CN110241195A - 一种个体化叶酸补充剂量的基因检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于个体化叶酸补充剂量的基因检测方法，通过设计用于扩增rs1801133、rs1801131、rs1805087以及rs1801394位点的引物，对个体中与叶酸代谢紧密相关的4个SNP位点进行扩增，进一步分析个体扩增片段的基因型，根据个体基因型的差异给出叶酸需求量的建议。本方法操作简便，应用性强，适合推广使用。

Description

一种个体化叶酸补充剂量的基因检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种与叶酸吸收、代谢、后期反应相关基因的基因型别数据库，叶酸相关基因的基因分型方法，以及判断叶酸缺乏及过量的检测方法。

背景技术

B族维生素，全是水溶性维生素，在体内滞留的时间只有数小时，必须每天补充。虽然《中国居民膳食指南2016》(以下简称“指南”)给出了每种B族维生素相对于中国人群的推荐补充剂量，但是每个人对于B族维生素的实际需求是不同的，简单地按照《指南》推荐的剂量补充并不是个体的最优化方案。

造成B族维生素需求个体差异的因素有许多，包括性别、年龄、体重等多个方面，其中最主要的是遗传因素，包括B族维生素的代谢、转运以及作用相关基因的遗传多态性。研究表明，特定的基因位点多态性会影响维生素的吸收、代谢及转化效率，使B族维生素在不同个体中的需求会偏离《指南》中的推荐量。其中，与维生素B1需求量相关的基因为SLC35F3，相应SNP位点为rs17514104；与维生素B2需求量相关的基因为MTHFR，相应SNP位点为rs1801133和rs1801131；与维生素B3需求量相关的基因为LPL、SIRT1和HERC4，相应SNP位点分别为rs285、rs1467568和rs497849；与叶酸(维生素B9)需求量相关的基因为MTHFR、MTR和MTRR，相应SNP位点为rs1801133、rs1801131、rs1805087和rs1801394；与维生素B12需求量相关的基因为CLYBL、FUT6、MS4A3和FUT2，相应SNP位点分别为rs41281112、rs3760776、rs2298585和rs602662。其详细的对应关系和原理如下：

SLC35F3编码硫胺素转运蛋白，rs17514104位于SLC35F3基因内部，其变异位点与SLC35F3的硫胺素(维生素B1)转运活性显著相关。

与维生素B2相关的基因为MTHFR，其编码产物亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是一个依赖维生素B2作为辅因子的还原酶。SNP位点rs1801133和rs1801131位于MTHFR基因内部，导致MTHFR基因型不同；进而导致其与维生素B2的亲和力不同，进一步活性差异很大，最终导致对体内同型半胱氨酸的清除效率高低不同。对这些异常人群，适当补充维生素B2可提高MTHFR的催化活性，消除基因型导致的酶活降低，同时降低相关疾病如神经管畸形等发生的风险。

与维生素B3相关的基因有三个，分别为LPL、SIRT1和HERC4。LPL编码脂蛋白脂肪酶，是血脂代谢过程的关键酶，能够调节血液中甘油三酯的含量。rs285(C变T)是LPL基因上风险位点，导致LPL活性降低。联合相关分析表明，该携带风险位点(TT)的人群维生素B3摄入不足时，患代谢综合征的概率升高。SIRT1基因产物与DNA抗氧化相关，其位点rs1467568G位点携带者易患糖尿病，每天服用19.8mg VB3降低该风险至正常。HERC4基因毗邻SIRT1基因，与其共享rs497849位点。

与维生素B12水平相关的四个多态性位点均来自于全基因组关联分析研究。rs6022662位于FUT2基因的第二外显子区域，该位点每携带一个A位点会导致维生素B12含量升高44.2pg/ml。其作用原理可能是A位点会降低对细菌感染的敏感性，从而降低维生素B12吸收不良的风险，因此导致维生素B12含量增高。rs41281112位于CLYBL基因，碱基由G到A的突变导致编码的精氨酸转变成终止密码子，无法合成正常的CLYBL蛋白，影响金属离子与CLYBL蛋白的结合，从而导致金属离子的吸收，进而影响维生素B12的吸收。携带纯合突变子的人群体内维生素B12的含量明显偏低。rs2298585位于MS4A3基因的内含子内，MS4A3蛋白是细胞周期的调控因子。因为人体不能合成维生素B12，主要通过饮食提供。MS4A3的多态性位点可能通过调节肠胃道的上皮细胞周期来影响维生素B12的吸收。相对于携带C的人群，携带T突变的人群体内维生素B12的含量明显升高。rs3760776位于FUT6基因启动子内，其作用原理与rs2298585类似，可能是A位点会降低对细菌感染的敏感性，从而降低维生素B12吸收不良的风险，因此导致维生素B12含量增高。

叶酸属于B族维生素，是体内极为重要的甲基供体，参与DNA合成和修复，维持细胞内正常甲基化和基因组稳定性。叶酸主要存在于食物中，人体无法依靠自身合成。叶酸摄入不足或代谢障碍均会引起叶酸缺乏，进而引起各种疾病。

与叶酸(维生素B9)需求量相关的基因为MTHFR、MTR和MTRR，其中MTHFR编码亚甲基四氢叶酸还原酶，作用是将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。位点rs1801133和rs1801133与代谢综合征患病风险、高血糖指数、高腰围、心脑血管疾病以及多种肿瘤疾病相关。MTR与MTRR分别编码甲硫氨酸合成酶和甲硫氨酸合成酶还原酶，催化5-甲基四氢叶酸提供甲基给同型半胱氨酸使后者转变成甲硫氨酸的反应。其酶活与体内同型半胱氨酸含量有关，rs1805087和rs1801394分别为其重要SNP位点。

1999年JAMES等首先提出参与叶酸代谢的亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)可能在染色体不分离的过程中发挥着重要作用，并采用病例和对照结合的方法，证实MTHFR基因C66T7的突变是造成DS发生的危险因素之一。2000年，HOBBS又发现并证实叶酸代谢的另一关键酶甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)基因A66G突变是DS发生的又一个母源性危险因素，MTRRA66G纯合突变合并MTHFR C667T至少一个突变位点也会增加生育DS患儿的危险性。

上述基因分别与不同B族维生素的吸收、代谢和转化效应相关，每个基因特征位点的变异会影响个体对B族维生素的需求。因此在整体上这四个基因产生了多种排列组合形式，每种组合形式与不同的B族维生素需求级别相对应。为此我们建立了上述基因不同单核苷酸多态性(SNP)以及插入/缺失分布类型与B族维生素需求量的对应关系矩阵。通过检测个体基因组中这些基因的SNP分布类型，应用软件将其对应到矩阵中的相应位置，从而快速得到个体对B族维生素的需求量。

现有技术中已经存在对叶酸代谢相关基因的的检测，常见的方法为测序法或荧光定量PCR方法等，这些方法操作复杂，周期较长，且需要大型的仪器设备。另外，现有技术中也仅是针对叶酸缺乏患者是否存在基因型的突变进行简单的检测，对于不同基因型的检测结果，鲜见给出针对不同基因型的后续治疗或补充建议

发明内容

为克服现有技术中存在的对叶酸代谢相关基因检测的不足，以及后续针对不同基因型的治疗或补充建议的缺乏。本发明提供了一种个体化叶酸补充剂量的基因检测方法。

本发明的目的是提供一种引物组，所述引物组分别包括用于扩增rs1801133、rs1801131、rs1805087以及rs1801394位点的引物。

优选的，所述用于扩增rs1801133位点的引物序列如SEQ ID NO：1-3所示；所述用于扩增rs1801131位点的引物序列如SEQ ID NO：4-6所示；所述用于扩增rs1805087位点的引物序列如SEQ ID NO：7-9所示；所述用于扩增rs1801394位点的引物序列如SEQ ID NO：10-12所示。

优选的，其特征在于，所述引物标记荧光基团。

优选的，所述荧光基团为FAM和HEX。

本发明进一步公开了一种个体化叶酸补充剂量的基因检测试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。

优选的，所述引物组序列如SEQ ID NO：1-12所示。

本发明进一步公开了所述引物组在个体化叶酸补充剂量的基因检测中的应用。

本发明公开了一种用于判定个体叶酸需求量的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)样本收集和制备个体DNA模板；

(2)采用上述的引物组对步骤(1)的DNA模板进行扩增；

(3)对步骤(2)扩增得到的片段进行基因型分析；

(4)根据个体基因型的不同给出叶酸需求量的建议。

优选的，个体基因型与叶酸需求量的对应关系如下：

表1：个体基因型与叶酸需求量的对应关系

其中所述需求量的单位为μg，优选的，所述方法用于非疾病诊断和/或治疗目的。

本发明公开了一种个体化叶酸补充剂量的基因检测方法，所述方法采用上述引物组进行检测，优选的，所述方法用于非疾病诊断和/或治疗目的。

优选的，所述检测方法为荧光PCR方法，PCR扩增反应程序为：94℃ 15分钟，热启动；94℃，20S，61-55℃，60S，10个循环每个循环降0.6℃；94℃，20S，55℃，60S，26个循环；读取荧光值。

本发明公开了一种个体叶酸需求量与基因型关联的建立方法，所述方法包括：

(1)样本收集和制备个体DNA模板；

(2)采用上述的引物组对步骤(1)的DNA模板进行扩增；

(3)对步骤(2)扩增得到的片段进行基因型分析；

(4)将个体基因型与叶酸需求量进行关联，所述的关联如下所示：

表1：个体基因型与叶酸需求量的对应关系

其中所述需求量的单位为μg。

本发明通过提供的引物组对个体的基因型进行检测，根据个体基因型的差异给出叶酸需求量的建议。本方法操作简便，应用性强，适合推广应用。

附图说明

图1为制备的部分样品的基因组DNA电泳图。

图2为采用荧光定量PCR反应检测得到的基因型分布图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1样本收集和DNA模板制备

1)采用口腔拭子收集待测人员口腔上皮细胞，方法为将拭子伸进口腔内部，使拭子头部充分接触脸颊内部及上下牙床处粘膜，用刷牙的力度上下擦动，同时旋转拭子，让拭子头部充分接触口腔粘膜，重复此动作1分钟。

2)采用标准口腔拭子DNA提取试剂盒及相应步骤，将沾有口腔细胞的拭子置于800μL生理盐水中，涮洗20秒，使细胞完全脱落，贴离心管壁挤干拭子上的液体，12,000rpm离心5min。

3)弃700μL上清，剩余100μL上清，充分振荡混匀15秒，加入200μL裂解液和20μL消化液，振荡混匀，56℃水浴10分钟。

4)加入500μL析出液，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响DNA的提取与后续实验。

5)将吸附柱放入收集管内，将上述溶液转入吸附柱内，静置2min，12,000rpm 4℃离心1min，弃收集管内废液。

6)将吸附柱放回收集管内，加500μL洗涤液至吸附柱内，12,000rpm 4℃离心1min，弃收集管内废液。

7)将吸附柱放回收集管内，12,000rpm 4℃离心2min，离去残留的洗涤液。

8)取出吸附柱，放入新的1.5mL离心管内，加入30-50μL洗脱液，静置3min，12,000rpm 4℃离心2min，收集DNA溶液。

提取得到的基因组DNA的电泳图片参照图1。

实施例2 rs1801133、rs1801131、rs1805087以及rs1801394位点的引物设计

设计了分别针对SNP位点不同分型的特异性扩增引物(两个引物仅末端碱基不同，分别用F1和F2表示)，以及相对应的反向引物(R表示)，3个引物组合形成引物预混液。此外，两条正向引物5′端分别连接有不同的检测序列，用于荧光检测。特异性扩增引物用下划线表示，检测引物序列分别用斜体表示。

具体4个位点的引物序列如下：

MTHFR(rs1801133)

F1：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGA-3′，如SEQ ID NO：1所示；

F2：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGG-3′，如SEQ ID NO：2所示；

R：5′-TTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGA-3′，如SEQ ID NO：3所示；

MTHFR(rs1801131)

F1：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAGGAGCTGACCAGTGAAGA-3′，如SEQ ID NO：4所示；

F2：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGAGGAGCTGACCAGTGAAGC-3′，如SEQ ID NO：5所示；

R：5′-GGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT-3′，如SEQ ID NO：6所示；

MTR(rs1805087)

F1：

′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGGA-3′，如SEQ ID NO：7所示；

F2：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGGG-3′，如SEQ IDNO：8所示；

R：5′-TCTACCACTTACCTTGAGAGACTCATAAT-3′，如SEQ ID NO：9所示；

MTRR(rs1801394)

F1：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGTACCACAGCTTGCTCACAT-3′，如SEQ ID NO：10所示；

F2：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGTACCACAGCTTGCTCACAC-3′，如SEQ ID NO：11所示；

R：5′-GGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT-3′，如SEQ ID NO：12所示。

实施例3 PCR反应体系的建立

PCR扩增体系包含有商业购买的2x Mix(包含Taq酶、4种dNTPs、与正向引物的检测引物序列相对应的两个探针)。PCR体系如下：

PCR扩增体系(10μL)：

表2：PCR反应扩增程序

荧光值读取：

在低于40℃的环境下，读取荧光值。

结果判读：

对于每一个SNP位点，以MTHFR基因rs1801133位点为例，该位点在人群中存在CC、CT和TT三种可能的分布类型。如果一个人该位点的基因型为CC，则只有F1引物能够正常扩增，F1引物带有FAM发光基团，显示蓝色荧光；如果该位点基因型为TT，则只有F2引物能够正常扩增，F2引物带有HEX发光基团，显示红色色荧光；如果该位点基因型为杂合型CT，则引物F1和F2均能够正常扩增，结果可以同时读取到两种荧光且两种荧光的光强接近，整体显示出绿色。

选取一定数目的样本，提取基因组DNA后采用上述荧光PCR反应体系进行扩增，分析样本中基因型的分布，扩增结果参见图2。

实施例4 对100例志愿者进行基因型和血液中叶酸含量的测定

1)采集空腹静脉血3-5mL.静置30分钟后，离心分离血清；

2)血清叶酸水平检测参考：(饮食因素及血清中几种B族维生素含量与食管癌前病变关系的研究，鲍刘莉，中国优秀硕士学位论文全文数据库，2014年6月)

3)基因型检测采用实施例1-3中的方法；

4)基因型和对应血清中的叶酸含量测定结果如下：

表3：100例志愿者基因型和血清叶酸测定结果

实施例5 对叶酸缺乏的个体进一步补充叶酸后测定血清叶酸含量

1)对实施例4中测定的结果，根据郝玲，刘明珠，刘晓慧等，(血浆同型半胱氨酸与叶酸、维生素B12及还原酶的关系[J].中华预防医学杂志，2000，34：22)的研究，对实施例4中测定的个体分为3类，对血清中叶酸含量大于10nmol/L的认定为叶酸正常的个体，叶酸水平大于6nmol/L小于10nmol/L的个体为叶酸相对缺乏个体，叶酸水平小于6nmol/L的个体为叶酸严重缺乏个体；

2)根据《中国居民膳食指南2016》为基准，对叶酸测定值接近正常值但是仍然表现出叶酸缺乏症状的志愿者每天额外补充叶酸400μg，对叶酸相对缺乏个体每天额外补充叶酸550μg，对叶酸严重缺乏个体每天额外补充叶酸700μg，一周后，对这些额外补充叶酸的个体再次测定叶酸血清含量，测定结果如下：

表4：叶酸缺乏志愿者补充叶酸后血清叶酸测定结果

从表4测定的结果来看，对于叶酸缺乏志愿者补充叶酸后，血清叶酸测定结果趋于正常，可见，采用本申请得出的基因型与叶酸需求的关联可以有效的给出个体叶酸补充剂量建议。

基于志愿者的基因型以及补充的叶酸的量，进一步建立个体基因型与维生素B1需求量的对应关系，如下表所述。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种引物组，其特征在于，所述引物组包括分别用于扩增rs1801133、rs1801131、rs1805087以及rs1801394位点的引物。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述用于扩增rs1801133位点的引物序列如SEQ ID NO：1-3所示；所述用于扩增rs1801131位点的引物序列如SEQ ID NO：4-6所示；所述用于扩增rs1805087位点的引物序列如SEQ ID NO：7-9所示；所述用于扩增rs1801394位点的引物序列如SEQ ID NO：10-12所示。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物标记荧光基团。

4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述荧光基团为FAM和HEX。

5.权利要求1-4任一权利要求所述引物组在个体化叶酸补充剂量的基因检测中的应用。

6.一种用于判定个体叶酸需求量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)样本收集和制备个体DNA模板；

(2)采用权利要求1-4任一权利要求所述的引物组对步骤(1)的DNA模板进行扩增；

(3)对步骤(2)扩增得到的片段进行基因型分析；

(4)根据个体基因型的不同给出叶酸需求量的建议。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，个体基因型与叶酸需求量的对应关系如下：

其中所述需求量的单位为μg。

8.一种个体化叶酸补充剂量的基因检测方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一权利要求所述的引物组进行检测。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法为荧光PCR方法，PCR扩增反应程序为：94℃ 15分钟，热启动；94℃，20S，61-55℃，60S，10个循环每个循环降0.6℃；94℃，20S，55℃，60S，26个循环；读取荧光值。

10.一种个体叶酸需求量与基因型关联的建立方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)样本收集和制备个体DNA模板；

(2)采用权利要求1-4任一权利要求所述的引物组对步骤(1)的DNA模板进行扩增；

(3)对步骤(2)扩增得到的片段进行基因型分析；

(4)将个体基因型与叶酸需求量进行关联，所述的关联如下所示：

其中所述需求量的单位为μg。