CN103215265B

CN103215265B - 一种老年黄斑变性疾病的筛查试剂盒

Info

Publication number: CN103215265B
Application number: CN201310176231.3A
Authority: CN
Inventors: 杨正林; 鲁芳; 刘小琦; 石毅
Original assignee: Sichuan Peoples Hospital of Sichuan Academy of Medical Sciences
Current assignee: Sichuan Peoples Hospital of Sichuan Academy of Medical Sciences
Priority date: 2012-05-14
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2033-05-14
Also published as: CN103215265A; WO2013170744A1; CN104293953A

Abstract

本发明公开了SKIV2L基因位点rs429608、rs2075702以及RDBP基因位点rs760070、rs3880457、rs9501161的变异碱基。本发明还公开了检测前述碱基变异的试剂在制备老年黄斑变性疾病的筛查试剂中的用途，以及老年黄斑变性疾病的筛查试剂盒。本发明试剂盒，可用于老年黄斑变性的辅助性诊断，以及个体老年黄斑变性疾病的抗性评估。

Description

一种老年黄斑变性疾病的筛查试剂盒

技术领域

本发明涉及SNP领域，特别涉及与老年黄斑变性相关的SNP。

背景技术

老年黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)，被认为是一类以进行性中心视力下降及黄斑部视网膜色素上皮变性为特征的异质性疾病，是全球成人致盲的首要疾病之一，全世界患病人数1000万，我国60-69岁人群AMD患病率为7.77％，70岁以上可达15.33％。黄斑变性包括老年黄斑变性、黄斑营养不良(stargart病、best病、sorsby眼底营养不良等)。

近年来研究认为，黄斑变性是一组异质性疾病，很多研究显示其具有显著的遗传倾向。目前，关于老年黄斑变性疾病的易感性遗传标记研究较多，如，在公告号：101173314B、101550451B的专利文件、公开号：101857899A的专利申请文件中，公开了老年黄斑变性疾病的易感性遗传标记及其在制备老年黄斑变性疾病检测试剂中的用途。但是，关于老年黄斑变性疾病的抗性遗传标记研究极少。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的老年黄斑变性疾病的筛查试剂盒。

本发明提供了5种变异碱基，变异碱基I为A，位于SKIV2L基因位点rs429608；变异碱基Ⅱ为C，位于SKIV2L基因位点rs2075702；变异碱基Ⅲ为C，位于RDBP基因位点rs760070；变异碱基Ⅲ为C，位于RDBP基因位点rs3880457；变异碱基Ⅲ为A，位于RDBP基因位点rs9501161。

SNP是Single Nucleotide Polymorphism的缩写，中文翻译为单核苷酸多态性，是指基因组上单个核苷酸的变异。前述5个变异碱基属于单核苷酸变异的结果。

本发明还提供了检测SKIV2L基因位点rs429608变异、位点rs2075702变异、RDBP基因位点rs760070变异、位点rs3880457变异或/和位点rs9501161变异的相关试剂在制备老年黄斑变性疾病的筛查试剂中的用途。

其中，所述的试剂包括检测SKIV2L基因位点rs429608 G→A变异、位点rs2075702 T→C变异、RDBP基因位点rs760070变异T→C、位点rs3880457 T→C变异或/和位点rs9501161 G→A变异的试剂；还包括任选的用于扩增包含SKIV2L基因位点rs429608、位点rs2075702、RDBP基因位点rs760070、位点rs3880457或/和位点rs9501161的基因片段的试剂。

其中，所述检测SKIV2L基因位点rs429608 G→A变异、位点rs2075702 T→C变异、RDBP基因位点rs760070变异T→C、位点rs3880457 T→C变异或/和位点rs9501161 G→A变异的试剂为Snapshot试剂。

其中，所述检测SKIV2L基因位点rs429608 G→A变异、位点rs2075702 T→C变异、RDBP基因位点rs760070变异T→C、位点rs3880457 T→C变异或/和位点rs9501161 G→A变异的试剂为测序用试剂。

其中，所述检测SKIV2L基因位点rs429608 G→A变异、位点rs2075702 T→C变异、RDBP基因位点rs760070变异T→C、位点rs3880457 T→C变异或/和位点rs9501161 G→A变异的试剂限制性片段长度多态性分析用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。

本发明首次阐明了SKIV2L基因位点rs429608变异、位点rs2075702变异、RDBP基因位点rs760070变异、位点rs3880457变异或/和位点rs9501161变异是老年黄斑变性疾病的保护型变异，前述变异可以有效降低老年黄斑变性疾病的患病几率。使用本发明提供的试剂盒，可以有效筛查待检人群的对老年黄斑变性疾病的抗性，评估待检人群患老年黄斑疾病的可能性，应用前景良好。

本发明的测定方法测定来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等，通过提取和纯化这些样品均可制备基因组DNA。

染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点，SNP在人群中大多只有两种等位型，故亦称为双等位标记，其检测是一种“+/﹣”或“全/无”的检测方式。SNP的检测方法多种多样，可分为测序法、杂交法、溶解法、电泳法、化学法、酶学法、物理法以及它们的组合方法，这些方法均是检测核苷酸变异的常规实验手段。本发明公开了SKIV2L基因位点rs429608变异、位点rs2075702变异、RDBP基因位点rs760070变异、位点rs3880457变异或/和位点rs9501161变异的碱基类型，且SKIV2L基因和RDBP基因的序列已知，用现有检测核苷酸变异的方法均可以检测上述两个位点的多态性。

附图说明

图1 Snapshot检测SNP rs429608位点的基因分型图谱

图2 Snapshot检测SNP rs2075702位点的基因分型图谱

图3 Snapshot检测SNP rs760070位点的基因分型图谱

图4 Snapshot检测SNP rs3880457位点的基因分型图谱

图5 Snapshot检测SNP rs9501161位点的基因分型图谱

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

用于下列实施例中表示试剂均为市售品，其英文缩写如下。

需要时，用高压锅(120℃，20分钟)灭菌

EDTA：乙二胺四乙酸二钠

SDS：十二烷基硫酸钠

TE：10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA(pH8.0)

dNTP：脱氧核苷三磷酸

实施例1样本收集和基因组DNA的提取

样本是由四川省医学科学院·四川省人民医院人类疾病基因研究四川省重点实验室承担的国家自然科学基金课题(课题号：30771220，81170882)收集的病例。共计收集老年黄斑变性患者370例，平均年龄68.7±10.9岁，其中男性占199例占53.8％，对照632例，平均年龄69.4±9.2岁，其中男性326例占51.6％。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了伦理委员会批准。

根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA。在抗凝剂EDTA存在下，将收集的5ml人外周血在3000rpm离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在3000rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mM Tris-HCl(pH8.0)和10mMEDTA(4m1)，以悬浮该沉淀物。将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16μl和20μl，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37℃过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟，除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加l/10，3M NaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA。最后将所得的基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率，DNA工作液浓度校正至50ng/μl，置-20℃冰箱保存。

实施例2包含rs429608、rs2075702、rs760070、rs3880457以及rs9501161单核苷酸多态性DNA片段的PCR扩增和基因型分析

本发明采用Snapshot基因分型技术对rs429608、rs2075702、rs760070、rs3880457以及rs9501161五个位点进行检测。采用基因扩增试剂及Snapshot引物A-E分别按照下述方法进行分型。

实验步骤如下：

1、PCR：95℃变性5分钟；95℃30秒、55℃退火30秒、72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟，4℃保温。

2、纯化1：PCR产物各取1-3μl(根据需混合的PCR个数而定，总量为9μl，加入混合液3μl(SAP 2μl,1：10 Exol酶1μl)。1：10 Exol酶的配制：1体积Exol酶，1体积SAP 10Xbuffer,8体积ddH₂O。程序：37℃1h,75℃15min。

3、Snapshot反应：Snapshot MULTIPLEX 1μl,purified PCR mix 1μl,Snapshot引物每个为0.2μl，DDH₂O补足5μl。程序：96℃1分钟,96℃10秒,50℃5秒,60℃30秒,cycle to step 2 for 25 more times,12℃保温。

4、纯化2：每个反应加SAP 0.5-1.0μl，程序：37℃1小时,75℃15分钟，4℃保温。

5、1μl上述产物加9μl HD。程序：95℃，5分钟，迅速置冰上，冷却后上机检测。

PCR引物对A(rs429608)：

F:5’-GTAAGGGCAGTTTGGGTGAA-3’

R:5’-GAGCCACTGTACAGCATGGA-3’

PCR引物对B(rs2075702)：

F:5’-GCTGAGATGTGTCGCTCACT-3’

R:5’-GACTCAGGACCTCCCATCAC-3’

PCR引物对C(rs760070)：

F:5’-TGGATGTCTGCAAAAACCAG-3’

R:5’-CTGGATTCCTTGTGCCTCAT-3’

PCR引物对D(rs3880457)：

F:5’-ATGAGGCACAAGGAATCCAG-3’

R:5’-GGTTGGCACAAAGGAGCTAA-3’

PCR引物对E(rs9501161)：

F:5’-CCATCCCTTAGGGCAACATA-3’

R:5’-ACACAGCCACAGCAACAGAG-3’

所得到的扩增序列如下：

序列1(rs429608)429bp：

GTAAGGGCAGTTTGGGTGAAgaagaggagcacctgagcttctggggcatgcttccacgagggctccatgtgggagaggaagtgcgggccatgagtctgcggagggactggctaacttcatgctctcttcccagcaccatctacacttcgcccatcaaggccctgagcaaccagaagttccgggacttccgaaacacattcggggatgtggggctgctcaccggggatgtacagctgcatccggaggcctcctgcctcatcatgaccacagagatccttcggtgagagatggacactcaatacaggggagttttggctgggaagatgtggccgttgtggagagtgtgctgtctgaggagggggtggagacgagccactggG/AgagtcaatccttggcctcttctccccagcTCCATGCTGTACAGTGGCTC

序列2(rs2075702)339bp：

GCTGAGATGTGTCGCTCACTgcggggggcagcccgcctggtaggagagcctgtgctgggtgccaagatggagacagcggctaccttgctacggcgggacatcgtatttgcggccagcctctacacccagtgaatgccccatgtaaaaacaT/CgatgataaaacagcaaagcactgttgtgtgcttgagttgctggacagggatgactcagctaagaagacagcgagagaacctcttagaaatatgcttttattatctgcacacagagatatgactgcctccctctaaagcattactatttgggagagggagtcttgggggGTGATGGGAGGTCCTGAGTC

序列3(rs760070)392bp：

TGGATGTCTGCAAAAACCAGaagcggcaaaagcaggtacctgctcacgcccgagactttcacatcaacctctttcaagtgctgccctggctgaaggagaaactccaagatgaggatttgggttttctataaggggtttcctgctggacaggggcgtgggattgaattaaaacagctgcgacaacacctgtgttccagatccttttggggcaagggagtggggaacaggcactggccatgttgttacactgagatcaaacctgacagccgtttttaaaggT/CttaaccccaatcccaagtgctgaaaaaccagaggctgagggagatgtgtaagcttccacctcagtgttttactgagaccagcattggggcatATGAGGCACAAGGAATCCAG

序列4(rs3880457)296bp：

ATGAGGCACAAGGAATCCAGctctgttccctagaagccatccacaaggttttccttgtagacgtcatcactgtagacaatctgggtcctcttgtcccggtggcaacccttagggctgttctggacagctagggagggaggagaggaacagttaaggtctaaaggagatcaT/CagaacagaccctgaggctgactcctgaccacctcactcctggccactggcccctggaagcccagtttccacgctgccctctggtggccaggatggcctgtcttccTTAGCTCCTTTGTGCCAACC

序列5(rs9501161)356bp：

CCATCCCTTAGGGCAACATAttccaagagctccaatccaaggtggattagaaccacagaatttgtaaaatggagaattcaggagtcgtctaG/AttttttcattttatacatgagaggtgaaactcagaatggtacagcaatttgccagtgcttgagtatgcatatttttccccaaacccatctacattccaacttggagggatgccctttaaacaatctttctgcttgtgctcacctttaacttcccctcaagggttcgagaacgcttgaagcctgagttcttggtctcagccttgatggcactgatggctcctgacttcaccagctgctttgcctgCTCTGTTGCTGTGGCTGTGT

Snapshot引物A(rs429608)：

5’-

AGCCACTGTACAGCATGGAGCTGGGGAGAAGAGGCCAAGGATTGACTC-3’

Snapshot引物B(rs2075702)：

5’-TCTACACCCAGTGAATGCCCCATGTAAAAACA-3’

Snapshot引物C(rs760070)：

5’-CTGACAGCCGTTTTTAAAGG-3’

Snapshot引物D(rs3880457)：

5’-TCAGCCTCAGGGTCTGTTCT-3’

Snapshot引物E(rs9501161)：

5’-ACCACAGAATTTGTAAAATGGAGAATTCAGGAGTCGTCTA-3’

图1～图5为Snapshot检测rs429608、rs2075702、rs760070、rs3880457以及rs9501161的基因型图。

实施例3 SNP位点与老年黄斑变性疾病的相关性

统计方法：利用SPSS13.0软件进行分析，检验Hardy-Weinberg平衡检测，数量变量采用t检验，质量变量采用卡方检验。双侧P<0.05认为统计学的差异显著。结果如下：

1)病例和对照的基本信息

2)SNP位点多态性与老年黄斑变性密切相关

rs429608：

在未考虑老年黄斑变性传统危险因子的情况下，A等位基因可提高老年黄斑变性疾病的抗性，使老年黄斑变性的危险性显著降低(OR＝0.51，95％CI＝0.35-0.75)，老年黄斑变性患病风险降低49％。见图1。

rs2075702：

在未考虑老年黄斑变性传统危险因子的情况下，C等位基因可提高老年黄斑变性疾病的抗性，使老年黄斑变性的危险性显著降低(OR＝0.51，95％CI＝0.27-0.95)，老年黄斑变性患病风险降低49％。见图2。

rs760070：

在未考虑老年黄斑变性传统危险因子的情况下，C等位基因可提高老年黄斑变性疾病的抗性，使老年黄斑变性的危险性显著降低(OR＝0.56，95％CI＝0.34-0.92)，老年黄斑变性患病风险降低44％。见图3。

rs3880457：

在未考虑老年黄斑变性传统危险因子的情况下，C等位基因可提高老年黄斑变性疾病的抗性，使老年黄斑变性的危险性显著降低(OR＝0.52，95％CI＝0.28-0.96)，即老年黄斑变性患病风险降低48％。见图4。

rs9501161：

在未考虑老年黄斑变性传统危险因子的情况下，A等位基因可提高老年黄斑变性疾病的抗性，使老年黄斑变性的危险性显著降低(OR＝0.56，95％CI＝0.34-0.90)，即老年黄斑变性患病风险降低44％。见图5。

实施例4检测试剂盒

本发明试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：

PCR扩增试剂(50人份)：

Sanpshot分型检测试剂(50人份)

标准DNA样品：

使用方法：

1)DNA提取

取患者全血(EDTA抗凝)2ml，提取其基因组DNA。

2)通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段

PCR扩增(20μl体系)：

反应条件：

PCR产物检测：

用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在后续反应中加入的量。

3)Sanpshot分型检测

第一步：PCR产物纯化(12μl体系)：

反应条件：

1、37℃酶切 1小时

2、75℃灭活 15分钟

3、4℃保存

第二步：单碱基引物延伸反应(5μl)：

反应条件：

第三步：纯化反应物：

反应体系：0.7μl血清碱性磷酸酶/孔

反应条件：37℃1小时，75℃15分钟，4℃保存。

第四步：ABI遗传分析仪读取结果：

反应体系：纯化产物1μl+HD 9μl

反应条件：95℃5分钟，迅速冰浴冷却

ABI PRISM 3130XL DNA Sequencer上机读取基因型结果。

本试剂盒用于：1、老年黄斑变性疾病抗性人群的早期诊断和分型参考；2、老年黄斑变性疾病抗性人群的基因检测和可能性评估。

1)本发明的检测方法可用于分析rs429608、rs2075702、rs760070、rs3880457以及rs9501161五个SNP位点的多态性，应用在老年黄斑变性的辅助性诊断和个体老年黄斑变性疾病抗性的评估中。

2)利用本发明阐述的老年黄斑变性抗性基因/位点的多态性，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节这些基因表达的活性分子，促进新药开发。

3)本发明建立的检测SNP位点多态性的核酸序列和老年黄斑变性相关基因/位点，可高灵敏度、特异性地应用于老年黄斑变性基因诊断用的试剂盒。

如上所述，得出结论，rs429608、rs2075702、rs760070、rs3880457以及rs9501161五个SNP位点的多态性与老年黄斑变性具有显著相关性。因此，根据本发明，测定其多态性可用于进行基因诊断。

综上，本发明通过检测rs429608、rs2075702、rs760070、rs3880457以及rs9501161五个SNP位点的变异，评估待检样本发生老年黄斑变性疾病的可能性，灵敏度高，只需要少量DNA样品就足以测定所述位点的变异，达到早期筛查的目的。

Claims

1.检测RDBP基因位点rs760070变异的相关试剂在制备老年黄斑变性疾病的筛查试剂中的用途；所述的试剂为检测RDBP基因位点rs760070 T→C变异的试剂。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测RDBP基因位点rs760070 T→C变异的试剂包括为扩增包含RDBP基因位点rs760070T→C变异的基因片段的试剂。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测RDBP基因位点rs760070 T→C变异的试剂为Snapshot试剂。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测RDBP基因位点rs760070 T→C变异的试剂为测序用试剂。