CN109112211A - 一种人类胚胎Chediak-Higashi综合征LYST基因突变检测的引物组合及方法 - Google Patents
一种人类胚胎Chediak-Higashi综合征LYST基因突变检测的引物组合及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于高通量测序技术检测Chediak‑Higashi综合征LYST基因突变检测的引物及方法。其中，所用的引物组合物包括特异性扩增LYST基因和特异性扩增LYST基因上下游2Mb范围内紧密连锁多态性位点(SNP)的引物。本发明的方法具有通用性、多位点SNP测序、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点，可以对所有Chediak‑Higashi综合征基因突变进行胚胎移植前检测，并且检测过程更加快速，检测结果也更为准确。
Description
技术领域
本发明提供了一种基于高通量测序技术检测Chediak-Higashi综合征基因突变试剂盒。其中，所用的引物组合物包括特异性扩增LYST基因和特异性扩增LYST基因上下游2Mb范围内紧密连锁多态性位点(SNP)的引物。本发明的方法具有通用性、多位点SNP测序、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点，可以对所有Chediak-Higashi综合征基因突变进行胚胎移植前检测，并且检测过程更加快速，检测结果也更为准确。
技术背景
Chediak-Higashi综合征(Chediak-Higashi syndrome，CHS，OMIM 214500)是一种罕见的常染色体隐性遗传病，临床表现有色素减退、免疫缺陷、轻微出血倾向、进行性神经系统异常等，其发病率约为1/1000000。该病早期病情稳定，以后多在十年内迅速发展，出现弥散性淋巴细胞和组织细胞浸润，病情恶化，患者常因严重感染或出血而死亡，少数患者病情稳定，可存活至成年。近20年来，全世界累计报道临床诊断者不超过500例，我国累计临床报道近50例，目前国内少见LYST基因分析病例的报道。CHS是单基因遗传病，致病基因为LYST(lysosomaltrafficking regulator，溶酶体转运调节蛋白)，定位于1号染色体q42.1-q42.2。
遗传病起因于上代生殖细胞和受精卵的遗传物质突变，杜绝遗传病患儿的出生仍是减少遗传病发病率最有效的手段，以往通过产前诊断在妊娠16-20周进行选择性流产，阻止患儿的出生。胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)是辅助生殖技术和分子生物学技术相结合而发展起来的一门新的诊断技术，通过胚胎活检技术获得1～2个卵裂球进行遗传学诊断分析，选择正常、无缺陷的健康胚胎植入子宫继续妊娠，达到优生的目的，可以避免传统的产前诊断技术引起的出血、感染等并发症以及流产和引产给孕妇造成的身心痛苦，并避免由此引起的伦理上的争议。
随着我国全面二孩政策的放开，高龄产妇数量猛增，再加上不孕不育率逐年上升，提高妊娠率及优生已经成为普遍关注的问题，以PGD/PGS为代表的第三代试管婴儿技术正是解决这些问题的关键。第二代测序技术具有高通量、自动化、低成本的特征，在PGD/PGS临床上的应用得到迅速推广。目前还没有商品化的基于第二代测序技术的试剂盒用来进行胚胎植入前LYST基因检测，本发明属于国内首创，提供了一种高覆盖率的试剂盒来满足临床应用的需求。
传统PCR虽然灵敏，但应用于PGD的时候，存在污染、等位基因脱扣、扩增失败等缺点。单细胞PCR的扩增失败率大约是5％～10％。扩增失败可能与样本的准备过程有关，如未移入细胞、靶DNA的丢失和变性以及细胞的裂解过程。污染是导致误诊的重要原因，通过设立严格的阴性和阳性对照、严格的实验室操作以及单精子卵胞浆内注射技术的应用可以减少污染。等位基因脱扣(allele dropout，ADO)是指在单细胞扩增时，杂合子的两个等位基因之一出现扩增，而另一个等位基因无扩增产物。ADO是导致误诊的主要原因之一，通常有5％～20％的单细胞扩增出现等位基因脱扣。其发生机理复杂，可能与染色体嵌合体、部分二倍体细胞中存在单倍体细胞和PCR变性的温度有关。
为了克服现有技术的上述局限性，该试剂盒设计了一种基于高通量测序技术检测LYST基因突变检测的方法。提供了一种用于检测Chediak-Higashi综合征LYST基因突变的引物组合物，其由特异扩增LYST基因CDS区域以及LYST基因上下游2Mb范围内紧密连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点的引物组成(总共107对引物)。这些引物的特点为：(1)在目标染色体上序列唯一；(2)位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度；(3)多对引物混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中能进行多重反应。(4)通过高通量测序分析既能对胚胎进行基因检测，又能通过SNP连锁分析判断胚胎的致病性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人类胚胎Chediak-Higashi综合征LYST基因突变检测引物组合及方法，该方法基于家系SNP连锁分析原理，可以对所有Chediak-Higashi综合征LYST基因突变进行胚胎移植前诊断。
本发明中检测地贫相关基因突变情况采用特异性引物多重PCR扩增的方法建库并测序。本发明提供了一种基于Ion Torrent测序平台的Chediak-Higashi综合征LYST基因突变检测方法，具体步骤如下：
(1)胚胎细胞全基因组扩增和夫妻双方全血DNA提取：将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进行富集，和全血DNA提取，得到DNA后进行浓度测定；
(2)目的片段扩增：将DNA与多重PCR引物和PCR扩增试剂混合，经多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；
(3)引物消除：将步骤(2)得到的DNA片段与引物消除试剂混合反应，降解去除PCR扩增片段中的引物序列，得到去引物的DNA片段；
(4)接头连接：将步骤(3)得到的DNA片段与P1接头、特异性接头、连接反应试剂混合进行连接反应，得到加接头的DNA片段；
(5)磁珠纯化：将加接头的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化的DNA片段；
(6)文库扩增：将步骤(5)的DNA片段加入文库扩增反应液及文库扩增引物进行PCR扩增，并采用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文库；
(7)文库检测：将步骤(6)得到的文库采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度；
(8)高通量测序：采用Ion Proton或Ion PGM测序平台对步骤(7)得到的文库进行高通量测序。
(9)生物信息分析：对下机的数据进行生物信息分析；
(10)应用一代测序技术对分析结果进行验证；
作为本发明进一步的方案：Chediak-Higashi综合征LYST基因突变检测的多重PCR扩增引物对为：SEQ ID NO：1-107；
作为本发明进一步的方案：步骤(1)中的试剂盒为QiagenSingle CellKit(24)：
作为本发明进一步的方案：步骤(2)中的反应体系为20μL体系，反应体系的组成成分具体为：
作为本发明进一步的方案，多重PCR反应条件如下：
99℃预变性2min，1个循环；99℃变性15sec，60℃退火和延伸4min，22个循环；10℃终止。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)中引物消除试剂为Life Technologines公司的FuPa Reagent，加入量为20μL PCR反应体系加入2μL引物消除试剂。
作为本发明进一步的方案：步骤(4)中的P1接头为：
作为本发明进一步的方案：步骤(4)中的特异性接头是由如下正反两个序列组成的Barcode x：
Barcode x代表的具体序列如下：
Barcode 1：
Barcode 2：
Barcode 3：
Barcode 4：
Barcode 5：
Barcode 6：
Barcode 7：
Barcode 8：
Barcode 9：
Barcode 10：
Barcode 11：
Barcode 12：
Barcode 13：
Barcode 14：
Barcode 15：
Barcode 16：
作为本发明进一步的方案：步骤(4)所述接头连接反应的体系为30μL，接头连接反应的体系具体为：
作为本发明进一步的方案：步骤(5)中所用磁珠为XPReagent。
作为本发明进一步的方案：步骤(6)中文库扩增反应液为PlatiumTM PCRSuperMix High Fidelity，文库扩增引物为Library Amplification Primer Mix。
作为本发明进一步的方案：步骤(6)中文库扩增体系为52μL，具体为向步骤(5)产物中加入50μL PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity和2μL Library AmplificationPrimer Mix。
作为本发明进一步的方案：步骤(6)中文库PCR扩增的反应条件如下：
98℃预变性2min，1个循环；98℃变性15sec，60℃退火和延伸1min，5～7个循环；10℃终止。
本发明提供了一种试剂，该试剂包括上述引物对。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的方法具有通用性、多位点SNP测序、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点，防止扩增等位基因脱扣(ADO)造成的检测误诊，可以对进行胚胎移植前检测，并且检测过程更加快速，检测结果也更为准确。
附图说明
图1显示各个样本测序的总体情况。
图2显示各个样本的测序数据量情况。
图3显示各个样本的SNP单体型视图。
图4、图5显示各个样本的巢式PCR电泳图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明。
实施例中所用的技术手段若无特殊指明，均为常规方法；试剂与耗材若无特殊说明均可从商业途径获取。
本发明公开了LYST基因突变检测方法，所有试剂均可由市场购得：其中，5×IonAmpliseqTM HiFi Master Mix(Life公司)，2×Ion AmpliseqTM Primer Pool(Life公司)，FuPa Reagent(Life公司)，Ion P1 Adapter和Ion XpressTM Barcode X(Life公司)，SwitchSolution (Life公司)，DNA Ligase(Life公司)，XP Reagent(Beckman公司)，PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity(Life公司)，LibraryAmplification Primer Mix(Life公司)。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：基于Ion Torrent测序平台的4例胚胎Chediak-Higashi综合征LYST基因突变移植前诊断
本实施例采用以下试剂：5×Ion AmpliseqTM HiFi Master Mix(Life公司)，2×Ion AmpliseqTM Primer Pool(Life公司)，FuPa Reagent(Life公司)，Ion P1 Adapter和Ion XpressTMBarcode X(Life公司)，Switch Solution(Life公司)，DNA Ligase(Life公司)， XP Reagent(Beckman公司)，PlatiumTM PCR SuperMix HighFidelity(Life公司)，Library Amplification Primer Mix(Life公司)，Nuclease-FreeWater，无水乙醇。
本方法实验前需要新鲜配置一种试剂：75％乙醇。
本实验需要用到的仪器和设备：离心机、磁力架、移液器、PCR仪、振荡器、荧光计Qubit 4.0。
主要实验步骤：
(1)样本来源：一对携带LYST突变基因的夫妻，女方LYST基因杂合性移码缺失突变：c1418_1422del；男方LYST基因杂合性剪切位点突变：c4883-1G＞A；样本数量：8个胚胎(取囊胚期滋养外胚层细胞)，2管全血(夫妻双方)。
(2)按照QiagenSingle Cell Kit(24)标准流程对8个胚胎样本进行全基因组扩增，用4.0荧光分析仪和配套试剂dsDNA HS Assay Kit测定浓度(结果见表1)。
表1单细胞DNA扩增浓度测定结果
按照QiagenBlood&Tissue Kit(50)标准流程对2管全血进行DNA提取，用4.0荧光计和配套试剂dsDNA HS Assay Kit进行浓度测定(结果见表2)。
表2全血DNA提取浓度测定结果
(3)目的片段扩增，按照以下体系加入各试剂进行PCR扩增：
反应条件：
(4)引物清除
向PCR产物中加入2μL引物清除试剂FuPa Reagent，涡旋混匀，瞬时离心，根据如下程序进行反应：
(5)接头连接
1)稀释混合接头，形成Barcode Adapter Mix；
2)在清除引物后的PCR产物中加入以下组分，涡旋混匀，瞬时离心。
P1接头为：
样本接头分别如下：
Barcode x：
Barcode x代表的序列如下：
Barcode 1：
Barcode 2：
Barcode 3：
Barcode 4：
Barcode 5：
Barcode 6：
Barcode 7：
Barcode 8：
Barcode 9：
Barcode 10：
Barcode 11：
Barcode 12：
Barcode 13：
Barcode 14：
Barcode 15：
Barcode 16：
(6)纯化连接产物
磁珠纯化连接产物，采用XP Reagent纯化产物：
1)将PCR产物转移至1.5ml EP管内，加入45μLXP Reagent，吹打混匀；
2)室温孵育5min；
3)将样本放置磁力架上，静置3mn至管内溶液澄清，小心吸取上清液并弃去；
4)加入300μL新鲜配制的75％乙醇，转动EP管清洗磁珠，弃去乙醇；
5)重复步骤4)一次；
6)室温晾干磁珠，不要过度干燥(风干即可，不要开裂)。
(7)文库扩增，在纯化后晾干的磁珠中加入50μL文库扩增酶PlatiumTM PCRSuperMix High Fidelity和2μL文库扩增引物Library Amplification Primer Mix，重悬磁珠，转移至PCR管中，涡旋混匀，进行PCR扩增。
反应条件：
(8)文库进行磁珠纯化，采用XP Reagent磁珠纯化产物：
1)每管加入25μL纯化磁珠，涡旋混匀，低速离心，室温孵育5分钟。
2)将EP管置于磁力架上，吸附3min至溶液变澄清之后，将上清液转移到另一标记的EP管中，注意不要吸到磁珠。
3)每管加入60μL纯化磁珠，涡旋混匀，低速离心，室温孵育5分钟。
4)将EP管置于磁力架上，吸附3分钟至溶液变澄清之后，吸去溶液，注意不要吸到磁珠。
5)吸取300μL 75％的乙醇于EP管，轻轻旋动EP管清洗磁珠。液澄清后吸去溶液，注意不要吸到磁珠。
6)重复上一步。
7)取下EP管，低速离心10秒。将EP管置于磁力架上，用移液枪吸去残留溶液，注意管壁上不能有残留。将EP管盖打开，室温静置5分钟，晾干磁珠。
8)吸取50μL洗脱液于EP管内，涡旋混匀，离心5秒，室温放置5分钟。
9)将EP管置于磁力架上，静置3分钟至溶液澄清后，小心转移液体到新的EP管中，并标记文库名称。
(9)检测文库浓度
DNA文库采用dsDNA HS Assay Kit试剂盒进行浓度测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。文库建议根据下列公式稀释到200pmol/L，稀释后使用荧光定量PCR仪定量，等质量混合后上机测序。
表3 PGD文库浓度测定结果
(10)高通量测序
对混合文库采用Ion Proton或Ion PGM测序平台进行高通量测序。
通过对Ion Torrent测序平台的测序结果进行分析，所有样本的覆盖度均达到或超过97％，均一性平均达到100％，每次测序反应样本的数据量分布均匀。
对胚胎活检细胞全基因组扩增WGA产物(DNA)及家系样本进行捕获测序进行生物信息学SNP分析，获得夫妇及致病基因连锁单倍型信息，再根据胚胎样本的测序信息判断是否遗传了父母亲的致病单体型。生物信息分析结果见图1、图2；数据分析结果见表5、表6、图3。
表5 SNP单体型分析结果
表6突变位点检测结果
实施例2：实施例1的Sanger一代测序验证
一、巢式PCR扩增：
1.样本：
1.1 WGA样本8个：编号1～8
1.2父母的全血DNA样本2个：M(母亲)、F(父亲)
2.PCR引物共2组3对：
2.1引物A组成：①G1-5Fa：GAGGTTCAGGAAGATTTTGTG、G1-5Ra：
2.2引物B组成：②G1-3Fa：CAGCTGATAATGACCCAAGAA、G1-3Ra：
ACTGGAAATGTTTCAAAGGAA---650bp；③G1-3F：AGGCAGGAGAATGGTGTGAAC、G1-3R：GCAATCATAGCTCACTCACCG---356bp
3.PCR方法：
3.1引物A进行普通PCR，即使用引物①按如下的PCR反应体系/条件进行PCR扩增
3.2引物B进行巢式PCR，即先使用引物②按如下的PCR反应体系/条件进行PCR扩增，再
将PCR产物稀释1万倍，使用引物③按相同条件进行PCR扩增
4.PCR反应体系：
5.PCR反应条件：
6.使用DL1000 Marker：
7.电泳：
1)配制1.5％琼脂糖凝胶，加样5μL，电压130V电泳30min，引物A(引物①)普通PCR电泳结果见附图4。引物B(引物②③)巢式PCR电泳结果见附图5。
2)送英淮捷基公司进行Sanger一代测序，验证结果见表7。
表7 Sanger验证结果
<110>广州达瑞生殖技术有限公司
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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TTCAGGTGCCTTTCTAAAATGACCTT
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CCTTTGGCTCCAAGTCTGCTAG
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ACTATACAGTCAGGATCCTGGCTTT
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CAAGACATCAGGTGGTGACAGA
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<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>27
GTGGTAACATTTGGCTGCCAAA
<210>28
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>28
GCATTAGCTTCTAGTTCATGTGCTGT
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>29
GGGAAGTGATACAGGGATGGAAAA
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>30
GCATGCCAAGCCCAAAGTACTA
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>31
GCAAGAACTCCCATCTGGATGT
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>32
CCAGGCTCGCACGTTAGATAAAAA
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>33
CACTCCGATGGAGAGTGATGTC
<210>34
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>34
GCATGTCCATCCTTACTCACTAGGA
<210>35
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>35
CAGTTCCTCAAAGAAGCAGGGAT
<210>36
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>36
GCTTCTTTCCTCTTTAGTTAGACCATCTTT
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>37
CCCATGAAGGAGGAAAACAGTTTG
<210>38
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>38
CAGAATCGAGGTCTGGAGTTCAG
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<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>39
CCCTTTACCTAAGGATGGAGAAAAGC
<210>40
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>40
ATCCCAATTTCTACATGTAAGTTGGTTTC
<210>41
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>41
CCACAGCGTAATAGATAATACATTTTGTGT
<210>42
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>42
CTCCTCCACCCTTCTCTTTTGAC
<210>43
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>43
ACCTGAGAGATCTCGGTGATGA
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>44
CAAGCCATGGATTTGGTTCAAGAA
<210>45
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>45
TGATATCCAAAAGTGGACACACATCTTT
<210>46
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>46
TCTTAAGTCACTGGACAGCAAACTC
<210>47
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>47
TCCTTCTAGGCCTTGTCACCTT
<210>48
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>48
AAGGCACAATACAGGAAAGCTGA
<210>49
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>49
GCCCATCTTCCACCTCTGTTTG
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>50
ATTCAGGTGCTCATCACCAACT
<210>51
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>51
GCCCAGACTGTGCTACATTCTG
<210>52
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>52
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<210>53
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>53
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<210>54
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>54
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>55
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<210>56
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>56
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>58
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>60
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>61
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>62
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>63
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>64
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>65
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>66
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>67
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<210>68
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>68
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<210>72
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>72
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>73
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<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>74
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<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>75
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>76
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>78
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>79
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>80
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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<210>82
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>82
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>83
CGCCTGGCCACATATATATTTTGATATG
<210>84
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>84
CCCACTTAACCAATGAGATGACCA
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>85
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<210>86
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>86
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>87
ATGGCCACAGTGGAAGGAAGAAT
<210>88
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>88
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>89
GTGCCCAAAGGAGAAGCACCTA
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>90
GTCAGGCAATCAGTGCAATTGA
<210>91
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>91
AGTCAAAACATCACTCTGTACTCCATG
<210>92
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>92
GGGAACCGATCTTCTGAGAGGT
<210>93
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>93
CCCAAGAAGCCAAGGTCATTCA
<210>94
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>94
CCAGGCTGATAATCCACCACTT
<210>95
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>95
TGGCTTTGTAGACAGGTACTTTAACAAG
<210>96
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>96
CAATTCCATAGGCCGATCACTACTC
<210>97
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>97
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>98
TCACTTCTCGAGAGGAATCACAGT
<210>99
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>99
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<210>100
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>100
GGCATTTGAGTGATAGGTAGAGGT
<210>101
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>101
ATCTCTGCTTGCCGAGCTAAAA
<210>102
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>102
TCATCACAGCCCAAATCTGAGAC
<210>103
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>103
CCCTCTCATGTAAGATGTTTCCCT
<210>104
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>104
GCGTTCTGGAGCTTATTCATATTCCATATT
<210>105
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>105
GGGATAGTCTGGAAAACAGAGAATGA
<210>106
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>106
GGCCCTCATAGCATGGGAAATC
<210>107
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>107
CAGTTGCACGCTGAAAATCCAG
<210>108
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>108
CAAACTGTGAGGGCTGAAATCTG
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>109
CCTTTCCAACTCTGGGAACTGT
<210>110
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>110
ACAGCTTGCATCCTAAATCTCAGG
<210>111
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>111
GGAAGGCAGAAGTACAGCTCAA
<210>112
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>112
CCACCCATTCCTTCGACAGATC
<210>113
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>113
TATGTGTGGCTGAAGACAATTTTCTTCT
<210>114
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>114
CATAAATTTCTCTTTGCCACCTCCAAA
<210>115
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>115
ACTTCCGGTCCCAGTCAACTAA
<210>116
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>116
GCATCTCTGTCTGCCACAAACAA
<210>117
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>117
GTTCTGGCAATATGCTTTGCCA
<210>118
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>118
AGTCACTCAGAGAACCCACAGT
<210>119
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>119
GGGTGTGTCAAATCTGAGGGTA
<210>120
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>120
TGCTTCCCATTATGTAGCCTAGAGTTAT
<210>121
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>121
CCTTCAGGTGGTGGATTTCCAG
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>123
TAGCAGAACACAGAGAGAAACTCATTC
<210>124
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>124
AAGCTGAGTGTGTTTTGTTTTATCACC
<210>125
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>125
CGCCCAGCCAAAACATAAATATTTTAAGA
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>126
ATTGTTTGCTGGCATATCATCAGC
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>127
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>128
CTGGAGCAAACTGAATGAGAAGGA
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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CCACTGGAAAGGTTTGTCTCCA
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<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>130
GGATCAAGTTTCAACATGAGTTCTTAAGGA
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<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>131
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>133
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>134
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<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>136
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>137
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>138
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<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<400>140
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>142
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>144
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>148
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>153
CTTTAGCCTCCCTGGCAAAATAAG
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>154
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>155
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>161
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>162
GTTCATCTAACCTCGGTGGTGAT
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>164
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<211>22
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<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>171
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<210>172
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>172
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<210>173
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>173
TCTTGACAATCAGAAGTACCTTGGGTA
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>174
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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GCCCTGAGAAGCGAGTGTTTAA
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>176
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>177
AGGGAGACCTCAATCAGATCACT
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>178
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>179
AGATTTTGAAATTCTGAATTCAAGCACACA
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<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>180
TACATGTAATCACACATATTCTGTCATGCA
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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GGATGAAAAGGCGTTAAGTGCA
<210>182
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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<210>183
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>183
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>184
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>185
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<210>186
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>186
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<210>187
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>187
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<210>188
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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CAAGTGATTTCACCTAATCCCGTACA
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>190
CTTTTGAGACCTTTGCCAAAGCAT
<210>191
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>191
AGGAGATGCCTAGACCACTGATT
<210>192
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>192
AACTTGGTCCAGGACAGGATTC
<210>193
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>193
CATGAGTTCATACTCAGCAGGGAAA
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<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>194
CAGAAGGCAGATAACCGGAAAGAAATA
<210>195
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>195
GTAACGTGTGTTGTTTAAGACTCAACTG
<210>196
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>196
CTTGAGAGCCTGGATAGAACAAAAAGA
<210>197
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>197
TCATGATCTTCCATCCTTTCATTCACC
<210>198
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>198
GAGAGAATCCCATTGAGCATGAGA
<210>199
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>199
CTTTTTGTTAGCATCAGATGTCAGCA
<210>200
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>200
CAATTATTCAAGCCATTCTCTCTCTCTCT
<210>201
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>201
ACCCATATCAAGCTTTCTGTGTAGTC
<210>202
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>202
GTAGCAAAGGCTCCCACATTCT
<210>203
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>203
ATTTACAAACATCTGCAGGTCTTCCT
<210>204
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>204
TAACATACACACTGGATTTTCATGCCTAA
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>205
TAGTTGGGAGGGAAGTGAAGTGA
<210>206
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>206
TTTCCTCCAAGCCTATCAAAGACC
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<211>29
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<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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GAAAAGAGGTTGTAGCTAGCAAAAAGTAC
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<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
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GTCAAAGGAATAGTCCTCAAGGAATTACT
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<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>209
GGAGTTAAAAAGTGAGAGCCCAAATC
<210>210
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>210
CAGGTCTTGTGCAATCTTCTTGAG
<210>211
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>211
CTTGACTCTGCTAACATAATAAAGCACTG
<210>212
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>212
CACTATGCAATTCAAAACAAAGTCAAGC
<210>213
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>213
TGTAGGACTACACCCAGCCTTT
<210>214
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>214
TATTATTAGAGGCCAGGCAGCAAAGAAATG
<210>215
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>215
CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT
<210>216
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>216
ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT
<210>217
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>217
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT
<210>218
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>218
ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC
<210>219
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>219
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT
<210>220
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>220
ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC
<210>221
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>221
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT
<210>222
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>222
ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC
<210>223
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>223
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT
<210>224
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>224
ATCGATCTTGGTACTGAGTCGGAGACACGC
<210>225
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>225
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT
<210>226
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>226
ATCGTTCCTTCTGCTGAGTCGGAGACACGC
<210>227
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>227
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT
<210>228
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>228
ATCGAACTTCTTGCTGAGTCGGAGACACGC
<210>229
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>229
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT
<210>230
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>230
ATCGAATCACGAACTGAGTCGGAGACACGC
<210>231
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>231
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT
<210>232
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>232
ATCGTTATCGGAACTGAGTCGGAGACACGC
<210>233
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>233
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT
<210>234
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>234
ATCGTTCCGCTCACTGAGTCGGAGACACGC
<210>235
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>235
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT
<210>236
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>236
ATCGTTCGGTCAGCTGAGTCGGAGACACGC
<210>237
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>237
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT
<210>238
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>238
ATCGATTCGAGGACTGAGTCGGAGACACGC
<210>239
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>239
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT
<210>240
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>240
ATCGAACCACCTACTGAGTCGGAGACACGC
<210>241
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>241
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT
<210>242
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>242
ATCGTCCGTTAGACTGAGTCGGAGACACGC
<210>243
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>243
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT
<210>244
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>244
ATCGACACTCCAACTGAGTCGGAGACACGC
<210>245
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>245
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT
<210>246
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>246
ATCGACCTCTAGACTGAGTCGGAGACACGC
<210>247
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>247
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT
<210>248
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>特定引物序列，以用作高通量测序建库引物。
<400>248
ATCGTCATCCAGACTGAGTCGGAGACACGC
Claims (4)
1.一种检测人类胚胎Chediak-Higashi综合征LYST基因突变的引物组合，其特征在于：所述引物组合由SEQ ID NO：1～107所示序列的多重PCR引物组成。
2.一种检测人类胚胎Chediak-Higashi综合征LYST基因突变的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)胚胎细胞全基因组扩增和夫妻双方全血DNA提取：将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进行富集，和全血DNA提取，得到DNA后进行浓度测定；
(2)目的片段扩增：将DNA与多重PCR引物和PCR扩增试剂混合，经多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；
(3)引物消除：将步骤(2)得到的DNA片段与引物消除试剂混合反应，降解去除PCR扩增片段中的引物序列，得到去引物的DNA片段；
(4)接头连接：将步骤(3)得到的DNA片段与P1接头、特异性接头、连接反应试剂混合进行连接反应，得到加接头的DNA片段；
(5)磁珠纯化：将加接头的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化的DNA片段；
(6)文库扩增：将步骤(5)的DNA片段加入文库扩增反应液及文库扩增引物进行PCR扩增，并采用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文库；
(7)文库检测：将步骤(6)得到的文库采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度；
(8)高通量测序：采用Ion Proton或Ion PGM测序平台对步骤(7)得到的文库进行高通量测序。
(9)生物信息分析：对下机的数据进行生物信息分析；
(10)应用一代测序技术对分析结果进行验证。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述的多重PCR反应条件如下：
99℃预变性2min，1个循环；99℃变性15sec，60℃退火和延伸4min，22个循环；10℃终止。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中所述的PCR扩增反应条件如下：
98℃预变性2min，1个循环；98℃变性15sec，60℃退火和延伸1min，5～7个循环；10℃终止。
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|---|---|---|---|
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- 2018-05-15 CN CN201810454610.7A patent/CN109112211A/zh active Pending
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