CN106350586A - 确定噬血细胞综合征的基因突变位点的方法 - Google Patents

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赵志丹
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Abstract

本发明公开了一种确定噬血细胞综合征的基因位点突变的方法，包括(1)获取外周血，所述外周血来自于临床诊断为噬血细胞综合征的个体；(2)从所述外周血中提取基因组DNA；(3)使用特异性扩增引物对通过PCR扩增所述基因组DNA，从而获得PCR扩增产物；(4)对所述PCR扩增产物进行第一测序，以便获得第一测序结果；(5)将所述第一测序结果进行过滤，以便获得经过过滤的第一测序结果；(6)将所述经过过滤的第一测序结果与参考序列进行比对，以及基于比对结果确定与噬血细胞综合征相关的基因突变位点；(7)将所述含有突变位点的基因进行第二测序，以便进行验证。本发明所使用方法为二代测序，相对传统一代测序，通量大、时间短、精确度高、信息量丰富。

Description

确定噬血细胞综合征的基因突变位点的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及确定一种疾病的基因突变位点的方法，更具体的涉及确定噬血细胞综合征的基因突变位点的方法。
背景技术
噬血细胞综合征(HPS)亦称噬血细胞性淋巴组织细胞增生症，又称噬血细胞性网状细胞增生症,于1979年首先由Risdall等报告。其特征是发热，肝脾肿大，全血细胞减少.本综合征分为两大类，一类为原发性或家族性，另一类为继发性，后者可由感染及肿瘤所致.原发性HPS，或称家族性HPS，为常染色体隐性遗传病，其发病和病情加剧常与感染有关；继发性HPS分为感染相关性HPS，此型多与病毒感染有关，由病毒引起者称病毒相关性HPS(VAHS)；由肿瘤引起者称肿瘤相关性HPS(MAHS)。
每50，000个新生儿会有1个FLH患者。该病70％都发生在新生儿出生的第一年。病情经过急骤、凶险、病死率高。原发性和继发性噬血细胞综合征虽然病因不同，但在临床表现和病理方面均非常相似甚至相同，以至于无法鉴别。不同病因的HLH治疗方案选择和预后差异较大，因此正确分析HLH病因非常重要。
噬血细胞综合征病因复杂，随着研究的推进，对其基因突变位点的检测方法还有待进一步的研究。
这种基因的检测方法与肺间质疾病有关，但是这种检测的直接目的并非是诊断噬血细胞综合征疾病，而只是检测噬血细胞综合征的中间参数。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个目的在于提供了一种确定噬血细胞综合征基因突变位点的方法，本方法可对噬血细胞综合征相关的10个基因的编码区全长及附近转录剪接位点进行突变分析。涵盖了该范围内的点突变、比较小的插入和缺失型突变。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种确定噬血细胞综合征的基因位点突变的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
(1)获取外周血，所述外周血来自于临床诊断为噬血细胞综合征的个体；
(2)从所述外周血中提取基因组DNA；
(3)使用特异性扩增引物对通过PCR扩增所述基因组DNA，从而获得PCR扩增产物；
(4)对所述PCR扩增产物进行第一测序，以便获得第一测序结果；
(5)将所述第一测序结果进行过滤，以便获得经过过滤的第一测序结果；
(6)将所述经过过滤的第一测序结果与参考序列进行比对，以及基于比对结果确定与噬血细胞综合征相关的基因突变位点；
(7)将所述含有突变位点的基因进行第二测序，以便进行验证。
进一步地，所述特异性扩增引物对的核苷酸序列是SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ ID NO:19和20、SEQ ID NO:21和22、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:25和26、SEQ ID NO:27和28、SEQ ID NO:29和30、SEQ IDNO:31和32、SEQ ID NO:33和34、SEQ ID NO:35和36、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:39和40、SEQ ID NO:41和42、SEQ ID NO:43和44、SEQ ID NO:45和46、SEQ ID NO:47和48、SEQ IDNO:49和50、SEQ ID NO:51和52、SEQ ID NO:53和54、SEQ ID NO:55和56、SEQ ID NO:57和58、SEQ ID NO:59和60、SEQ ID NO:61和62、SEQ ID NO:63和64、SEQ ID NO:65和66、SEQ IDNO:67和68、SEQ ID NO:69和70、SEQ ID NO:71和72、SEQ ID NO:73和74、SEQ ID NO:75和76、SEQ ID NO:77和78、SEQ ID NO:79和80、SEQ ID NO:81和82、SEQ ID NO:83和84、SEQ IDNO:85和86、SEQ ID NO:87和88、SEQ ID NO:89和90、SEQ ID NO:91和92、SEQ ID NO:93和94、SEQ ID NO:95和96、SEQ ID NO:97和98、SEQ ID NO:99和100、SEQ ID NO:101和102、SEQID NO:103和104、SEQ ID NO:105和106、SEQ ID NO:107和108、SEQ ID NO:109和110、SEQID NO:111和112、SEQ ID NO:113和114、SEQ ID NO:115和116、SEQ ID NO:117和118、SEQID NO:119和120、SEQ ID NO:121和122、SEQ ID NO:123和124、SEQ ID NO:125和126、SEQID NO:127和128、SEQ ID NO:129和130、SEQ ID NO:131和132、SEQ ID NO:133和134、SEQID NO:135和136、SEQ ID NO:137和138、SEQ ID NO:139和140、SEQ ID NO:141和142、SEQID NO:143和144、SEQ ID NO:145和146、SEQ ID NO:147和148、SEQ ID NO:149和150、SEQID NO:151和152、SEQ ID NO:153和154、SEQ ID NO:155和156、SEQ ID NO:157和158、SEQID NO:159和160、SEQ ID NO:161和162、SEQ ID NO:163和164、SEQ ID NO:165和166、SEQID NO:167和168、SEQ ID NO:169和170、SEQ ID NO:171和172、SEQ ID NO:173和174、SEQID NO:175和176、SEQ ID NO:177和178、SEQ ID NO:179和180、SEQ ID NO:181和182、SEQID NO:183和184、SEQ ID NO:185和186、SEQ ID NO:187和188、SEQ ID NO:189和190、SEQID NO:191和192、SEQ ID NO:193和194、SEQ ID NO:195和196、SEQ ID NO:197和198、SEQID NO:199和200、SEQ ID NO:201和202、SEQ ID NO:203和204、SEQ ID NO:205和206、SEQID NO:207和208、SEQ ID NO:209和210、SEQ ID NO:211和212、SEQ ID NO:213和214、SEQID NO:215和216、SEQ ID NO:217和218、SEQ ID NO:219和220、SEQ ID NO:221和222、SEQID NO:223和224、SEQ ID NO:225和226、SEQ ID NO:227和228、SEQ ID NO:229和230、SEQID NO:231和232、SEQ ID NO:233和234、SEQ ID NO:235和236、SEQ ID NO:237和238、SEQID NO:239和240、SEQ ID NO:241和242、SEQ ID NO:243和244、SEQ ID NO:245和246、SEQID NO:247和248、SEQ ID NO:249和250、SEQ ID NO:251和252、SEQ ID NO:253和254、SEQID NO:255和256、SEQ ID NO:257和258、SEQ ID NO:259和260、SEQ ID NO:261和262、SEQID NO:263和264、SEQ ID NO:265和266、SEQ ID NO:267和268、SEQ ID NO:269和270、SEQID NO:271和272、SEQ ID NO:273和274、SEQ ID NO:275和276、SEQ ID NO:277和278、SEQID NO:279和280、SEQ ID NO:281和282、SEQ ID NO:283和284、SEQ ID NO:285和286、SEQID NO:287和288。
进一步地，所述噬血细胞综合征相关的基因位点为PRF1、UNC13D、SH2D1A、STXBP2、STX11、XIAP、Rab27a、AP3B1、LYST和ITK基因的编码区全长及附近转录剪接位点。
进一步地，所述步骤(2)中基因组DNA的浓度为大于25ng/μL。
进一步地，所述步骤(4)中，在对所述PCR扩增产物进行第一测序的过程中，构建插入片段为175～275bp的测序文库；。
进一步地，按照10μL反应体系计算，所述步骤(3)中PCR扩增的反应体系为：
试剂 体积
2*Vazyme Lamp master mix 5μL
ddH2O 3μL
引物工作液 1μL
样品DNA 1μL
Total 10μL
任选地，所述引物工作液为扩增引物按其质量加超纯水配成浓度为100μmol的母液，再按照扩增引物对的配对原则，配成终浓度为5μmol的工作液。
任选地，所述PCR扩增的反应程序为：
进一步地，所述第一测序利用Illumina miseq平台进行双末端测序。
进一步地，所述步骤(4)中的参考序列为PRF1:NG_009615.1；UNC13D:NG_007266.1；SH2D1A:NG_007464.1；STXBP2:NG_016709.1；STX11:NG_007613.1；XIAP:NG_007264.1；Rab27a:NG_009103.1；AP3B1:NG_007268.1；LYST:NG_007397.1；和ITK:NG_016276.1，
任选地，所述参考序列来源于NCBI。
进一步地，所述第二测序是利用Sanger法进行的。
进一步地，所述测序文库是使用Illumina Nextera XT建库试剂盒制备的。
根据本发明的实施例，能够对噬血细胞综合征相关的10个基因同时进行检测，突变位点能直接给出，不需要对单个基因的测序结果逐个进行分析，优化的检测及分析流程。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明一个实施例扩增得到的152个外显子的PCR扩增片段的2％凝胶电泳图
图2为Sanger测序验证PRF1基因Exon2上存在c.148G>A(p.Val50Met)(杂合)突变的示意图
图3为Sanger测序验证PRF1基因Exon3上存在c.1168C>T(p.Arg390X)(杂合)突变的示意图
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
(1)样本DNA的准备
样本信息：中国男患者，2岁1个月，临床诊断为噬血细胞综合征。
收集患者的外周血标本，使用上海飞捷生物全血DNA提取试剂盒提取DNA，使用NanoDrop 2000分光光度计对提取好的DNA进行浓度测定。测定浓度为65.4ng/ul，达到检测标准。
(2)引物的设计和扩增
使用Primer5软件针对10个基因的编码区及附件内含子区域进行引物的设计，共设计了144对引物。
按如下扩增体系进行PCR扩增，
2*Vazyme Lamp master mix 5μL
ddH2O 3μL
引物工作液 1μL
样品DNA 1μL
TotaL 10μL
PCR扩增程序如下：
扩增得到144个DNA片段，进行凝胶电泳见图1，用于确定将要进行测序的目的片段都已得到有效扩增。
图1每个孔对应的基因名称分别为：
1-25PRF1EXON2,PRF1EXON3,UNC13D EXON1,UNC13D EXON2+3+4,UNC13D EXON5+6,UNC13D EXON 7+8+9,UNC13D EXON10+11+12,UNC13D EXON13+14+15,Marker,UNC13DEXON16+17+18,UNC13D EXON19+20,UNC13D EXON21+22,UNC13D EXON23+24,UNC13DEXON25,UNC13D EXON26+27,UNC13D EXON28+29,UNC13D EXON30,UNC13D EXON31,UNC13DEXON32,STX11EXON2.1,STX11EXON2.2,STX11EXON2.3,STXBP2EXON1,STXBP2EXON2+3,STXBP2EXON4
26-50STXBP2EXON5+6,STXBP2EXON7,STXBP2EXON8+9+10,STXBP2EXON11+12+13,STXBP2EXON14+15,STXBP2EXON16,STXBP2EXON17+18+19,SH2D1A EXON1,Marker,SH2D1AEXON2,SH2D1A EXON3,SH2D1A EXON4,XIAP EXON2a,XIAP EXON2b,XIAP EXON3,XIAPEXON4,XIAP EXON5,XIAP EXON6,XIAP EXON7,RAB27A EXON2,RAB27A EXON3,RAB27AEXON4,RAB27A EXON5,RAB27A EXON6,RAB27A EXON7
51-75AP3B1EXON1,AP3B1EXON2,AP3B1EXON3,AP3B1EXON4,AP3B1EXON5,AP3B1EXON6,AP3B1EXON7,AP3B1EXON8,Marker,AP3B1EXON9,AP3B1EXON10+11,AP3B1EXON12,AP3B1EXON13,AP3B1EXON14,AP3B1EXON15,AP3B1EXON16,AP3B1EXON17,AP3B1EXON18,AP3B1EXON19,AP3B1EXON20,AP3B1EXON21,AP3B1EXON22,AP3B1EXON23,AP3B1EXON24,AP3B1EXON25
76-100AP3B1EXON26,AP3B1EXON27,LYST EXON3,LYST EXON4,LYST EXON5.1,LYSTEXON5.2,LYST EXON5.3,LYST EXON5.4,Marker,LYST EXON5.5,LYST EXON6.1,LYSTEXON6.2,LYST EXON7,LYST EXON8,LYST EXON9,LYST EXON10,LYST EXON11,LYST EXON12,LYST EXON13,LYST EXON14,LYST EXON15,LYST EXON16,LYST EXON17,LYST EXON18,LYSTEXON19
101-125LYST EXON20,LYST EXON21,LYST EXON22,LYST EXON23,LYST EXON24,LYST EXON25,LYST EXON26,LYST EXON27,Marker,LYST EXON28,LYST EXON29,LYSTEXON30,LYST EXON31,LYST EXON32,LYST EXON33+34,LYST EXON35+36,LYST EXON37,LYSTEXON38,LYST EXON39,LYST EXON40,LYST EXON41,LYST EXON42,LYST EXON43,LYSTEXON44,
126-150LYST EXON45,LYST EXON46,LYST EXON47,LYST EXON48,LYST EXON49,LYST EXON50,LYST EXON51,LYST EXON52,Marker,ITK EXON1,ITK EXON2,ITK EXON3,ITKEXON4,ITK EXON5,ITK EXON6,ITK EXON7,ITK EXON8,ITK EXON9,ITK EXON10,ITKEXON11,ITK EXON12,ITK EXON13,ITK EXON14+15,ITK EXON16,ITK EXON17
151-152Marker,LYST EXON53
(2)文库的构建和测序
文库的制备：使用Illumina Nextera XT建库试剂盒构建插入片段175-275bp的样本文库，具体操作见文库制备试剂盒说明书。然后使用Illumina miseq平台进行双末端测序。
(3)数据分析
对低质量原始数据进行过滤，患者血液样本获得3950乘数的单倍体覆盖度。
测序结果通过MiSeq Report与对应参考序列(PRF1:NG_009615.1；UNC13D:NG_007266.1；SH2D1A:NG_007464.1；STXBP2:NG_016709.1；STX11:NG_007613.1；XIAP:NG_007264.1；Rab27a:NG_009103.1；AP3B1:NG_007268.1；LYST:NG_007397.1；和ITK:NG_016276.1)对比，基于vcf.out文件进行分析，得到此患者的基因变异数据如下：
结合临床信息及参考数据库：HGMD Pro、PubMed、1000Genmes、dbSNP及ExAC。，对上列变异信息进行分析筛选，去除多态性位点以及非致病性性位点。
该患者检测到PRF1基因Exon2上存在错义变异c.148G>A(p.Val50Met)(杂合)，据目前文献检索该变异在HLH患者中检出过,但该变异位点是否为致病性变异位点暂无文献支持。
再者，该患者检测到PRF1基因Exon3上存在无义变异c.1168C>T(p.Arg390X)(杂合)，该基因编码区第1168位碱基C变异成T，使得编码第390位氨基酸Arg的密码子变异成终止密码子，导致氨基酸的编码提前终止，可能导致蛋白质功能受到影响。并有相关文献支持。
(4)阳性位点验证
对患者PRF1基因的阳性位点进行Sanger法测序验证。
使用引物如下：
引物序列(5'to3') 引物名称
GTAAAACGACGGCCAGTGCCCTTCCATGTGCCCTGATAATC PRF1-EX2-F
GGAAACAGCTATGACCATGAGCAGCCTCCAAGTTTGATTGG PRF1-EX2-R
GTAAAACGACGGCCAGTGCCAGTCCTAGTTCTGCCCACTTAC PRF1-EX3-F
GGAAACAGCTATGACCATGGAACCCCTTCAGTCCAAGCATAC PRF1-EX3-R
对患者标本进行扩增，扩增程序以及体系同之前。
对扩增产物进行一代测序，测序引物为：
正向测序引物：GTAAAACGACGGCCAGTG
反向测序引物：GGAAACAGCTATGACCATG
一代测序使用ABI3500，测序操作见仪器说明书。
测序结果分析：
使用软件FinchTV及Mutation Surveyor对一代测序下机数据进行分析，从NCBI上下载PRF1基因参考序列，进行对比，检测到PRF1基因Exon2上存在错义变异c.148G>A(p.Val50Met)(杂合)和PRF1基因Exon3上存在无义变异c.1168C>T(p.Arg390X)(杂合)，使用Sanger法测序验证，见图2和3。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种确定噬血细胞综合征的基因位点突变的方法，其特征在于，包括
(1)获取外周血，所述外周血来自于临床诊断为噬血细胞综合征的个体；
(2)从所述外周血中提取基因组DNA；
(3)使用特异性扩增引物对通过PCR扩增所述基因组DNA，从而获得PCR扩增产物；
(4)对所述PCR扩增产物进行第一测序，以便获得第一测序结果；
(5)将所述第一测序结果进行过滤，以便获得经过过滤的第一测序结果；
(6)将所述经过过滤的第一测序结果与参考序列进行比对，以及基于比对结果确定与噬血细胞综合征相关的基因突变位点；
(7)将所述含有突变位点的基因进行第二测序，以便进行验证。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性扩增引物对的核苷酸序列是SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ IDNO:19和20、SEQ ID NO:21和22、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:25和26、SEQ ID NO:27和28、SEQ ID NO:29和30、SEQ ID NO:31和32、SEQ ID NO:33和34、SEQ ID NO:35和36、SEQ IDNO:37和38、SEQ ID NO:39和40、SEQ ID NO:41和42、SEQ ID NO:43和44、SEQ ID NO:45和46、SEQ ID NO:47和48、SEQ ID NO:49和50、SEQ ID NO:51和52、SEQ ID NO:53和54、SEQ IDNO:55和56、SEQ ID NO:57和58、SEQ ID NO:59和60、SEQ ID NO:61和62、SEQ ID NO:63和64、SEQ ID NO:65和66、SEQ ID NO:67和68、SEQ ID NO:69和70、SEQ ID NO:71和72、SEQ IDNO:73和74、SEQ ID NO:75和76、SEQ ID NO:77和78、SEQ ID NO:79和80、SEQ ID NO:81和82、SEQ ID NO:83和84、SEQ ID NO:85和86、SEQ ID NO:87和88、SEQ ID NO:89和90、SEQ IDNO:91和92、SEQ ID NO:93和94、SEQ ID NO:95和96、SEQ ID NO:97和98、SEQ ID NO:99和100、SEQ ID NO:101和102、SEQ ID NO:103和104、SEQ ID NO:105和106、SEQ ID NO:107和108、SEQ ID NO:109和110、SEQ ID NO:111和112、SEQ ID NO:113和114、SEQ ID NO:115和116、SEQ ID NO:117和118、SEQ ID NO:119和120、SEQ ID NO:121和122、SEQ ID NO:123和124、SEQ ID NO:125和126、SEQ ID NO:127和128、SEQ ID NO:129和130、SEQ ID NO:131和132、SEQ ID NO:133和134、SEQ ID NO:135和136、SEQ ID NO:137和138、SEQ ID NO:139和140、SEQ ID NO:141和142、SEQ ID NO:143和144、SEQ ID NO:145和146、SEQ ID NO:147和148、SEQ ID NO:149和150、SEQ ID NO:151和152、SEQ ID NO:153和154、SEQ ID NO:155和156、SEQ ID NO:157和158、SEQ ID NO:159和160、SEQ ID NO:161和162、SEQ ID NO:163和164、SEQ ID NO:165和166、SEQ ID NO:167和168、SEQ ID NO:169和170、SEQ ID NO:171和172、SEQ ID NO:173和174、SEQ ID NO:175和176、SEQ ID NO:177和178、SEQ ID NO:179和180、SEQ ID NO:181和182、SEQ ID NO:183和184、SEQ ID NO:185和186、SEQ ID NO:187和188、SEQ ID NO:189和190、SEQ ID NO:191和192、SEQ ID NO:193和194、SEQ ID NO:195和196、SEQ ID NO:197和198、SEQ ID NO:199和200、SEQ ID NO:201和202、SEQ ID NO:203和204、SEQ ID NO:205和206、SEQ ID NO:207和208、SEQ ID NO:209和210、SEQ ID NO:211和212、SEQ ID NO:213和214、SEQ ID NO:215和216、SEQ ID NO:217和218、SEQ ID NO:219和220、SEQ ID NO:221和222、SEQ ID NO:223和224、SEQ ID NO:225和226、SEQ ID NO:227和228、SEQ ID NO:229和230、SEQ ID NO:231和232、SEQ ID NO:233和234、SEQ ID NO:235和236、SEQ ID NO:237和238、SEQ ID NO:239和240、SEQ ID NO:241和242、SEQ ID NO:243和244、SEQ ID NO:245和246、SEQ ID NO:247和248、SEQ ID NO:249和250、SEQ ID NO:251和252、SEQ ID NO:253和254、SEQ ID NO:255和256、SEQ ID NO:257和258、SEQ ID NO:259和260、SEQ ID NO:261和262、SEQ ID NO:263和264、SEQ ID NO:265和266、SEQ ID NO:267和268、SEQ ID NO:269和270、SEQ ID NO:271和272、SEQ ID NO:273和274、SEQ ID NO:275和276、SEQ ID NO:277和278、SEQ ID NO:279和280、SEQ ID NO:281和282、SEQ ID NO:283和284、SEQ ID NO:285和286、SEQ ID NO:287和288。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述噬血细胞综合征相关的基因位点为PRF1、UNC13D、SH2D1A、STXBP2、STX11、XIAP、Rab27a、AP3B1、LYST和ITK基因的编码区全长及附近转录剪接位点。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中基因组DNA的浓度大于25ng/μL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，在对所述PCR扩增产物进行第一测序的过程中，构建插入片段为175～275bp的测序文库；。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照10μL反应体系计算，所述步骤(3)中PCR扩增的反应体系为：
试剂 体积 2*Vazyme Lamp master mix 5μL ddH2O 3μL 引物工作液 1μL 样品DNA 1μL Total 10μL
任选地，所述引物工作液为扩增引物按其质量加超纯水配成浓度为100μmol的母液，再按照扩增引物对的配对原则，配成终浓度为5μmol的工作液。
任选地，所述PCR扩增的反应程序为：
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一测序利用Illumina miseq平台进行双末端测序。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的参考序列为PRF1:NG_009615.1；UNC13D:NG_007266.1；SH2D1A:NG_007464.1；STXBP2:NG_016709.1；STX11:NG_007613.1；XIAP:NG_007264.1；Rab27a:NG_009103.1；AP3B1:NG_007268.1；LYST:NG_007397.1；和ITK:NG_016276.1，
任选地，所述参考序列来源于NCBI。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二测序是利用Sanger法进行的。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述测序文库是使用Illumina NexteraXT建库试剂盒制备的。
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