CN105349662A - 检测sca致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒 - Google Patents
检测sca致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒 Download PDFInfo
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- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Abstract
本申请公开了一种检测SCA致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒，所述检测方法包括：样本处理，DNA提取，PCR扩增，PCR产物电泳，PCR产物纯化，测序。所述引物序列如：SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示，所述试剂盒包括有上述引物。本发明的优点是：解决了现有技术中进行SCA致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。
Description
技术领域
本发明属分子生物学技术领域，涉及检测SCA致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒。
背景技术
SCA(Spino-cerebellarataxias)是一种脊髓小脑共济失调疾病，现有的检测SCA的致病基因技术主要是基于单个突变位点的PCR和测序方法及单基因芯片方法，显著缺点主要在于仅仅能检测单个突变位点，不能对多个突变位点进行同时检测，也不能对分布于多个外显子的位点进行同时检测。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种检测SCA致病基因突变的方法，其解决了现有技术中进行SCA致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种检测SCA致病基因突变的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μL抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μLBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10min；
2)加220μL无水乙醇震荡混合约20sec；
3)12000rpm离心1min；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2min；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μLHBsolution，室温放置5min；
6)12000rpm离心2min；
7)加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μL70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2min，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μL；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μL；
上游引物PrimerU1μL；
下游引物PrimerL1μL；
DNA模板xμL；
灭菌蒸馏水20μL---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μLPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μL70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μLBigDye+1.5μLBigDyeSeqBuffer+3μL引物+1μLPCR纯化产物+3.5μLddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
5)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
6)延伸的条件，60℃4min；
7)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10μL反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
1)每管加入100μL100％酒精，或每管加入1μL125mMEDTA到管底，或每管加入1μL3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μL70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
6)测序纯化：使用ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在SCA基因突变位点两端设计三对特异性引物；
所述引物是SCA1、SCA2和SCA3；
所述引物SCA1的sense为：
5'ACCTTCCAGTTCATTGGGTC3'，
所述引物SCA1的antisense为：
5'GTGTGTGGGATCATCGTCTG3'，
所述引物SCA2的sense为：
5'CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT3'，
所述引物SCA2的antisense为：
5'CTGGACAGGCCTGACAATCCC3'，
所述引物SCA3的sense为：
5'TTCCTAAGATCAGCACTTCC3'，
所述引物SCA3的antisense为：
5'GATAAAGTGTGAAGGTAGCG3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
本发明的另一目的在于提供一种检测SCA致病基因突变的引物，其特征在于，所述引物序列包括：
SEQIDNO:15'ACCTTCCAGTTCATTGGGTC3'
SEQIDNO:25'GTGTGTGGGATCATCGTCTG3'
SEQIDNO:35'CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT3'
SEQIDNO:45'CTGGACAGGCCTGACAATCCC3'
SEQIDNO:55'TTCCTAAGATCAGCACTTCC3'
SEQIDNO:65'GATAAAGTGTGAAGGTAGCG3'。
本发明的还一目的在于提供一种包含所述引物的检测SCA致病基因突变的试剂盒。
本发明的有益效果为：
能对多个突变位点进行同时检测，也能对分布于多个外显子的位点进行同时检测，简单、快速、准确、有效的对脊髓小脑共济失调疾病进行检测和临床诊断，利用多种特异性引物同时对患者可能存在的多个突变位点进行检测，使用该方法能保证95％以上的疾病检出率。其解决了现有技术中进行SCA致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例1中SCA1～3电泳结果示意图。
图2是本发明应用实施例1中正常人SCA1突变位点基因序列测序的示意图。
图3是本发明应用实施例1中正常人SCA2突变位点基因序列测序的示意图。
图4是本发明应用实施例1中正常人SCA3突变位点基因序列测序的示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
样本处理：体检无相关SCA疾病病史的人外周血2ml(样品由首都医科大学宣武医院提供)于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μL抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μLBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10min；
2)加220μL无水乙醇震荡混合约20sec；
3)12000rpm离心1min；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2min；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μLHBsolution，室温放置5min；
6)12000rpm离心2min；
7)加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μL70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2min，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μL；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μL；
上游引物PrimerU1μ1；
下游引物PrimerL1μL；
DNA模板xμL；
灭菌蒸馏水20μL---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
检测SCA1～3电泳结果如图1所示。
实施例2
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μL抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μLBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10min；
2)加220μL无水乙醇震荡混合约20sec；
3)12000rpm离心1min；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2min；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μLHBsolution，室温放置5min；
6)12000rpm离心2min；
7)加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μL70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2min，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μL；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μL；
上游引物PrimerU1μL；
下游引物PrimerL1μL；
DNA模板xμL；
灭菌蒸馏水20μL---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μLPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μL70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μLBigDye+1.5μLBigDyeSeqBuffer+3μL引物+1μLPCR纯化产物+3.5μLddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
8)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
9)延伸的条件，60℃4min；
10)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10μL反应体系，96孔板，酒精法；
1)每管加入100μL100％酒精，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μL70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
7)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在SCA基因突变位点两端设计三对特异性引物；
所述引物是SCA1、SCA2和SCA3；
所述引物SCA1的sense为：
5'ACCTTCCAGTTCATTGGGTC3'，
所述引物SCA1的antisense为：
5'GTGTGTGGGATCATCGTCTG3'，
所述引物SCA2的sense为：
5'CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT3'，
所述引物SCA2的antisense为：
5'CTGGACAGGCCTGACAATCCC3'，
所述引物SCA3的sense为：
5'TTCCTAAGATCAGCACTTCC3'，
所述引物SCA3的antisense为：
5'GATAAAGTGTGAAGGTAGCG3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
所述引物SCA1的扩增产物序列是：
AGCCAGACGCCGGGACACAAGGCTGAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCATCAGCATCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCACCTCAGCAGGGCTCCGGGGCTCATCACCCCGGGGTCCCCCCCACCAGCCCAGCAGAACCAGTAC
所述引物SCA2的扩增产物序列是：
ATGTCGCTGAAGCCCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCCGCCGCCCGCGGCTGCCAATGTCCGCAAGCCCGGCGGCAGCGGCCTTCTAGCGTCGCCCGCCG
所述引物SCA3的扩增产物序列是：
TGAAACAATGTATTTTCCTTATGAATAGTTTTTCTCATGGTGTATTTATTCTTTTAAGTTTTGTTTTTTAAATATACTTCACTTTTGAATGTTTCAGACAGCAGCAAAAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCGGGACCTATCAGGACAGAGT
实施例3
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μL抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μLBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10min；
2)加220μL无水乙醇震荡混合约20sec；
3)12000rpm离心1min；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2min；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μLHBsolution，室温放置5min；
6)12000rpm离心2min；
7)加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μL70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2min，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μL；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μL；
上游引物PrimerU1μL；
下游引物PrimerL1μL；
DNA模板xμL；
灭菌蒸馏水20μL---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μLPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μL70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μLBigDye+1.5μLBigDyeSeqBuffer+3μL引物+1μLPCR纯化产物+3.5μLddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
11)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
12)延伸的条件，60℃4min；
13)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10μL反应体系，96孔板，EDTA法；
1)每管加入1μL125mMEDTA到管底，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μL70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
8)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在SCA基因突变位点两端设计三对特异性引物；
所述引物是SCA1、SCA2和SCA3；
所述引物SCA1的sense为：
5'ACCTTCCAGTTCATTGGGTC3'，
所述引物SCA1的antisense为：
5'GTGTGTGGGATCATCGTCTG3'，
所述引物SCA2的sense为：
5'CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT3'，
所述引物SCA2的antisense为：
5'CTGGACAGGCCTGACAATCCC3'，
所述引物SCA3的sense为：
5'TTCCTAAGATCAGCACTTCC3'，
所述引物SCA3的antisense为：
5'GATAAAGTGTGAAGGTAGCG3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
实施例4
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μL抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μLBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10min；
2)加220μL无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1min；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2min；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μLHBsolution，室温放置5min；
6)12000rpm离心2min；
7)加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μL70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2min，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μL；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μL；
上游引物PrimerU1μL；
下游引物PrimerL1μL；
DNA模板xμL；
灭菌蒸馏水20μL---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μLPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μL70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μLBigDye+1.5μLBigDyeSeqBuffer+3μL引物+1μLPCR纯化产物+3.5μLddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
14)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
15)延伸的条件，60℃4min；
16)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10μL反应体系，96孔板，NaAc法；
1)每管加入1μL3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μL70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
9)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在SCA基因突变位点两端设计三对特异性引物；
所述引物是SCA1、SCA2和SCA3；
所述引物SCA1的sense为：
5'ACCTTCCAGTTCATTGGGTC3'，
所述引物SCA1的antisense为：
5'GTGTGTGGGATCATCGTCTG3'，
所述引物SCA2的sense为：
5'CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT3'，
所述引物SCA2的antisense为：
5'CTGGACAGGCCTGACAATCCC3'，
所述引物SCA3的sense为：
5'TTCCTAAGATCAGCACTTCC3'，
所述引物SCA3的antisense为：
5'GATAAAGTGTGAAGGTAGCG3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
优选地，PCR缓冲液中各物质的浓度分别为10-40mMTriscl，50-200mM氯化钾(KCL)，0-5.0mM二硫苏糖醇(DTT)，0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)，0-2.0％(V/V)乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40，0-2.0％(V/V)吐温20(Tween20)，30-70％(v/v)甘油(glycerol)，稳定剂(stabilizer)：pH7.0-10.0(20℃)。优选浓度为20mMTriscl、100mMKCL、1mMDTT、0.1mMEDTA、0.5％(V/V)NonidetP-40、0.5％(V/V)Tween20、50％glycerol(v/v)，稳定剂，终pH值为9.0。DNA模板为用常规方法从患者抗凝全血中提取获得的DNA。
优选地，引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15～25个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。
优选地，引物设计遵循原则：第一，引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。第二，产物不能形成二级结构。第三，引物长度一般在15～30碱基之间。第四，G+C含量在40％～60％之间。第五，碱基要随机分布。第六，引物自身不能有连续4个碱基的互补。第七，引物之间不能有连续4个碱基的互补。第八，引物5′端可以修饰。第九，引物3′端不可修饰。第十，引物3′端要避开密码子的第3位。引物合成采用的方法为亚磷酰胺三酯法，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
优选地，试剂盒包括：1)序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物；2)PCR反应体系；3)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
优选地，所述引物的浓度为10μmol/L。
优选地，所述试剂盒由PremixTaqPCRMasterMIX缓冲液，模板DNA，PrimerU，PrimerL，灭菌蒸馏水组成，各组份反应时终浓度为：
优选地，所述PremixTaqPCRMasterMIX缓冲液包括Tris.cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁，-20℃下pH值在8.0-9.0之间。
应用实施例1
取抗凝全血30例，样品由首都医科大学宣武医院提供，提取DNA作为模板。使用仪器：ABIVeritiDxPCR仪器分析，用SCA1,SCA2和SCA3引物对检测，PCR扩增。将扩增产物使用ABI3500DX进行测序分析，将测序结果与NCBIBLAST进行比对分析，结果显示，与报道的目的基因序列完全一致。
通过提取受试者全血DNA，通过特异性引物进行PCR，并对PCR产物进行测序，将测序产物与Genebank检索的正常人序列进行比对，查看是否存在基因位点突变，从而判断该患者是否罹患该项疾病。
图2为本发明提供方法对正常人SCA1突变位点基因序列测序的示意图,SCA患者会有更多的CAG重复序列，正常人为17～36个重复序列，患者为43～91个。同时扩增产物长度较正常人长30～130bp。
图3为本发明提供方法对正常人SCA2突变位点基因序列测序的示意图,显示为正常人序列，SCA患者会有更多的CAG重复序列，正常人为17～29个重复序列，患者为37～50个。同时扩增产物长度较正常人长20～100bp。
图4为本发明提供方法对正常人SCA3突变位点基因序列测序的示意图,此处显示为正常人序列，SCA患者会有更多的CAG重复序列，正常人为13～36个重复序列，患者为61～79个。同时扩增产物长度较正常人长100～150bp。
应用实施例2
1.样本来源：
健康对照(外周静脉血)30例：来自于首都医科大学宣武医院健康体检受试者，体检无相关SCA疾病病史。
SCA患者(外周静脉血)30例：其中，10例为SCA1突变,10例为SCA2突变，10例为SCA3突变(上述病例由临床表现并结合高通量测序确诊)，均由首都医科大学宣武医院提供。
2.样本的处理和标记：
将上述组织标本(外周血)用Qiagen公司DNA抽提试剂盒提取线粒体DNA，编号备用。
样本的PCR扩增和标记处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μL抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μLBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10min；
2)加220μL无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1min；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2min；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μLHBsolution，室温放置5min；
6)12000rpm离心2min；
7)加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μL70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2min，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μL；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dNTPmix2μL；
上游引物PrimerU1μ1；
下游引物PrimerL1μL；
DNA模板xμL；
灭菌蒸馏水20μL---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μLPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入700μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μL70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μLBigDye+1.5μLBigDyeSeqBuffer+3μL引物+1μLPCR纯化产物+3.5μLddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
17)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
18)延伸的条件，60℃4min；
19)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10μL反应体系，96孔板，酒精法；
1)每管加入100μL100％酒精，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μL70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
10)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在SCA基因突变位点两端设计三对特异性引物；
所述引物是SCA1、SCA2和SCA3；
所述引物SCA1的sense为：
5'ACCTTCCAGTTCATTGGGTC3'，
所述引物SCA1的antisense为：
5'GTGTGTGGGATCATCGTCTG3'，
所述引物SCA2的sense为：
5'CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT3'，
所述引物SCA2的antisense为：
5'CTGGACAGGCCTGACAATCCC3'，
所述引物SCA3的sense为：
5'TTCCTAAGATCAGCACTTCC3'，
所述引物SCA3的antisense为：
5'GATAAAGTGTGAAGGTAGCG3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
所述PCR扩增的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
用实施例4提供的试剂盒按照上述方法分别对各样本按上述方法进行检测：30份健康对照受试者标本均未检出突变位点；10例含SCA1突变位点的患者相应突变位点检出率为100％，10例含SCA2突变位点的患者相应突变位点检出率为100％；10例含SCA3突变位点的患者相应突变位点检出率为100％(其中SCA1突变诊断比值＜0.3，SCA2突变突变诊断比值介于0.3和3之间，SCA2突变诊断比值介于0.3和3之间，正常位点诊断比值大于3)。试剂盒检测结果与理论结果符合率为100％。
本发明利用多条特异性引物同时对患者的多个可能的突变位点进行检测，使用该方法能保证95％以上的疾病检出率。克服了现有SCA引物，由于其设计年代较为久远，使用目前常用的反应体系和taq酶很难保证检测的特异性和准确性的显著缺点
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种检测SCA致病基因突变的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：
样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；
DNA提取，取220μL抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
1)加220μLBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10min；
2)加220μL无水乙醇震荡混合约20秒；
3)12000rpm离心1min；
4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2min；
5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μLHBsolution，室温放置5min；
6)12000rpm离心2min；
7)加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm离心2min；
9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μL70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2min，滤液即为模板DNA；
PCR扩增
PCR反应体系：
10×PCRBuffer2μL；
HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
dentmix2μL；
上游引物PrimerU1μ1；
下游引物PrimerL1μL；
DNA模板xμL；
灭菌蒸馏水20μL---上述总体积；
PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
PCR产物纯化
每管内加入100μLPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心
2min；
弃收集管内液体，加入700μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，加入400μLwashingbuffer，12000rpm离心2min；
弃收集管内液体，12000rpm离心2min；
柱内加入30μL70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；
测序反应
反应体系：0.8μLBigDye+1.5μLBigDyeSeqBuffer+3μL引物+
1μLPCR纯化产物+3.5μLddH2O；
测序PCR热循环条件：
1)变性的条件，96℃10sec；
2)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；
3)延伸的条件，60℃4min；
4)4℃保温；
每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
测序产物纯化
10μL反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
1)每管加入100μL100％酒精，或每管加入1μL125mMEDTA到管底，或每管加入1μL3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；
2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
3)每管加入100μL70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；
4)室温挥发净酒精，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA；
5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；
6)测序纯化：使用ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；
PCR检测，包括：
1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；
在SCA基因突变位点两端设计三对特异性引物；
所述引物是SCA1、SCA2和SCA3，
所述引物SCA1的sense为：
5'ACCTTCCAGTTCATTGGGTC3'，
所述引物SCA1的antisense为：
5'GTGTGTGGGATCATCGTCTG3'，
所述引物SCA2的sense为：
5'CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT3'，
所述引物SCA2的antisense为：
5'CTGGACAGGCCTGACAATCCC3'，
所述引物SCA3的sense为：
5'TTCCTAAGATCAGCACTTCC3'，
所述引物SCA3的antisense为：
5'GATAAAGTGTGAAGGTAGCG3'；
所述引物PCR扩增出目的片段模板；
所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；
2)25μL反应体系检测：
混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；
结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
2.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，最后于72℃延伸10min。
3.一种检测SCA致病基因突变的引物，其特征在于，所述引物序列包括：
引物是SCA1
SEQIDNO:15'ACCTTCCAGTTCATTGGGTC3'
SEQIDNO:25'GTGTGTGGGATCATCGTCTG3'；退火温度为62℃
引物是SCA2
SEQIDNO:35'CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT3'
SEQIDNO:45'CTGGACAGGCCTGACAATCCC3'；退火温度为58℃
引物是SCA3
SEQIDNO:55'TTCCTAAGATCAGCACTTCC3'
SEQIDNO:65'GATAAAGTGTGAAGGTAGCG3'；退火温度为58℃。
4.根据权利要求3所述的检测SCA致病基因突变的引物，其特征在于，
所述引物SCA1的扩增产物序列是：
AGCCAGACGCCGGGACACAAGGCTGAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCATCAGCATCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCACCTCAGCAGGGCTCCGGGGCTCATCACCCCGGGGTCCCCCCCACCAGCCCAGCAGAACCAGTAC
所述引物SCA2的扩增产物序列是：
ATGTCGCTGAAGCCCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCCGCCGCCCGCGGCTGCCAATGTCCGCAAGCCCGGCGGCAGCGGCCTTCTAGCGTCGCCCGCCG
所述引物SCA3的扩增产物序列是：
TGAAACAATGTATTTTCCTTATGAATAGTTTTTCTCATGGTGTATTTATTCTTTTAAGTTTTGTTTTTTAAATATACTTCACTTTTGAATGTTTCAGACAGCAGCAAAAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCGGGACCTATCAGGACAGAGT。
5.一种检测SCA致病基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有权利要求3所述的引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：1)序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物；2)PCR反应体系；3)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为10μmol/L。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由PremixTaqPCRMasterMIX缓冲液，模板DNA，PrimerU，PrimerL，灭菌蒸馏水组成，各组份反应时终浓度为：
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述PremixTaqPCRMasterMIX缓冲液包括Tris.cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁，-20℃下pH值在8.0-9.0之间。
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|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109321649A (zh) * | 2018-05-21 | 2019-02-12 | 上海迈浦生物科技有限公司 | Sca3基因cag重复序列动态突变的引物及检测方法 |
| CN111378653A (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-07 | 北京希望组生物科技有限公司 | Sca基因突变检测的引物、试剂盒及方法 |
| CN113046434A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-06-29 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 用于sca亚型基因检测的引物对、试剂盒及检测方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1251616A (zh) * | 1997-01-07 | 2000-04-26 | 研究发展基金会 | 大规模鉴定疾病基因型的方法和6型脊髓小脑共济失调的诊断试验 |
| CN101654711A (zh) * | 2009-09-04 | 2010-02-24 | 苏州大学 | 检测atxn3基因cag重复序列动态突变的引物及其pcr扩增方法 |
| CN102220337A (zh) * | 2010-09-19 | 2011-10-19 | 中南大学 | 一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因 |
-
2015
- 2015-11-27 CN CN201510849116.7A patent/CN105349662A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1251616A (zh) * | 1997-01-07 | 2000-04-26 | 研究发展基金会 | 大规模鉴定疾病基因型的方法和6型脊髓小脑共济失调的诊断试验 |
| CN101654711A (zh) * | 2009-09-04 | 2010-02-24 | 苏州大学 | 检测atxn3基因cag重复序列动态突变的引物及其pcr扩增方法 |
| CN102220337A (zh) * | 2010-09-19 | 2011-10-19 | 中南大学 | 一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 温玫等: "脊髓小脑共济失调1、2、3型的临床表现和基因分型", 《疑难病杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109321649A (zh) * | 2018-05-21 | 2019-02-12 | 上海迈浦生物科技有限公司 | Sca3基因cag重复序列动态突变的引物及检测方法 |
| CN111378653A (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-07 | 北京希望组生物科技有限公司 | Sca基因突变检测的引物、试剂盒及方法 |
| CN113046434A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-06-29 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 用于sca亚型基因检测的引物对、试剂盒及检测方法 |
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