突变的检测，可以检测出突变频率低至0.1％的低频变异。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，将所述测序读段与参考序列进行比对后，进一步包括确定预定低频DNA突变位点的碱基峰，所述预定低频DNA突变位点的突变碱基峰相应野生型DNA碱基峰的位置是存在预定低频DNA突变位点的指示。
根据本发明的具体实施例，所述预定低频DNA突变位点的突变碱基峰出现在野生型DNA碱基峰的位置，是预定低频DNA突变位点为点突变的指示；所述预定低频DNA突变位点的突变碱基峰出现在野生型DNA碱基峰的周边位置，是预定低频DNA突变位点为插入或缺失突变的指示。
根据本发明的具体实施例，当所述DNA探针是针对EGFR敏感突变L858R、19DEL或T790M进行设计的，则利用根据本发明实施例的方法可实现对肺腺癌患者EGFR基因的突变检测。
根据本发明实施例的上述检测低频DNA突变的方法具有如下特点：
1.微创性：受检者只需要提供微量的外周血样本，如10mL；
2.实时性：可对受检者进行多次实时采血检测，实现肿瘤的动态监控；
3.高灵敏度：不受限于病灶位置及大小，可以检测出突变频率低至0.1％的低频变异；
4.高特异性：在ctDNA含量较少的情况下，能够保证较低的假阳性率、假阴性率，确保得到的检测结果能够准确的反应受检者实时外周血状况。
附图说明
图1是根据本发明实施例的采用PEAC技术对Horizon标准品HD780中的4个样本进行实验的结果图，其中，3个肺腺癌临床样本在经过本发明的技术富集后都能观察到EGFR基因21外显子L858R突变；
图2是根据本发明实施例的采用PEAC技术对Horizon标准品HD780中的4个样本进行实验的结果图，其中，2个肺腺癌临床样本在经过本发明的技术富集后都能观察到EGFR基因20外显子T790M突变；以及
图3是根据本发明实施例的采用PEAC技术对Horizon标准品HD780中的4个样本进行实验结果图，其中，两个肺腺癌临床样本在经过PEAC技术富集后都能观察到EGFR基因19DEL突变。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
本例中以EGFR基因热点突变外显子21上的L858R突变为例来分析本发明的特殊DNA探针捕获富集EGFR突变的方法。实验用的样本为Horizon公司的Multiplex I cfDNAReference Standard Set(HD780)，分别为EGFR基因野生型、带5％EGFR L858R突变、带1％EGFR L858R突变、带0.1％EGFR L858R突变；3例肺腺癌临床样本。
利用上述方法检测EGFR基因热点突变外显子21上的L858R突变的方法包括以下步骤：
(一)外周血样本分离
1.采集受检者外周血1管(10mL/管)于Streck管中，轻柔上下颠倒(防止细胞破裂)6-8次充分混匀，在采血后7天内进行以下处理；
2.在4℃条件下1600g离心10分钟，离心后将上清(血浆)分装到多个1.5mL/2mL离心管中，在吸取过程中不能吸到中间层白细胞；
3.在4℃条件下16000g离心10分钟，去除残余细胞，将上清(血浆)转移到新的1.5mL/2mL离心管中，不能吸到管底白细胞，即得到分离后所需血浆；
4.血浆样本处理完后，分离得到的血浆及剩余血细胞均保存到-80℃冰箱中，避免反复冻融。
(二)血浆游离DNA提取(采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit)
1.加30μL蛋白酶K至1.5mL离心管中；
2.加入300μL血浆；
3.加入240μL Buffer ACL和1.68μL Carrier RNA(0.2μg/μL)，涡旋振荡30s，60℃温浴30min，温浴期间适当取出振荡；
4.加入540μL Buffer ACB，涡旋振荡15-30s，冰上或-20℃冰箱放置5min；
5.取700μL血浆混合物加入过滤柱中，7500rpm离心30s；
6.过滤柱空甩8000rpm，1min；
7.加入600μL Buffer ACW1，8000rpm，1min离心洗涤；
8.加入700μL Buffer ACW2，8000rpm，1min离心洗涤；
9.加入700μL无水乙醇，8000rpm，1min离心洗涤；
10.过滤柱空甩14.000rpm，3min；
11.把过滤柱放入新收集管中，打开盖子，56℃金属浴10min；
12.将柱子放入新离心管汇总，加入60μL Buffer AVE回溶3min；
13.000rpm离心1min，Qubit(Invitrogen，the Quant-iTTM dsDNA HS Assay Kit)定量质控所提取的cfDNA。
(三)突变富集
1.第一轮PCR扩增
2.变性缓冲液的配制
| 1M NaOH | 125μL |
| 80mM EDTA | 100μL |
| 0.5g/l酚红 | 400μL |
| 水 | 375μL |
| 总体积 | 1000μL |
3.PCR产物变性
4杂交缓冲液的配置
5.探针杂交
a)准备链霉素亲和性磁珠
每个样本需要20μL磁珠，在离心管中进行磁珠清洗：
1)加入200μL SureSelect Binding Buffer；
2)吹吸混匀至磁珠全部悬浮；
3)离心管放入磁力架；
4)溶液澄清后，去除上清；
5)重复步骤1-4，共2次；
6)加入30μL SureSelect Binding Buffer悬浮磁珠。
b)链霉素亲和性磁珠与DNA探针结合
c)洗涤未捕获的DNA片段
1)在磁力的作用下，20℃静置2min；
2)待溶液澄清，吸掉上清液；
3)加入100μl水洗缓冲液，吹吸混匀；
4)溶液澄清后，去除上清；
5)重复步骤1-4，1次；
6)加入20μL超纯水重悬磁珠。
d)第二轮PCR
(四)测序
本实施例中，采用ABI 3730进行Sanger测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行测序操作。
(五)突变分析
1)Sanger测序得到测序碱基峰图；
2)与reference序列进行比对；
3)寻找突变位点的突变碱基峰；
4)判断其是否有突变存在。
前述的Horizon标准品：EGFR基因野生型、带5％EGFR L858R突变、带1％EGFRL858R突变、带0.1％EGFR L858R突变经本发明的体系检测，EGFR基因野生型无突变碱基峰，其它3个样品都能观察到明显的突变碱基峰，而采用直接PCR产物进行测序则4个样本都看不到突变碱基峰，如图1所示，证明了本发明的高特异性和高灵敏度。
3例肺腺癌临床样本都检测出EGFR基因外显子21上的L858R突变。
重复性试验：采用了多个批次的Horizon标准品HD780进行实验，结果显示EGFR基因野生型都未发现突变碱基峰，其它3个样品都能观察到明显的突变碱基峰。
实施例2
本例中以EGFR基因热点突变外显子20上的T790M突变为例来分析本发明的特殊DNA探针捕获富集EGFR突变的方法。实验用的样本为Horizon公司的Multiplex I cfDNAReference Standard Set(HD780)，分别为EGFR基因野生型、带5％EGFR T790M突变、带1％EGFR T790M突变、带0.1％EGFR T790M突变；两例肺腺癌临床样本。
利用上述方法检测EGFR基因热点突变外显子20上的T790M突变的方法包括以下步骤：
(一)外周血样本分离
1、采集受检者外周血1管(10mL/管)于Streck管中，轻柔上下颠倒(防止细胞破裂)6-8次充分混匀，在采血后7天内进行以下处理；
2、在4℃条件下1600g离心10分钟，离心后将上清(血浆)分装到多个1.5mL/2mL离心管中，在吸取过程中不能吸到中间层白细胞；
3、在4℃条件下16000g离心10分钟，去除残余细胞，将上清(血浆)转移到新的1.5mL/2mL离心管中，不能吸到管底白细胞，即得到分离后所需血浆；
4、血浆样本处理完后，分离得到的血浆及剩余血细胞均保存到-80℃冰箱中，避免反复冻融。
(二)血浆游离DNA提取(采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit)
1、加30μL蛋白酶K至1.5mL离心管中；
2、加入300μL血浆；
3、加入240μL Buffer ACL和1.68μL Carrier RNA(0.2μg/μL)，涡旋振荡30s，60℃温浴30min，温浴期间适当取出振荡；
4、加入540μL Buffer ACB，涡旋振荡15-30s，冰上或-20℃冰箱放置5min；
5、取700μL血浆混合物加入过滤柱中，7500rpm离心30s；
6、过滤柱空甩8000rpm，1min；
7、加入600μL Buffer ACW1，8000rpm，1min离心洗涤；
8、加入700μL Buffer ACW2，8000rpm，1min离心洗涤；
9、加入700μL无水乙醇，8000rpm，1min离心洗涤；
10、过滤柱空甩14.000rpm，3min；
11、把过滤柱放入新收集管中，打开盖子，56℃金属浴10min；
12、将柱子放入新离心管汇总，加入60μL Buffer AVE回溶3min；
13、14.000rpm离心1min，Qubit(Invitrogen，the Quant-iTTM dsDNA HS AssayKit)定量质控所提取的cfDNA。
(三)突变富集
1、第一轮PCR扩增
2.变性缓冲液的配制
| 1M NaOH | 125μL |
| 80mM EDTA | 100μL |
| 0.5g/l酚红 | 400μL |
| 水 | 375μL |
| 总体积 | 1000μL |
3.PCR产物变性
4.杂交缓冲液的配置
5.探针杂交
a)准备链霉素亲和性磁珠
每个样本需要20μL磁珠，在离心管中进行磁珠清洗：
1)加入200μL SureSelect Binding Buffer；
2)吹吸混匀至磁珠全部悬浮；
3)离心管放入磁力架；
4)溶液澄清后，去除上清；
5)重复步骤1-4，共2次；
6)加入30μL SureSelect Binding Buffer悬浮磁珠。
b)链霉素亲和性磁珠与DNA探针结合
c)洗涤未捕获的DNA片段
1)在磁力的作用下，20℃静置2min；
2)待溶液澄清，吸掉上清液；
3)加入100μl Washing buffer，吹吸混匀；
4)溶液澄清后，去除上清；
5)重复步骤1-4，1次；
6)加入20μL超纯水重悬磁珠。
d)第二轮PCR
(四)测序
本实施例中，采用ABI 3730进行Sanger测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行测序操作。
(五)突变分析
1)Sanger测序得到测序碱基峰图；
2)与reference序列进行比对；
3)寻找突变位点的突变碱基峰；
4)判断其是否有突变存在。
前述的Horizon标准品：EGFR基因野生型、带5％EGFR T790M突变、带1％EGFRT790M突变、带0.1％EGFR T790M突变经本发明的体系检测，EGFR基因野生型无突变碱基峰，其它3个样品都能观察到明显的突变碱基峰，而采用直接PCR产物进行测序则4个样本都看不到突变碱基峰，如图2所示，证明了本发明的高特异性和高灵敏度。
两例肺腺癌临床样本都检测出EGFR基因外显子20上的T790M突变。
重复性试验：采用了多个批次的Horizon标准品HD780进行实验，结果显示EGFR基因野生型都未发现突变碱基峰，其它3个样品都能观察到明显的突变碱基峰。
实施例3
本例中以EGFR基因热点突变外显子19上的缺失突变为例来分析本发明的特殊DNA探针捕获富集EGFR突变的方法。实验用的样本为Horizon公司的Multiplex I cfDNAReference Standard Set(HD780)，分别为EGFR基因野生型、带5％EGFR 19DEL突变、带1％EGFR 19DEL突变、带0.1％EGFR 19DEL突变；两例肺腺癌临床样本。
利用上述方法检测EGFR基因热点突变外显子20上的缺失突变的方法包括以下步骤：
(一)外周血样本分离
1、采集受检者外周血1管(10mL/管)于Streck管中，轻柔上下颠倒(防止细胞破裂)6-8次充分混匀，在采血后7天内进行以下处理；
2、在4℃条件下1600g离心10分钟，离心后将上清(血浆)分装到多个1.5mL/2mL离心管中，在吸取过程中不能吸到中间层白细胞；
3、在4℃条件下16000g离心10分钟，去除残余细胞，将上清(血浆)转移到新的1.5mL/2mL离心管中，不能吸到管底白细胞，即得到分离后所需血浆；
4、血浆样本处理完后，分离得到的血浆及剩余血细胞均保存到-80℃冰箱中，避免反复冻融。
(二)血浆游离DNA提取(采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit)
1、加30μL蛋白酶K至1.5mL离心管中；
2、加入300μL血浆；
3、加入240μL Buffer ACL和1.68μL Carrier RNA(0.2μg/μL)，涡旋振荡30s，60℃温浴30min，温浴期间适当取出振荡；
4、加入540μL Buffer ACB，涡旋振荡15-30s，冰上或-20℃冰箱放置5min；
5、取700μL血浆混合物加入过滤柱中，7500rpm离心30s；
6、过滤柱空甩8000rpm，1min；
7、加入600μL Buffer ACW1，8000rpm，1min离心洗涤；
8、加入700μL Buffer ACW2，8000rpm，1min离心洗涤；
9、加入700μL无水乙醇，8000rpm，1min离心洗涤；
10、过滤柱空甩14.000rpm，3min；
11、把过滤柱放入新收集管中，打开盖子，56℃金属浴10min；
12、将柱子放入新离心管汇总，加入60μL Buffer AVE回溶3min；
13、14000rpm离心1min，Qubit(Invitrogen，the Quant-iTTM dsDNA HS AssayKit)定量质控所提取的cfDNA。
(三)突变富集
1、第一轮PCR扩增
2、变性缓冲液的配制
3、PCR产物变性
4、杂交缓冲液的配置
5、探针杂交
6、准备链霉素亲和性磁珠
每个样本需要20μL磁珠，在离心管中进行磁珠清洗：
1)加入200μL SureSelect Binding Buffer；
2)吹吸混匀至磁珠全部悬浮；
3)离心管放入磁力架；
4)溶液澄清后，去除上清；
5)重复步骤1-4，共2次；
6)加入30μL SureSelect Binding Buffer悬浮磁珠。
7、链霉素亲和性磁珠与DNA探针结合
8、洗涤未捕获的DNA片段
1)在磁力的作用下，20℃静置2min；
2)待溶液澄清，吸掉上清液；
3)加入100μl Washing buffer，吹吸混匀；
4)溶液澄清后，去除上清；
5)重复步骤1-4，1次；
6)加入20μL超纯水重悬磁珠。
9、第二轮PCR
(四)测序
本实施例中，采用ABI 3730进行Sanger测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行测序操作。
(五)突变分析
1)Sanger测序得到测序碱基峰图；
2)与reference序列进行比对；
3)寻找突变位点的突变碱基峰；
4)判断其是否有突变存在。
前述的Horizon标准品：EGFR基因野生型、带5％EGFR 19DEL突变、带1％EGFR19DEL突变、带0.1％EGFR 19DEL突变经本发明的体系检测，EGFR基因野生型无突变碱基峰，其它3个样品都能观察到明显的突变碱基峰，而采用直接PCR产物进行测序则4个样本都看不到突变碱基峰，如图3所示，证明了本发明的高特异性和高灵敏度。
两例肺腺癌临床样本都检测出EGFR基因的19DEL突变。
重复性试验：采用了多个批次的Horizon标准品HD780进行实验，结果显示EGFR基因野生型都未发现突变碱基峰，其它3个样品都能观察到明显的突变碱基峰。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州瑞普基因科技有限公司
<120> 用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用
<130> PIDC3181664
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针的核苷酸序列，具有LNA修饰
<400> 1
ggcgggcc 8
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针的核苷酸序列，具有LNA修饰
<400> 2
agctgcatga tg 12
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针的核苷酸序列，具有LNA修饰
<400> 3
atgttttgat 10
Claims (13)
1.一种用于富集低频DNA突变的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针与包含所述低频DNA突变的序列互补且具有LNA修饰；
所述探针具有如下序列的至少之一：
SEQ ID NO:1～3所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:1～3所示的核苷酸序列具有LNA修饰。
2.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述LNA修饰发生在突变位点互补核苷酸或与突变位点互补核苷酸临近的1、2、3、4或5位的核苷酸上。
3.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述互补为完全互补。
4.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述探针进一步结合有生物素。
5.权利要求1～4任一项所述的探针在制备试剂盒中的用途，所述低频DNA突变为癌症相关突变，所述试剂盒用于诊断癌症，所述癌症为肺癌。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的DNA探针。
7.一种富集低频DNA突变的方法，其特征在于，包括：
1)对DNA片段进行第一PCR扩增处理，以便获得第一PCR扩增产物；
2)对第一PCR扩增产物进行变性处理，以便获得变性产物；
3)将所述变性产物与权利要求1～4任一项所述的DNA探针进行杂交处理；
4)将杂交处理产物进行第二PCR扩增处理，以便获得第二PCR扩增产物，所述第二PCR扩增产物构成低频DNA突变集。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤3)之后、步骤4)之前，进一步包括：将所述杂交处理产物进行纯化处理。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化处理通过链霉素亲和性磁珠纯化进行的。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DNA片段来源于血液游离ctDNA。
11.一种检测低频DNA突变的方法，所述方法不用于诊断或治疗目的，其特征在于，包括：
1)根据权利要求7～10任一项所述的方法，富集预定低频DNA突变，以便获得预定低频DNA突变集；
2)对所述预定低频DNA突变集进行测序，以便获得测序结果，所述测序结果由至少一个测序读段构成；以及
3)将所述测序读段与参考序列进行比对，以便确定预定低频DNA突变位点是否存在突变。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，将所述测序读段与参考序列进行比对后，进一步包括确定预定低频DNA突变位点的碱基峰，所述预定低频DNA突变位点的突变碱基峰出现在相应野生型DNA碱基峰的位置是存在预定低频DNA突变位点的指示。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述预定低频DNA突变位点的突变碱基峰出现在野生型DNA碱基峰的位置，是预定低频DNA突变位点为点突变的指示；
所述预定低频DNA突变位点的突变碱基峰出现在野生型DNA碱基峰的周边位置，是预定低频DNA突变位点为插入或缺失突变的指示。
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Denomination of invention: DNA probe for enriching low frequency DNA mutation and its application Effective date of registration: 20211206 Granted publication date: 20210723 Pledgee: Hangzhou High-tech Financing Guarantee Co.,Ltd. Pledgor: HANGZHOU REPUGENE TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021980014102 |
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