CN113337598B

CN113337598B - 用于孕期维生素b12缺乏风险评估检测试剂盒与应用方法

Info

Publication number: CN113337598B
Application number: CN202110748973.3A
Authority: CN
Inventors: 叶辉铭; 苏志英; 李娟�; 吴琦嫦; 曹佳莉; 邹悦
Original assignee: Xiamen Maternity & Child Healthcare Hospital (xiamen City Family Planning Service Center)
Current assignee: Xiamen Maternity & Child Healthcare Hospital (xiamen City Family Planning Service Center)
Priority date: 2021-07-02
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2041-07-02
Also published as: CN113337598A

Abstract

用于孕期维生素B12缺乏风险评估检测试剂盒与应用方法，涉及分子生物学。所述用于筛查孕期维生素B12缺乏风险预测的引物组，其用于扩增维生素B12代谢基因单核苷酸多态性(SNP)位点；引物长度18～30bp。经过多重PCR扩增后的产物，加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基,不同基因型延伸不同碱基，而后用瞬时纳秒(10～9s)强激光激发，在一非电场漂移区内按照其质荷比率得以分离，根据延伸碱基的质量不同在真空小管中飞行到达检测器时间不同来区分不同基因型。

Description

用于孕期维生素B12缺乏风险评估检测试剂盒与应用方法

技术领域

本发明涉及分子生物学，尤其是涉及基于

MALDI-TOF System(时间飞行质谱生物芯片系统)检测孕期维生素B12的相关基因位点多态性的引物，试剂盒和方法。

背景技术

维生素B12(VitB12)是一种金属钴的水溶性维生素，其生理功能主要包括促进红细胞发育成熟，提高叶酸利用率，维持基因稳定性，维护神经系统正常运转等。人体内的维生素B12主要来源于肉、蛋、鱼、奶等动物性食物，动物及植物体内均不能合成。在血液循环系统中，维生素B12主要与血浆结合蛋白结合的形式存在，游离的维生素B12并不能被细胞吸收。维生素B12在人体内主要作为辅酶参与甲基丙二酸及同型半胱氨酸反应，维生素B12缺乏时,人类红细胞叶酸含量低,肝脏贮存的叶酸降低,，造成甲基从同型半胱氨酸向甲硫氨酸转移困难，导致同型半胱氨酸蓄积，同型半胱氨酸可在金属离子介导下自身氧化生成过氧化物及氧自由基，损伤血管内皮细胞的结构和功能，从而导致疾病的发生。

妊娠时蛋白质合成代谢及线粒体能量转换增强，维生素B12的需求量增加，更易引起维生素B12不足或者缺乏，研究表明维生素B12的需求量是非孕期的3～4倍，若妊娠期维生素B12和叶酸补充不足时同型半胱氨酸水平将升高，进而引起妊娠合并症如习惯性流产、妊娠高血压综合征、胎盘早剥、胎儿生长受限、胎儿畸形、死胎、早产、低体重儿等。相关研究提示一些国家的妊娠期女性体内维生素B12水平呈不同程度的降低。

近年来,参与维生素B12代谢的相关基因中单核苷酸多态性的研究引起了广泛关注，通过GWAS的研究结果显示,维生素B12在血清中的浓度不仅仅只受到一碳循环过程中的核心基因的影响，同时岩藻糖转移2(fucosyltransferase2,FUT2)、钴胺转运蛋白1(transcobalamin-1,TCN1)、甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoAmutase,MUT)等也对维生素B12的血清含量产生了重大影响。因此本领域需要可以通过对维生素B12代谢基因多态性的筛查实现孕期个体化精准补充维生素B12的方法。

发明内容

本发明的第一目的在于提供用于筛查孕期维生素B12缺乏风险预测的引物组。

本发明的第二目的在于提供一种用于筛查孕期维生素B12缺乏风险预测的检测试剂盒。

本发明的第三目的在于为了解决现有的孕期维生素B12缺乏风险预测产品中基因多态性测序价格昂贵的问题，提供了基于

MALDI-TOF System(时间飞行质谱生物芯片系统)检测孕期维生素B12的采用所述检测试剂盒筛查孕期维生素B12缺乏风险的方法。

所述用于筛查孕期维生素B12缺乏风险预测的引物组，其用于扩增维生素B12代谢基因单核苷酸多态性(SNP)位点；引物长度18～30bp。

所述单核苷酸多态性位点包括rs1047781、rs602662、rs2340550、rs1141321、rs9473555、rs2298585、rs3760776、rs41281112、rs526934。

所述引物组如SEQ ID NO.1～27所示。

一种用于筛查孕期维生素B12缺乏风险预测的检测试剂盒，包括：

(1)如上所述的引物组。

(2)用于多重PCR的反应液，组分组成如下所示：

一种采用所述检测试剂盒筛查孕期维生素B12缺乏风险的方法，包括以下步骤：

1)采集孕妇血液样品，提取基因组DNA；

2)采用引物组对基因组DNA的目的片段进行PCR扩增，包括至少一次基因片段扩增，至少一次产物碱性磷酸酶处理和至少一次单碱基引物延伸反应扩增，得到扩增产物混合液；

3)将扩增产物混合液通过树脂纯化得到扩增产物；

4)采用MassARRAY Analyzer Compac质谱检测扩增产物进行检测分析并输出结果。

所述样品包括人体外周血。

本发明经过多重PCR扩增后的产物，加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基,不同基因型延伸不同碱基，而后用瞬时纳秒(10～9s)强激光激发，在一非电场漂移区内按照其质荷比率得以分离，根据延伸碱基的质量不同在真空小管中飞行到达检测器时间不同来区分不同基因型。

与现有的技术相比，本发明具有以下突出优点：

1)超高灵敏度：检测下限为0.4ng。

2)超高灵活性：自行设计多重PCR，普通引物合成，通用试剂盒，芯片可分次使用，无需优化PCR条件，在标准条件即可快速建立新检测，从设计到结果仅需两天。

3)高质量数据：全自动分析数据，完成基因分型报告，并赋予质谱获得样品状态及结果可信度分析。

4)高PCR重数与转化成功率：10～36重PCR均能得到较好结果，最高可达40重；>95％的SNP位点能用这个平台进行分析研究。

5)高准确度：通过正反双向设计引物，能有效检测插入缺失INDEL和转位融合基因，准确率>99.7％。

6)高样本通量：每天可处理样品数3,000以上，100,000个基因分型。

7)高性价比：同时测定10～40个SNP位点，毋需荧光标记，耗材成本和样本用量很低。

8)低DNA样本量和质量要求：每组PCR反应只需10ng DNA

本发明提供了用于检测维生素B12代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法，能够检测维生素B12代谢基因。

附图说明

图1为位点rs1047781不同碱基的质谱聚类图。

图2为位点rs602662不同碱基的质谱聚类图。

图3为位点rs2340550不同碱基的质谱聚类图。

图4为位点rs1141321不同碱基的质谱聚类图。

图5为位点rs9473555不同碱基的质谱聚类图。

图6为位点rs2298585不同碱基的质谱聚类图。

图7为位点rs3760776不同碱基的质谱聚类图。

图8为位点rs41281112不同碱基的质谱聚类图。

图9为位点rs526934不同碱基的质谱聚类图。

图10为飞行时间质谱基本流程图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

引物组合物的设计

本发明基于FUT2基因、ACTL9基因、MUT基因、MS4A3基因、FUT6基因、CLYBL基因和TCN1基因中筛选出了9个SNP位点体系的优化选择，结合其SNP位点体系的特点，设计PCR引物组合物用于扩增不同基因上包含9个SNP位点的DNA片段，引物长度范围多为20～35bp，PCR扩增产物长度为100～200bp之间，GC含量以40-60％为宜并尽量避免引物本身产生发夹结构及5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的连续排列。另外，由于质谱检测采用的是多重PCR方法，同一反应体系内引物数量多，因此要格外注意引物间出现互补，需要绝对避免SNP延伸引物3’端与其他引物超过3个碱基的互补，否则会出现非特异性延伸，极大干扰检测结果。此外，所设计的引物应与基因组中其他序列无明显同源性，防止出现错误的检测结果。前引物和后引物的5’端额外都有10bp长度的接头序列:ACGTTGGATG，俗称“保护碱基”，保护碱基的序列使得PCR引物的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。对于单碱基延伸引物设计原则为：引物扩增的第一个碱基即为待测碱基，而且避免发夹结构和重复核苷酸序列。

本发明用于检测维生素B12代谢相关基因为FUT2基因(rs1047781、rs602662)、ACTL9基因(rs2340550)、MUT基因(rs1141321、rs9473555)、MS4A3基因(rs2298585)、FUT6基因(rs3760776)、CLYBL基因(rs41281112)和TCN1基因(rs526934)。

所述引物组如SEQ ID NO.1～27。

实施例2

下面结合实施例1对本发明试剂盒用法进行详细描述，实施例2在本发明技术前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。

S1：DNA提取：

1、样品处理：于200ul孕妇全血中加入2倍体积的Buffer TBP，充分混匀，室温放置1min，直至红细胞完全裂解。8,000rpm，离心1min，弃上清。用500μl TE Buffer重悬沉淀，8,000rpm，离心1min，弃上清，用TE Buffer洗涤一次至沉淀为白色，再加入200μl PBSsolution。

2、加入20μl Proteinase K，混匀。再加入200μl Buffer DL，震荡混匀，56℃水浴10min。混合液变澄清透明为裂解完全。

3、向上述离心管中加入200μl的无水乙醇，充分颠倒混匀。

4、将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10,000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液。

5、将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μl GW Solution，10,000rpm离心30s倒掉废液。

6、将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入700μl Wash Solution，10,000rpm离心30s倒掉废液。

7、重复步骤6一次。

8、将吸附柱重新放回收集管中，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的WashSolution。将吸附柱盖子打开于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的WashSolution，

9、取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50μl CE Buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。

S2：DNA质量检测：

1、取5μlDNA溶液1％琼脂糖、1X TAE缓冲溶液电泳(电压120～180V)检测，单一条带说明DNA完整无降解，有明显的条带说明浓度可以满足PCR要求；

2、分光光度计检测浓度和纯度，取1μl检OD值，OD260/280在1.7～2.0，说明DNA质量较好，小于1.7有蛋白污染，大于2.0有RNA污染。

S3：引物设计

设计引物软件用Sequenom公司Genotyping Tools及Massarray Assay Design软件设计待测位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物。特异性扩增引物序列和单碱基延伸引物序列见表1。

表1引物组序列

1、引物长度18～30bp，PCR产物80～200bp；

2、Tm值55～65℃，退火温度60℃左右；

3、GC含量40～70％；

4、要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

S4:PCR扩增

1、采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系的总体积是5μl，反应体系如下：

2、PCR反应条件:

S5：PCR产物碱性磷酸酶处理

PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alikaiine phosphtase虾碱性磷酸酶)处理，除去反应中的dNTPs，按表2次序配制SAP反应液(以384个样本为例)

表2 SAP反应液组分组成。

注：以上384孔反应液有4％过量。

1、取一排12联管，将SAP反应液以每孔66μl分装，短暂离心后，用10μl排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2μl，封膜、离心。

2、将已加入SAP反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“SAP”的反应程序。

3、SAP程序：37℃，40min；85℃,5min；4℃,forever。

4、反应结束，将384孔板取出短暂离心备用。

S6：延伸反应

按表3配制iPlex反应试剂。

表3 iPlex反应试剂。

注：以上384孔反应液有4％过量。

1、取一排12联管，将iPlex反应液以每孔66μl分装，短暂离心后，用10μl排枪分装于384孔PCR反应板，每孔加2μl，封膜、离心。

2、将已加入iPlex反应液的384孔板放入PCR仪中，运行名为“extension”的反应程序。

3、反应结束，将384孔板取出短暂离心备用。

S7：产物纯化

1、取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min。

2、将反应结束的384孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μl去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜。

3、以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20min，3500rpm、5min离心后备用。

S8：质谱检测

1、Nanodispenser SpectroCHIP芯片点样，将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的MassARRAY SpectroCHIP芯片。

2、MassARRAY Analyzer Compac质谱检测

3、将样品转移到SpectroCHIP芯片后，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析。

4、TYPER软件分析实验结果，获得分型数据(参见图1～9)。

实施例3

为了验证本试剂盒能够准确检测7个基因的9个SNP位点多态性，对3个已使用本发明专利所涉及的试剂盒检测过的待测样品同时进行一代测序验证。

一代测序结果与使用本发明专利所涉及的试剂盒的检测结果一致(见表4)，表明本发明专利能够准确检测相应SNP位点的多态性。

表4：两种检测方法结果对比：

^*专利：使用本发明所涉及的试剂盒检测结果；

^#一代：一代测序结果。

本发明所述的

MALDI-TOF System(时间飞行质谱生物芯片系统)是由美国西格诺公司(Sequenom,Inc.)独家研制并生产的基因分型检测系统,也是目前唯一采用飞行时间质谱的原理直接进行SNP分型检测的设备。其主要特点是：经过多重PCR扩增后的产物，加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基，不同基因型延伸不同碱基，而后用瞬时纳秒(10^-9s)强激光激发，在一非电场漂移区内按照其质荷比率得以分离，根据延伸碱基的质量不同在真空小管中飞行到达检测器时间不同来区分不同基因型，基本流程如图10所示。

序列表

<110> 厦门市妇幼保健院（厦门市计划生育服务中心）

<120> 用于孕期维生素B12缺乏风险评估检测试剂盒与应用方法

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg actggatgga ggaggaatac 30

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg aggtggtggt agaaggtcc 29

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaggaatacc gccac 15

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgttggatg aatctttggc aggtgagccc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgttggatg tgtcgggaga acattgacac 30

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaaacacca catcac 16

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgttggatg tcccaacgtg gtgaacaagc 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgttggatg ctgtgcccat gtcaataacc 30

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaccctgcag cgggact 17

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgttggatg atttccatct ccgctagcag 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgttggatg aaatccagca gggatcaagc 30

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttagtgcagc aagacaa 17

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgttggatg tttctgttag cacaatcccc 30

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgttggatg ttctcagttg tatgtaagg 29

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acaatcccct tgaatcta 18

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgttggatg gctgtaattc aagagaggtg 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgttggatg tcagaaacaa cttcaaaccc 30

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

attcacatga tctcaaagc 19

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acgttggatg gggagtgaga gagtttaagg 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acgttggatg cagggagcta tgcaaacttc 30

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

agagtttaag gtcatcctc 19

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acgttggatg gaatcatacc agtgaagccc 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acgttggatg tgactttcga gatggagctg 30

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcccctggcg gctccttctc 20

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

acgttggatg gacagaaaat ttatgctccc 30

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acgttggatg gggttaaccc aaaaatcatg c 31

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggtcttgata tgcaatcttt ttt 23

Claims

1.用于筛查孕期维生素B12缺乏风险预测的引物组，其特征在于其用于扩增维生素B12代谢基因单核苷酸多态性位点；引物长度18～30bp；

所述单核苷酸多态性位点包括rs1047781、rs602662、rs2340550、rs1141321、rs9473555、rs2298585、rs3760776、rs41281112、rs526934；

所述引物组如SEQ ID NO.1～27所示。

2.一种用于筛查孕期维生素B12缺乏风险预测的检测试剂盒，其特征在于包括：

(1)如权利要求1所述的引物组；

(2)用于多重PCR的反应液，其由如下组分组成：

10～30ng/μl的模板DNA 1μl、10μM的引物F 0.25μl、10μM的引物R 0.25μl、25mM的dNTPs mix 0.1μl、10X的PCR Buffer 0.5μl、25mM的MgCl₂ 0.4μl、5U/μl的HotStar Taq0.1μl和添加ddH₂O到5μl。