CN110438206B

CN110438206B - 一组检测egfr基因19外显子缺失突变的引物、探针和试剂盒

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Publication number: CN110438206B
Application number: CN201910781849.XA
Authority: CN
Inventors: 虞闰六; 任绪义
Original assignee: Hangzhou D A Genetic Engineering Co ltd
Current assignee: Hangzhou D A Genetic Engineering Co ltd
Priority date: 2019-08-23
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2039-08-23
Also published as: CN110438206A

Abstract

本发明公开了一组用于检测EGFR基因19号外显子缺失(19‑Del)突变的核酸序列及试剂盒，属于分子诊断技术领域。本发明提供的检测EGFR基因19‑Del突变的引物、探针和试剂盒能高灵敏度和高特异性地检测临床NSCLC患者EGFR‑TKIs靶向用药常见53种(覆盖99％以上突变发生率)突变种类。本发明还公开了用于检测EGFR基因19‑Del突变的试剂盒，能实现1孔简便快速、灵敏、特异、准确的定量检测EGFR基因19‑Del的突变，可作为临床EGFR‑TKIs靶向用药的参考依据，并用于实时动态监测药物疗效。

Description

一组检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物、探针和试剂盒

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种用于EGFR基因19-Del突变检测的引物、探针和试剂盒。

背景技术

近年来，表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factorreceptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR—TKIs)等靶向药物已经成为晚期非小细胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma，NSCLC)重要的治疗方式之一。NCCN、ESMO和CSCO等国内外肿瘤诊疗和临床实践指南均推荐所有含有腺癌成分的NSCLC患者，必须进行EGFR基因突变检测，用以指导选择EGFR-TKI的靶向治疗。

大量临床研究发现，携带EGFR基因敏感性突变的非小细胞肺癌细胞患者，使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)如易瑞沙(吉非替尼)、特罗凯(厄洛替尼)，相比于标准的一线化疗方案，EGFR-TKI在无进展生存期(PFS)、生活质量以及耐受性方面都具有显著的优势。

EGFR基因编码受体酪氨酸激酶，属于表皮生长因子受体(HER/ErbB)家族成员之一。EGFR基因突变主要发生在18号到21号外显子激酶结构域，其靶向药物用药敏感性相关突变主要包括：19号外显子缺失突变，约占所有突变的45％，21号外显子L858R突变，约占所有突变的40％，此外还有18号外显子G719X突变、20号外显子S768I突变和21号外显子L861Q突变。

FDA和CFDA已经批准吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼用于携带EGFR基因19号外显子缺失或21号外显子Leu858Arg突变的转移性非小细胞肺癌患者的一线治疗。CFDA也已经批准埃克替尼用于携带EGFR敏感突变的晚期非小细胞肺癌患者的一线治疗。2018年FDA批准奥希替尼用于携带EGFR 19号外显子缺失或者Leu858Arg突变的转移性非小细胞肺癌的一线治疗。此外，对于难以获得肿瘤组织样本的患者，可以采用外周血ctDNA作为补充替代标本评估EGFR基因突变状态。

目前针对NSCLC患者靶向用药及伴随诊断中，临床需要灵敏度高、特异性强的检测技术以实现尽可能早期的精准诊断和治疗，以提高患者的生存率和治疗效果。目前已有部分研究者开发了多种方法用于一系列用于EGFR靶向药物敏感性和耐药突变的检测，用以指导靶向药物的用药。前期研究者开发的方法有扩增阻滞(ARMS)技术和高通量测序(NGS)技术，ARMS技术，其灵敏度一般也只有0.5-1％，检测位点和突变种类有限；而高通量测序(NGS)技术灵敏度也较低(约1％)，且检测流程长，操作复杂，结果分析困难，需要专业生信分析人员，仪器和试剂成本高，临床推广使用难度高。这两种技术对低频微量的治疗及用药相关突变无法灵敏地检出，将对靶向用药和耐药监测带来困难，均适宜检测组织样本，但当肿瘤组织样本难以获得时，需要用血浆样本进行检测，但肿瘤cfDNA含量极低的血浆样本的检测，需要用高灵敏度的数字PCR技术进行检测，可以获得高灵敏度和准确性的突变定量结果，用以指导靶向用药治疗和耐药检测。

针对EGFR基因主要的靶向药物敏感性突变位点19-Del，是一系列位于EGFR基因19外显子的短片段缺失突变，突变形式多样，共有超过60种突变形式，任一种缺失突变的出现即可作为指导靶向用药的依据。前期部分研究者已开发出多种基于ARMS、NGS和数字PCR技术的19-Del多重检测体系和方法，但其开发的体系和方法均有其局限性，基于NGS技术的方法检测突变种类较全，但灵敏度不足，操作复杂，难度高，成本高昂，无法满足临床；ARMS技术方法灵敏度也偏低，且检测的位点只有数种到20余种，有多种突变形式无法检测，造成漏检将对患者的用药带来严重后果，扩增阻滞法对临床样本上样量比较苛刻，必需稀释至一定浓度范围，上样量过多容易造成假阳性，过低则降低其灵敏度，造成漏检；ddPCR技术灵敏度高，定量准确，但目前的相关文献和专利中只能检测到10-30余种突变形式，覆盖60-95％的突变发生率，有超过1/3种类的突变，约5-15％的19-Del突变患者不能检出，无法避免部分漏检情况的发生。因此，现有的产品均无法有效满足目前临床NSCLC患者精准的个性化用药及伴随诊断的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一组效果优良，能囊括EGFR基因19-Del至少53种突变种类，覆盖99％以上19-Del突变发生率的引物、探针和试剂盒，且每一种不同突变都必须能有效、高灵敏度的被检出；操作简便、结果准确、成本低廉和高通量，能很好地满足临床NSCLC患者EGFR-TKIs靶向用药诊疗的需求，进一步提高和改善患者生存率和治疗质量。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

从开放的全球最大和最全面的肿瘤突变数据库COSMIC数据库(https://cancer.sanger.ac.uk/osmic)筛选19-Del突变发生率较高的突变种类，设计和合成针对常见突变类型的突变阳性质粒，设计各突变型特异扩增引物，进行多种突变类型筛选和多重引物设计和测试优化，最终得出一组用于检测EGFR基因19-Del突变的引物、探针，

包括如下引物对及探针：

(1)扩增EGFR基因19-Del突变型的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～33所示；

(2)扩增EGFR基因19-Del突变型的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示；

(3)扩增EGFR基因19-Del野生型的引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：35～36所示；

(4)扩增EGFR基因19-Del野生型的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：37所示；

其中，部分引物碱基前面的“+”号表示该碱基用锁核酸LNA代替普通的核苷酸；碱基“W”代表该碱基为简并碱基，具体为“A或T”；19-Del突变型基因探针SEQ ID NO：34序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团；19-Del野生型探针SEQ ID NO：37序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团；上述37条核酸序列在1孔检测中同时使用。

经过一系列的引物筛选和组合测试，保证所有突变种类均能有效，高灵敏的检出，特别是前期多重混合检测效果较差的几种突变相关引物：2，3,11,12,14,17,22，32号，均经过超过4轮的设计和优化，最终采用最优选的引物序列。

本发明还提供另一种技术方案，一种用于检测EGFR基因19-Del突变的试剂盒，主要包括如下试剂：

(1)2*supermix：该PCR反应液中含有热启动DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、dNTPmixture、甜菜碱和三(2-羧乙基)膦(TCEP)、BSA；

(2)突变型引物探针预混液(20*MUT)：将SEQ ID NO：1～34所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，探针的浓度为10μM，配制20*MUT预混液；

(3)野生型引物探针预混液(20*WT)：将SEQ ID NO：35～37所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，探针的浓度为10μM，配制20*WT预混液；

(4)阳性对照：经测序确认的包含19-Del突变型质粒与野生型基因组DNA(gDNA)的溶液，其中，突变型质粒的浓度为大于10拷贝/μL，gDNA浓度为大于100拷贝/μL。

(5)阴性对照：经测序确认的包含野生型gDNA的溶液，其中gDNA浓度大于100拷贝/μL。

作为优选，所述步骤(1)中热启动DNA聚合酶浓度0.02-0.04U/μL，Mg2+浓度7-8mM，dNTP mixture浓度500-1000μM，甜菜碱浓度0.5-1M，TCEP浓度0.5-1mM。

进一步地，所述步骤(2)中SEQ ID NO：22和25号引物的浓度为3-4μM，SEQ ID NO：1和32号引物的浓度为7-8μM，其余29条引物的浓度为1-2μM，SEQ ID NO：34号探针浓度4-6μM。

进一步地，所述步骤(3)中将SEQ ID NO：35～37所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为10-20μM，探针浓度4-6μM。

此外，提供一种基于数字PCR技术平台的19-Del突变的检测方法，适用于临床组织和血浆游离DNA样本的检测，包括以下步骤：

1)抽提组织DNA或血浆中的cfDNA；

2)用上述设计的试剂盒进行EGFR基因19-Del突变检测，包括PCRmix配制、微滴生成，微滴PCR扩增、微滴分析和结果判读；

所述微滴PCR扩增体系，优选的条件如下：2*supermix 10μL，20*MUT和20*WT各1μL，标本抽提模板DNA 8μL(或不超过50ng)，总体系20μL；所述PCR扩增条件为：95℃10min；40个循环(94℃30s，58℃60s)，98℃10min；4℃，hold。

所述的微滴分析和结果判读：将扩增完毕的PCR板放入微滴读取仪，对每一扩增完的样本进行微滴读取仪的荧光分析，在阴阳性对照结果正常的前提下，软件自动计算样本反应孔中19-Del突变型拷贝数(FAM通道，蓝色荧光)和野生型拷贝数(VIC通道，绿色荧光)，最终得出样本中EGFR基因19-Del突变的准确定量结果。

本发明的有益效果：

1)本发明通过权威公开数据库确定常见19-Del突变种类和突变发生率最高的53种突变种类，并针对这些突变种类，进行突变特异性上游引物设计，包括简并碱基设计，以及在靠近3’端的碱基采用LNA修饰核苷酸，可有效缩短引物长度同时保持高Tm值，增加不同突变种类的匹配程度，使用32条上游引物即可容纳所有53种突变类型，特异性进一步增强。

2)通过各突变类型的阳性质粒，测试所有突变引物的灵敏度和特异性，为了获得良好的检测效果，保证体系的灵敏度和特异性，不断筛选进而选出最优引物序列，通过不同特异引物的浓度梯度测试，使各突变类型检测灵敏度和特异性保持最优组合，有效保证检测体系灵敏度和特异性。

3)在通用的PCR扩增2*supermix中，针对多重检测体系的高特异性要求，优化了各组分配方，并且额外添加降低非特异性，提升扩增效率的组分，通过摸索不同浓度，获得最优配方缓冲试剂，且能非常好的兼容于数字PCR技术平台。

4)摒弃NGS技术平台和ARMS QPCR技术平台，采用具有最高灵敏度的数字PCR技术平台，根据不同突变类型检测效果不同，调整优化不同突变类型特异性引物的浓度，使所有突变类型检测灵敏度一致，且保证了良好的特异性；双通道同时检测且不影响结果准确性，突变型和野生型检测在同一孔中进行，有效降低了试剂和珍贵的微量DNA样本浪费，降低成本至原来的1/2以下，效果突出。

5)本发明采用的一孔检测常见EGFR基因19-Del突变种类的优选引物、探针和试剂盒，采用优化的检测程序，可有效检测常见19-Del突变种类和突变发生率最高的53种突变类型，覆盖99％以上的突变发生率(采用COSMIC数据库突变发生率统计数据)，尤其适用于血浆游离DNA样本检测，优化的体系使所有突变肿瘤检测灵敏度可达0.01％，特异性为100％，操作简单，检测快速，通量高，成本低廉，对技术员要求低，相比已有的检测技术和试剂，检测效果获得了突出的提升和改良，具有非常优秀的临床应用效果，非常适宜于临床各级医院的大规模推广应用。

附图说明

图1为19-Del阳性对照品检测结果图。其中Ch1通道为FAM通道，检测19-Del突变型拷贝数，横向直线为阈值线，500以上的阳性点之和即为19-Del突变型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测19-Del野生型拷贝数(即EGFR基因总拷贝数)，竖向直线为阈值线，2000以上的荧光点之和即为19-Del野生型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度。结果：19-Del突变拷贝数454；19-Del野生型拷贝数5460；突变比例8.3％。

图2为19-Del阴性对照品检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测19-Del突变型拷贝数，横向直线为阈值线，500以上的阳性点之和即为19-Del突变型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测19-Del野生型拷贝数(即EGFR基因总拷贝数)，竖向直线为阈值线，2000以上的荧光点之和即为19-Del野生型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度。结果：19-Del突变拷贝数0；19-Del野生型拷贝数5200；突变比例0％。

图3为阳性参考品1(19-Del1质粒和gDNA混合)高浓度检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测19-Del突变型拷贝数，横向直线为阈值线，500以上的阳性点之和即为19-Del突变型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测19-Del野生型拷贝数(即EGFR基因总拷贝数)，竖向直线为阈值线，2000以上的荧光点之和即为19-Del野生型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度。结果：19-Del突变拷贝数506；19-Del野生型拷贝数5080；突变比例9.96％。

图4为阳性参考品1(19-Del1质粒和gDNA混合)低浓度(近检测限)检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测19-Del突变型拷贝数，横向直线为阈值线，500以上的阳性点之和即为19-Del突变型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测19-Del野生型拷贝数(即EGFR基因总拷贝数)，竖向直线为阈值线，2000以上的荧光点之和即为19-Del野生型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度。结果：19-Del突变拷贝数1.6；19-Del野生型拷贝数5680；突变比例0.02％。

图5为阳性参考品2(19-Del2质粒和gDNA混合)高浓度检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测19-Del突变型拷贝数，横向直线为阈值线，500以上的阳性点之和即为19-Del突变型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测19-Del野生型拷贝数(即EGFR基因总拷贝数)，竖向直线为阈值线，2000以上的荧光点之和即为19-Del野生型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度。结果：19-Del突变拷贝数948；19-Del野生型拷贝数4520；突变比例20.97％。

图6为阳性参考品2(19-Del2质粒和gDNA混合)低浓度(近检测限)检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测19-Del突变型拷贝数，横向直线为阈值线，500以上的阳性点之和即为19-Del突变型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测19-Del野生型拷贝数(即EGFR基因总拷贝数)，竖向直线为阈值线，2000以上的荧光点之和即为19-Del野生型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度。结果：19-Del突变拷贝数1.2；19-Del野生型拷贝数5720；突变比例0.02％。

图7为一例临床血浆样本(18号)抽提cfDNA样本19-Del突变检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测19-Del突变型拷贝数，横向直线为阈值线，500以上的阳性点即为19-Del突变型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测19-Del野生型拷贝数(即EGFR基因总拷贝数)，竖向直线为阈值线，2000以上的荧光点之和即为19-Del野生型阳性微滴，计算机自动计算拷贝浓度。结果：19-Del突变拷贝数42；19-Del野生型拷贝数4900；突变比例0.86％。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制本发明。

实施例1：检测19-Del的引物和探针由百力格生物技术有限公司合成，如下表：

实施例2：合成用于测试各突变型引物的阳性突变质粒，可以用同一条特异上游引物扩增的突变类型则只需合成其中一种质粒，设计插入序列并由上海生工生物工程有限公司合成，共35个阳性质粒(pUC57克隆质粒+插入序列)，特异引物位置匹配常见53种突变类型，覆盖99％以上突变发生率，具体如下表：

/>

注：*突变对应ID号及突变发生率数据来源于全球最全面的公开肿瘤突变数据库(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)

实施例3：EGFR基因19-Del突变检测试剂盒的制备。

(1)2*supermix：该PCR反应液中含有热启动DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、dNTPmixture、甜菜碱和三(2-羧乙基)膦(TCEP)、BSA等。优选的，热启动DNA聚合酶浓度0.02-0.04U/μL，Mg2+浓度为7-8mM，dNTP mixture浓度为500-1000μM，甜菜碱浓度为0.5-1M，TCEP浓度0.5-1mM。-20℃保存。

(2)突变型引物探针预混液(20*MUT)：将SEQ ID NO：1～34所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，探针的浓度为10μM，配制20*MUT预混液；优选的，22和25号引物的浓度为3-4为μM，1和32号引物的浓度为7-8μM，其余29条引物的浓度为1-2μM，34号探针浓度为4-6μM，-20℃保存。

(3)野生型引物探针预混液(20*WT)：将SEQ ID NO：35～37所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，探针的浓度为10μM，配制20*WT预混液；优选的，引物的浓度为10-20μM，探针浓度为4-6μM，-20℃保存。

(3)阳性对照：经测序确认的包含19-Del突变型质粒与野生型基因组DNA(gDNA)的溶液，其中，突变型质粒的浓度为大于10拷贝/μL，gDNA浓度为大于100拷贝/μL。-20℃保存。

(4)阴性对照：经测序确认的包含野生型gDNA的溶液，其中gDNA浓度大于100拷贝/μL。-20℃保存。

实施例4：一种优化后检测效果优良的19-Del突变检测方法。

仪器：Eppendorf Mastercycler pro S定性PCR仪，Bio-rad QX200微滴式数字PCR系统(包括微滴生成仪、封膜仪、微滴读取仪)，BECKMAN22R台式微量冷冻离心机，WH-866型涡旋振荡器(太仓华利达)，低速板式离心机(安徽中佳)。

1.19-Del突变检测血浆样本cfDNA模板的制备：采用QIAGEN公司QIAampCirculating Nucleic Acid Kit(货号55114)，按照试剂盒说明书操作。

2.以步骤(1)得到的核酸为模板，利用实施例3所述试剂盒中20*MUT和20*WT进行EGFR基因19-Del突变的扩增检测，具体包括如下步骤；

(1)PCR反应液配制：从-20℃冰箱取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备用。加样前10分钟之内，按检测样本数配置PCR反应液XμL/孔：

X＝(10μLPCR反应液+2μL 20*引物探针预混合液)×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)。

振荡混匀后，10000rpm瞬时离心10s，按每人份12μL分装到八联PCR反应管中，传至样本制备区备用。

(2)加样：向分装好试剂的反应孔中，分别加入样本抽提DNA、阳性对照、阴性对照DNA模板8μL(若模板保存在-20℃，使用前置室温解冻，以10000rpm离心10s)，空白对照孔加入8μL双蒸水。盖上八联管盖，涡旋震荡，板式离心机2000rpm离心1min。

(3)微滴生成：将八联PCR管中的20μL PCR反应液转移至QX200微滴生成仪专用卡夹(Bio-rad公司，货号1864008)的样品行的8孔中，生成油行对应的8孔加入配套的微滴生成油70μL(Bio-rad公司，货号1863005)，放入微滴生成仪中，自动生成微滴于上方微滴行；

(4)PCR扩增：将生成的40μL微滴转移至96孔PCR反应板(Eppendorf公司，货号30128605)，封膜仪封铝膜，放入定性PCR仪中，反应条件如下：95℃10min；40个循环(94℃30s，58℃60s)，98℃10min；4℃，hold。扩增完成降至4℃时即可取出。

3.微滴读取仪进行结果分析，具体包括如下步骤：

(1)简单设置每个反应孔样本信息，开始运行，仪器会自动对每个孔的约20000个微滴进行荧光读取和分析，并自动计算浓度结果，也可手动微调：

检测合格标准：

阳性对照，19-Del突变型拷贝数大于80拷贝,野生型拷贝数大于800拷贝；阴性对照，19-Del突变型拷贝数为0，野生型基因拷贝数大于800拷贝；

样本结果：样本中19-Del突变比例的准确计算公式如下：

突变比例＝突变型拷贝数/野生型拷贝数

(2)如果样本中突变型或野生型浓度过高，导致测试孔中拷贝数超过100000，则需对样本进行稀释10倍，再进行检测。

实施例5：各突变型阳性质粒参考品和部分临床血浆样本检测

将本发明所述的检测试剂盒用于不同浓度各阳性参考品(含对应编号阳性突变质粒及gDNA)、阴性参考品(不同浓度gDNA)和部分临床患者样本的检测，方法参照实施例4，结果与目前在售灵敏度最高的的19-Del基因突变检测试剂盒(多重荧光定量PCR-ARMS法，可检测19种19-Del突变，不同突变类型灵敏度范围0.2-0.8％)检测结果进行比对，结果如下表：

/>

参考品检测结果显示，所有35个参考品(53种突变类型)的高低浓度样本均能用本发明的检测体系有效检出，且能准确定量，可有效指导临床靶向用药，监控药物疗效；阴性参考品检测效果良好，无任何假阳性微滴产生；比对试剂盒阴性参考品检测结果良好，但阳性参考品中只能检出对应18个参考品(对应该试剂检测范围19种突变类型)样本的高浓度样本，低浓度参考品因低于其检测限而无法检出，且只能判读阴阳性，无法获得定量结果，这对于靶向药物的用药指导和疗效监测非常不利。

临床血浆样本58例的检测结果显示，本发明检出19-Del突变阳性样本13例，阳性率22.4％；比对试剂盒检出19-Del突变阳性样本9例，阳性率15.5％；未检出的4例其中3例(22,35,46号)为接近或低于试剂盒的检测限的阳性样本，1例(52号)突变比例为超过2％，但该试剂盒未检出，可能原因是突变类型不在该试剂盒检测范围内。

综上比对结果显示，基于本发明所述的一组引物探针及配套试剂盒，通过优化的引物探针序列，采用优化的浓度及辅助试剂配方，采用优化的方法学进行检测，可以快速、灵敏、特异、高通量的检测EGFR基因19-Del突变，相比现有试剂盒，获得了性能的极大的提升，灵敏度更高，检测体系流程更加简便，结果判读客观易懂，成本更加低廉，且检测范围大大提高，能覆盖临床常见99％以上突变发生率，对临床NSCLC患者靶向用药的指导作用更加准确，并可及时监控药物疗效，指导医师改变治疗方案，临床使用效果突出，非常值得临床大规模推广应用。

序列表

<110> 杭州迪安医学检验中心有限公司

<120> 一组检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物、探针和试剂盒

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtcgctatc aaaacatc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgtcgctat caaaatatc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgtcgctat caagacatc 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcgctatca aggagcaatc 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcgctatcaa ggatccgaa 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgctatcaag gaacaatct 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcgctatca aggaacagaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcgctatca aggaaccgaa 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgctatcaag gaaccaaca 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcgctatca aggaagca 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcgctatcaa ggaatctcc 19

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcgctatcaa ggaatcga 18

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccgtcgctat caagtctcc 19

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtcgctatca aggttcc 17

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgtcgctatc aaggcatctc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtcgctatca aggagccaac 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgctatcaag gaatcatctc 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtcgctatca aggctccg 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgtcgctatc aaggtatctc 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtcgctatca aggaacaacc g 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgtcgctatc aaggttgctt 20

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccgtcgctat caaaattcc 19

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gaattaagag aagcaaccct cg 22

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgtcgctatc aaggtctcga 20

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ccgtcgctat cgcaaca 17

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gaattaagag aagcaacact cga 23

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccgtcgctat caaagcaa 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gtcgctatca aggaagcc 18

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ccgtcgctat cacaacat 18

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gaattaagag aagcaaatct cg 22

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cgtcgctatc aaggtccc 18

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gaattaagag aagcaawcct 20

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cctgaggttc agagccatg 19

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tgagtttctg ctttgctgt 19

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ggcatagatc agaagactac aaaaatg 27

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gggttggggt gatggcta 18

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ctgctctgaa atctcctt 18

<210> 38

<211> 3

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 38

Claims

1.一组用于检测EGFR基因19-Del突变的引物、探针，其特征在于，包括如下引物对及探针：

(4)扩增EGFR基因19-Del野生型的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：37所示；其中，部分引物碱基前面的“+”号表示该碱基用锁核酸LNA代替普通的核苷酸；碱基“W”代表该碱基为简并碱基，具体为“A或T”；19-Del突变型基因探针SEQ ID NO：34序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团；19-Del野生型探针SEQ ID NO：37序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团；上述37条核酸序列在1孔检测中同时使用。

2.一种用于检测EGFR基因19-Del突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂：(1)2*supermix：该PCR反应液中含有热启动DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、dNTPmixture、甜菜碱和三(2-羧乙基)膦(TCEP)、BSA；

(2)突变型引物探针预混液20*MUT：将SEQ ID NO：1～34所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，探针的浓度为10μM，配制突变型引物探针预混液；

(3)野生型引物探针预混液20*WT：将SEQ ID NO：35～37所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，探针的浓度为10μM，配制野生型引物探针预混液；

(4)阳性对照：经测序确认的包含19-Del突变型质粒与野生型基因组DNA(gDNA)的溶液，其中，突变型质粒的浓度为大于10拷贝/μL，gDNA浓度为大于100拷贝/μL；

3.根据权利要求2所述的用于检测EGFR基因19-Del突变的试剂盒，其特征在于，所述步骤(1)中热启动DNA聚合酶浓度0.02-0.04U/μL，Mg2+浓度7-8mM，dNTP mixture浓度500-1000μM，甜菜碱浓度0.5-1M，TCEP浓度0.5-1mM。

4.根据权利要求2所述的用于检测EGFR基因19-Del突变的试剂盒，其特征在于，所述步骤(2)中SEQ ID NO：22和25号引物的浓度为3-4μM，SEQ ID NO：1和32号引物的浓度为7-8μM，其余29条引物的浓度为1-2μM，SEQ ID NO：34号探针浓度4-6μM。

5.根据权利要求2所述的用于检测EGFR基因19-Del突变的试剂盒，其特征在于，所述步骤(3)中将SEQ ID NO：35～37所示的引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为浓度为10-20μM，探针浓度4-6μM。