CN107574233A - 用于检测egfr基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组，所述引物组包括扩增引物对、探针及PNA。本发明还提供一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，所述试剂盒包括含有扩增引物对和探针的第一套PCR反应体系及含有扩增引物对、探针和PNA的第二套PCR反应体系。本发明还提供一种检测方法，将待检DNA模板分别用第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系进行扩增，通过获得两套PCR反应体系的CT值及其差值定性判断EGFR基因19外显子缺失突变。本发明具有检测快速、操作简便、高灵敏、高通量的特点，可用于组织或血液临床标本的EGFR基因19外显子缺失突变的检测。

Description

用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及 方法

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，特别的，涉及一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

EGFR表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物，定位于细胞膜上。目前已经报道不下30种EGFR基因突变与药物反应性有关，但绝大部分是外显子19上的缺失突变。通过对患者EGFR基因的突变检测，可辅助临床医生筛选可受益于分子靶向抗肿瘤药物如易瑞沙、特罗凯和凯美纳等的肿瘤患者。

临床上大都采用病理组织标本提取DNA进行EGFR检测，但晚期肺癌病人有时无法获取肿瘤标本。血液(血浆)肿瘤基因突变检测方便在不同时间点获取样本，没有空间抽样偏差，已逐渐在临床上推广应用。近年来的研究还表明，癌症病人的血浆中能否检测到癌细胞逸出的突变DNA，以及分析血浆中肿瘤基因含量的变化，可以为肿瘤的疗效监测及预后提供重要的参考。

采用血浆检测EGFR基因突变检测的是来源于肿瘤组织的体细胞突变，不同于检测一般性的遗传突变；在血浆中存在大量野生型DNA。传统的测序法要求突变含量达到20％以上才能有效检出，因此不适合用于血浆EGFR基因突变检测。

《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》已于2015年发布，推荐采用突变基因特异扩增PCR法(ARMS法)用于血浆EGFR基因突变检测。研究表明，19外显子缺失型中以2种E746-A750del突变型(2235_2249del15和2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的70％左右，其它缺失型出现频率都较低。由于外显子19上存在大量缺失类型，而ARMS法要求对每种突变类型都设计特异性引物，不能对未知突变类型进行检测。目前商品化的ARMS法EGFR检测试剂盒最多只能检测19种19外显子缺失型。

肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)由丹麦科学家在1991年最先先成。PNA是具有类多肽骨架的DNA类似物，主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA/DNA杂交的TM值比DNA/DNA高15℃，但PNA与DNA若有单碱基错配，则结合能力很弱或不结合。PNA钳制PCR检测基因突变的原理是：通过设计一条涵盖突变位点的15-25bp长的PNA，其序列与野生型序列完全匹配，当PCR的模板为野生型时，PNA与其完全匹配，引物延伸受阻，扩增可受到强烈地抑制；而当PCR的模板为突变型时，PNA与其存在哪怕是一个碱基的错配，两者间的杂交能力急剧下降或完全消失，引物延伸不受影响，扩增可以正常进行。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法，针对EGFR基因的19号外显子区域，在缺失突变位置两端的保守区域设计一对PCR引物，在PCR上游引物3’端附近的保守区域设计一条探针；在缺失突变位置设计一条与EGFR野生型基因完全匹配的PNA序列，基于PNA钳制PCR检测基因突变的原理对肿瘤组织标本或血液(血浆)中提取的DNA进行检测，具有检测速度快、检测类型多及灵敏度高的优点。具体地：

本发明提供一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组，所述引物组包括扩增引物对、探针及PNA，其中：

所述扩增引物对序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述PNA序列为：

NH₂-5’-GATGTTGCTTCTCTTAATTCC-3’-COOH。

本发明同时提供一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，所述试剂盒包括两套PCR反应体系，第一套PCR反应体系包括针对EGFR基因19外显子野生型和缺失突变检测设计的扩增引物对及探针，其中：

所述扩增引物对序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述第一套PCR反应体系还包括2×PCRbuffer、DNA模板和去离子水；

第二套PCR反应体系包括针对EGFR基因19外显子缺失突变检测设计的扩增引物对、探针及PNA，其中：

所述扩增引物对序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述PNA序列为：

NH₂-5’-GATGTTGCTTCTCTTAATTCC-3’-COOH；

所述第二套PCR反应体系还包括2×PCRbuffer、DNA模板和去离子水。

在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述第一套PCR反应体系的成分终浓度为：1×PCR buffer、0.2μM正向引物、0.2μM反向引物、0.2μM探针和1μL DNA模板。

在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述第二套PCR反应体系的成分终浓度为：1×PCR buffer、0.2μM正向引物、0.2μM反向引物、0.2μM探针、2μM PNA和1μL DNA模板。

在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。

在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述阳性对照品为EGFR基因突变型质粒，所述阴性对照品为EGFR基因野生型质粒，所述空白对照品为无核酸酶水。

本发明同时提供一种检测EGFR基因19外显子缺失突变的方法，所述检测EGFR基因19外显子缺失突变的方法包括如下步骤：

步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板；

步骤二：提供如上文所述的试剂盒，取出适量第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系，将适量PCR模板分别与第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系分别混匀；

步骤三：两套PCR反应体系均进行PCR扩增反应：95℃预变性5min；45cycles，95℃15sec，58℃30sec；

步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品、阴性对照器和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到两套PCR反应体系的CT值及其差值定性判断EGFR基因19外显子缺失突变。

相较于现有技术，本发明提供的用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：本发明针对EGFR基因的19号外显子区域，在缺失突变位置两端的保守区域设计一对PCR引物，在PCR上游引物3’端附近的保守区域设计一条TAQMAN-MGB荧光检测探针；在缺失突变位置设计一条与EGFR野生型基因完全匹配的PNA序列，基于PNA钳制PCR检测基因突变的原理对肿瘤组织标本或血液(血浆)标本中提取的DNA进行检测，建立了检测EGFR基因19外显子缺失突变的实时PCR定量方法，该方法的灵敏度为1％～0.5％，最低可以在100倍的野生型基因背景下检测出低至1个拷贝的EGFR突变型基因，其灵敏度与ARMS法相当，但突变检测类型却多于ARMS法，可筛查出更多缺失突变，适用于高通量的样本检测，具有操作简单、检测快速及准确性高的特点。

附图说明

图1为梯度稀释的野生型质粒标准品用第一套PCR反应体系扩增的扩增曲线图；

图2为梯度稀释的野生型质粒标准品用第二套PCR反应体系扩增的扩增曲线图；

图3为梯度稀释的突变型质粒标准品用第一套PCR反应体系扩增的扩增曲线图；

图4为梯度稀释的突变型质粒标准品用第二套PCR反应体系扩增的扩增曲线图；

图5为不同突变比例的混合质粒用第二套PCR反应体系扩增的扩增曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：试剂盒的制备

一、扩增引物对、探针及PNA的设计与合成

肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)是一类以中性酰胺键(假肽键)代替DNA中的糖-磷酸二酯键作为骨架的脱氧核糖核酸类似物，保留其中的碱基部位。PNA的特殊结构，使之可以不被蛋白酶或者核酸酶降解，有很高的稳定性，是一种非离子、非手性、不易被水解和酶切的分子。PNA与DNA模板结合能力高于普通寡核苷酸，可作为阻遏物置于引物前面，并与PCR引物部分重合；若PNA与模板正确配对时可阻止聚合酶链反应，野生型模板无法扩增；若发生错配(例如模板为发生突变的DNA)，则结合能力迅速下降，失去阻遏作用，此时可用来扩增突变模板。

本发明针对EGFR基因的19号外显子区域，在缺失突变位置两端的保守区域设计一对PCR引物，在PCR上游引物3’端附近的保守区域设计一条探针；在缺失突变位置设计一条PNA，序列与EGFR野生型基因完全匹配。引物、探针和PNA序列由国内某专业公司合成。扩增引物对、探针及PNA序列，如表一所示：

表一、扩增引物对、探针及PNA序列

二、对照品选择

阳性对照品为1μL 10⁴拷贝数/μL EGFR基因突变型质粒，；

阴性对照品1μL 10⁴拷贝数/μL EGFR基因野生型质粒；

空白对照品为1μL无核酸酶水。

三、两套PCR反应体系组成

第一套PCR反应体系包括针对EGFR基因19外显子野生型和缺失突变检测设计的扩增引物对及探针，其中：

所述扩增引物对序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述第一套PCR反应体系还包括：2×PCRbuffer、DNA模板和去离子水。

第二套PCR反应体系系包括针对EGFR基因19外显子缺失突变检测设计的扩增引物对、探针及PNA，其中：

所述扩增引物对序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述PNA序列为：

NH₂-5’-GATGTTGCTTCTCTTAATTCC-3’-COOH；

所述第二套PCR反应体系还包括2×PCRbuffer、DNA模板和去离子水。

四、两套PCR反应体系配置

表二、第一套PCR反应体系(不含PNA)

原料名称	终浓度
		2×PCRbuffer	1×
上游引物	0.2μM
		下游引物	0.2μM
探针	0.2μM
		DNA模板	1μL
去离子水	适量
		总体积	25μL

表三、第二套PCR反应体系(含PNA)

原料名称	终浓度
		2×PCR buffer	1×
上游引物	0.2μM
		下游引物	0.2μM
探针	0.2μM
		PNA	2μM
DNA模板	1μL
		去离子水	适量
总体积	25μL

实施例2：利用上述试剂盒检测EGFR基因19外显子缺失突变的方法

一、提供待测样本DNA作为PCR模板：

从待测肿瘤患者的病理组织标本中或其血液(血浆)中提取DNA模板作为PCR模板。

二、提供本发明的试剂盒，取出第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系，并将所述第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系分别与适量所述模板混匀；

从试剂盒中取出所需数量PCR反应液连管(PCR管数＝2×(样本数+1个空白对照+1个阳性对照+1个阴性对照)。

第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系室温融解后，瞬时离心，揭开管盖。

从待测样本DNA(或对照品)中取1.0μL分别加至第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系。

振荡混匀后，瞬时离心10s，将其移至扩增区。

四、进行PCR扩增反应：95℃预变性5min；45cycles，95℃15sec，58℃30sec，采集荧光。

使用的PCR仪器为ABI 7500或杭州博日FQD-96A荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测系统，反应体系为25μL；

PCR反应条件如表四所示：

表四、PCR反应条件

五、PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品、阴性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到两套PCR反应体系的CT值及其差值定性判断EGFR基因19外显子缺失突变。

第一套PCR反应体系中未加入PNA，其CT值记为CT_-PNA，第二套PCR反应体系中加入PNA，其CT值记为CT_+PNA，CT_+PNA值和CT_-PNA值的差值ΔCT＝CT_+PNA-CT_-PNA。

1、质控标准：

阴性对照品的Ct_-PNA≤30，ΔCt﹥8或加有第二套PCR反应体系的反应管无扩增；

阳性对照品的Ct_-PNA和Ct_+PNA均≤30；

空白对照(无核酸酶水)的Ct_-PNA＞35或加有第一套PCR反应体系的反应管无扩增，Ct_+PNA＞40或加有第二套PCR反应体系的反应管无扩增。

以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效。

2、待测样本定性判断：

若Ct_-PNA＞30，说明DNA质量太低，需要重新提取DNA或更换样本；

若Ct_-PNA≤30，当ΔCt＞8或加有第二套PCR反应体系的反应管无扩增，判断EGFR基因19外显子突变阴性；当ΔCt≤8，判断EGFR基因19外显子突变阳性。

实施例3：分析加入PNA对不同浓度EGFR野生型质粒及EGFR突变型质粒扩增的影响

步骤一、EGFR基因野生型及其突变型质粒标准品的制备

EGFR野生型(SEQ ID NO:5)和突变型(SEQ ID NO:6)质粒由国内某专业生物公司合成。经紫外分光光度计定量，将EGFR野生型和突变型质粒模板分别倍比稀释为10⁴、10³、10²、10¹、10⁰拷贝数/μL。

步骤二、PCR扩增反应

应用实施例1配制的第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系分别对步骤一制备的不同浓度的野生型及突变型质粒标准品进行两次PCR扩增，其中；第一套PCR反应体系中未加入PNA的CT值记为CT_-PNA，第二套PCR反应体系中加入PNA的CT值记为CT_+PNA，ΔCT＝CT_+PNA-CT_-PNA；

扩增反应条件详见表五。

表五、扩增反应条件

步骤三、PCR结果分析

野生型质粒标准品用第一套PCR反应体系扩增的扩增曲线如图1所示，其中，图1中①至⑤依次为10⁴、10³、10²、10¹、10⁰的野生型质粒标准品的扩增曲线，⑥为空白对照(无核酸酶水)的扩增曲线；野生型质粒标准品用第二套PCR反应体系扩增的扩增曲线如图2所示，其中图2中①、②和③分别为10⁴、10³、10²野生型质粒标准品的扩增曲线，④为10¹和10⁰的野生型质粒标准品及其空白对照(无核酸酶水)的扩增曲线(无扩增)。突变型质粒标准品用第一套PCR反应体系扩增的扩增曲线如图3所示，其中，图3中①至⑤依次为10⁴、10³、10²、10¹、10⁰的突变型质粒标准品的扩增曲线，⑥为空白对照(无核酸酶水)的扩增曲线；突变型质粒标准品用第二套PCR反应体系扩增的扩增曲线如图4所示，其中，图4中①至⑤依次为10⁴、10³、10²、10¹、10⁰的突变型质粒标准品的扩增曲线，⑥为空白对照(无核酸酶水)的扩增曲线。结果表明，加入PNA的第二套PCR反应体系可以对EGFR野生型质粒的扩增产生强烈的抑制作用，导致ΔCt(Ct_+PNA-Ct_-PNA)＞9或者无Ct_+PNA显示；而加入PNA的第二套PCR反应体系对EGFR突变型质粒的扩增无明显抑制作用，因而ΔCt(Ct_+PNA-Ct_-PNA)＜1。

实施例4：灵敏度检测

按照实施例3的方法，区别在于，本实施例应用实施例1配制的第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系分别对突变型质粒和野生型质粒按一定比例混合得到的混合型质粒进行PCR扩增，具体地，将突变型质粒分别与10³野生型质粒以1∶10、1∶50、1∶100、1∶200的比例混合得到的四种混合质粒，扩增结果如图5所示，其中图5中①为10³的野生型质粒标准品的扩增曲线(不加PNA)，②至⑤依次为10³的野生型质粒标准品与突变型质粒以10∶1、50∶1、100∶1、200∶1比例混合的扩增曲线(加入PNA)，⑥为10³的野生型质粒标准品的扩增曲线(加入PNA)，⑦为空白对照(无核酸酶水)的扩增曲线。突变型与野生型质粒以1∶10突变比例混合时ΔCT＝3.5；1∶50比例混合时ΔCT＝6.2；1∶100比例混合时ΔCT＝7.1；1∶200比例混合时ΔCT＝8.1；而10³的纯野生型质粒ΔCT＝9.5，说明本方法的检测灵敏度可达1％～0.5％。

实施例5：本发明提供的方法与测序法的比较

一、DNA模板提取

从肿瘤医院搜集500例肺癌组织标本，采用组织DNA提取试剂盒完成DNA提取，具体提取如下：

1)取无菌的1.5mL EP管，加入250uL全血。

2)加750ul细胞裂解液，颠倒混匀5-6次，室温静置10min。

3)12000rpm离心1.5min；倒掉上部废液，收集管底沉淀。

4)依次加入20uL蛋白酶K、250uL裂解液ABL，涡旋振荡10s，65℃水浴15min，期间振荡混匀2-3次。

5)取出，加入250uL无水乙醇，涡旋振荡10s，短暂离心5s。

6)将吸附柱插入收集管中，将上一步所得混合液转移至吸附柱中；10,000rpm离心1min。

7)弃收集管中废液，将吸附柱重新放入收集管；加入500uL洗液I，10,000rpm，1min离心。

8)弃收集管中废液，加入700uL洗液II，10,000rpm，1min，离心。弃废液。(洗液II使用前需加入无水乙醇至80％)

9)重复步骤8一次。

10)弃流出液，将吸附柱插回收集管，空转离心，13,000rpm，2min。

11)将吸附柱插入到新的EP管中；加入30-100uL DNA溶解液(65℃预热可提高DNA获得率)，室温静置5min。

12)10,000rpm，1min，离心；弃吸附柱，EP管内液体即为DNA溶液。2-8℃保存，若需长期保存请置于-20℃或更低温度。

二、采用本发明实施例2提供的检测方法对500例标本DNA模板进行检测；

三、采用测序法对500例标本DNA模板进行检测；

1)EGFR基因19外显子测序用PCR扩增体系见表六:

表六、EGFR基因19外显子测序用PCR扩增体系

原料名称	终浓度
		2×PCR反应液	1×
上游引物(外围)	0.2μM
		下游引物(外围)	0.2μM
DNA	1μL
		去离子水	适量
总体积	50μL

其中：上游引物(外围)的序列为：

5’-TCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游引物(外围)的序列为：

5’-TTTAGGATGTGGAGATGAGC-3’(SEQ ID NO：8)。

2)PCR扩增程序：

95℃5min；(95℃10s，58℃20s，72℃30s)40个循环；72℃5min。

3)PCR扩增产物电泳及测序：PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确认后，交由专业测序公司完成测序。

四、结果与分析

统计测序法和本发明方法检测EGFR基因突变的效果，500例肺癌中基因测序突变型81例，经本发明方法检测全部为突变型；基因测序野生型419例，其中有5例经本发明方法检测为突变型，两种方法检测EGFR基因19外显子缺失突变的结果如表七所示。81例突变型中共出现15种缺失型，如表八所示，其中表八中最后6种为ARMS法所检测的19种突变型以外的缺失型，采用本发明方法可以全部有效检出。

表七、测序法与本发明方法检测肺癌EGFR基因19外显子缺失突变的比较

表八、500例肺癌EGFR基因19外显子测序所筛查到的缺失型种类及频次

本发明提供的用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：本发明针对EGFR基因的19号外显子区域，在缺失突变位置两端的保守区域设计一对PCR引物，在PCR上游引物3’端附近的保守区域设计一条TaqMan-MGB荧光检测探针；在缺失突变位置设计一条与EGFR野生型基因完全匹配的PNA序列，基于PNA钳制PCR检测基因突变的原理对肿瘤组织标本或血液(血浆)标本中提取的DNA进行检测，建立了检测EGFR基因19外显子缺失突变的实时PCR定量方法，该方法的灵敏度为1％～0.5％，最低可以在100倍的野生型基因背景下检测出低至1个拷贝的EGFR突变型基因，其灵敏度与ARMS法相当，但突变检测类型却多于ARMS法，可筛查出更多缺失突变，适用于高通量的样本检测，具有操作简单、检测快速及准确性高的特点。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 长沙三济生物科技有限公司

<120> 用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法

<130> 2017

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcccagaagg tgagaaagt 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggatttcctt gttggcttt 19

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attcccgtcg ctatc 15

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgttgctt ctcttaattc c 21

Claims (7)

1.一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括扩增引物对、探针及PNA，其中：

所述扩增引物对序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述PNA序列为：

NH₂-5’-GATGTTGCTTCTCTTAATTCC-3’-COOH。

2.一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两套PCR反应体系，第一套PCR反应体系包括针对EGFR基因19外显子野生型和缺失突变检测设计的扩增引物对及探针，其中：

所述扩增引物对序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述第一套PCR反应体系还包括2×PCRbuffer、DNA模板和去离子水；

第二套PCR反应体系包括针对EGFR基因19外显子缺失突变检测设计的扩增引物对、探针及PNA，其中：

所述扩增引物对序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述PNA序列为：

NH₂-5’-GATGTTGCTTCTCTTAATTCC-3’-COOH；

所述第二套PCR反应体系还包括2×PCRbuffer、DNA模板和去离子水。

3.根据权利要求2所述的用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述第一套PCR反应体系的成分终浓度为：1×PCR buffer、0.2μM正向引物、0.2μM反向引物、0.2μM探针和1μL DNA模板。

4.根据权利要求3所述的用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述第二套PCR反应体系的成分终浓度为：1×PCR buffer、0.2μM正向引物、0.2μM反向引物、0.2μM探针、2μM PNA和1μL DNA模板。

5.根据权利要求2至4任一项所述的用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。

6.根据权利要求5所述的用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为EGFR基因突变型质粒，所述阴性对照品为EGFR基因野生型质粒，所述空白对照品为无核酸酶水。

7.一种检测EGFR基因19外显子缺失突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板；

步骤二：提供如权利要求6所述的试剂盒，取出适量第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系，将适量PCR模板分别与第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系分别混匀；

步骤三：两套PCR反应体系均进行PCR扩增反应：95℃预变性5min；45cycles，95℃15sec，58℃30sec；

步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品、阴性对照器和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到两套PCR反应体系的CT值及其差值定性判断EGFR基因19外显子缺失突变。