CN103966306A - Egfr突变检测引物/探针及方法(pcr/ldr法) - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针及使用方法，涉及肿瘤相关基因突变的检测。本发明的方法包括(1)提供引物和探针;(2)待测样品处理和模板提取;(3)配制改良的特异性PCR扩增突变基因序列的反应体系，以及检测基因突变的反应体系;(4)用方法(1)的引物和探针扩增富集待测的突变基因靶序列;(5)利用与扩增产物互补的荧光标记探针进行连接反应，ABI3130毛细管电泳条带大小作为结果的判断标准。本发明的引物、探针及方法:可同时检测EGFR基因的30多种点突变、插入缺失突变:灵敏度高:特异性强:选择性能力强:检测速度快，整个检测过程在2-3个小时内完成。

Description

EGFR突变检测引物/探针及方法(PCR/LDR法)

技术领域

本发明涉及肿瘤基因突变检测，特别涉及检测人类表皮生长因子受体EGFR基因30余种突变的引物、探针及方法。

背景技术

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤。表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR）是表皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) 和 Her 4 (ErbB-4)。EGFR也被称作HER1、ErbB1，突变或过表达一般会引发肿瘤。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)为NSCLC的治疗带来曙光,但用药前必须对表皮生长因子受体（EGFR）进行突变检测。

临床试验表明，EGFR的突变状态是决定EGFR-TKIs药物，如吉非替尼（易瑞沙）和厄洛替尼（特罗凯）一线疗效的关键因素。根据当前的数据表明，EGFR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21外显子，其中19号外显子缺失和21号外显子L858R突变占目前已知的EGFR突变的90%，吉非替尼对这些突变为阳性的肿瘤病人治疗有效。众所周知的为EGFR突变型阳性双位点突变，最常见的有，T790M和外显子19缺失或者T790M 和 L858R类型的突变。对于这种类型的肿瘤患者，仅有有限的数据支持吉非替尼对其有效或耐药。外显子20单位点突变T790M以及外显子20插入占已知突变的3%，目前没有数据支持吉非替尼对其有效。在EGFR基因存在突变的病人中，这两种药物治疗有效率可高达90%，EGFR基因不存在突变的癌症病人，这两种药物的疗效低，甚至无效。因此，FDA现在已经强制要求在选择使用易瑞沙之前必须先进行EGFR和K-RAS基因的突变检测，以确定安全、合理、有效用药的保障。

肿瘤基因突变检测方法不同于一般突变检测，肿瘤突变检测样本中，肿瘤细胞往往处于大量的野生型细胞背景中，肿瘤细胞含量很低，因而在提取的DNA中，突变基因型所占比例低于野生型。靶标基因在大量野生型基因背景中，这种稀有突变的检测就需要检测技术具有很高的灵敏度和特异性。这就是稀有突变检测的难点:一面要具有高灵敏的检测能力,甚至单个突变拷贝和在成千上万野生型模板的干扰下，能够成功地富集并检测出来；另外必须保证极高的特异性,即实验本身不会造成假阳性。

目前检测EGFR基因稀有突变的方法有多种，检测能力在 1%-20%之间。主要有测序和 DHPLC，检测能力仅为 20% 和 5% ，而且需要PCR后处理，步骤繁琐，耗时长，容易污染;另一类是实时PCR，主要有完全依赖DNA序列自身识别特异性和依赖酶识别特异性两大类策略，有TaqMan探针、高分辨熔解曲线分析、 竞争性抑制实时PCR方法，检测能力5%-20%之间，DxS揭子引物;检测能力可达1% 。NCCN推荐SNaPshot Multiplex技术，可以进行多重突变筛选分析，可检测包括EGFR在内的100多种点突变，此技术的优点是完全依赖于模板，假阳性低，通量高，可自动化，不足时在模板富集阶段还是采用普通的PCR，突变富集过程会因为PCR反应对高比例模板的偏好导致突变不能很好的富集，因而灵敏度较低。另一NCCN推荐Smart Amplification Process（SMAP）技术是一种恒温DNA扩增技术，适用于快速检测并且具有极高保真性，此技术采用了TaqMutS能够通过特异性地结合到错配扩增的产物上,抑制背景DNA在进入扩增循环中错误引发，为进一步防止错配引发，可在引物近3端设计错配碱基，该技术检测快捷，灵敏度和特异性都非常高，然而由于采用的是完全抑制错配引发，因而只要有一个点的错配就会抑制临近点的检测。飞行时间质谱（MALDI-TOF/ assArray）检测方法是一种快速廉价的检测方法，灵敏度在5%,其原理是通过将被测物质离子化，按离子的质荷比分离，测量各种离子谱峰的强度而实现分析样品的方法；液相分析芯片，原理是对去除野生型基因序列片段的突变序列进行富集后，与偶联在荧光微球上的特异探针杂交，杂交后的微球通过液相芯片（微流体技术）进行分析。微滴数字PCR，检测灵敏度和特异性在目前看来是一种理想的选择，在肿瘤检测方面很有潜力，然而目前市场中已有产品的技术成本较高，样本通量也不高。

近年来，研究发现在病人的外用血液中能够检测到癌细胞的游离DNA，成为良好的肿瘤早期诊断、治疗预后的生物标记。Kimura等 (2006 年)报道能够在循环血血清中检测到EGFR突变。认为检测这些外用血液中的突变DNA，

可以知道靶向药物靶标位点的分子学特征，从而判断哪个药物对病人最有效。但是，外用血液中癌细胞的突变DNA 是存在于大量野生型基因背景下的极为稀少的突变基因，其存在比率一般小于0.2% ，即便是手术切除的肺癌组织中也混杂了大量的正常细胞，而且并不是所有的肿瘤细胞都带有突变。上述方法不能满足越来越多的无创的突变检测需要，因此能否准确无创地检测这类稀有突变对现有检测技术提出了挑战。

本试剂盒基于多重PCR/LDR技术，具有高度特异性和灵敏性，适用于定性检测非小细胞患者中和激活或耐药相关的EGFR基因突变，即吉非替尼（易瑞沙）和厄洛替尼（特罗凯）药敏性位点，可准确检测EGFR18-21号外显子突变（见表1），检测结果仅供临床医生或相关研究人员参考及辅助指导用药，不能单独作为治疗依据。

发明内容

为了克服现有技术检测灵敏度和特异性方面的不足以及检测通量低的问题，现提供一种检测人类表皮生长因子受体EGFR基因突变的特异性多重PCR/LDR方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是，采用一种检测人类表皮生长因子受体EGFR基因突变的特异性多重PCR/LDR方法，其包括以下步骤:

(1) 人类表皮生长因子受体 (EGFR) 基因 18- 21号外显子的野生型基因序列和相应突变基因序列，设计多对高特异性引物和多个特异性连接探针。

(2) 配制引物预处理液及多重PCR扩增突变基因序列的反应体系和LDR检测反应体系。

(3) 步骤1)的各种特异性引物和特异性探针扩增待测的突变基因序列。

(4) 利用ABI3130检测连接酶反应产物，在突变检测位置出现信号表明存在该种突变。

1X引物预处理反应体系

MgC12 1-9 mmol

dNTP* 1-4mmol

特异性探针 0.02-2 umol

DNA 5-15ul

DNA聚合酶 0.5-3 U

模板 2-5 uL

总体积 20-50 uL

注： dNTP*主要包含dATP、dGTP、dCTP或dATP、dGTP、dTTP

所述引物预处理程序为95度预变性5分钟，10-25个循环 （94度变性 10 秒，50 退火5 秒），16度保存。

1X特异性多重PCR反应体系：

MgC12 1-9 mmol

dNTP 1-4 mmol

各对引物 0.02-1 umol

BSA 0.3-0.8 mg/ml

Taq 酶 0.5-3 U

模板 2-5 uL

总体积 20-50 uL

所述多重PCR的反应条件是95度预变性 15分钟，35个循环（94度变性15秒，62度退火50秒，65度延伸10秒）。

1XLDR 反应体系

10X连接酶缓冲液 1-9 mmol

各条探针 0.02-1 umol

耐热Taq连接酶 0.5-4 U

DNA预处理液 2-5 uL

总体积 20-50 uL

所述多重LDR 的反应条件是 95度预变性分钟，35个循环94度变性秒，62度退火秒，65 度延伸10秒）。

LDR反应实验结束后，取0.5uL LDR产物，加入到含有0.125uLROX标记的Standard的4.5ul HiDi中，混匀后进行毛细管电泳。

所述的缺失突变为肺癌患者表皮生长因子受体 (EGFR)基因 35 种常见突变，具体详见表1 :

表 1 :肺癌患者表皮生长因子受体 (EGFR)基因的 35 种突变

30余种突变一个LDR反应检测，所述特异性引物和特异性探针详见表2

表 2 特异性引物和特异性探针

SEQ ID	SEQUENCE	SEQ NAME
			1	CCTTCCAAATGAGCTGGCAAGT	Exon18F
2	CTCCCCACCAGACCATGAGAG	Exon18R
			3	GCATGTGGCACCATCTCACAAT	Exon19F
4	GAGAAAAGGTGGGCCTGAGGTT	Exon19R
			5	AGCCACACTGACGTGCCTCTC	Exon20F
6	CTCCTTATCTCCCCTCCCCGTA	Exon20R
			7	TTCATGCGCCTTTCCATTCTTT	Exon21F
8	GGTCCCTGGTGTCAGGAAAATG	Exon21R
			9	CTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT	G719
10	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGC	G719A
			11	GCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT	G719-0
12	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT	G719C
			13	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA	G719S
14	CCTTCAAGATCCTCAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT	E709
			15	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCCCAGCACTTTGATCTTTTTGAATTCAGTTG	E709A
16	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCCCAGCACTTTGATCTTTTTGAATTCAGTTC	E709G
			17	CGTGGACAACCCCCACGTGTGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT	S768
18	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCtccagGAAGCCTACGTGATGGCCAT	S768I
			19	TGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT	T790
20	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGCA	T790M
			21	GGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT	L858
22	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCG	L858R
			23	GCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT	L861
24	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACA	L861Q
			25	TGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT	L833
26	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTgGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCG	L833V
			27	TCAAGATCACAGATTTTGG	L858R SelfX
28	CCACCGTGCAGCTCATC	T790MSelfX
			29	ATTTTGGGCTGGCCA	L861QSelfX
30	CACTTTGATCTTTTTGAATTCAGTT	E709G/ASelfX
			31	TGCCGAACGCACCG	G719ASelfX
32	CCGAACGCACCGGAGC	G719S/CSelfX
			33	ACTACTTGGAGGACCGTC	L833VSelfX
34	TGGGGGTTGTCCAC	S768ISelfX

所述一种检测人类表皮生长因子受体EGFR基因30余种突变的多重PCR/LDR方法不包括对待测样品处理和模板提取步骤，但对于来自甲醒固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的短片段DNA依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。

本发明的检测优势在于:本发明在多重PCR/LDR技术的基础上，建立了多重依赖于DNA的特异性PCR/LDR，可在一管反应内检测30余种种人类表皮生长因子受体(EGFR) 基因突变，此方法:(1)可在一个PCR管里同时检测EGFR基因的30余种突变;(2)灵敏度高，1-10拷贝的突变即可检出;(3)特异性强，在野生型基因组DNA背景下不会有非特异信号;(4) 选择性能力强，可以在10ng野生型基因组DNA背景下检出0.1%的突变; (5)检测速度快，整个检测过程需要1.5-3个小时。

具体实施方式

发明以人类EGFR基因21号外显子的L858R突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及联合使用连接探针，从而实现快速准确、简单地同时检测30余种突变，而且检测突变的能力高达0.1%。

野生型质粒puc57的基因组 DNA为野生型模板，其他突变以经过基因工程构建的突变质粒作为突变模板，建立多重PCR/LDR 检测EGFR基因30余种突变的反应体系，并将此体系用于EGFR缺失突变的快速检测。此方法主要包括以下步骤:

(1)根据UCSC数据库公布的人类表皮生长因子受体EGFR基因野生型基序列和突变基因序列，设计多对高特异性引物和多条特异性探针。

(2) 待测样品处理和模板提取。

(3) 引物预处理及特异性多重PCR/LDR扩增。

(4) 检测扩增产物，根据产物片段大小所在的特定位置作为结果判断的标准。

步骤(1)中根据UCSC数据库公布的人类表皮生长因子受体 (EGFR)基因的野生型基因序列和突变基因序列，设计多对高特异性引物和多条特异性探针，详见表 3

步骤 (2)样品处理和模板提取，样品适用范围包括子术切除的新鲜病理组织，甲醇固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液等标本。新鲜病理组织，取绿豆大小，约 1g重，使用 Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组 DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。蜡块样品切成5-10μm切片，取8片，或己经制成的5-10μm切片取 8 片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋 DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用上海星耀医学科技发展有限公司的核酸提取试剂盒提取基因组 DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取全血200ul，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μ1。所提DNA 溶于Tris-HCl (10mmol/L，pH 8.0) ，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA 浓度到 2ng/μl作为PCR扩增的模板。

步骤(3)的引物预处理体系为:

1X引物预处理反应体系

MgC12 1-9 mmol

dNTP* 1-4mmol

特异性探针 0.02-2 umol

DNA 5-15ul

DNA聚合酶 0.5-3 U

模板 2-5 uL

总体积 20-50 uL

注： dNTP*主要包含dATP、dGTP、dCTP或dATP、dGTP、dTTP

所述引物预处理程序为95度预变性5分钟，10-25个循环 （94度变性 10 秒，50 退火5 秒），16度保存。

步骤(3)的1X特异性多重PCR反应体系：

MgC12 1-9 mmol

dNTP 1-4 mmol

各对引物 0.02-1 umol

BSA 0.3-0.8 mg/ml

Taq 酶 0.5-3 U

模板 2-5 uL

总体积 20-50 uL

所述多重PCR的反应条件是95度预变性 15分钟，35个循环（94度变性15秒，62度退火50秒，65度延伸10秒）。

步骤(3)的1XLDR 反应体系

10X连接酶缓冲液 1-9 mmol

各条探针 0.02-1 umol

耐热Taq连接酶 0.5-4 U

多重PCR产物 2-5 uL

总体积 20-50 uL

所述多重LDR 的反应条件是 95度预变性分钟，35个循环94度变性秒，62度退火秒，65 度延伸10秒）。

步骤 (4) 的LDR产物检测 检测 LDR反应实验结束后，取0.5uL LDR产物，加入到含有0.125uLROX标记的Standard的4.5ul HiDi中，混匀后进行毛细管电泳。以ROX标记的standard为标准，根据产物片段大小所在的特定位置作为结果判断的标准。

实施例 1

本例中以 EGFR 基因热点突变外显子21上的L858R突变为例来分析本发明的多重PCR/LDR检测 EGFR 基因30余种突变的方法。实验用质粒puc57(EGFR 基因野生型);10份健康的无偿献血者全血样品，7份临床肺癌样品 (胸腔积液)，20份临床肺癌样品（血清）。

利用上述特异性多重PCR/LDR检测EGFR基因热点突变外显子21上的L858R突变的方法包括以下步骤:

(1)样品处理和模板提取质控:

样品适用范围包括子术切除的新鲜病理组织，甲醇固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液等标本。新鲜病理组织，取绿豆大小，约 1g重，使用 Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组 DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。蜡块样品切成5-10μm切片，取8片，或己经制成的5-10μm切片取 8 片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋 DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用上海星耀医学科技发展有限公司的核酸提取试剂盒提取基因组 DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取全血200ul，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μ1。所提DNA 溶于Tris-HCl (10mmol/L，pH 8.0) ，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA 浓度到 2ng/μl作为PCR扩增的模板。

(2)引物预处理、多重PCR/LDR体系的配制及相应反应程

所述1X引物预处理反应体系

MgC12 1-9 mmol

dNTP* 1-4mmol

特异性探针 0.02-2 umol

DNA 5-15ul

DNA聚合酶 0.5-3 U

模板 2-5 uL

总体积 20-50 uL

注： dNTP*主要包含dATP、dGTP、dCTP或dATP、dGTP、dTTP

所述引物预处理程序为95度预变性5分钟，10-25个循环 （94度变性 10 秒，50 退火5 秒），16度保存。

所述1X特异性多重PCR反应体系：

MgC12 1-9 mmol

dNTP 1-4 mmol

各对引物 0.02-1 umol

BSA 0.3-0.8 mg/ml

Taq 酶 0.5-3 U

模板 2-5 uL

总体积 20-50 uL

所述多重PCR的反应条件是95度预变性 15分钟，35个循环（94度变性15秒，62度退火50秒，65度延伸10秒）。

所述1XLDR 反应体系

10X连接酶缓冲液 1-9 mmol

各条探针 0.02-1 umol

耐热Taq连接酶 0.5-4 U

多重PCR产物 2-5 uL

总体积 20-50 uL

所述多重LDR 的反应条件是 95度预变性分钟，35个循环94度变性秒，62度退火秒，65 度延伸10秒）。

(3)LDR产物检测

所述检测LDR反应实验结束后，取0.5uL LDR产物，加入到含有0.125uLROX标记的Standard的4.5ul HiDi中，混匀后进行毛细管电泳。以ROX标记的standard为标准，根据产物片段大小所在的特定位置作为结果判断的标准。

前述10份健康献血者全血样品以及质粒puc57(EGFR 基因野生型)经本发明的体系检测，样品无突变信号，进一步证明了多重PCR/LDR的特异性。

灵敏度分析:将突变质粒从0.1pg/μl连续10倍梯度稀释，分别为0.1png/μ L，0.01pg/μ L，0.001pg/μl，0.0001pg/μl，0.00001pg/μl，0.000001pg/μ L。每次反应加入 5μl DNA。 结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出。

选择性能力分析:固定每次 PCR 反应总 DNA 用量，0.1pg/ 反应和 0.01pg/ 反应。先将突变细胞质粒DNA和野生型质粒DNA浓度都调整为0.02pg/μl和0.002pg/μl。这样每个反应加5μl模板即为0.1pg/反应和0.00pg/反应。按下述方法配置模拟DNA模板。

A :50 %即为 0.1pg/μl 突变细胞 DNA。

B :30 %取 A 液 60 μl 后混入 40 μl 0.1pg/μl 野生质粒 DNA，震荡泪均。

C :20 %取 A 液 40 μl 后混入 60 μl 0.1pg/μl 野生质粒 DNA，震荡泪均。

D :15 %取 B 液 50 μl 后混入 50 μl 0.1pg/μl 野生质粒 DNA，震荡泪均。

E :10 %取 C 液 50 μl 后混入 50 μl 0.1pg/μl 野生质粒 DNA，震荡泪均。

F:5% 取 E 液 50 μl 后混入 50 μl 0.1pg/μl 野生质粒 DNA，震荡混均。

G :1 %取 F 液 20 μl 后混入 80 μl 0.1pg/μl 野生质粒 DNA，震荡混均。

重复性试验:每个反应分别加入突变质粒DNA0.01pg、0.001pg 和 0.0001pg，重复 10次进行多重PCR/LDR扩增，每次均检测到L858R突变信号。

收集手术切除的肺癌标本，全血和血浆标本以及胸水标本共27例，其中7 例胸水，20例血清。

对于外显子21，本发明检测结果与 DNA 测序结果完全一致 :27例样品中有5 例发生外显子L858R突变突变，22例正常肺组织对照均为野生型。

表 3 多重PCR/LDR检测结果与 DNA测序结果的比较

外显子21

检测类型 DNA测序 本明检测结果

检出例数 5 5

检出率 5/27 5/27

一致性 100% 100%

本发明一次特异性多重PCR/LDR反应就可以同时检测EGFR外显子19的30余种缺失，检测时间仅需1.5-3小时，因此本发明省时省力，准确性高，可满足突变的快速诊断。而且，该方法和传统测序方法结果的符合率为100%，多重PCR/LDR的灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，10ng人类样品DNA中含0.1%的突变DNA即可检出。

Claims (2)

1.富集人类突变EGFR基因目标区及突变检测的引物和探针，引物和探针序列如下:

SEQ ID SEQUENCE SEQ NAME 1 CCTTCCAAATGAGCTGGCAAGT Exon18F 2 CTCCCCACCAGACCATGAGAG Exon18R 3 GCATGTGGCACCATCTCACAAT Exon19F 4 GAGAAAAGGTGGGCCTGAGGTT Exon19R 5 AGCCACACTGACGTGCCTCTC Exon20F 6 CTCCTTATCTCCCCTCCCCGTA Exon20R 7 TTCATGCGCCTTTCCATTCTTT Exon21F 8 GGTCCCTGGTGTCAGGAAAATG Exon21R 9 CTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT G719 10 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGC G719A 11 GCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT G719-0 12 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT G719C 13 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA G719S 14 CCTTCAAGATCCTCAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT E709 15 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCCCAGCACTTTGATCTTTTTGAATTCAGTTG E709A 16 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCCCAGCACTTTGATCTTTTTGAATTCAGTTC E709G 17 CGTGGACAACCCCCACGTGTGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT S768 18 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCtccagGAAGCCTACGTGATGGCCAT S768I 19 TGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT T790 20 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGCA T790M 21 GGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT L858 22 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCG L858R 23 GCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT L861 24 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACA L861Q 25 TGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT L833 26 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTgGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCG L833V 27 TCAAGATCACAGATTTTGG L858R SelfX 28 CCACCGTGCAGCTCATC T790MSelfX 29 ATTTTGGGCTGGCCA L861QSelfX 30 CACTTTGATCTTTTTGAATTCAGTT E709G/ASelfX 31 TGCCGAACGCACCG G719ASelfX 32 CCGAACGCACCGGAGC G719S/CSelfX 33 ACTACTTGGAGGACCGTC L833VSelfX 34 TGGGGGTTGTCCAC S768ISelfX

。

2.一种试剂盒，至少包括:

权利要求1所述的引物和探针，以引物预处理液及多重PCR/LDR反应缓冲液。