CN102181537B - 用于检测人类egfr基因21号外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域和医学领域，具体地，本发明涉及一种用于检测人类EGFR基因21号外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法。一种用于检测人类EGFR基因21号外显子突变的引物组合物，其包括下列3组引物中的至少一组：（1）如SEQIDNo:1所示的引物,如SEQIDNo:2所示的引物,（2）、如SEQIDNo:1所示的引物,如SEQIDNo:3所示的引物,（3）、如SEQIDNo:4所示的引物,如SEQIDNo:2所示的引物。本发明以人类EGFR基因21号外显子突变为检测对象，利用特异引物组的半巢式PCR反应，通过对PCR产物进行微流体芯片检测，实现快速、简单、准确、敏感的诊断人类EGFR基因突变。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域和医学领域，具体地，本发明涉及一种用于检测人类EGFR基因21号外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法。
背景技术
肺癌是较为常见的肺原发性恶性肿瘤，发病率和病死率较高，男性肺癌占各种癌病死因第一位，女性则仅次于乳腺癌占第二位。按传统的组织病理学分类，肺癌可分小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌（Non-small-cell carcinoma ，NSCLC）即“非小细胞癌”，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚，非小细胞肺癌约占肺癌总敉的80-85%。
上皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor； EGFR）是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) 和 Her 4 (ErbB-4)。EGFR也被称作HER1、ErbB1，突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体。研究表明，EGFR突变基因与酪氨酸激酶抑制类药物使用有疗效关联，这些药物包括Iressa（易瑞沙）和Tarceva（特罗凯）。EGFR 基因突变影响着EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的临床疗效，目前发现EGFR基因突变90%以上的突变位于外显子19-21。外显子21的点突变，主要是第851为密码子出现T→G转变，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由亮氨酸转变为精氨酸（L858R）,位于DGF序列附近，其作用使A-loop的稳定性增强，提高了肿瘤细胞对EGFR-TKI的敏感性。
目前EGFR突变基因的检测方法有DNA测序法、特异性位点的聚合酶链式反应、荧光实时聚合酶链式反应、高效液相色谱法、毛细管电泳、聚合酶链式反应一单链构象多态性分析。相对于DNA测序，其它分子生物学方法尽管灵敏度和／或特异度有所提高，但是大多数方法仍对组织的取材要求较高，需要较多的肿瘤组织和有较高的肿瘤细胞含量。此外，有的方法，如荧光实时聚合酶链式反应、高效液相色谱和毛细管电泳等，需要特殊的仪器设备，因而仍然不能在临床上进行大范围推广。聚合酶链式反应一单链构象多态性（PCR-SSCP）分析，尽管只能做定性的分析，但通过条件优化，临床上可以作为一种初筛突变的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测人类EGFR基因21号外显子突变的引物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种利用上述的引物组合物制备的试剂盒，以及该试剂盒在检测非小细胞肺癌药物疗效相关的EGFR基因21号外显子突变中的应用。
本发明的又一个目的是提供一种检测人类EGFR基因21号基因外显子突变的方法，该方法利用本发明提供的试剂盒进行检测，检测耗时少、灵敏度高、特异性好、检测结果稳定。
本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：
一种用于检测人类EGFR基因21号外显子突变的引物组合物，其特征在于其包括下列3组引物中的至少一组：
（1）、5’-CCATGATGATCTGTCCCTCACA-3’ SEQ ID No:1,
5’-ACCTCCTTACTTTGCCTCC-3’ SEQ ID No:2,
位置：EGFR21号外显子外引物，
扩增产物片段大小：209bp；
（2）、5’-CCATGATGATCTGTCCCTCACA-3’ SEQ ID No:1,
5’-CGCACCCAGCAGTTTGGACC-3’ SEQ ID No:3,
位置：EGFR21号外显子内引物，
扩增产物片段大小：166bp；
（3）、5’-TGTCAAGATCACAGATTTTGGGCT-3’ SEQ ID No:4,
5’-ACCTCCTTACTTTGCCTCC-3’ SEQ ID No:2，
位置：EGFR21号外显子内引物，
扩增产物片段大小：88bp。具体检测原理如图6。
用于检测人类EGFR基因21号外显子突变的引物组合物可以定向检测人类EGFR基因21号外显子突变体T→G。这种突变的发生导致了EGFR蛋白中第858位氨基酸由野生型的亮氨酸突变为精氨酸，该突变的发生是靶向治疗药物吉非替尼、厄洛替尼等治疗非小细胞肺癌取得成功的一个必要条件。本发明提供的引物组合物中的外引物EGFR21F2/EGFR21R4，可以扩增人类EGFR基因21号外显子中包含突变位点的一段长为209bp的核苷酸序列；引物组合物中的EGFR21F2/EGFRLRmr，其中EGFRLRmr引物的3'端只可以与T→G突变体复性，引起PCR反应，扩增的核苷酸片段大小为166bp；引物组合物中的EGFRLRnf1/EGFR21R4，其中的EGFRlRnf1引物的3 '端只可以与野生型的21号外显子复性，引起PCR反应，扩增的核苷酸片段大小为88bp，引物名称和核苷酸序列对照表见表1。
表1 PCR扩增混合引物序列表
| SEQ ID NO | 引物名称 | 引物信息方向5′
 |
| 1 | EGFR21F2 | CCATGATGATCTGTCCCTCACA |
| 2 | EGFR21R4 | ACCTCCTTACTTTGCCTCC |
| 3 | EGFRLRmr | CGCACCCAGCAGTTTGGACC |
| 4 | EGFRLRnf1 | TGTCAAGATCACAGATTTTGGGCT |
一种试剂盒，至少包括上述的引物组合物和PCR反应液。作为优选，所述的PCR反应液包括以下组分：pH 8.4的Tris-HCl 40 mM，MgCl2 15～24 mM，KCl 50 mM，(NH4)2SO4 10 mM，dNTP 0.5mM，终浓度0.06～0.10 U/μl 的Taq DNA聚合酶；所述的引物组合物包括：各10μM的SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物。
本发明还提供一种所述的试剂盒在检测非小细胞肺癌药物疗效相关的EGFR基因21号外显子突变中的应用。所述的药物为Iressa（易瑞沙）或Tarceva（特罗凯）。本发明的试剂盒用于辅助临床医生诊断出可受益于Iressa（易瑞沙）和Tarceva（特罗凯）等特效药的肺癌患者，适合于非小细胞肺癌患者在进入个体化靶向治疗疗程之前使用，可为病者个体用药提供用药科学依据，降低治疗风险以及患者负担。
一种检测人类EGFR基因21号外显子突变的方法，包括以下步骤：（1）待测样本处理和模板DNA提取；（2）使用本发明所述的试剂盒对步骤（1）得到的DNA进行半巢式PCR扩增；（3）检测步骤（2）所得到的PCR扩增产物。
作为优选，步骤（1）中的样本为手术切除的新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织、全血、血浆、血清或胸腔积液。
作为优选，步骤（3）中的检测方法为微流体芯片检测法。
作为优选，本发明的检测方法与微流体芯片检测法相结合，具体包括以下步骤：
（1）用本发明所述的引物组合物对被测样本的DNA进行半巢式PCR扩增，纯野生型、纯突变型和杂合突变型的扩增产物不同；
（2）扩增产物通过微流体芯片进行检测；
（3）通过对各检测峰的数量及检测峰位置的判断，确定检测到的片段数量及大小，从而确定被检测的基因，判断临床样本EGFR基因21号外显子的突变情况；
（4）结果判断：a）出现209bp和88bp两个PCR扩增产物，说明临床样本的EGFR基因21号外显子未出现突变情况，为纯野生型；b）出现209bp和166bp两个PCR扩增产物，说明临床样本的EGFR基因21号外显子发生突变，为纯突变型；c）出现209bp、166bp和88bp三个PCR扩增产物，说明临床样本的EGFR基因21号外显子发生部分突变，为杂合突变型。
本发明以人类EGFR基因21号外显子突变为检测对象，利用特异引物组的半巢式PCR反应，通过对PCR产物进行微流体芯片检测，实现快速、简单、准确、敏感的诊断人类EGFR基因突变。与现有的检测方法和试剂盒相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明采用PCR—SSCP（聚合酶链式反应—单链构象多态性分析）方法，定向对人类EGFR基因21号外显子缺失突变进行检测，与微流体芯片检测法的结合，具有灵敏度高、速度快、结果直观、可信性好的优点。
（2）本发明的检测方法与微流体芯片检测法联合，具有自动化程度高、人机界面良好的优点，避免了诸多人为因素所带来的误差，所需时间和费用远远低于常规测序技术，符合临床上的需要。
附图说明
图1为EGFR基因21号外显子纯野生型DNA样品的微流体芯片检测图。
图2为EGFR基因21号外显子纯突变型DNA样品的微流体芯片检测图。
图3为EGFR基因21号外显子杂合突变型DNA样品的微流体芯片检测图。
图4为EGFR基因21号外显子纯野生型DNA样品的基因测序图。
图5为EGFR基因21号外显子突变型DNA样品的基因测序图。
图6为EGFR基因21号外显子突变检测原理示意图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例及附图来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。本发明所述的“PCR”是指聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），是本领域技术人员熟知的用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增的一项分子生物学技术。
本发明微流体芯片检测法使用的检测仪器是宁波基内生物技术有限公司生产的AMA2100型全自动微流芯片分析仪，该仪器的专利申请号为：CN200910272437.X、CN200920230097.X、CN200910272874.X、CN200910273037.0、CN200920288540.9 、CN200910272436.5。
实施例1：试剂盒的组成与配制
本发明的试剂盒由PCR反应液、引物组合物的混合液、阴性对照物、阳性对照物和灭菌双蒸水组成。
1.配制PCR反应液：Tris-HCl（pH 8.4）40 mM，MgCl2 15～24mM，KCl 50 mM，(NH4)2SO4 10 mＭ，dNTP 0.5 mM，Taq DNA聚合酶的终浓度为0.06～0.10 U/μL。其中MgCl2最佳的浓度为20 mM，Taq DNA多聚酶的最佳终浓度为0.08 U/μL。
2.配制引物组合物的混合液：10μM的EGFR21F2引物，10μM的EGFR21R1引物，10μM的EGFRLRmr引物和10μM的EGFRLRnf1引物混合配制而成，EGFR21F2所示的引物、EGFR21R4所示的引物、EGFRLRmr所示的引物、EGFRLRnf1所示的引物体积比值为1：0.5：1：1.5；
3.灭菌双蒸水（ddH2O）；
4.阳性对照物：21号外显子发生突变的临床样本DNA；
5.阴性对照物：ddH2O。
为方便描述本发明的效果，以下各实施例均采用本试剂盒的最优配比，即本发明的试剂盒包括：
1. PCR反应液：Tris-HCl（pH 8.4）40 mM，MgCl2 20 mM，KCl 50 mM，(NH4)2SO4 10 mＭ，dNTP 0.5 mM，Taq DNA多聚酶的终浓度为0.08 U/μL；
2. 引物组合物的混合液：10μM的EGFR21F2引物，10μM的EGFR21R4引物，10μM的EGFRLRmr引物和10μM的EGFRLRnf1引物混合配制而成，EGFR21F2所示的引物、EGFR21R4所示的引物、EGFRLRmr所示的引物、EGFRLRnf1所示的引物体积比值为1：0.5：1：1.5；
3.灭菌双蒸水（ddH2O）；
4.阳性对照物：21号外显子发生突变的临床样本DNA；
5.阴性对照物：ddH2O。
实施例3：临床样本DNA的提取
临床样本适用范围包括手术切除的新鲜病理组织、石蜡包埋病例组织、全血、血浆、血清、胸腔积液等，DNA提取试剂盒使用宁波基内生物技术有限公司生产的血液/组织基因组提取试剂盒（注册号：浙甬食药监械（准）字2010第1400013号），按照试剂盒说明书进行操作。本实施例使用此试剂盒分别提取1个正常生理组织样本及19个临床非小细胞肺癌新鲜病理组织样本基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明，提取的正常生理组织样本DNA编号为1号，其它病理组织DNA样本依次编号为2-20号。
实施例4：用引物组合物混合液扩增DNA样本
实施例为采用本发明所提供的引物组合物序列扩增实施例3所提取的1-20号共20个DNA样品，引物的核苷酸序列见表1。
1、PCR反应体系见表2。
表2
| 成份 | 体积/μl |
| ddH2O | 9.5 |
| PCR反应液 | 12.5 |
| 引物组合物混合液 | 2 |
| 提取的DNA样品 | 1 |
2、PCR反应程序
第一阶段94℃预变性2分钟；
第二阶段94℃变性20秒，65℃退火20秒，72℃延伸30秒，35轮循环；
第三阶段72℃保温10分钟。
实施例5：微流体芯片检测样本方法
本实施例为采用微流体芯片检测实施例3中所扩增出的PCR产物。微流体芯片检测样本具体包括以下操作步骤：
1）接通AMA2100型全自动微流芯片分析仪（宁波基内生物技术有限公司生产）电源，仪器预热30分钟。
2）连接检测池与主机箱正面输出接口，在缓冲溶液瓶中加入新配制好的缓冲溶液（2% HPMC-50，80mM MES，40mM Tris），将电极和毛细管的两端浸在缓冲溶液中，保持毛细管两端出口在同一水平面上，且毛细管内必须充满缓冲溶液，关好仪器正门，确认仪器各部分连接正确后，按动高压启动按钮，如果发生异常应立即按动高压关断钮，检查并排除故障后，再重新加压。
3）进样：在样品池点加20ul样品溶液。
4）根据实验需要设定仪器工作参数。其中进样电压为380v，电泳电压为700v。
5）运行进样及电泳程序，当DNA条带通过检测点时，其信息由数据采集系统记录下来，并转化为电信号，即开始样品的分析工作，收集芯片检测图谱。
按照上述方法检测实施例4中所扩增出的20个DNA样品，其中15号样本检测结果图如图2，检测结果图中出现2个峰，且两个峰之间的时间差较小，因此可以判定两个峰对应的条带大小分别为166bp和209bp，15号样本为EGFR基因21号外显子纯突变型；12号和19号样本检测结果图如图3，检测结果图中出现3个峰，因此可以判定3个峰对应的条带大小分别为88bp、166bp和209bp，12号和19号样本为EGFR基因21号外显子杂合突变型；其它17个样本检测结果都是一样的，如图1，检测结果中只出现2个峰，且两个峰之间的时间稍大，因此其它17个样本为EGFR基因21号外显子纯野生型。
委托Invitrogen上海分公司对图2中所示EGFR基因21号外显子纯突变型的15号样本和纯野生型的1号样本的扩增结果进行测序比对，EGFR基因21号外显子纯野生型和突变型的基因测序图分别如图4和图5所示，通过比对可知，15号临床样本扩增得到的序列相比纯野生型基因序列确实存在C→A(G→T)的突变。
本发明检测方法相比测序方法，不仅耗时少，检测费用也相对较低，对取材和技术要求也没测序方法那么高。
序列表
<110> 宁波基内生物技术有限公司
<120> 用于检测人类EGFR基因21号外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法
<130> ZH10095
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccatgatgat ctgtccctca ca 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acctccttac tttgcctcc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcacccagc agtttggacc 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgtcaagatc acagattttg ggct
Claims (3)
1.一种用于检测人类EGFR基因21号外显子突变的引物组合物，其特征在于其包括下列4条引物：
（1）、5’-CCATGATGATCTGTCCCTCACA-3’ SEQ ID No:1,
（2）、5’-ACCTCCTTACTTTGCCTCC-3’ SEQ ID No:2,
（3）、5’-CGCACCCAGCAGTTTGGACC-3’ SEQ ID No:3,
（4）、5’-TGTCAAGATCACAGATTTTGGGCT-3’ SEQ ID No:4。
2.一种试剂盒，其特征在于至少包括如权利要求1所述的引物组合物和PCR反应液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的PCR反应液包括以下组分：pH 8.4的Tris-HCl 40 mM，MgCl2 15～24 mM，KCl 50 mM，(NH4)2SO4 10 mM，dNTP 0.5mM，终浓度0.06～0.10 U/μl 的Taq DNA聚合酶；所述的引物组合物包括：各10μM的SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物。
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