CN109762901B - 用于富集低频dna突变的dna探针应用于多种突变的同时检测 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用。该探针具有如下序列的至少之一:1)SEQ ID NO:1~6所示的核苷酸序列;以及2)与1)相比具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核苷酸序列。该探针可以同时检测对待测核酸样品中变异频率极低的突变,即EGFR基因19外显子上的多种缺失突变,进行特异性的富集,进而实现上述低频突变的特异性检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,本发明涉及用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用,更具体地,本发明涉及用于富集低频DNA突变的DNA探针、探针在制备试剂盒中的用途、试剂盒、富集低频DNA突变的方法以及检测低频DNA突变的方法。
背景技术
肺癌有很高的发病率和死亡率,它的发病率在美国是第二位,在中国是第一位,死亡率在美国和中国都是第一位。除了吸烟者,很多从未吸烟的人因为遗传和环境的因素也患有肺癌。肺癌患者中有85-90%的病例是非小细胞肺癌。近年来经大量研究,科学家对于这一类肺癌患者所携带的基因突变情况也有了更为清楚的认识。
人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)稳定表达于多种上皮组织以及间质和神经元组织中,对细胞的生长、分化的调节有重要作用。当表皮生长因子(EGF)与EGFR结合时,可以使EGFR的胞内区活化,并且激活多种媒介物质,启动繁杂的信号通路。因此,EGFR成为肿瘤尤其是非小细胞肺癌靶向治疗研究的一个重要靶点。目前,临床上针对肺癌EGFR的靶向治疗,主要包括小分子酪氨酸激酶抑制剂,如贝达药业的埃克替尼(凯美纳),阿斯利康公司的吉非替尼(易瑞沙)等。
研究表明,肺癌患者的EGFR基因编码区,主要是在外显子18-21上会发生突变,而这些突变与埃克替尼和吉非替尼等药物的临床疗效有关,即小分子酪氨酸激酶抑制剂能够竞争性抑制ATP与EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的结合,进而影响酪氨酸残基的磷酸化,抑制EGFR下游信号转导。目前,虽然已经在EGFR基因外显子18-21上发现不下30种突变,但85%-90%的突变都是外显子19上的缺失突变和外显子21上L858R的点突变。与 EGFR 21号外显子上的L858R点突变不同,19号外显子上的缺失突变存在近30种类型,有研究表明,尽管19号外显子的缺失突变类型不同,但大部分都能够响应靶向药物。因此,对多种EGFR 19外显子的突变进行检测对于肺癌患者来说至关重要。
因此,对于EGFR 19外显子的突变的检测技术仍需要进一步开发和改进。
发明内容
本发明目的是至少在一定程度上解决相关的技术问题之一。为此,本申请的发明人设计了一组DNA探针,对微量血液或其他体液游离DNA突变进行特异性的捕获富集,能够检测到血液或其他体液中变异频率极低的肿瘤DNA变异。利用该探针检测肺癌患者EGFR 基因19外显子上的多种缺失突变类型,并且实现多种突变类型的同时检测。同时,发明人还提出了一种无创、高灵敏度、高特异性的同时检测肺癌患者EGFR 19外显子多种突变类型的检测方法,通过使用特殊设计的DNA探针,对肺癌患者外周血或其他体液游离DNA (cfDNA/ctDNA)中的EGFR 19外显子突变进行特异性的富集,能够应用在肺癌患者靶向用药指导,靶向治疗期间的动态监控等。
在本发明的第一方面,本发明提出了一种用于富集低频DNA突变的DNA探针。根据本发明的实施例,所述探针具有如下序列的至少之一:1)SEQ ID NO:1~6所示的核苷酸序列;以及2)与1)相比具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%同一性的核苷酸序列。
atgttttgat(SEQ ID NO:1)。
gatgtcttga(SEQ ID NO:2)。
ctttcgattcc(SEQ ID NO:3)。
gttggttcct(SEQ ID NO:4)。
cggagattcc(SEQ ID NO:5)。
cggaaccttg(SEQ ID NO:6)。
根据本发明的实施例,上述探针可以同时检测对待测核酸样品中变异频率极低的突变 -EGFR基因19外显子上的多种缺失突变进行特异性的富集,进而实现上述低频突变的特异性检测。同时,上述探针在同时进行特异性富集时不会形成二聚体,进而检测灵敏度高。
根据本发明的实施例,上述探针还可以包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述探针具有LNA修饰。LNA可以与互补单链核苷酸杂交,亲和性比相应的寡核苷酸高得多,形成的杂交物的解链温度都很高。根据本发明实施例的探针具有更好的热稳定性和生物学活性。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第九位核苷酸以及第十核苷酸上。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸以及第七位核苷酸上。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针的第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针的第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上。
根据本发明的实施例,所述探针5’端具有生物素标记。结合有生物素的探针可后续与链霉亲和素磁珠结合,进而进行磁珠纯化,进一步提高对低频DNA突变的富集的特异性。
根据本发明的实施例,所述探针3’端具有磷酸修饰。探针的3’端进行磷酸修饰能阻止该探针在PCR过程中进行错误的延伸根据本发明的实施例,所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生突变的样本。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2235-2249del15突变的样本。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列,所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2236-2250del15突变的样本。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2240-2257del18突变的样本。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列,所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2239-2248>C突变的样本。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列,所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2240-2254del15突变的样本。
根据本发明的实施例,所述探针具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列,所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2237-2255>T突变的样本。
在本发明的第二方面,本发明提出了前面所述的富集低频DNA突变的DNA探针在制备试剂盒中的用途,所述低频DNA突变为癌症相关突变,所述试剂盒用于诊断肺癌或指导用药。如前所述,上述探针可以同时检测待测核酸样本中低频DNA突变-EGFR基因19外显子上的多种缺失突变。进而利用上述探针制备获得的试剂盒能通过检测患者外周血或胸水、脑脊液,在基因突变频率较低的情况下,无创、高灵敏性、高特异性地检测患者血液或其他体液中的基因突变的DNA,进而判定肺癌患者是否有EGFR基因19外显子上的缺失突变,进而对肺癌患者的精准治疗提供指导以及能为肺癌患者在靶向治疗期间提供动态监控等。
根据本发明的实施例,上述用途还可以包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述癌症相关突变为EGFR基因19外显子的突变。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例,所述方法包括:所述试剂盒包括前面所述的DNA探针。如前所述,上述探针可以同时检测待测核酸样本中低频DNA突变。进而包含上述探针的试剂盒能通过检测患者外周血或胸水、脑脊液,在基因突变频率较低的情况下,无创、高灵敏性、高特异性地检测患者血液或其他体液中的基因突变的DNA,进而判定肺癌患者是否有EGFR基因19外显子上的缺失突变,进而对肺癌患者的精准治疗提供指导以及能为肺癌患者在靶向治疗期间提供动态监控等。
在本发明的第四方面,本发明提出了富集低频DNA突变的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:1)对DNA片段进行第一PCR扩增处理,以便获得第一PCR扩增产物;2) 对第一PCR扩增产物进行变性处理,以便获得变性产物;3)将所述变性产物与前面所述的DNA探针进行杂交处理;4)将杂交处理产物进行第二PCR扩增处理,以便获得第二 PCR扩增产物,所述第二PCR扩增产物构成低频DNA突变集。根据本发明实施例的富集低频DNA突变的方法,可实现对低频DNA-EGFR基因19外显子上的多种缺失突变的特异性富集,进而用于对上述低频突变位点的科学研究,如相关功能或作用机制研究或用于对上述低频突变位点的特异性检测,实现对上述低频突变位点相关疾病的检测。
根据本发明的实施例,上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,在步骤3)之后、步骤4)之前,进一步包括:将所述杂交处理产物进行纯化处理。进而可进一步提高杂交处理产物的纯度,提高低频DNA的富集效率。
根据本发明的实施例,所述杂交处理是在温度为15℃的条件下进行30min。由此,附件效果更佳。
根据本发明的实施例,所述纯化处理通过链霉素亲和性磁珠纯化进行的。链霉素亲和性磁珠可特异性地结合具有生物素标记的上述DNA探针,而上述DNA探针又在杂交过程中与含有DNA低频突变的序列特异性结合,进而通过磁珠纯化,可进一步提高对DNA低频突变的特异性富集。
根据本发明的实施例,所述DNA片段来源于血液或其他体液游离ctDNA或cfDNA。根据本发明实施例的方法,可实现血液或其他体液游离ctDNA或cfDNA中低频DNA突变的高效富集。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种检测低频DNA突变的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:1)根据前面所述的方法,富集预定低频DNA突变,以便获得预定低频DNA突变集;2)对所述预定低频DNA突变集进行测序,以便获得测序结果,所述测序结果由至少一个测序读段构成;以及3)将所述测序读段与参考序列进行比对,以便确定预定低频DNA突变位点是否存在突变。根据本发明实施例的方法,可高灵敏性和特异性地实现对待测核酸样品中低频DNA突变-EGFR基因19外显子上的多种缺失突变的检测,可以检测出突变频率低至0.1%的低频变异。
根据本发明的实施例,上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,将所述测序读段与参考序列进行比对后,进一步包括确定预定低频DNA突变位点的碱基峰,所述预定低频DNA突变位点的突变碱基峰出现在相应野生型DNA碱基峰的位置是存在预定低频DNA突变位点的指示。
根据本发明的具体实施例,所述预定低频DNA突变位点的突变碱基峰出现在野生型 DNA碱基峰的位置,是预定低频DNA突变位点为点突变的指示。
附图说明
图1是根据本发明实施例的对于c.2240-2257del18突变来说,对其设计的3组探针分别为c.2240-2257del18、c.2240-2257del18-2和c.2240-2257del18-3,分别测试其在含1% c.2240-2257del18突变的标准品上,在杂交温度15℃,洗脱温度15℃条件下,对于c.2240-2257del18突变的富集能力的结果图;
图2是根据本发明实施例的对于c.2239-2248>C突变、c.2240-2254del15突变和c.2237-2255>T突变,采用上述相同的方法进行测试的结果图;
图3是根据本发明实施例的以单一探针和6种探针一起富集EGFR c.2236-2250del15突变测试的结果图;
图4是根据本发明实施例的0.1%EGFR 19外显子c.2235_2249del15,p.E746_A750基因突变经本发明的体系检测,能观察到明显的突变碱基峰,证明其能检测低至0.1%的突变频率的结果图;
图5是根据本发明实施例的0.1%EGFR 19外显子c.2236_2250del15,p.E746_A750del 基因突变经本发明的体系检测,能观察到明显的突变碱基峰,证明其能检测低至0.1%的突变频率的结果图;
图6是根据本发明实施例的0.1%EGFR 19外显子c.2237_2255delinsT, p.E746_A752delinsV基因突变经本发明的体系检测,能观察到明显的突变碱基峰,证明其能检测低至0.1%的突变频率的结果图;
图7是根据本发明实施例的0.1%EGFR 19外显子c.2239_2248delinsC, p.L747_A750delinsP基因突变经本发明的体系检测,能观察到明显的突变碱基峰,证明其能检测低至0.1%的突变频率的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
LNA是一种特殊的双环状核苷酸衍生物,结构中含有一个或多个2′-O,4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体,核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形,这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N 构型,降低了核糖结构的柔韧性,增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。
LNA修饰是指LNA直接修饰在核苷酸的五碳糖上。
本发明适用于所有可以提供外周血或其他体液样本的肺癌患者人群,所涉及的内容主要包括3大部分:用于肺癌患者靶向用药相关基因EGFR敏感突变位点富集的DNA探针设计、样本突变富集及测序、变异数据解读。以下详细介绍这三个方面。
(一)用于肺癌患者靶向用药相关基因EGFR敏感突变位点富集的DNA探针设计
基于相关文献参考,根据LNA修饰碱基发生错配时,其Tm值会下降(GT错配除外),且比正常碱基发生错配时Tm值降低更多的原则,设计了与EGFR基因突变型序列完全配对的LNA修饰的DNA探针,对肺癌靶向用药相关基因EGFR 19外显子突变进行特异性的捕获。DNA探针设计如下:
表1.DNA探针列表
名称 | 序列 |
c.2235-2249del15 | Biot-a+tg+t+t+t+tg+at-PHOS |
c.2236-2250del15 | Biot-g+at+g+t+c+tt+ga-PHOS |
c.2240-2257del18 | Biot-c+t+ttcgat+t+cc-PHOS |
c.2239-2248>C | Biot-g+tt+g+g+t+tcct-PHOS |
c.2240-2254del15 | Biot-cgg+a+g+a+tt+cc-PHOS |
c.2237-2255>T | Biot-cgg+a+a+c+ct+tg-PHOS |
备注+:代表LNA修饰,Biot:代表生物素,PHOS:代表磷酸。
(二)样本突变富集及测序
1.对cfDNA/ctDNA片段进行第一轮PCR扩增;
2.取部分扩增产物进行变性;
3.在变性产物中加入特殊设计的DNA探针进行杂交;
4.在杂交体系中加入链霉素亲和性磁珠,结合DNA探针上的生物素;
5.用洗涤缓冲液清洗上述混合物两遍;
6.清洗后的产物进行第二轮PCR;
7.用ABI 3730进行Sanger测序;
(三)变异数据解读
1.Sanger测序得到测序碱基峰图;
2.与参考序列进行比对;
3.寻找突变位点的突变碱基峰;
4.判断其是否有突变存在。
以下介绍本发明的具体实施例。
实施例1
采用多种DNA探针在一个反应中同时检测多种突变的难度在于每种DNA探针不但都需要达到检测样品中低至0.1%丰度的突变,而且检测的实验条件也要一致,更不能互相影响。在本发明中,每个位点设计探针如下:
名称 | 序列 |
c.2235-2249del15 | Biot-a+tg+t+t+t+tg+at-PHOS |
c.2236-2250del15 | Biot-g+at+g+t+c+tt+ga-PHOS |
c.2240-2257del18 | Biot-c+t+ttcgat+t+cc-PHOS |
c.2240-2257del18-2 | Biot-t+tt+c+g+a+tt+cc-PHOS |
c.2240-2257del18-3 | Biot-ctttc+g+attcc-PHOS |
c.2239-2248>C | Biot-g+tt+g+g+t+tcct-PHOS |
c.2239-2248>C-2 | Biot-gttg+g+t+tcct-PHOS |
c.2240-2254del15 | Biot-cgg+a+g+a+tt+cc-PHOS |
c.2240-2254del15-2 | Biot-c+g+gagat+t+cc-PHOS |
c.2237-2255>T | Biot-cgg+a+a+c+ct+tg-PHOS |
c.2237-2255>T-2 | Biot-cgg+a+a+ccttg-PHOS |
备注:+:代表LNA修饰,代表LNA直接修饰在该核苷酸序列的“+”后的核苷酸的五碳糖上,Biot:代表生物素,PHOS:代表磷酸。
在研究过程中,考虑到c.2235-2249del15突变与c.2236-2250del15突变在所有EGFR 19外显子缺失的类型中所占比例最大,故以这两种突变类型为基准进行后续的研究。当前针对c.2235-2249del15和c.2236-2250del15突变设计的探针,其最佳实验条件皆为杂交温度15℃,洗脱温度15℃,故需要将针对其它突变位点的探针的最佳实验条件也调整至该条件。
对于c.2240-2257del18突变来说,对其设计的3组探针分别为c.2240-2257del18、c.2240-2257del18-2和c.2240-2257del18-3,分别测试其在含1%c.2240-2257del18突变的标准品上,在杂交温度15℃,洗脱温度15℃条件下,对于c.2240-2257del18突变的富集能力。如图1所示,相比之下,c.2240-2257del18探针对于EGFR c.2240-2257del18 突变的富集能力较另外两个探针好,故选择c.2240-2257del18探针。
对于c.2239-2248>C突变、c.2240-2254del15突变和c.2237-2255>T突变,采用上述相同的方法进行测试,选择结果更好的一个探针。根据如图2所示的结果,针对 c.2239-2248>C突变、c.2240-2254del15突变和c.2237-2255>T突变,分别选择 c.2239-2248>C探针、c.2240-2254del15探针和c.2237-2255>T探针。
由上可知,这些富集效果差的探针,虽然在设计时遵循了满足探针一起检测的设计原则,但在实际富集和检测中,检测效果并不理想,本申请的探针组的获得需要申请人的创造性的实验劳动。
同时,在探针设计时充分考虑了各个探针之间可能存在的互相影响的问题,尽量避开互相匹配的区域,故该设计中6个探针在一起进行突变富集时没有形成二聚体的问题,故本发明的单一探针进行富集和6种探针一起富集,在富集效果上没有太大的区别。发明人以单一探针和6种探针一起富集EGFR c.2236-2250del15突变为例进行了验证,结果如图3所示。
实施例2
本例中以EGFR 19外显子的c.2235_2249del15,p.E746_A750突变类型为例来分析本发明的特殊DNA探针捕获富集EGFR突变的方法。实验用的样本为实验室配置的含0.1%EGFR 19外显子c.2235_2249del15突变的标准品。
利用上述方法检测EGFR 19外显子的c.2235_2249del15,p.E746_A750突变的方法包括以下步骤:
1、第一轮PCR扩增
2、变性缓冲液的配制
1M NaOH | 125μL |
80mM EDTA | 100μL |
0.5g/l酚红 | 400μL |
水 | 375μL |
总体积 | 1000μL |
3、PCR产物变性
4、杂交缓冲液的配置
5、探针杂交
6、准备链霉素亲和性磁珠
每个样本需要20μL磁珠,在离心管中进行磁珠清洗:
1)加入200μL SureSelect Binding缓冲液;
2)吹吸混匀至磁珠全部悬浮;
3)离心管放入磁力架;
4)溶液澄清后,去除上清;
5)重复步骤1-4,共2次;
6)加入30μL SureSelect Binding缓冲液悬浮磁珠。
7、链霉素亲和性磁珠与DNA探针结合
8、洗涤未捕获的DNA片段
1)在磁力的作用下,20℃静置2min;
2)待溶液澄清,吸掉上清液;
3)加入100μl水洗缓冲液,吹吸混匀;
4)溶液澄清后,去除上清;
5)重复步骤1-4,1次;
6)加入20μL超纯水重悬磁珠。
9、第二轮PCR
10、测序
本实施例中,采用ABI 3730进行Sanger测序,测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行测序操作。
11、突变分析
1)Sanger测序得到测序碱基峰图;
2)与参考序列进行比对;
3)寻找突变位点的突变碱基峰;
4)判断其是否有突变存在。
在前述的自制标准品中,0.1%EGFR 19外显子c.2235_2249del15,p.E746_A750基因突变经本发明的体系检测,能观察到明显的突变碱基峰,证明其能检测低至0.1%的突变频率,结果见图4。
实施例3
本例中以EGFR 19外显子的c.2236_2250del15,p.E746_A750del突变类型为例来分析本发明的特殊DNA探针捕获富集EGFR突变的方法。实验用的样本为实验室配置的含0.1% EGFR 19外显子c.2236_2250del15突变的标准品。
利用上述方法检测EGFR 19外显子的c.2236_2250del15,p.E746_A750del突变的方法包括以下步骤:
1、第一轮PCR扩增
2、变性缓冲液的配制
1M NaOH | 125μL |
80mM EDTA | 100μL |
0.5g/l酚红 | 400μL |
水 | 375μL |
总体积 | 1000μL |
3、PCR产物变性
4、杂交缓冲液的配置
5、探针杂交
6、准备链霉素亲和性磁珠
每个样本需要20μL磁珠,在离心管中进行磁珠清洗:
1)加入200μL SureSelect Binding Buffer;
2)吹吸混匀至磁珠全部悬浮;
3)离心管放入磁力架;
4)溶液澄清后,去除上清;
5)重复步骤1-4,共2次;
6)加入30μL SureSelect Binding Buffer悬浮磁珠。
7、链霉素亲和性磁珠与DNA探针结合
8、洗涤未捕获的DNA片段
1)在磁力的作用下,20℃静置2min;
2)待溶液澄清,吸掉上清液;
3)加入100μL水洗缓冲液,吹吸混匀;
4)溶液澄清后,去除上清;
5)重复步骤1-4,1次;
6)加入20μL超纯水重悬磁珠。
9、第二轮PCR
10、测序
本实施例中,采用ABI 3730进行Sanger测序,测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行测序操作。
11、突变分析
1)Sanger测序得到测序碱基峰图;
2)与参考序列进行比对;
3)寻找突变位点的突变碱基峰;
4)判断其是否有突变存在。
在前述的自制标准品中,0.1%EGFR 19外显子c.2236_2250del15,p.E746_A750del基因突变经本发明的体系检测,能观察到明显的突变碱基峰,证明其能检测低至0.1%的突变频率,结果见图5。
实施例4
本例中以EGFR 19外显子的c.2237_2255delinsT,p.E746_A752delinsV突变类型为例来分析本发明的特殊DNA探针捕获富集EGFR突变的方法。实验用的样本为实验室配置的含0.1%EGFR 19外显子c.2237_2255delinsT突变的标准品。
利用上述方法检测EGFR 19外显子的c.2237_2255delinsT,p.E746_A752delinsV突变的方法包括以下步骤:
1、第一轮PCR扩增
2、变性缓冲液的配制
1M NaOH | 125μL |
80mM EDTA | 100μL |
0.5g/l酚红 | 400μL |
水 | 375μL |
总体积 | 1000μL |
3、PCR产物变性
4、杂交缓冲液的配置
5、探针杂交
6、准备链霉素亲和性磁珠
每个样本需要20μL磁珠,在离心管中进行磁珠清洗:
1)加入200μL SureSelect Binding Buffer;
2)吹吸混匀至磁珠全部悬浮;
3)离心管放入磁力架;
4)溶液澄清后,去除上清;
5)重复步骤1-4,共2次;
6)加入30μL SureSelect Binding Buffer悬浮磁珠。
7、链霉素亲和性磁珠与DNA探针结合
8、洗涤未捕获的DNA片段
1)在磁力的作用下,20℃静置2min;
2)待溶液澄清,吸掉上清液;
3)加入100μl Washing buffer,吹吸混匀;
4)溶液澄清后,去除上清;
5)重复步骤1-4,1次;
6)加入20μL超纯水重悬磁珠。
9、第二轮PCR
10、测序
本实施例中,采用ABI 3730进行Sanger测序,测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行测序操作。
11、突变分析
1.Sanger测序得到测序碱基峰图;
2.与参考序列进行比对;
3.寻找突变位点的突变碱基峰;
4.判断其是否有突变存在。
在前述的自制标准品中,0.1%EGFR 19外显子c.2237_2255delinsT, p.E746_A752delinsV基因突变经本发明的体系检测,能观察到明显的突变碱基峰,证明其能检测低至0.1%的突变频率,结果见图6。
实施例5
本例中以EGFR 19外显子的c.2239_2248delinsC,p.L747_A750delinsP突变类型为例来分析本发明的特殊DNA探针捕获富集EGFR突变的方法。实验用的样本为实验室配置的含0.1%EGFR 19外显子c.2239_2248delinsC突变的标准品。
利用上述方法检测EGFR 19外显子的c.2239_2248delinsC,p.L747_A750delinsP突变的方法包括以下步骤:
1、第一轮PCR扩增
2、变性缓冲液的配制
1M NaOH | 125μL |
80mM EDTA | 100μL |
0.5g/l酚红 | 400μL |
水 | 375μL |
总体积 | 1000μL |
3、PCR产物变性
4、杂交缓冲液的配置
5、探针杂交
6、准备链霉素亲和性磁珠
每个样本需要20μL磁珠,在离心管中进行磁珠清洗:
1)加入200μL SureSelect Binding Buffer;
2)吹吸混匀至磁珠全部悬浮;
3)离心管放入磁力架;
4)溶液澄清后,去除上清;
5)重复步骤1-4,共2次;
6)加入30μL SureSelect Binding Buffer悬浮磁珠。
7、链霉素亲和性磁珠与DNA探针结合
8、洗涤未捕获的DNA片段
1)在磁力的作用下,20℃静置2min;
2)待溶液澄清,吸掉上清液;
3)加入100μl Washing buffer,吹吸混匀;
4)溶液澄清后,去除上清;
5)重复步骤1-4,1次;
6)加入20μL超纯水重悬磁珠。
9、第二轮PCR
10、测序
本实施例中,采用ABI 3730进行Sanger测序,测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行测序操作。
11、突变分析
1)Sanger测序得到测序碱基峰图;
2)与参考序列进行比对;
3)寻找突变位点的突变碱基峰;
4)判断其是否有突变存在。
在前述的自制标准品中,0.1%EGFR 19外显子c.2239_2248delinsC,p.L747_A750delinsP 基因突变经本发明的体系检测,能观察到明显的突变碱基峰,证明其能检测低至0.1%的突变频率,结果见图7。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州瑞普基因科技有限公司
<120> 用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用
<130> PIDC3185740
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 富集EGFR基因19号外显子发生C.2235-2249del15突变的样本的探针的核苷酸
序列
<400> 1
atgttttgat 10
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 富集EGFR基因19号外显子发生C.2236-2250del15突变的样本的探针的核苷酸
序列
<400> 2
gatgtcttga 10
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 富集EGFR基因19号外显子发生C.2240-2257del18突变的样本的探针的核苷酸
序列
<400> 3
ctttcgattc c 11
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 富集EGFR基因19号外显子发生C.2239-2248>C突变的样本的探针的核苷酸序
列
<400> 4
gttggttcct 10
<210> 5
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 富集EGFR基因19号外显子发生C.2240-2254del15突变的样本的探针的核苷酸
序列
<400> 5
cggagattcc 10
<210> 6
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 富集EGFR基因19号外显子发生C.2237-2255>T突变的样本的探针的核苷酸序
列
<400> 6
cggaaccttg 10
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 19Del-FOR
<400> 7
gaaagttaaa attcccgtcg ctatc 25
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 19Del-NEST-R
<400> 8
gggcctgagg ttcagag 17
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 19Del-REV
<400> 9
ttcagagcca tggaccc 17
Claims (8)
1.一种用于富集低频DNA突变的DNA探针组合,其特征在于,所述DNA探针组合由核苷酸序列如SEQ ID NO:1~6所示的DNA探针组成;
其中,所述探针具有LNA修饰;
所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA探针,用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2235-2249del15突变的样本,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上;
所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA探针,用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2236-2250del15突变的样本,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上;
所述核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA探针,用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2240-2257del18突变的样本,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第九位核苷酸以及第十位核苷酸上;
所述核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的DNA探针,用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2239-2248>C突变的样本,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸以及第七位核苷酸上;
所述核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的DNA探针,用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2240-2254del15突变的样本,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针的第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上;
所述核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的DNA探针,用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2237-2255>T突变的样本,从探针的5’端到3’端的方向,所述LNA修饰位于所述探针的第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上;
所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1-6所示的DNA探针组合的杂交条件为15℃孵育30min;
所述DNA探针3’端具有磷酸修饰;
所述DNA探针5’端具有生物素标记。
2.权利要求1所述的富集低频DNA突变的DNA探针组合在制备试剂盒中的用途,所述低频DNA突变为癌症相关突变,所述试剂盒用于诊断肺癌或指导肺癌用药。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述癌症相关突变为EGFR基因19外显子的突变。
4.一种试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的DNA探针组合。
5.一种富集低频DNA突变的方法,其特征在于,包括:
1)对DNA片段进行第一PCR扩增处理,以便获得第一PCR扩增产物;
2)对第一PCR扩增产物进行变性处理,以便获得变性产物;
3)将所述变性产物与权利要求1所述的DNA探针组合进行杂交处理,将所述杂交处理产物进行纯化处理,所述纯化处理通过链霉素亲和性磁珠纯化进行的;
4)将杂交处理产物进行第二PCR扩增处理,以便获得第二PCR扩增产物,所述第二PCR扩增产物构成低频DNA突变集。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述DNA片段来源于血液或其他体液的游离ctDNA或cfDNA。
7.一种非疾病诊断目的的检测低频DNA突变的方法,其特征在于,包括:
1)根据权利要求5~6任一项所述的方法,富集预定低频DNA突变,以便获得预定低频DNA突变集;
2)对所述预定低频DNA突变集进行测序,以便获得测序结果,所述测序结果由至少一个测序读段构成;以及
3)将所述测序读段与参考序列进行比对,以便确定预定低频DNA突变位点是否存在突变。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,将所述测序读段与参考序列进行比对后,进一步包括确定预定低频DNA突变位点的碱基峰,所述预定低频DNA突变位点的突变碱基峰出现在相应野生型DNA碱基峰的位置是存在预定低频DNA突变位点的指示。
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CN103773889B (zh) * | 2014-02-20 | 2015-07-15 | 武汉大学 | 一种临床检测egfr基因突变的hrm方法及试剂盒 |
US10329605B2 (en) * | 2015-04-20 | 2019-06-25 | Neogenomics Laboratories, Inc. | Method to increase sensitivity of detection of low-occurrence mutations |
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CN107012221A (zh) * | 2016-10-14 | 2017-08-04 | 苏州艾达康医疗科技有限公司 | 基于阻断物的富集系统及其应用 |
CN109161543B (zh) * | 2018-07-27 | 2021-07-23 | 杭州瑞普基因科技有限公司 | 用于富集低频dna突变的dna探针及其应用 |
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Denomination of invention: Application of DNA probes for enriching low-frequency DNA mutations for simultaneous detection of multiple mutations Granted publication date: 20221129 Pledgee: Guotou Taikang Trust Co.,Ltd. Pledgor: HANGZHOU REPUGENE TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980004912 |
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