CN109234385A - 检测阿尔茨海默症基因突变的引物组及试剂盒 - Google Patents

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戴敬
李阳
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明提供了一种检测阿尔茨海默症基因突变的引物组及试剂盒，设计了4组针对阿尔茨海默症相关基因不同位点的引物组，本发明所用质谱检测平台操作更加简便，并可以同时检测每份样本DNA的多个位点以及对检测结果进行实时监控和评价，且结果判定方式更加简单直观，同时具有操作简便，相对单个样品成本较低等诸多优势，同时多基因多位点分析，可以更准确的评估阿尔茨海默症的发病风险。

Description

检测阿尔茨海默症基因突变的引物组及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种检测阿尔茨海默症基因突变的引物组及试剂盒。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer disease，AD)是一种病因未明的起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上主要表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆的特征。该病可能是一组异质性疾病，在多种因素(包括生物和心理因素)的作用下才发病。从目前研究来看，该病的可能因素和假说多达30余种，如家族史、头部外伤、教育水平较低、甲状腺病、母育龄过高或过低、病毒感染等。根据发病时间，可以分为早老性痴呆(65岁前发病者)和老年性痴呆(65岁后发病者)，且女性发病高于男性发病，女性发病约为男性发病的3倍。
由于该病起病缓慢或隐匿，病人及家人常说不清何时起病，不能及时的预防或减缓发病的时间。目前，检测AD的手段主要集中在神经心理学检验、血液检查、神经影像检查、脑电图、脑脊液检测，但这些检测手段的检测过程繁复、成本高，且只能在有发病征兆或发病初期检测出AD。
据目前研究结果显示，基因检测可以为AD诊断提供参考。目前，在国际上已经有四个AD致病基因和易感基因被确定以及认可，分别为蛋白前体蛋白(APP)基因、早老蛋白-1(PSEN1)基因、早老蛋白(PSEN2)-2基因和载脂蛋白E(APOE)基因。在家族性早发型AD中发现有50％的人群携带APP、PS1、PS2的突变，在晚发型AD病人中，携带APOE4基因的频率增多。基因检测可以从根源上预测AD的发病概率，从而做到早发现，早预防。
APP位于染色体21q21.1-21.3，14％的EOAD是由该基因的突变所引起的，研究发现rs1800557为EOAD的一个致病突变位点；PSEN1位于染色体14q24.3，PSEN2位于染色体1q31-Q42，它们编码的蛋白是γ－分泌酶复合体的重要组成部分。研究发现，约80％的家族性EOAD患者中携带PSEN1的突变，约5％的家族性EOAD患者检测到PSEN2发生突变。最近研究发现PSEN1rs17125721和PSEN2rs28936379突变是AD的致病因素；APOE4位于染色体19q13.2，编码的载脂蛋白E是脂蛋白代谢的调节因子，在中枢神经系统内与胆固醇转运、神经可塑性、炎症反应等有关。是目前认为与LOAD发病风险关联性最强的基因，rs429358是LOAD发病相关的一个位点。
近年来分子诊断技术发展迅速，基因测序手段日益发展，在AD基因诊断技术应用过程中，荧光定量PCR是当前比较常用的阿尔茨海默症基因检测方法，但其检测过程只能检测单个基因位点，单次检测样本量小，从而对阿尔茨海默症的诊断分析造成误差。因此，检测技术还是以质谱检测为主，该技术主要检测的是中国人群阿尔茨海默症的致病基因突变。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种检测阿尔茨海默症基因突变的引物组及试剂盒，在采用质谱检测方法检测人体DNA中的阿尔茨海默症相关致病基因是否突变时，具有可操作性强、灵敏度和准确度高、节省时间等优点。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测阿尔茨海默症基因突变的引物组，包括：
检测APP基因rs1800557位点的扩增引物和单碱基延伸引物，所述扩增引物又包括具有SEQ ID NO：1序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2序列的下游引物，所述单碱基延伸引物具有SEQ ID NO：3的序列；
检测PSEN1基因rs17125721位点的扩增引物和单碱基延伸引物，所述扩增引物又包括具有SEQ ID NO：4序列的上游引物和具有SEQ ID NO：5序列的下游引物，所述单碱基延伸引物具有SEQ ID NO：6的序列；
检测PSEN2基因rs28936379位点的扩增引物和单碱基延伸引物，所述扩增引物又包括具有SEQ ID NO：7序列的上游引物和具有SEQ ID NO：8序列的下游引物，所述单碱基延伸引物具有SEQ ID NO：9的序列；以及
检测APOE4基因rs429358位点的扩增引物和单碱基延伸引物，所述扩增引物又包括具有SEQ ID NO：10序列的上游引物和具有SEQ ID NO：11序列的下游引物，所述单碱基延伸引物具有SEQ ID NO：12的序列。
本发明还提供了一种检测阿尔茨海默症基因突变的试剂盒，包括上述引物组。
优选地，所述试剂盒中还包括与所述扩增引物配合以进行扩增反应的PCR反应试剂和与所述单碱基延伸引物配合以进行单碱基延伸反应的SNP反应试剂。
更优选地，所述PCR反应试剂包括：聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；所述SNP反应试剂包括：单碱基延伸酶，dNTPs，延伸反应缓冲液。
优选地，所述试剂盒中还包括标准品DNA。
本发明具有如下有益效果：
1.质谱检测平台操作更加简便，并可以同时检测每份样本DNA的多个位点以及对检测结果进行实时监控和评价。
2.结果判定方式更加简单直观，同时具有操作简便，相对单个样品成本较低等诸多优势。
3.多基因多位点分析，可以更准确的评估阿尔茨海默症的发病风险。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明中用到的主要试剂有：
1.引物
名称 编号 序列(5'→3') 针对位点 用途
APP-F SEQ ID NO：1 GCCTACACCTCGCATCT rs1800557 扩增引物
APP-R SEQ ID NO：2 ATCCGAACTCATCAGCCT rs1800557 扩增引物
PSEN1-F SEQ ID NO：4 GGATTCAGCCAGAATC rs17125721 扩增引物
PSEN1-R SEQ ID NO：5 TCCTGTACTTCAAGGACTG rs17125721 扩增引物
PSEN2-F SEQ ID NO：7 GACCTCAGACGAAATC rs28936379 扩增引物
PSEN2-R SEQ ID NO：8 TCCGTAATTCAAGGCCTG rs28936379 扩增引物
APOE-F SEQ ID NO：10 GCAAGTAGTAATTGATGG rs429358 扩增引物
APOE-R SEQ ID NO：11 TCACGTACTTGTCCATCA rs429358 扩增引物
APP-E SEQ ID NO：3 ATCCGTCAAGGTACG rs1800557 延伸引物
PSEN1-E SEQ ID NO：6 GATCTTGGATATCACT rs17125721 延伸引物
PSEN2-E SEQ ID NO：9 TATCGCCAAGTAGCA rs28936379 延伸引物
APOE4-E SEQ ID NO：12 CCGTAAAGGCTATGCA rs429358 延伸引物
2.用于质谱检测的标准品(含有APP基因、PSEN1基因、PSEN2基因和APOE4基因的四个基因突变阴性DNA溶液)；购买于Coriell Institute人类基因组DNA标准品NA12878。
3.用于质谱检测前的实验试剂
即扩增反应和单碱基延伸反应中与扩增引物和单碱基延伸引物配合使用以进行扩增和单碱基延伸反应的反应试剂。
包括：PCR mix，SAP mix，Extend mix，(主要包括Enzyme、Buffer、dNTP)，试剂购买于Agena Bioscience的Complete iPLEX Reagent Set 10×384试剂盒。
本发明检测阿尔茨海默症相关基因突变的步骤主要包括：
步骤一：DNA样品采集
按照医疗常规操作(唾液、尿液、血液等方法)采集人体基因组DNA。样品DNA通过微定量仪测定，OD260/OD280的比值在1.7-2.0之间，基因组DNA浓度在10-20ng/μl为合格样品。
步骤二：反应体系配制
(1)PCR反应体系(总反应体系为5μl)及反应程序：
反应体系：PCR反应试剂(PCR mix)1.0μl；四个基因的引物混合物(Primer mix，包含APP基因、PSEN1基因、PSEN2基因和APOE4基因的扩增引物，每种0.3μl)共1.2μl；样本DNA模板：2μl；HPLC水0.8μl。
反应程序：95℃变性3min；95℃变性20sec+58℃退火40sec+72℃延伸30sec，40个循环；72℃终变性5min；4℃保持1h。
(2)SAP反应体系(总反应体系为7μl)及反应程序：
反应体系：SAP反应试剂(SAP mix)0.47μl；样本DNA模板(第1步PCR反应产物)：5μl；HPLC水1.53μl。
反应程序：35℃保持30min；80℃保持10min；4℃保持1h。
(3)Extend反应体系(总反应体系为9μl)及反应程序：
反应体系：Extend反应试剂(Extend mix)0.441μl；四个基因的引物混合物(Extend Primer mix，包含APP基因、PSEN1基因、PSEN2基因和APOE4基因的单碱基延伸引物，每种0.235μl)共0.94μl；样本DNA模板(第2步SAP反应产物)：7μl；HPLC水0.619μl。
反应程序：95℃变性1min；95℃变性5sec+54℃退火5sec+80℃延伸5sec，40个循环；72℃终变性5min；4℃保持1h。
步骤三：质谱检测
在第3步反应产物中加入30μl HPLC水，进行质谱检测。
步骤四：PCR结果质控
空白对照在任一检测通道无检测结果。若有检测结果，说明实验操作过程中有污染，建议重新实验。
试剂盒中的标准品DNA的检测有结果，作为阳性对照。
步骤五：结果分析
以标准品DNA检测结果为阳性对照，分析待测样品DNA的检测结果，与对照结果不一致，为突变基因型。
实施例1
本发明的临床应用研究。对57份样品DNA进行质谱检测，分析阿尔茨海默症相关基因的突变情况。
步骤一：DNA样品采集
收集32例阿尔茨海默症患者，25例正常人体基因组DNA样品(由北京人民医院、上海市第六人民医院提供)。
使用微定量仪对57份样品DNA进行测定，结果OD260/OD280的比值在1.7-2.0之间，基因组DNA浓度在10-20ng/μl为合格样品。
步骤二：反应体系配制
(1)PCR反应体系(总反应体系为5μl)及反应程序：
反应体系(5μl)：
试剂 体积
HPLC水 0.8μl
PCR mix 1.0μl
Primer mix 1.2μl
模板 2μl
反应程序：
(2)SAP反应体系(总反应体系为7μl)及反应程序：
反应体系：
反应程序：
温度 时间
35℃ 30min
80℃ 10min
4℃ 1h
(3)Extend反应体系(总反应体系为9μl)及反应程序：
反应体系：
试剂 体积
HPLC水 0.619μl
Extend mix 0.441μl
Extend Primer mix 0.94μl
模板(第2步SAP反应产物) 7μl
反应程序：
步骤三：在第3步反应产物中加入30μl HPLC水，进行质谱检测。
32例患者检测结果如下表：
25例正常人检测结果如下表：
步骤四：检测结果分析
将步骤三中32例患者和25例正常人的检测结果进行统计，结果见下表：
由此可见，APP基因rs1800557位点、PSEN1基因rs17125721位点、PSEN2基因rs28936379位点和APOE4基因rs429358位点的突变均与阿尔茨海默症的发病风险相关。
实施例2
步骤一：采集实施例1中的10例阿尔茨海默症相关四个基因中突变一个或多个基因的患者的体基因组DNA。
步骤二：对阿尔茨海默症相关基因进行测序。
具体操作过程如下：
主要试剂
1.APP基因rs1800557的扩增引物
上游引物APP-F；5'GCCTACACCTCGCATCT 3'
下游引物APP-R；5'ATCCGAACTCATCAGCCT 3'
2.PSEN1基因rs17125721位点的扩增引物
上游引物PSEN1-F；5'GGATTCAGCCAGAATC 3'
下游引物PSEN1-R；5'TCCTGTACTTCAAGGACTG 3'
3.PSEN2基因rs28936379位点的扩增引物
上游引物PSEN2-F；5'GACCTCAGACGAAATC 3'
下游引物PSEN2-R；5'TCCGTAATTCAAGGCCTG 3'
4.APOE4基因rs429358位点的扩增引物
上游引物APOE-F,5'GCAAGTAGTAATTGATGG 3'
下游引物APOE-R 5'TCACGTACTTGTCCATCA 3'
5.PCR mix(主要包括Enzyme、Buffer、dNTP)，试剂购买于Agena Bioscience的Complete iPLEX Reagent Set 10×384试剂盒。
配制PCR反应体系(25μl)：
反应体系(5μl)：
试剂 体积
RNase-Free水 18.0μl
PCR mix 5.0μl
Primer-F 0.5μl
Primer-R 0.5μl
模板 1.0μl
反应程序：
采用全式金琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，送华大基因测序。
测序结果如下表：
以测序结果为标准，对本发明试剂盒检测结果进行验证。
使用本发明对这10样本DNA进行检测，检测结果与测序结果一致，准确率达100％，可以说明本发明准确性良好。
综上实施例的结果，本发明所用质谱检测平台操作更加简便，并可以同时检测每份样本DNA的多个位点以及对检测结果进行实时监控和评价，且结果判定方式更加简单直观，同时具有操作简便，相对单个样品成本较低等诸多优势，同时多基因多位点分析，可以更准确的评估阿尔茨海默症的发病风险。
序列表
<110> 苏州绘真生物科技有限公司
<120> 检测阿尔茨海默症基因突变的引物组及试剂盒
<130> B01538123783297
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> designed
<400> 1
gcctacacct cgcatct 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> designed
<400> 2
atccgaactc atcagcct 18
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> designed
<400> 3
atccgtcaag gtacg 15
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> designed
<400> 4
ggattcagcc agaatc 16
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> designed
<400> 5
tcctgtactt caaggactg 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> designed
<400> 6
gatcttggat atcact 16
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> designed
<400> 7
gacctcagac gaaatc 16
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> designed
<400> 8
tccgtaattc aaggcctg 18
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> designed
<400> 9
tatcgccaag tagca 15
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> designed
<400> 10
gcaagtagta attgatgg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> designed
<400> 11
tcacgtactt gtccatca 18
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> designed
<400> 12
ccgtaaaggc tatgca 16

Claims (5)

1.一种检测阿尔茨海默症基因突变的引物组，包括：
检测APP基因rs1800557位点的扩增引物和单碱基延伸引物，所述扩增引物又包括具有SEQ ID NO：1序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2序列的下游引物，所述单碱基延伸引物具有SEQ ID NO：3的序列；
检测PSEN1基因rs17125721位点的扩增引物和单碱基延伸引物，所述扩增引物又包括具有SEQ ID NO：4序列的上游引物和具有SEQ ID NO：5序列的下游引物，所述单碱基延伸引物具有SEQ ID NO：6的序列；
检测PSEN2基因rs28936379位点的扩增引物和单碱基延伸引物，所述扩增引物又包括具有SEQ ID NO：7序列的上游引物和具有SEQ ID NO：8序列的下游引物，所述单碱基延伸引物具有SEQ ID NO：9的序列；以及
检测APOE4基因rs429358位点的扩增引物和单碱基延伸引物，所述扩增引物又包括具有SEQ ID NO：10序列的上游引物和具有SEQ ID NO：11序列的下游引物，所述单碱基延伸引物具有SEQ ID NO：12的序列。
2.一种检测阿尔茨海默症基因突变的试剂盒，包括权利要求1所述的引物组。
3.如权利要求2所述的一种检测阿尔茨海默症基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括与所述扩增引物配合以进行扩增反应的PCR反应试剂和与所述单碱基延伸引物配合以进行单碱基延伸反应的SNP反应试剂。
4.如权利要求3所述的一种检测阿尔茨海默症基因突变的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括：聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；所述SNP反应试剂包括：单碱基延伸酶，dNTPs，延伸反应缓冲液。
5.如权利要求2-4任一项所述的一种检测阿尔茨海默症基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括标准品DNA。
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