发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于检测非小细胞肺癌疗效相关的EGFR基因突变的试剂盒。
本发明的目的还在于提供一种快速、准确、操作简便及对设备要求低的肺癌组织中EGFR基因突变检测方法。
在本发明的第一方面,提供一种用于检测非小细胞肺癌药物疗效相关的EGFR基因突变的试剂盒,所述的试剂盒包括容器以及装于容器中的以下引物探针组合体:
(a)组合体1:SEQ ID NO:11所示的正向引物+SEQ ID NO:12所示的反向引物+SEQ ID NO:1所示的野生型探针+SEQ ID NO:2所示的突变型探针;
(b)组合体2:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:4所示的突变型探针;
(c)组合体3:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:5所示的突变型探针;以及
(d)组合体4:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:6所示的突变型探针。
在本发明的另一优选例中,所述的试剂盒中还包括以下的引物探针组合体中的一种或多种:
(e)组合体5:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:7所示的突变型探针;
(f)组合体6:SEQ ID NO:15所示的正向引物+SEQ ID NO:16所示的反向引物+SEQ ID NO:8所示的野生型探针+SEQ ID NO:9所示的突变型探针;或
(g)组合体7:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:10所示的突变型探针。
在本发明的另一优选例中,所述的野生型探针的5’端连接有第一荧光发射基团,3’端连接有荧光淬灭基团;所述的突变型探针的5’端连接有第二荧光发射基团,3’端连接有荧光淬灭基团。
在本发明的另一优选例中,在所述的组合体中,引物和探针的比例为2∶1-10∶1。
在本发明的另一优选例中,在所述的组合体中,两种引物之间的比例为1∶3-3∶1;或两种探针之间的比例为1∶3-3∶1。
在本发明的另一优选例中,所述的第一荧光发射基团选自:FAM、TET、VIC、或HEX;所述的第二荧光发射基团选自:FAM、TET、VIC、或HEX;第一荧光发射基团不同于第二荧光发射基团。
在本发明的另一优选例中,所述的荧光淬灭基团选自:TAMRA。
在本发明的另一优选例中,所述的药物为Iressa(学名gefitinib,易瑞沙),或Tarceva(学名erlotinib,它赛瓦)。
在本发明的第二方面,提供一种检测非小细胞肺癌药物疗效相关的EGFR基因外显子上的位点突变的方法,所述的方法包括以下步骤:
(1)以待测非小细胞肺癌组织样品的基因组DNA为模板,使用以下组合体中的引物和探针,分别进行PCR反应:
(a)组合体1:SEQ ID NO:11所示的正向引物+SEQ ID NO:12所示的反向引物+SEQ ID NO:1所示的野生型探针+SEQ ID NO:2所示的突变型探针;该组合体对应于EGFR基因21外显子,2573位点T→G突变(2573T→G);
(b)组合体2:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:4所示的突变型探针,该组合体对应于EGFR基因19外显子,2235-2249位点缺失突变(2235-2249del);
(c)组合体3:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:5所示的突变型探针,该组合体对应于EGFR基因19外显子,2240-2257位点缺失突变(2240-2257del);以及
(d)组合体4:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:6所示的突变型探针,该组合体对应于EGFR基因19外显子,2240-2254位点缺失突变(2240-2254del);
各组合体中,所述的野生型探针的5’端连接有第一荧光发射基团,3’端连接有荧光淬灭基团;所述的突变型探针的5’端连接有第二荧光发射基团,3’端连接有荧光淬灭基团;
(2)检测对应于各组合体的PCR反应产物中的荧光信号,判断所测非小细胞肺癌组织样品的EGFR基因外显子上目标位点的基因型;
当PCR反应产物中产生荧光信号,并且所述的荧光信号为第一荧光发射基团形成的荧光信号,则待测样品的EGFR基因中对应于该组合体的位点为野生型;
当PCR反应产物中产生荧光信号,并且所述的荧光信号为第二荧光发射基团形成的荧光信号,则待测样品的EGFR基因中对应于该组合体的位点为突变型;
当PCR反应产物中产生荧光信号,并且所述的荧光信号含有第一荧光发射基团形成的荧光信号和第二荧光发射基团形成的荧光信号,则待测样品的EGFR基因中对应于该组合体的位点为野生型和突变型的杂合子。
在本发明的另一优选例中,在步骤(1)中,还使用以下引物探针组合体中的引物和探针进行PCR反应:
(e)组合体5:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:7所示的突变型探针;该组合体对应于EGFR基因19外显子,2238-2255位点缺失突变(2238-2255del);
(f)组合体6:SEQ ID NO:15所示的正向引物+SEQ ID NO:16所示的反向引物+SEQ ID NO:8所示的野生型探针+SEQ ID NO:9所示的突变型探针;该组合体对应于EGFR基因18外显子,2155位点G→A突变(2155G→A);或
(g)组合体7:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:10所示的突变型探针;该组合体对应于EGFR基因19外显子,2237-2251位点缺失突变(2237-2251del)。
在本发明的第三方面,提供一种组合物的用途,用于制备检测非小细胞肺癌药物疗效相关的EGFR基因突变的试剂盒,所述的组合物选自以下引物探针组合体:
(a)组合体1:SEQ ID NO:11所示的正向引物+SEQ ID NO:12所示的反向引物+SEQ ID NO:1所示的野生型探针+SEQ ID NO:2所示的突变型探针;
(b)组合体2:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:4所示的突变型探针;
(c)组合体3:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:5所示的突变型探针;
(d)组合体4:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:6所示的突变型探针;
(e)组合体5:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:7所示的突变型探针;
(f)组合体6:SEQ ID NO:15所示的正向引物+SEQ ID NO:16所示的反向引物+SEQ ID NO:8所示的野生型探针+SEQ ID NO:9所示的突变型探针;或
(g)组合体7:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:10所示的突变型探针。
在本发明的另一优选例中,所述的药物为Iressa(学名gefitinib,易瑞沙),或Tarceva(学名erlotinib,它赛瓦)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人针对目前现有技术中对肺癌组织中EGFR基因相关突变位点区域DNA进行测序时检测周期长、检测过程复杂等问题,经过广泛而深入的研究,设计出一套TaqMan引物和探针,从而通过荧光定量PCR技术快速准确地检出NSCLC中与Iressa和Tarceva疗效相关的包括单个核苷酸替换及小片段缺失在内的EGFR基因突变。基于此完成了本发明。
基本原理
本发明的方法基本原理是TaqMan荧光技术,即以TaqMan荧光探针为基础。TaqMan荧光探针为一种寡核苷酸,其两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。当探针完整时,荧光发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离,从而通过荧光检测系统可接受到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,即荧光信号的累计与PCR产物形成的完全同步,从而实现定性和定量。
Iressa及Tarceva药物疗效
Iressa及Tarceva是两种目前对于部分NSCLC患者治疗最有效的药物。并且,该两种药物的疗效与NSCLC组织中EGFR基因外显子18、19、20、21上的功能突变呈正相关。研究发现,在NSCLC患者中,当EGFR基因外显子18、19、20、21上存在功能突变时,该两种药物的治疗的有效率接近100%;而当EGFR基因外显子18、19、20、21上不存在功能突变时,该两种药物的治疗有效率低于20%。
因此,在进行治疗前,检测患者是否有相关的EGFR功能性突变,可准确预测两种药物的治疗有效性,便于临床准确用药,避免不必要治疗的时效损失以及经济损失。
引物和探针的设计
在本发明中,根据中国NSCLC患者主要EGFR功能突变来设计进行TaqMan荧光检测的引物和探针。以EGFR外显子18、19、21上的功能性突变位点为基础,来设计特定的能够与突变位点及其附近的核苷酸序列完全互补的检测探针(所述的探针具有约10-40个核苷酸,更优选的为15-30个核苷酸)。并且,相应地,根据EGFR基因外显子18至外显子21区域的基因组DNA序列(NCBI序列:NT_033968.5:155339-173243)来设计用于与相应的探针共同参与TaqMan荧光PCR检测的引物。
其中,所述的EGFR外显子18、19、21上的功能性突变位点包括:
(a)EGFR外显子21,2573T→G;
(b)EGFR外显子19,2235-2249del;
(c)EGFR外显子19,2240-2257del;和
(d)EGFR外显子19,2240-2254del。
更优选的,所述的EGFR外显子18、19、21上的功能性突变位点还包括:
(e)EGFR外显子19,2238-2255del;
(f)EGFR外显子18,2155G→A;
(g)EGFR外显子19,2237-2251del。
上述表述中,符号“→”代表位于该符号前的碱基被位于该符号后的碱基取代,如“2573T→G”即指核苷酸序列中第2573位的碱基T被碱基G取代。“del”表示碱基的缺失,如“2235-2249del”即指核苷酸序列中第2235-2249位碱基发生缺失。
样品、基因型标准品
本发明检测的样品获自哺乳动物(比如人)的肺癌组织。从肺癌组织中提取出基因组DNA,作为TaqMan荧光PCR的模板,与前述设计的引物和探针组合相混合,进行荧光PCR反应,通过检测PCR反应体系中形成的荧光情况来判断所测肺癌组织中的EGFR基因突变位点的基因型,以此来判断Iressa及Tarceva两种药物对于受试对象是否有效。
为了实现准确的基因型判断,在本发明的优选方式中,还设置基因型阳性对照或基因型标准品。
针对每一种突变位点来设计基因型标准品,所述标准品包括:野生型纯合子阳性标准品(WW),野生型与突变型杂合子阳性标准品(WV),以及突变型纯合子阳性标准品(VV)。
在确定了所需检测的各突变位点后,各种基因型标准品的设计可采用常规的方法。在本发明的优选方式中,以正常人基因组DNA序列作为模板,针对各个待测突变位点或缺失位点,分别设计一对能扩增目标外显子区域的外侧引物和一对突变引物(引入点突变或缺失突变),运用重叠PCR(over-lap PCR)的方法进行PCR扩增。将经测序验证序列正确的最终扩增产物与载体连接后,转化入DH5α感受态细胞,孵育后挑取单克隆菌落继续培养扩增提取质粒并进行测序验证,插入序列正确的质粒经浓度标定后作为待检测突变位点基因型的标准品。杂合基因型用两种纯合基因型质粒等比配制而成。
试剂盒
为了使检测更加精确,优选对多种突变情况进行同时并列检测。因此,本发明提供了一种用于检测非小细胞肺癌药物疗效相关的EGFR基因突变的试剂盒,所述的试剂盒含有多个独立的容器或相互分隔的孔,每个容器或孔中装有以下分别由两条引物和两条探针组成的引物探针组合体:
(a)组合体1:SEQ ID NO:11所示的正向引物+SEQ ID NO:12所示的反向引物+SEQ ID NO:1所示的野生型探针+SEQ ID NO:2所示的突变型探针;
(b)组合体2:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:4所示的突变型探针;
(c)组合体3:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:5所示的突变型探针;以及
(d)组合体4:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:6所示的突变型探针。
更优选的,所述试剂盒中还包括选自以下的引物探针组合体:
(e)组合体5:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:7所示的突变型探针;
(f)组合体6:SEQ ID NO:15所示的正向引物+SEQ ID NO:16所示的反向引物+SEQ ID NO:8所示的野生型探针+SEQ ID NO:9所示的突变型探针;或
(g)组合体7:SEQ ID NO:13所示的正向引物+SEQ ID NO:14所示的反向引物+SEQ ID NO:3所示的野生型探针+SEQ ID NO:10所示的突变型探针。
更优选的,所述的野生型探针的5’端连接有第一荧光发射基团,3’端连接有荧光淬灭基团;所述的突变型型探针的5’端连接有第二荧光发射基团,3’端连接有荧光淬灭基团。
在本发明的优选方式中,在所述的组合体中,引物和探针的比例为2∶1-10∶1,本发明人发现,所述的比例特别有利于本发明的检测,使检测效果更准确。更优选的,引物和探针的比例为3∶1-8∶1;比如,引物和探针的比例约为5∶1。
在本发明的优选方式中,在所述的组合体中,两种引物之间的比例为1∶3-3∶1,本发明人发现,所述的比例特别有利于本发明的检测,使检测效果更准确。更优选的,两种引物之间的比例为1∶2-2∶1;比如,两种引物之间的比例约为1∶1。
在本发明的优选方式中,在所述的组合体中,两种探针之间的比例为1∶3-3∶1,本发明人发现,所述的比例特别有利于本发明的检测,使检测效果更准确。更优选的,两种探针之间的比例为1∶2-2∶1;比如,两种探针之间的比例约为1∶1。
在本发明的优选方式中,所述的第一荧光发射基团选自:FAM、TET、VIC、或HEX;所述的第二荧光发射基团选自:FAM、TET、VIC、或HEX;并且第一荧光发射基团不同于第二荧光发射基团,从而可区分出待测基因的野生型或突变型。
在本发明的优选方式中,所述的荧光淬灭基团包括但不限于:TAMRA。
在采用所述的试剂盒进行检测时,可将待测样品的基因组DNA(作为PCR模板),或将基因型标准品(作为PCR模板)加入到试剂盒的各分别含有不同的引物探针组合体的容器或孔中,再加入其它进行PCR反应所需的常规成份(如Taq酶),进行荧光PCR反应,反应结束后,通过检测PCR反应体系中形成的荧光量以及荧光种类来判断肺癌组织中的EGFR基因突变位点的基因型,以此来判断Iressa及Tarceva两种药物对于患者是否有效。
本发明的主要优点在于:
(1)采用本发明的试剂盒进行非小细胞肺癌药物疗效相关的EGFR基因突变的检测,可同时对EGFR基因突变相对频率较高的位点进行检测,检测时的反应条件均一,检测准确度达到99%以上。
(2)本发明的检测方法步骤简单,因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定因素,因而可大大提高检测准确率。
(3)本发明的检测突变的方法消耗时间远远低于以前常用的测序技术,且对设备要求低,特别符合临床实际需要。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1待检测EGFR突变位点确定
根据有关的NSCLC患者EGFR突变研究报道(Mu XL等,Gefitinib-sensitivemutations of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase domain in ChinesePatients with non small cell lung cancer.Clin Cancer Res 2005;11(12):4289-4294;ZhangXT等,The EGFR mutation and its correlation with response of gefitinib in previouslytreated Chinese patients with advanced non-small-cell lung cancer.Annals of OncologyAdvance Access,2005.doi:10.1093/annonc/mdi340;Qin BM等,Identification of EGFRkinase domain mutations among lung cancer patients in China:implication for targetedcancer therapy.Cell Research,2005.15(3):212-217;Huang SF等,High Frequency ofEpidermal Growth Factor Receptor Mutations with Complex Patterns in Non-Small CellLung Cancers Related to Gefitinib Responsiveness in Taiwan.Clinical Cancer Research,2004.10(12):8195-8203)及本发明人前期研究结果(姜斌,朱冠山,刘峰,龚圣济,姚宝娣,钟镭,朱忠政,曾骥孟。中国人非小细胞肺癌EGFR基因突变情况的研究。上海第二医科大学学报2005,25(11):1148-1150),中国NSCLC患者中存在十余个疗效相关的EGFR突变位点。根据各突变位点在NSCLC中出现的频率,本发明人将代表92%突变携带NSCLC患者的7个EGFR突变位点,确定为本发明人的检测目标。
具体突变位点及相关信息见表1。
表1.中国NSCLC患者主要EGFR功能突变
突变命名 |
定位<sup>*</sup>及属性 |
氨基酸改变 |
报道例数 |
代表频率 |
EGFR2573T→G |
外显子21,2573T→G |
L858R |
51 |
52% |
EGFR2235D15 |
外显子19,2235-2249del |
E746_A750del |
27 |
27% |
EGFR2240D18 |
外显子19,2240-2257del |
L747_P753del,insS |
4 |
4% |
突变命名 |
定位<sup>*</sup>及属性 |
氨基酸改变 |
报道例数 |
代表频率 |
EGFR2240D15 |
外显子19,2240-2254del |
L747_T751del |
4 |
4% |
EGFR2238D18 |
外显子19,2238-2255del |
E746_S752del,insD |
2 |
2% |
EGFR2155G→A |
外显子18,2155G→A |
G719S |
2 |
2% |
EGFR2237D15 |
外显子19,2237-2251del |
E746-T751del,insA |
1 |
1% |
*参考NCBI序列:X00588.1
实施例2检测方法设计及引物和探针的合成
针对选定的7个EGFR突变位点,应用Primer Express V2.0软件(美国应用系统公司产品),设计出3对PCR引物(分别扩增三个外显子中的突变区)及10条TaqMan探针(组合成7对,其中第19号外显子突变区野生型检测探针为5种缺失突变所共用)。野生型等位基因特异性探针5’端标记荧光为FAM,突变型等位基因特异性探针5’端标记荧光为VIC,所有探针的3’端淬灭基团均为TAMRA。所有引物及探针均由上海基康生物技术有限公司自行合成。
详细信息见表2。
实施例3待检测突变位点各种基因型标准品的构建与制备
以正常人基因组DNA序列作为模板,针对各个待测突变位点或缺失位点,分别设计一对能扩增目标外显子区域的外侧引物和一对突变引物(引入点突变或缺失突变),运用重叠PCR(over-lap PCR)的方法进行PCR扩增。
具体突变引物及相关信息见表3。
将经测序验证序列正确的最终扩增产物与pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)连接(即采用常规手段将所述序列连接入pMD18-T载体的多克隆位点中)后,转化入DH5α感受态细胞,孵育后挑取单克隆菌落继续培养扩增提取质粒并进行测序验证,插入序列正确的质粒经浓度标定后作为待检测突变位点基因型的标准品。杂合基因型用两种纯合基因型质粒等比配制而成。
实验流程见图1。
实施例4基因型标准品的测试与验证
1.基因型标准品的测试
(1)表2中引物探针组合体(PPM)配制为:引物浓度为5μM(5×),探针浓度为1μM(5×)。
(2)每一突变位点三种基因型WW,WV,VV标准模板浓度配制为:106拷贝/ul,其中WV由WW与VV标准模板等比混合而成。
(3)按如下方案准备检测反应体系:
5×PPM 1μl
2×ABI Master Mix 2.5μl
标准模板DNA 1μl
H2O 0.5μl
总体积 5μl
采用的标准模板DNA即为前述插入序列正确的质粒,其中ABI Master Mix为ABI公司产品。
(4)按如下反应条件进行PCR反应:
50℃/2min,95℃/10min,95℃/15sec-60℃/1min×40个循环。
(5)在ABI7900 DNA序列检测仪读取终点荧光信号(FAM和VIC),并判读基因型。
(6)每次实验中设无模板对照NTC。
2.EGFR突变位点基因型标准品测试结果
对EGFR基因七种突变类型所设计的TaqMan检测方法,经基因型标准品验证,基因型分型清晰,判读容易。
结果见图2-图8,由图可见基因型分型很清晰,非常易于判读。
实施例5待测样品的测试与验证
1.待测样品的测试
(1)取待检测的NSCLC石蜡包埋的组织切片,用改进后的酚氯仿抽提法(Zhu ZZ等,A p53 polymorphism modifies the risk of hepatocellular carcinomaamong non-carriers but not carriers of chronic hepatitis B virus infection.CancerLetters,2005.229:77-83)从肺癌组织中抽提基因组DNA,标化DNA水溶液浓度至25ng/μl。
(2)按如下方案准备检测反应体系:
5×PPM 1μl
2×ABI Master Mix 2.5μl
样本基因组DNA 1μl
H2O 0.5μl
总体积 5μl
(3)按如下反应条件进行PCR反应:
50℃/2min,95℃/10min,95℃/15sec-60℃/1min×40个循环。
(4)在ABI7900 DNA序列检测仪读取终点荧光信号(FAM和VIC),并判读基因型。
(5)每次检测中设无模板NTC及标准基因型对照。
2.TaqMan方法检测NSCLC标本EGFR突变结果及与测序结果的比较
选部分前期研究中(姜斌,朱冠山等,中国人非小细胞肺癌EGFR基因突变情况的研究;上海第二医科大学学报2005,25(11):1148-1150)确认的EGFR正常及带有常见突变EGFR2573T→G或EGFR2235D15的NSCLC样本,用TaqMan方法检测EGFR突变,并与测序法检测结果比较,符合率达100%。具体结果见图9及图10。
图9显示了TaqMan方法和测序法检测EGFR2573T→G点突变结果对照。其中,A为TaqMan方法,WW为野生型纯合子阳性标准品,WV为野生型与突变型杂合子阳性标准品,VV为突变型纯合子阳性标准品。S1-S4为野生型纯合子样本,S5-S7为野生型与突变杂合子样本,S8为突变型纯合子样本。NTC为无模板阴性对照。B为测序法,图中所示为EGFR2573T→G点突变位点附近部分序列(2563-2593)。S1-S4显示为野生型纯合子序列,S5-S7显示为野生型与突变杂合子序列,S8显示为突变纯合子序列。可见用TaqMan方法和测序法检测EGFR突变,结果是相符合的。
图10显示了TaqMan方法和测序法检测EGFR2235D15缺失突变结果对照。其中,A为TaqMan方法,WW为野生型纯合子阳性标准品,WV为野生型与突变型杂合子阳性标准品,VV为突变型纯合子阳性标准品。S1-S4为野生型纯合子样本,S5-S7为野生型与突变杂合子样本,S8-S9为突变纯合子样本。NTC为无模板阴性对照。B为测序法,图中所示为EGFR2235D15缺失突变位点附近部分序列(2225-2255)。S1-S4显示为野生型纯合子序列,S5-S7显示为野生型与突变杂合子序列,S8-S9显示为突变纯合子序列。可见用TaqMan方法和测序法检测EGFR突变,结果是相符合的。
并且,本发明人还实验比较了采用本发明的方法和测序法进行检测所需消耗的时间。采用本发明的方法消耗的时间为4-6小时,也即仅需半个工作日的时间即可完成检测;而采用测序法消耗的时间为15-21小时,如以正常工作时间进行检测,实际至少需要3个工作日才能发出检测结果报告。
因此可见,采用本发明的方法非常的便捷快速,从而更加符合临床诊断和治疗的时效性要求。
讨论
本研究采用常规用于基因定量及单核苷酸多态性检测的TaqMan方法,设计了一套TaqMan引物和探针,并构建待检测突变位点各种基因型阳性对照,建立了荧光定量PCR方法,在ABI7900荧光定量PCR仪上快速(总计5小时)准确检出NSCLC中与Iressa和Tarceva疗效相关的包括单个核苷酸改变及基因片段缺失在内的EGFR基因突变。该方法经检测真实临床NSCLC标本验证,其检测结果与测序法所得结果完全一致,准确率超过99%。
根据文献报道及本发明人之前的研究结果显示,NSCLC中与Iressa及Tarceva疗效相关的EGFR突变集中在外显子18-21,突变种类包括单个核苷酸替换、小片段缺失或插入。全世界范围内报道过的突变位点达20余个以上,其中以外显子21中EGFR2573T→G点突变、外显子19中EGFR2235D15缺失及外显子20中的插入最为常见。为克服因突变位点众多给TaqMan方法设计带来的困扰,本发明人系统分析了中国人群NSCLC中各种相关EGFR突变位点出现的频率,确定代表92%的带有相关EGFR突变的NSCLC患者的7个突变位点作为检测目标。这样,临床应用时,相关EGFR突变检出率将达90%以上。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。