CN108823303A - 一种检测试剂盒及其评估精神分裂症遗传风险的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测试剂盒及其评估精神分裂症遗传风险的用途,属于基因检测领域。现有技术缺少用于评估精神分裂症遗传风险的方法的检测试剂盒,本发明试剂盒覆盖了通过GWAS研究中筛选或根据发病机制从病理生理学通路中得到与精神分裂症患病风险相关的123个易感基因位点。根据患者易感基因的检测结果,可为临床医生的诊断提供参考,也可对有家族遗传病史的正常人群进行患病风险评估,其填补了国内市场上精神分裂症早期风险评估产品的空白,可大规模,高效的对人群进行筛查,将精神分裂症的影响与负担大幅度降低。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域,具体涉及一种检测试剂盒及其评估精神分裂症遗传风险的用途。
背景技术
精神疾病是指在生物学、环境因素等影响下,引起个体的认知、情感、意志和行为等精神活动出现不同程度的障碍。常见的精神疾病有:精神分裂症、双相情感障碍、抑郁症、自闭症、老年痴呆症等等。精神分裂症是最为严重的精神疾病,该疾病以基本个性、思维、情感及行为的分裂,精神活动与环境的不协调为主要特征,表现为幻觉、妄想、情绪消沉、悲观厌世等。
1991年Gottesman发表对双生子的研究和家系的分析显示:精神分裂症患者亲属的患病率高于一般人群,而且与患者亲缘关系越近(即遗传背景越相似)其发病概率也越高。比如:同卵双生子的同病率平均为48%,远高于异卵双生子(同病率是17%),而同胞兄弟姐妹的患病率为9%。目前较普遍地认为精神分裂症是受多基因调控的并受众多环境因素作用影响、与早期神经发育异常相关的复杂疾病。因此具有明显的遗传异质性、表型复杂性及种族差异性等特征。精神分裂症的遗传力约为80%,发病率在全球范围内为1%左右。在相同的环境条件下,不同个体对特定复杂疾病的易感性不同.个体的易感性在很大程度上取决于其所携带的疾病易感基因数.精神分裂症易感基因是指能够增加个体罹患某种精神分裂症倾向的基因。个体携带的疾病易感基因数越多,其易感性越高,患病风险越高。因此,研究确定精神分裂症发病易感基因,寻找精神分裂症的多态性遗传标志,是进行早期诊断和个体化治疗的关键环节之一。
全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)可通过比较研究患者和正常人基因组中的遗传变异,筛选出与精神分裂症相关联的遗传标志。在我国2个研究组分别对我国精神分裂症患者开展了大规模全基因组关联分析。北京大学和国家人类基因组南方研究中心对2345名受试者(其中包括746名精神分裂症患者和1599名未患该病的对照个体)进行了全基因组关联分析,鉴别出1个精神分裂症相关新染色体区域11p11.2。上海交通大学遗传发育与精神神经疾病教育部重点实验室对分别来自中国北方、中部和南方的10218名受试者(其中包括3750名精神分裂症患者和6468名未患该病的对照个体)进行了全基因组关联分析。在随后的研究中进一步对另一组8922名受试者(其中包括4383名精神分裂症患者和4539名对照个体)进行了检测,鉴别出2个与精神分裂症相关的风险位点-8p12和1q24.2。GWAS已逐渐成为研究精神分裂症的遗传变异和寻找其易感基因的主要手段。
精神分裂症多发病于青壮年,早期症状比较隐蔽,由于早期识别比较困难,往往造成诊断治疗延迟和治疗困难。而且,患者病程多迁延,约占精神科住院患者的一半以上,约一半的患者最终结局为出现精神残疾,给社会及患者和家属带来严重的负担。目前国际上对精神分裂症高危人群的早期识别主要是依靠症状进行判断,如病人是否出现轻微阳性症状及短暂而局限的间隙性精神病性症状,并辅助于遗传危险性分析国内对精神分裂症的诊断主要是依据ICD-10、CCMD-3和DSM-5等标准进行判断,临床医生的主观性对诊断结果有很大影响。临床上极度缺乏能够为医师的临床诊断提供客观支持的工具。
发明内容
现有技术缺少用于评估精神分裂症遗传风险的方法的检测试剂盒,基于此,本发明提供一种检测试剂盒及其评估精神分裂症遗传风险的用途。本发明试剂盒覆盖了通过GWAS研究中筛选或根据发病机制从病理生理学通路中得到与精神分裂症患病风险相关的123个易感基因位点。根据患者易感基因的检测结果,可为临床医生的诊断提供参考。也可对有家族遗传病史的正常人群进行患病风险评估,风险高的人群可做到早预防、早治疗,将精神分裂症对个人、家庭及社会的影响降到最低。本试剂盒填补了国内市场上精神分裂症早期风险评估产品的空白。产品覆盖面广,准确性高。配备相应仪器,可大规模,高效的对人群进行筛查,将精神分裂症的影响与负担大幅度降低。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果:
一种检测试剂盒,其包含如下组分:
(1)捕获反应液:Primers mix,5×PCR buffer、dNTP Mix、DNA Polymerase,所述的Primers mix包括123对引物,所述引物的通式为:
5′-CCTACACGACGCTCTTCCGATCT-F-3′
5′-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-R-3′
其中各位点的-F和-R序列如下所示:(见表1),引物终浓度为每条引物0.005μM-0.02μM。
(2)接头反应液:2×PCRbuffer、dNTP Mix、通用引物F1、KOD高保真酶;其中
通用引物F1序列如下:
5`-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3`
(3)接头R1-R48:所述接头R1-R48的通式为:
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3
所述的NNNNNNNN中“N”表示“A”“T”“C”“G”中任意一个不同的组合用以区分不同的样本(如表2所示),其余为相同的共同序列。理论上一次性可做48个样本,本试剂盒共准备了R1-R48,48个接头序列,可一次性同时做48个样本。
(4)纯化磁珠。
其中所述的检测试剂盒,各位点的-F和-R序列如下(表1)所示
表1各位点的-F和-R序列
接头R1-R48中“NNNNNNNN”具体序列如下表(表2):
表2 R1-R48中“NNNNNNNN”具体序列
如上所述的检测试剂盒,所述的捕获反应液的组成为:5×PCR buffer 5μL,dNTPMix(10mM)0.25μL,DNA Polymerase(10U/μL)0.6μL,Primers mix(0.075μM)5μL,加入H2O补至20μL。
如上所述的检测试剂盒,所述的接头反应液的组成为:2×PCR buffer 12.5μL,dNTP Mix(10mM)0.5μL,通用引物F1(10μM)1μL,KOD高保真酶0.5μL,加入H2O至20μL。
本发明还提供一种上述检测试剂盒的应用,即所述检测试剂盒在评估精神分裂症遗传风险中的应用。
一种利用所述检测试剂盒评估精神分裂症遗传风险的方法,其具体包括下述步骤:
(1)取人类外周抗凝血样本,使用商业化核酸提取试剂盒提取使得A260/A280在1.6-2.0之间,浓度≥20ng/μL;
(2)PCR捕获产物制备:取20μL捕获反应液,加入步骤(1)中提取的80-100ng加H2O使总体积至25μL;按照如下程序进行PCR扩增:95℃3min,1循环;95℃15sec,60℃30sec,72℃90sec,30循环;72℃5min,1循环;得到PCR捕获产物;
(3)产物纯化:向PCR捕获产物中加入等体积纯化磁珠,用移液枪吸打混匀数次,室温孵育5min,待溶液澄清后移除上清;向其中加入200μL 80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30秒后移除上清;开盖空气干燥磁珠5-10分钟后向样品中加入20μL无核酸酶纯化水充分混匀,室温静置;溶液澄清后吸取上清至无核酸酶的离心管中,即得纯化后PCR捕获产物;
(4)将纯化后的捕获产物稀释至10ng/μL,取1μL加入20μL接头反应液,加入接头2μL,补纯化水至总体积为25μL,按照如下反应程序进行PCR扩增:95℃3min,1循环;95℃15sec,60℃30sec,72℃30sec,8循环;72℃5min,1循环;得到加接头的PCR产物;
(5)按照步骤(3)所述的纯化方法对加接头的PCR产物进行纯化。
(6)质量检测及测序:使用Qubit3.0测定产物纯化后的浓度,使用全自动核酸蛋白分析系统Qseq100检测产物片段大小;然后使用高通量测序仪对加接头的PCR产物进行测序。
如上利用所述检测试剂盒评估精神分裂症遗传风险的方法中,所述步骤(2)中所述引物终浓度范围为0.005μM-0.02μM。所述扩增反应的循环为25-30循环;优选地,所述引物终浓度为0.015μM,扩增反应的循环为30循环。
本发明相对于现有技术具有如下有益的技术效果:
(1)本发明检测试剂盒填补了国内市场上精神分裂症早期风险评估产品的空白。
(2)本发明试剂盒位点覆盖123个位点,几乎覆盖了所有已被证实的所有与精神分裂症相关的位点。
(3)试剂盒灵敏度好、准确性高,确保了检测结果的准确性。
(4)基于二代测序的基因捕获技术,可一次性对大量样本进行检测,效率高。
附图说明
图1为使用Qseq100检测实施例1中产物片段大小图。
图2为实施例2中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测图。
图3为按照条件1获得的产物纯化后片段大小图。
图4为按照条件2获得的产物纯化后片段大小图。
图5为按照条件3获得的产物纯化后片段大小图。
图6为按照条件4获得的产物纯化后片段大小图。
图7为高通量测序123个位点的测序深度。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明,但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例1:一种利用所述检测试剂盒评估精神分裂症遗传风险的方法
一种利用所述检测试剂盒评估精神分裂症遗传风险的方法,其具体包括下述操作步骤:
(1)取人类外周抗凝血样本1例,首先使用商业化核酸提取试剂盒提取人基因组DNA样本,对提取的DNA进行检测,要求A260/A280在1.6-2.0之间,浓度≥20ng/μL。本实施例中DNA的浓度和A260/A280比值如下:
A260/A280 | C(ng/μL) |
1.70 | 87 |
(2)取20μL捕获反应液,加入步骤(1)中提取的DNA 1.2μL和3.8μL纯化水;
其中捕获反应液的组成如下:
组分 | 体积(μL) |
5×PCR buffer | 5 |
dNTP Mix(10mM) | 0.25 |
DNA Polymerase(10U/μL) | 0.6 |
Primers mix(0.075μM) | 5 |
H2O | Up to 20 |
按照如下程序进行扩增:
(3)产物纯化
a、向PCR捕获产物中加入等体积纯化磁珠,用移液枪吸打混匀数次,室温孵育5min。
b、将EP管置于磁力架上5min,待溶液澄清后,保持样品始终处于磁力架中,小心移除上清。
c、保持样品始终处于磁力架中,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠(注意不要吹散磁珠),室温孵育30秒,小心移除上清。
d、重复步骤c;
e、保持样品始终处于磁力架中,开盖空气干燥磁珠5-10分钟。
f、样品从磁力架中取出,加入20μL nuclease free水,涡旋振荡或使用移液枪吹打充分混匀,室温静置2分钟。
g、放入磁力架上静置5分钟,待溶液澄清后,小心吸取上清至一个新的nucleasefree离心管中。
纯化后用Qubit3.0定量得捕获产物浓度为:19ng/μL.
(4)将纯化后的捕获产物稀释至10ng/μL,取1μL加入20μL接头反应液,加接头R1 2μL,补纯化水至总体积为25μL.
R1的序列为:
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTACGCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3
接头反应液的组分如下:
组分 | 体积(μL) |
2×PCR buffer | 12.5 |
dNTP Mix(10mM) | 0.5 |
通用引物F1(10μM) | 1 |
KOD高保真酶 | 0.5 |
H2O | Up to 20 |
按照下列上机程序进行运行:
(5)产物纯化:纯化步骤同步骤3
(6)质量检测
采用Qubit3.0测定产物纯化后的浓度为:24.2ng/μL;使用Qseq100检测产物片段大小,如图1。上高通量测序仪进行测序。
实施例2
(1)使用实施例1中(1)步骤所提取的DNA样本;
(2)取20μL捕获反应液,加(1)中提取的DNA 1.2μL和3.8μL纯化水
其余条件与实施例1步骤2中相同。
PCR扩增结束后,将PCR产物进行电泳检测,2%琼脂糖凝胶,PCR产物上样量5μL。(见图2)
(3)产物纯化
纯化步骤同实施例1步骤3。使用Qseq100检测产物纯化后的片段大小,其中图3为按照条件1获得的产物纯化后片段大小;图4为按照条件2获得的产物纯化后片段大小;图5为按照条件3获得的产物纯化后片段大小;图6为按照条件4获得的产物纯化后片段大小。由上图可知引物终浓度为0.015μM,循环数为30时,扩增目的产物浓度最高。
实施例3
取一例临床抗凝血样本,按实施例1步骤进行操作,将质量检测合格的样本在高通量测序仪上进行测序。各位点的测序深度如图7所示。由图可知,通过本试剂盒处理后的样本,在高通量测序仪上进行测序,123个位点均成功测序且各个位点测序深度的均一性良好。
Claims (10)
1.一种检测试剂盒,其包含如下组分:
(1)捕获反应液:Primers mix,5×PCR buffer、dNTP Mix、DNA Polymerase,所述的Primers mix包括123对引物,所述引物的通式为:
5′-CCTACACGACGCTCTTCCGATCT-F-3′
5′-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-R-3′;
(2)接头反应液:2×PCR buffer、dNTP Mix、通用引物F1、KOD高保真酶;其中
通用引物F1序列如下:
5`-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3`;
(3)接头R1-R48:所述接头R1-R48的通式为:
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3;
(4)纯化磁珠。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述的123对引物的-F和-R序列如下所示:
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述的接头序列中的N为A或T或C或G。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述的捕获反应液的组成为:5×PCR buffer 5μL,dNTP Mix(10mM)0.25μL,DNA Polymerase(10U/μL)0.6μL,Primers mix(0.075μM)5μL,加入H2O补至20μL。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述的接头反应液的组成为:2×PCR buffer 12.5μL,dNTP Mix(10mM)0.5μL,通用引物F1(10μM)1μL,KOD高保真酶0.5μL,加入H2O至20μL。
6.权利要求1-5任一所述的检测试剂盒在评估精神分裂症遗传风险中的应用。
7.一种利用所述检测试剂盒评估精神分裂症遗传风险的方法,其具体包括下述步骤:
(1)取人类外周抗凝血样本,使用商业化核酸提取试剂盒提取使得A260/A280在1.6-2.0之间,浓度≥20ng/μL;
(2)PCR捕获产物制备:取20μL捕获反应液,加入步骤(1)中提取的DNA 80-100ng加H2O使总体积至25μL;按照如下程序进行PCR扩增:95℃3min,1循环;95℃15sec,60℃30sec,72℃90sec,30循环;72℃5min,1循环;得到PCR捕获产物;
(3)产物纯化:向PCR捕获产物中加入等体积纯化磁珠,用移液枪吸打混匀数次,室温孵育5min,待溶液澄清后移除上清;向其中加入200μL 80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30秒后移除上清;开盖空气干燥磁珠5-10分钟后向样品中加入20μL无核酸酶纯化水充分混匀,室温静置;溶液澄清后吸取上清至无核酸酶的离心管中,即得纯化后PCR捕获产物;
(4)将纯化后的捕获产物稀释至10ng/μL,取1μL加入20μL接头反应液,加入接头2μL,补纯化水至总体积为25μL,按照如下反应程序进行PCR扩增:95℃3min,1循环;95℃15sec,60℃30sec,72℃30sec,8循环;72℃5min,1循环;得到加接头的PCR产物;
(5)按照步骤(3)所述的纯化方法对加接头的PCR产物进行纯化。
(6)质量检测及测序:使用Qubit3.0测定产物纯化后的浓度,使用全自动核酸蛋白分析系统Qseq100检测产物片段大小;然后使用高通量测序仪对加接头的PCR产物进行测序。
8.根据权利要求7所述的利用所述检测试剂盒评估精神分裂症遗传风险的方法,其特征在于,所述的接头R1-R48的核苷酸序列中“NNNNNNNN”的具体序列如下表:
9.根据权利要求7所述的利用所述检测试剂盒评估精神分裂症遗传风险的方法,其特征在于,所述步骤(2)中所述引物终浓度范围为0.005μM-0.02μM,所述扩增反应的循环为25-30循环。
10.根据权利要求7所述的利用所述检测试剂盒评估精神分裂症遗传风险的方法,其特征在于,所述引物终浓度为0.015μM,扩增反应的循环为30循环。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20181116 |