CN105331721A - 检测pd致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒 - Google Patents

检测pd致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒 Download PDF

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CN105331721A
CN105331721A CN201510850073.4A CN201510850073A CN105331721A CN 105331721 A CN105331721 A CN 105331721A CN 201510850073 A CN201510850073 A CN 201510850073A CN 105331721 A CN105331721 A CN 105331721A
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王培昌
张强
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本申请公开了一种检测PD致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒，所述检测方法包括：样本处理，DNA提取，PCR扩增，PCR产物电泳，PCR产物纯化，测序。所述引物序列如：SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示，所述试剂盒包括有上述引物。本发明的优点是：解决了现有技术中进行PD致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。

Description

检测PD致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒
技术领域
本发明属分子生物学技术领域，涉及检测PD致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒。
背景技术
PD(Parkinson’sdisease)基因，大量研究证明GBA和LRRK2基因突变可能增加患帕金森病的危险性，且在人群中的分布具有明显的种族差异性。GBA基因突变对PD发病潜在影响的研究已成为目前PD研究的热点。中国人群中最常见的GBA基因突变则是L444P，约占36％。LRRK2(富含亮氨酸重复序列激酶2)基因变异不仅能够导致晚发性家族型帕金森病的发生，而且与散发型帕金森病也存在显著相关，为常染色体显性遗传性PD致病基因。其变异具有种族的特异性，在LRRK2基因多态性中，G2385R和R1628P是二个东亚人群的特异性位点，未出现于其他种族。
现有的检测技术主要是基于单个突变位点的PCR和测序方法及单基因芯片方法，缺点主要在于仅仅能检测单个突变位点，不能对多个突变位点进行同时检测，也不能对分布于多个外显子的位点进行同时检测。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种检测PD致病基因突变的方法，其解决了现有技术中进行PD致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种检测PD致病基因突变的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加200μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加200μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2.5μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水25μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μl70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μlBigDye+1.5μlBigDyeSeqBuffer+3μl引物+1μlPCR纯化产物+3.5μlddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
5)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
6)延伸的条件，60℃4min；
7)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10ul反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
1)每管加入100μl100％酒精，或每管加入1μl125mMEDTA到管底，或每管加入1μl3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μl70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μlHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
6)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在PD基因突变位点两端设计三对特异性引物；
所述引物GBA-F的核苷酸序列为：
5'-AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3'，
所述引物GBA-R的核苷酸序列为：
5'-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3'，
所述LRRK2-F1引物的核苷酸序列为：
5'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'，
所述LRRK2-R1引物的核苷酸序列：
5'-AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3'；
所述LRRK2-F2引物的核苷酸序列为：
5'-AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3'，
所述LRRK2-R2引物的核苷酸序列：
5'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
本发明的另一目的在于提供一种检测PD致病基因突变的引物，其特征在于，所述引物序列包括：
SEQIDNO:15'-AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3'
SEQIDNO:25'-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3'
SEQIDNO:35'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'
SEQIDNO:45'-AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3'
SEQIDNO:55'-AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3'
SEQIDNO:65'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3'。
本发明的还一目的在于提供一种包括所述引物的检测PD致病基因突变的试剂盒。
本发明的有益效果为：
能对多个突变位点进行同时检测，也能对分布于多个外显子的位点进行同时检测，简单、快速、准确、有效的对强直性肌营养不良两种突变类型进行检测和临床诊断，利用多种特异性引物同时对患者可能存在的多个突变位点进行检测，使用该方法能保证95％以上的疾病检出率。其解决了现有技术中进行PD致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是本发明PD致病基因检测分析结果示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取200μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加200μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加200μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2.5μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水25μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
实施例2
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取200μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加200μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加200μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2.5μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水25μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700ulwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400ulwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30ul70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8ulBigDye+1.5ulBigDyeSeqBuffer+3ul引物+1ulPCR纯化产物+3.5ulddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
8)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
9)延伸的条件，60℃4min；
10)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10ul反应体系，96孔板，酒精法；
1)每管加入100μL100％酒精，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μL70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在PD基因突变位点两端设计三对特异性引物；
所述引物GBA-F的核苷酸序列为：
5'-AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3'，
所述引物GBA-R的核苷酸序列为：
5'-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3'，
所述LRRK2-F1引物的核苷酸序列为：
5'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'，
所述LRRK2-R1引物的核苷酸序列：
5'-AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3'；
所述LRRK2-F2引物的核苷酸序列为：
5'-AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3'，
所述LRRK2-R2引物的核苷酸序列：
5'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3'，
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性5min，94℃变性30sec，61℃退火30sec，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
所述引物GBA的扩增产物序列是：
AATTGGGTGCGTAACTTTGTCGACAGTCCCATCATTGTAGACATCACCAAGGACACGTTTTACAAACAGCCCATGTTCTACCACCTTGGCCACTTCAGGTGAGTGGAGGGCGGGCACCCCCATTCCATACCAGGCCTATCATCTCCTACATCGGATGGCTTACATCACTCTACACCACGAGGGAGCAGGAAGGTGTTCAGGGTGGAACCTCGGAAGAGGCACACCCATCCCCTTTTGCACCATGGAGGCAGGAAGTGACTAGGTAGCAACAGAAAACCCCAATGCCTGAGGCTGGACTGCGATGCAGAAAAGCAGGGTCAGTGCCCAGCAGCATGGCTCCAGGCCTAGAGAGCCAGGGCAGAGCCTCTGCAGGAGTTATGGGGTGGGTCCGTGGGTGGGTGACTTCTTAGATGAGGGTTTCATGGGAGGTACCCCGAGGGACTCTGACCATCTGTTCCCACATTCAGCAAGTTCATTCCTGAGGGCTCCCAGAGAGTGGGGCTGGTTGCCAGTCAGAAGAACGACCTGGACGCAGTGGCACTGATGCATCCCGATGGCTCTGCTGTTGTGGTCGTGCTAAACCGGTGAGGGCAATGGTGAGGTCTGGGAAGT
所述引物LRRK2-G2385R的扩增产物序列是：
TTGCTAAGCAAAATAGCCCTGTTGTGGAAGTGTGGGATAAGAAAACTGAAAAACTCTGTGGACTAATAGACTGCGTGCACTTTTTAAGGTAAATTCTGTGGTTTTTAATTTTATTCCCAAAAGAATTATCTTTGCACTTCATGTGTCACAGAGGAAGGATTTTTCTTCCTTTCTGCCTCTGAATAGAGAATTTTTTTAAAATGCAGAAAAAAATTTGTAATGCTTCTCAGCACCATCTT
所述引物LRRK2-R1628P的扩增产物序列是：
AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAGGTTGTCCAAAACACCCTAAGGGCATTATTTCGCGTAGAGATGTGGAAAAATTTCTTTCAAAAAAAAGGAAATTTCCAAAGAACTACATGTCACAGTATTTTAAGCTCCTAGAAAAATTCCAGATTGCTTTGCCAATAGGAGAAGAATATTTGCTGGTTCCAAGCAGGTAAAGAAAACCTTA
实施例3
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取200μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加200μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加200μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2.5μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水25μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μl70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μlBigDye+1.5μlBigDyeSeqBuffer+3μl引物+1μlPCR纯化产物+3.5μlddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
11)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
12)延伸的条件，60℃4min；
13)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10ul反应体系，96孔板，EDTA法；
1)每管加入1μl125mMEDTA到管底，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μl70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μlHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在PD基因突变位点两端设计三对特异性引物；
所述引物GBA-F的核苷酸序列为：
5'-AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3'，
所述引物GBA-R的核苷酸序列为：
5'-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3'，
所述LRRK2-F1引物的核苷酸序列为：
5'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'，
所述LRRK2-R1引物的核苷酸序列：
5'-AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3'；
所述LRRK2-F2引物的核苷酸序列为：
5'-AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3'，
所述LRRK2-R2引物的核苷酸序列：
5'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性5min，94℃变性30sec，61℃退火30sec，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
实施例4
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取200μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加200μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加200μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2.5μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水25μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μl70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μlBigDye+1.5μlBigDyeSeqBuffer+3μl引物+1μlPCR纯化产物+3.5μlddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
14)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
15)延伸的条件，60℃4min；
16)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10ul反应体系，96孔板，NaAc法；
1)每管加入1μl3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μl70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μlHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
7)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在PD基因突变位点两端设计三对特异性引物；
所述引物GBA-F的核苷酸序列为：
5'-AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3'，
所述引物GBA-R的核苷酸序列为：
5'-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3'，
所述LRRK2-F1引物的核苷酸序列为：
5'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'，
所述LRRK2-R1引物的核苷酸序列：
5'-AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3'；
所述LRRK2-F2引物的核苷酸序列为：
5'-AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3'，
所述LRRK2-R2引物的核苷酸序列：
5'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性5min，94℃变性30sec，61℃退火30sec，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
优选地，PCR缓冲液中各物质的浓度分别为10-40mMTriscl，50-200mM氯化钾(KCL)，0-5.0mM二硫苏糖醇(DTT)，0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)，0-2.0％(V/V)乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40，0-2.0％(V/V)吐温20(Tween20)，30-70％(v/v)甘油(glycerol)，稳定剂(stabilizer)：pH7.0-10.0(20℃)。优选浓度为20mMTriscl、100mMKCL、1mMDTT、0.1mMEDTA、0.5％(V/V)NonidetP-40、0.5％(V/V)Tween20、50％glycerol(v/v)，稳定剂，终pH值为9.0。DNA模板为用常规方法从患者抗凝全血中提取获得的DNA。GBA为葡萄糖脑甘酯酶基因；LRRK2为富含亮氨酸重复序列激酶2。
优选地，引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15～25个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。
优选地，引物设计遵循原则：第一，引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。第二，产物不能形成二级结构。第三，引物长度一般在15～30碱基之间。第四，G+C含量在40％～60％之间。第五，碱基要随机分布。第六，引物自身不能有连续4个碱基的互补。第七，引物之间不能有连续4个碱基的互补。第八，引物5′端可以修饰。第九，引物3′端不可修饰。第十，引物3′端要避开密码子的第3位。引物合成采用的方法为亚磷酰胺三酯法，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
优选地，试剂盒包括：1)序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物；2)PCR反应体系；3)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
优选地，所述引物的浓度为10μmol/L。
优选地，所述试剂盒由PremixTaqPCRMasterMIX缓冲液，模板DNA，PrimerU，PrimerL，灭菌蒸馏水组成，各组份反应时终浓度为：
优选地，所述PremixTaqPCRMasterMIX缓冲液包括Tris.cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁，-20℃下pH值在8.0-9.0之间。
应用实施例1
取抗凝全血30例，样品由首都医科大学宣武医院提供，提取DNA作为模板。使用仪器：ABIVeritiDxPCR仪器分析，用GBA-F和GBA-R,LRRK2-F1和LRRK2-R1,LRRK2-F2和LRRK2-R2引物对检测，PCR扩增。将扩增产物使用ABI3500DX进行测序分析，将测序结果与NCBIBLAST进行比对分析，结果显示，与报道的目的基因序列完全一致。如图1所示，为利用本发明提供的试剂盒对正常人GBA和LRRK2基因突变位点的检测结果,通过提取受试者全血DNA，对特异性引物进行PCR，并对PCR产物进行测序，将测序产物与Genebank检索的正常人序列进行比对，查看是否存在基因位点突变，从而判断该患者是否罹患该项疾病。
本发明设计特异性扩增引物通过PCR(聚合酶链反应)技术扩增包含GBA基因L444P目的位点，LRRK2基因rs34778348(G2385R)和rs33949390(R1628P)目的位点的特异性基因片段，并对此基因片段进行测序分析，进而确定其基因型。对不同基因型的人群预测PD发生的风险性。与现有影像学检测方法相比，本技术通过设计特异性引物进行PCR扩增保证了检测的特异性，对特异性片段进行测序保证了检测的准确性，并且能够在患者发病前预测疾病发生风险，达到早期诊断和预防的目的。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种检测PD致病基因突变的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取200μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加200μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；
2)加200μl无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1分钟；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；
6)12000rpm离心2分钟；
7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2.5μl；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μl；
上游引物PrimerU1μl；
下游引物PrimerL1μl；
DNA模板xμl；
灭菌蒸馏水25μl---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μl70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μlBigDye+1.5μlBigDyeSeqBuffer+3μl引物+1μlPCR纯化产物+3.5μlddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
2)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
3)延伸的条件，60℃4min；
4)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10μl反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
1)每管加入100μl100％酒精，或每管加入1μl125mMEDTA到管底，或每管加入1μl3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μl70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μlHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在PD基因突变位点两端设计三对特异性引物；
所述引物GBA-F的核苷酸序列为：
5'-AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3'，
所述引物GBA-R的核苷酸序列为：
5'-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3'，
所述LRRK2-F1引物的核苷酸序列为：
5'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'，
所述LRRK2-R1引物的核苷酸序列：
5'-AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3'；
所述LRRK2-F2引物的核苷酸序列为：
5'-AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3'，
所述LRRK2-R2引物的核苷酸序列：
5'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3'
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性5min，94℃变性30sec，61℃退火30sec，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
3.一种检测PD致病基因突变的引物，其特征在于，所述引物序列包括：
引物是GBA
SEQIDNO:15'-AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3'
SEQIDNO:25'-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3'；
引物是LRRK2-G2385R
SEQIDNO:35'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'
SEQIDNO:45'-AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3'；
引物是LRRK2-R1628P
SEQIDNO:55'-AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3'
SEQIDNO:65'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3'。
4.根据权利要求3所述的检测PD致病基因突变的引物，其特征在于，
所述引物GBA的扩增产物序列是：
AATTGGGTGCGTAACTTTGTCGACAGTCCCATCATTGTAGACATCACCAAGGACACGTTTTACAAACAGCCCATGTTCTACCACCTTGGCCACTTCAGGTGAGTGGAGGGCGGGCACCCCCATTCCATACCAGGCCTATCATCTCCTACATCGGATGGCTTACATCACTCTACACCACGAGGGAGCAGGAAGGTGTTCAGGGTGGAACCTCGGAAGAGGCACACCCATCCCCTTTTGCACCATGGAGGCAGGAAGTGACTAGGTAGCAACAGAAAACCCCAATGCCTGAGGCTGGACTGCGATGCAGAAAAGCAGGGTCAGTGCCCAGCAGCATGGCTCCAGGCCTAGAGAGCCAGGGCAGAGCCTCTGCAGGAGTTATGGGGTGGGTCCGTGGGTGGGTGACTTCTTAGATGAGGGTTTCATGGGAGGTACCCCGAGGGACTCTGACCATCTGTTCCCACATTCAGCAAGTTCATTCCTGAGGGCTCCCAGAGAGTGGGGCTGGTTGCCAGTCAGAAGAACGACCTGGACGCAGTGGCACTGATGCATCCCGATGGCTCTGCTGTTGTGGTCGTGCTAAACCGGTGAGGGCAATGGTGAGGTCTGGGAAGT
所述引物LRRK2-G2385R的扩增产物序列是：
TTGCTAAGCAAAATAGCCCTGTTGTGGAAGTGTGGGATAAGAAAACTGAAAAACTCTGTGGACTAATAGACTGCGTGCACTTTTTAAGGTAAATTCTGTGGTTTTTAATTTTATTCCCAAAAGAATTATCTTTGCACTTCATGTGTCACAGAGGAAGGATTTTTCTTCCTTTCTGCCTCTGAATAGAGAATTTTTTTAAAATGCAGAAAAAAATTTGTAATGCTTCTCAGCACCATCTT
所述引物LRRK2-R1628P的扩增产物序列是：
AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAGGTTGTCCAAAACACCCTAAGGGCATTATTTCGCGTAGAGATGTGGAAAAATTTCTTTCAAAAAAAAGGAAATTTCCAAAGAACTACATGTCACAGTATTTTAAGCTCCTAGAAAAATTCCAGATTGCTTTGCCAATAGGAGAAGAATATTTGCTGGTTCCAAGCAGGTAAAGAAAACCTTA。
5.一种检测PD致病基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有权利要求3所述的引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：1)序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物；2)PCR反应体系；3)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为10μmol/L。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由2×PowerTaqPCRMasterMixterMIXterMIX缓冲液，模板DNA，PrimerU，PrimerL，灭菌蒸馏水组成，各组份反应时终浓度为：
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述2×PowerTaqPCRMasterMixterMIXterMIX缓冲液包括Tris.cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁，-20℃下pH值在8.0-9.0之间。
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