CN102115792A

CN102115792A - 一种检测人结直肠癌kras基因突变的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN102115792A
Application number: CN 201010596774
Authority: CN
Inventors: 张泓; 姬云; 侯青
Original assignee: SUZHOU KEBEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SUZHOU KEBEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2010-12-20
Filing date: 2010-12-20
Publication date: 2011-07-06

Abstract

本发明涉及一种检测基因突变的方法和试剂盒，具体涉及一种检测 KRAS 基因 12 、 13 密码子突变的方法和试剂盒。该试剂盒包括： PCR 缓冲液、 dNTP 、 DNA 聚合酶、特异性引物对、荧光染料、水，特异性探针、野生型对照，其特征在于， DNA 聚合酶为 HotStarTaqDNA 聚合酶，荧光染料为 SYTO9 荧光染料， 1 ）按照常规方法采集待分析的基因组 DNA ； 2 ）对上述基因组 DNA 进行 PCR 扩增，得到 PCR 扩增产物；反应完成后，将 PCR 产物再进行变复性； 3 ）对上述 PCR 扩增产物进行熔解曲线分析，和野生型的基因组 DNA 的 PCR 扩增产物所产生的熔解曲线相比，突变型的基因组 DNA 的 PCR 扩增产物所产生的熔解曲线先下降。

Description

一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测基因突变的方法和试剂盒，具体涉及一种检测KRAS基因12、13密码子突变的方法和试剂盒。

背景技术

基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。RAS基因家族由KRAS、HRAS 和NRAS组成，基因家族的各成员相互间同源性可达85%。RAS基因编码的蛋白质是P21蛋白，分子量为21KD，由188-189个氨基酸组成，也称之为P21高度相关蛋白。P21蛋白位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参于传导细胞增生信号的调控系统。其激活状态为GTP结合状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活动性致癌基因的主要部位是第12、13 和61 密码子的突变，其中以第12 密码子点突变最常见。该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15-30%，在结直肠癌患者中为20-50%。

美国国家癌症综合网络(NCCN) 2010年版的临床指南4中明确指出：KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15-30%，在结直肠癌患者中为20-50%。NCCN指出KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药；使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物（西妥西单抗、帕尼单抗）产生耐药。所以NCCN提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。欧盟也明确规定，帕尼单抗的适应症为KRAS野生型的结直肠癌患者。因此KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。

但是，尽管KRAS基因突变的意义已得到公认，但是目前全球范围内仍缺乏标准化的检测方法。

传统的直接测序方法一直是公认的“金标准”，但是这种方法的灵敏度低，要求突变率达到20%-30%时才能检出，因此需要显微切割或选择性组织抽提来富集突变细胞。且费用高、通量低、检测周期长，临床应用局限性大。

限制性片段多态性分析（RFLP）虽然具有较高的灵敏度，但所检测的突变位点必须具有限制性内切酶的酶切位点，实际设计和操作复杂。

高效变性液相（dHPLC）的灵敏度在5%-10%之间，但只能区分杂合型样本，当检测纯合型样本时，需要掺入野生型样本混合成杂合型来检测，带来额外的检测费用、延长了检测周期。

上面的几种检测方法由于自身的缺陷，在临床应用方面局限性较大，至今仍然只是作为一种检测方法，而非成品试剂盒。

而目前欧洲比较流行的检测KRAS的分子信标-扩增阻滞系统（molecular beacon-ARMS）的技术，已做成试剂盒，也是全世界唯一的一个成熟的KRAS检测试剂盒，灵敏度可达1%左右，但一个样品就要检测8管反应，还需要分子信标探针，单个样品的操作繁琐、且成本很高。

高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。HRM既可以对未知突变进行筛查、扫描，也可以对已知突变进行分析。相对于传统的突变分析而言，操作步骤大大简化，时间和成本也降低了不少。而且样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。

现有技术中，采用高分辨率熔解分析KRAS基因突变的报道有：

1、陈志红等人报道了一种HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS基因突变的方法，应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况，并与直接测序法的结果进行比较分析，结果HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可获得检测结果。HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10%的突变，其检测灵敏度达10%；HRM法从60份大肠癌患者组织标本中，检出17份KRAS基因密码子12或13突变(28.3%)；直接测序法检出15份(25.0%)突变，2份未检出KRAS基因突变，HRM法检测的敏感度为100%(15/15)，特异度为96%(43/45)，可见：HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时，具有操作简便、快速、灵敏，单管避免污染等优点（参见：陈志红.中华检验医学杂志. 2010 33(3) ）。

、苏州为真生物医药有限公司销售一种K-RAS基因突变试剂盒，采用新型突变研究技术——高分辨率熔点曲线分析，应用配有HRM模块的荧光定量PCR仪器（如LightCylcer480等）分析，即可完成对样品基因型的判断，具有以下特点：高通量：1次可检测10-300个样本。高敏度：HRM检测灵敏度能达到1％-0.1％，是传统“PCR＋测序”方法的25-250倍。特异性好：PCR产物无需后续处理，特异性达100％；重复性好：实验闭管进行，避免交叉污染。精确度高：精确获得K-RAS基因多个位点状况，包括已知的7个热点突变（第12编码子核苷酸突变，第13编码子核苷酸突变和第61编码子核苷酸突变），也可同时侦测未知突变。适用范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。而传统“PCR＋测序”方法对大部分不能手术的患者难以检测。

现有试剂盒对HRM技术作了较大的改进，可一次检测7个热点突变，包括了密码子12、13和61，同时可以筛查未知突变。但是，现有技术仍然没有解决HRM检测无法进行基因分型的致命缺陷，虽可同时检测多达7种的热点突变，却无法区分这些突变的具体位点，在科研和临床工作中，往往需要后续的PCR富集和测序来对检出的突变进行基因分型，将与结直肠癌的预后和靶向治疗疗效密切相关的密码子12、13突变与其他突变有效的区分开来。

发明内容

本发明目的是提供一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的方法和试剂盒，通过对引物、检测试剂以及检测条件的优化，使该试剂盒的操作简单快速、检测结果更为稳定、检测成本也更低。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的方法，包括以下步骤：

1）按照常规方法采集待分析的基因组DNA；

2）对上述基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；反应完成后，将PCR产物再进行变复性；

3）对上述PCR扩增产物进行熔解曲线分析，和野生型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线相比，突变型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线先下降；

其中，步骤2）中，PCR扩增使用的特异性引物对选自：引物对A、引物对B或引物对C；其中，引物对A包括：正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2，引物对B包括：正向引物SEQ ID No：3和反向引物SEQ ID NO：4，引物对C包括：正向引物SEQ ID No：5和反向引物SEQ ID NO：6；

每20μl的PCR扩增体系包括：基因组DNA溶液、2μl PCR缓冲液（10×）、0.6-1.0μl氯化镁溶液、1.6μl dNTP、0.1-0.3μl HotStarTaq DNA聚合酶、100-200nM正向引物和100-200nM反向引物、2-5μl SYTO 9 荧光染料，其余为水；

PCR扩增的过程为：95℃ 15分钟，95℃ 10-15秒，60℃ 10-15秒，72℃ 10-15秒，进行20-25个循环，81℃ 10-15秒，60℃ 10-15秒，72℃ 10-15秒，15个循环，72℃ 2分钟；

反应完成后，将PCR产物再进行变复性，95℃ 30秒，50℃ 1分钟。

上述技术方案中，步骤2）中加入的基因组DNA溶液的体积根据提取液中DNA浓度而调整，使加入的DNA量达到10ng。

上述技术方案中，步骤3）中，PCR扩增产物样本在LightCycler 480仪中进行熔解曲线分析。仪器以0.2℃/s的速度从72℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线。

本发明同时要求保护一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的试剂盒，该试剂盒包括：PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、特异性引物对、荧光染料、水和野生型对照，其中，DNA聚合酶为HotStarTaq DNA聚合酶，荧光染料为SYTO 9 荧光染料，特异性引物对选自：引物对A、引物对B或引物对C；其中，引物对A包括：正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2，引物对B包括：正向引物SEQ ID No：3和反向引物SEQ ID NO：4，引物对C包括：正向引物SEQ ID No：5和反向引物SEQ ID NO：6。

上述技术方案中，所述DNA聚合酶具有热启动特征，活力为5个单位每微升；所述DNA荧光染料为饱和荧光染料SYTO 9，浓度为50μM。

上述技术方案中，10×的PCR缓冲液（数字10表示使用时稀释的倍数），由Tris·Cl，KCl，(NH ₄ ) ₂ SO ₄ ，15mM MgCl ₂ 组成，pH 8.7。

上述技术方案中，所述的mM和μM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含溶质的摩尔数。

上述技术方案中，所述的SYTO 9是高灵敏度的DNA荧光染料，可与双链DNA结合，在高浓度的情况下对PCR反应仍没有抑制作用。

上述试剂盒可以测定人源的基因组DNA，样品没有限制如，体液（包括血液、腹水）、组织细胞（肿瘤组织）等，通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。

上述技术方案中，从基因组DNA中，可扩增含KRAS12、13密码子的DNA片段，以获得用于测定熔解曲线，本发明中，设计的引物位于人KRAS基因外显子2中，具体序列为SEQIDNo：8。这种通过扩增含KRAS12、13密码子的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。例如，可按PCR方法，使用引物进行扩增，此引物经合理设计以便仅扩增含KRAS12、13密码子的部分。本发明特异性引物为本发明的发明点之一，该引物本领域技术人员可经常规制备引物的方法制备。待扩增区的碱基长度不受限制，但推荐小于150个碱基的片段。当按本发明所述制备引物时，可获得适宜的测定样品，其作为扩增的DNA片段，并具有特异性长度。

本发明的另一目的是提供一种含有特异性探针的检测人结直肠癌KRAS基因突变的试剂盒，弥补HRM检测只能进行突变筛查的缺点，实现基因分型。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种检测人结直肠癌KRAS基因分型的方法，包括以下步骤：

1）按照常规方法采集待分析的基因组DNA；

2）对上述基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；反应完成后，将PCR产物再进行变性熔解；

3）对上述PCR扩增产物进行熔解曲线分析，和野生型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线相比，突变型的基因组DNA的PCR扩增产物所产生的熔解曲线先下降；在通过PCR扩增产物的熔解曲线确定突变后，如果扩增产物在探针区的熔解曲线也先下降，则说明突变发生在密码子12、13的位置，而不是PCR扩增片段的其他区域；

步骤2）中，PCR扩增使用的特异性引物对选自：引物对A、引物对B或引物对C；其中，引物对A包括：正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2，引物对B包括：正向引物SEQ ID No：3和反向引物SEQ ID NO：4，引物对C包括：正向引物SEQ ID No：5和反向引物SEQ ID NO：6；特异性探针SEQ ID No：7；

每20μl的PCR扩增体系包括：基因组DNA溶液，使加入的DNA量达到10ng、2μl PCR缓冲液（10×）、0.6-1.0μl氯化镁溶液、1.6μl dNTP、0.1-0.3μl HotStarTaq DNA聚合酶、100-200nM正向引物和20-40nM反向引物、2-5μl SYTO 9 荧光染料，100-200nM特异性探针其余为水；

PCR扩增的过程为：95℃ 15分钟，95℃ 10-15秒，60℃ 10-15秒，72℃ 10-15秒，进行20-25个循环，81℃ 10-15秒，60℃ 10-15秒，72℃ 10-15秒，进行15个循环；72℃ 2分钟；

反应完成后，将PCR产物再进行变复性，90℃30秒，50℃1分钟。

上述技术方案中，步骤3）中，PCR扩增产物样本在LightCycler 480仪中进行熔解曲线分析。仪器以0.2℃/s的速度从55℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线。

本发明同时要求保护一种含有特异性探针的检测人结直肠癌KRAS基因突变的试剂盒，该试剂盒包括：PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、特异性引物对、荧光染料、水，野生基因对照，该试剂盒还包括特异性探针；其中，DNA聚合酶为HotStarTaq DNA聚合酶，荧光染料为SYTO 9 荧光染料，特异性探针的DNA序列为SEQ ID No：7；特异性引物对选自：引物对A、引物对B或引物对C；其中，引物对A包括：正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2，引物对B包括：正向引物SEQ ID No：3和反向引物SEQ ID NO：4，引物对C包括：正向引物SEQ ID No：5和反向引物SEQ ID NO：6；特异性探针SEQ ID No：7。

本发明的主要原理是：1）采用HRM技术在PCR反应前加入饱和荧光染料，在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性，使DNA双链逐渐解链，此时荧光染料分子逐渐从DNA双链上脱落，荧光信号下降。KRAS密码子12、13发生突变后，经过特异性引物扩增的PCR产物的熔解温度（Tm值）降低，在温度逐渐升高的时候会首先发生解链，其荧光信号首先下降，而此时的野生型PCR产物由于解链温度较高，荧光信号需要在更高的温度下才会开始下降，LightCycler480通过光学检测荧光信号并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型和突变型。

）COLD-PCR是一项新的低丰度突变富集技术，它与常规PCR的最大区别是在PCR过程中采用了关键变性温度（Tc），这个Tc比标准的变性温度低，因此在Tc温度的情况下，只有异源双链会变性解链并随后与引物配对扩增，而变性温度较高的同源双链则不会解链，从而也不能扩增。数个循环后，突变型基因组得到了优势扩增，在总基因组中所占比例增加，得到了突变富集的目的。由于起始的模板量较少，我们选择采用了常规PCR与COLD-PCR结合的技术路线，先使用的标准变性温度，进行20-25个循环的常规PCR；紧接着，采用的关键变性温度，进行10-15个循环的COLD-PCR。

）特异性探针结合HRM技术，在突变筛查基础上可以进行基因分型。特异性探针包含了KRAS 12、13密码子，且与扩增产物互补。在PCR体系中，我们调整了反向引物的浓度，其浓度为正向引物的五分之一，这样的不对称PCR可以大量扩增出正向引物的PCR产物，而只扩增少量反向引物产物。在熔解初期，特异性探针与大量单链正向引物产物互补配对，由此在熔解过程中，随着温度的升高会先后出现两段荧熔解曲线，一段是由特异性探针引起的，另一段则是常规的双链PCR产物引起的。当常规的双链PCR产物的熔解曲线显示为突变型时，我们可以通过特异性探针的熔解曲线来确定突变是否发生在密码子12、13位置，或是发生在其他位置的新突变。

因此，本发明通过上述优化的引物，根据PCR方法扩增所需DNA片段。光学检测荧光信号变化产生温度熔解曲线证实，它们显示不同的熔解曲线。根据在上述方法中获得的熔解曲线，可测定KRAS 12、13密码子突变情况。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、本发明提供的KRAS 12、13密码子突变检测试剂盒，采用的是一种生物学的检测方法，与现有检测试剂盒相比，具有显著的进步，如本发明试剂盒对于样本没有特殊的限制，无论是体液还是细胞均可作为本发明的检测样本，使得检测方便快捷。

、本发明设计的特异性引物对待扩增区的碱基长度无严格要求，通过本发明特异性引物可获得本发明所述的PCR产物并进行高分辨率熔解曲线分析。

、本发明在PCR反应体系中添加了特异性的探针，通过不对称PCR反应，可将已知的与结直肠癌最为密切相关的密码子12、13突变与扩增片段内的其他突变位点有效区分，基因分型更为精确。

、本发明与现有技术相比引入了COLD-PCR富集技术，操作简便，检测成本低廉，且检测结果准确，灵敏度高达0.1%-0.05%，具有很好的临场应用价值和市场价值。

附图说明

图1实施例二中野生型、纯合突变以及杂合突变三种基因型的熔解曲线；

图2实施例三中敏感性实验熔解曲线；

图3实施例四中全血基因组和石蜡固定组织基因组的熔解曲线；

图4实施例四中全血基因组和石蜡固定组织基因组的熔解峰。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：样本的选择和基因组DNA的提取

收集的基因组DNA分别来源于全血、细胞、新鲜组织以及石蜡固定组织，提取方法参照试剂盒提供的操作手册，同时做了部分优化。

健康人全血基因组DNA作为实验的野生型对照，使用康为世纪的BloodGen Mini Kit提取；

来源于A549细胞株的基因组DNA作为实验的纯合突变型（G34A）对照，

来源于HCT116细胞株的基因组DNA作为实验的杂合突变型（G38A）对照，使用康为世纪的DNA FlexGen DNA Kit 提取；

而新鲜组织和石蜡组织均来源小鼠，用于评估HRM方法对固定组织的适应性，使用康为世纪的DNA TissueGen DNA Kit提取；

细胞株	组织来源	突变情况	基因型	氨基酸
					A549	肺癌组织	34G >A	纯合子	G12S
HCT116	结直肠癌	38G >A	杂合子	G13D

*12、13密码子突变是KRAS最常见的突变基因型

基因组DNA全部符合实验室质控要求：OD260/280介于1.8-2.0；电泳结果显示，除石蜡固定组织外，其余基因组DNA片段都是10kb以上的大片段，而石蜡固定组织的基因组DNA存在部分降解，片段大小分布在1000-23kb之间。

溶液浓度调整至10ng每微升，-20℃保存备用。

实施例二：突变位点的识别

采用HRM技术对已知KRAS 12、13密码子基因型的样本进行检测。

．特异性引物和探针如下：

SEQ ID No：1，正向引物1：5’-GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’

SEQ ID No：2，反向引物1：5’-TATCGTCAAGGCACTCTTGC-3’

SEQ ID No：7，特异性探针：5’-CTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACT-3’。

．通过PCR扩增12/13密码子附近部分片段；制备混合液：加入之前制备的基因组DNA溶液1μl、2μl PCR缓冲液（10×）、1.6μl dNTP、0.1μl HotStarTaq DNA聚合酶、正向引物0.4μl和反向引物各0.08μl、SYTO 9 荧光染料 2μl，加PCR级别的纯水使反应体积为20μl。反应在95℃ 15分钟，95℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 15秒，进行20个循环，81℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 15秒，进行15个循环，72℃ 2分钟；反应完成后，将PCR产物再进行变复性，95℃ 30秒，50℃ 1分钟。

．通过将样本在LightCycler 480仪中进行熔解曲线分析。仪器以0.2℃/s的速度从72℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线，如图1所示，图1为KRAS 12/13密码子分型数据图；根据样品的熔解曲线，区分基因型。

上述实施例结果验证：

由于KRAS密码子12、13发生突变，使得纯合突变PCR扩增产物的熔解温度降低，随着温度的升高，纯合突变型的扩增产物首先开始解链，荧光信号随之开始下降；而野生型PCR扩增产物由于熔解温度较高，只有温度继续升高时，才会开始解链，荧光信号才会开始下降；而杂合突变的PCR产物兼有纯合突变和野生型PCR扩增产物的特点，有一部分突变的扩增产物和纯合突变型扩增产物一同开始解链，荧光值同时下降，另一部分未突变的扩增产物与野生型扩增片段一同开始解链，荧光值同时下降并一同结束。根据上述特点，可将突变型（包括纯合、杂合突变）与野生型基因组有效区分。

实施例三：试剂盒敏感性验证

将A549纯合突变型基因组与全血中提取的野生型基因组按一定比例混合，使A549基因组占总DNA量的0.05%。上述混合基因组DNA与野生型基因组DNA浓度调整为10ng每微升。

．特异性引物如下：

SEQ ID No：1，正向引物1：5’-GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’

SEQ ID No：2，反向引物1：5’-TATCGTCAAGGCACTCTTGC-3’

SEQ ID No：7，特异性探针：5’-CTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACT-3’。

．通过PCR扩增12/13密码子附近部分片段；制备混合液：加入之前制备的基因组DNA溶液1μl、2μl PCR缓冲液（10×）、1.6μl 2.5mM dNTP、0.1μl HotStarTaq DNA聚合酶、正向引物0.4μl和反向引物各0.08μl、SYTO 9 荧光染料 2μl，特异性探针200nM，加PCR级别的纯水使反应体积为20μl。反应在95℃ 15分钟，95℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 15秒，进行20个循环，81℃ 15秒， 15秒， 15秒，进行15个循环，72℃ 2分钟；反应完成后，将PCR产物再进行变复性，95℃ 30秒，50℃ 1分钟。

．通过将样本在LightCycler 480仪中进行熔解曲线分析。仪器以0.2℃/s的速度从72℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线，如图2所示，图2为KRAS 12/13密码子分型数据图；根据样品的熔解曲线，区分基因型。

上述实施例结果分析：

按实施例2中提到的分型方法，我们可以明确区分检测的0.05%样品和纯合突变以及野生型对照。具体基因学如图中所示，本实施例说明传统的PCR-HRM技术在引入COLD-PCR之后，敏感性大为提高，最高可达0.05%。

实施例四：试剂盒的通用性验证

临床检测中，固定组织标本是很多的，从中提取的基因组DNA大多会发生降解、断裂，会对PCR产生一定的影响，所以必须确认本发明试剂盒是否适合用于固定组织提取的基因组DNA的突变检测。

取全血提取基因组；另外取石蜡包埋的小鼠组织，提取基因组，定量并稀释至10ng每微升。

．特异性引物如下：

SEQ ID No：1，正向引物1：5’-GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’

SEQ ID No：2，反向引物1：5’-TATCGTCAAGGCACTCTTGC-3’。

．通过PCR扩增12/13密码子附近部分片段；制备混合液：加入之前制备的基因组DNA溶液1μl、2μlPCR缓冲液（10×）、1.6μldNTP、0.1μlHotStarTaqDNA聚合酶、正向引物0.4μl和反向引物各0.08μl、SYTO9荧光染料2μl，加PCR级别的纯水使反应体积为20μl。反应在95℃15分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，进行20个循环，81℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，进行15个循环，72℃2分钟；反应完成后，将PCR产物再进行变复性，95℃30秒，50℃1分钟。

．通过将样本在LightCycler 480仪中进行熔解曲线分析。仪器以0.2℃/s的速度从72℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线，如图2所示，图3为KRAS 12/13密码子分型数据图；根据样品的熔解曲线，区分基因型。

上述实施例结果分析：

以全血基因组DNA为对照，观察固定组织基因组DNA的熔解曲线。结果如图3、4。未调整前的熔解曲线如图3显所，固定组织基因组DNA的熔解曲线形状与全血基因组DNA的完全一致，几乎在一条曲线上，是典型的纯合型熔解曲线；熔解峰型图如图4所示，虽然固定组织基因组DNA的荧光信号较弱，但是峰型和熔解温度值（Tm）是与野生型对照一致的，荧光信号弱是因为PCR效率低导致的，但这并不影响区分样本的基因型。

实施例五：检测试剂盒

本发明试剂盒由以下试剂组成，来源如下，本发明试剂盒供10人份检测应用，-20℃保存：

组分	体积(μl)	来源
			PCR 缓冲液 (10×)	25	Qiagen
dNTP混合液 (每种碱基2.5mM)	20	Takara
			MgCl2（25mM）	10	Qiagen
FO 引物 (10μM)	6	自制
			RE 引物 (2μM)	6	自制
特异性探针（10μM）	6	自制
			HotStarTaq DNA聚合酶(5U/μl)	1.5	Qiagen
SYTO 9饱和荧光染料（50μM）	25	Invitrogen

<110> 苏州科贝生物技术有限公司

<120> 一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的方法和试剂盒

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tatcgtcaaggcactcttgc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gcctgctgaaaatgactgaa 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gtatcgtcaaggcactcttg c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gcctgctgaaaatgactgaa 20

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgaattagctgtatcgtcaa ggcact 26

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ctcttgcctacgccaccagc tccaact 27

<210> 8

<211> 122

<212> DNA

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 8

gcctgctgaaaatgactgaa tataaacttg tggtagttgg agctggtggc gtaggcaaga 60

gtgccttgacgatacagcta attcagaatc attttgtgga cgaatatgat ccaacaatag 120

ag 122

Claims

1. 一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）按照常规方法采集待分析的基因组DNA；

步骤2）中，PCR扩增使用的特异性引物对选自：引物对A、引物对B或引物对C；其中，引物对A包括：正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2，引物对B包括：正向引物SEQ ID No：3和反向引物SEQ ID NO：4，引物对C包括：正向引物SEQ ID No：5和反向引物SEQ ID NO：6；

反应完成后，将PCR产物再进行变复性，90℃30秒，50℃1分钟。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中加入的DNA提取液的体积根据提取液中DNA浓度而调整，使加入的DNA量达到10ng。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，PCR扩增产物样本进行熔解曲线分析时，以0.2℃/s的速度从72℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线。

4. 一种检测人结直肠癌KRAS基因突变的试剂盒，该试剂盒包括：PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、特异性引物对、荧光染料、水和野生型对照，其特征在于，DNA聚合酶为HotStarTaq DNA聚合酶，荧光染料为SYTO 9 荧光染料，特异性引物对选自：引物对A、引物对B或引物对C；其中，引物对A包括：正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2，引物对B包括：正向引物SEQ ID No：3和反向引物SEQ ID NO：4，引物对C包括：正向引物SEQ ID No：5和反向引物SEQ ID NO：6。

5. 一种检测人结直肠癌KRAS基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）按照常规方法采集待分析的基因组DNA；

每20μl的PCR扩增体系包括：基因组DNA溶液、2μl PCR缓冲液（10×）、0.6-1.0μl氯化镁溶液、1.6μl dNTP、0.1-0.3μl HotStarTaq DNA聚合酶、100-200nM正向引物和20-40nM反向引物、2-5μl SYTO 9 荧光染料，100-200nM特异性探针其余为水；

反应完成后，将PCR产物再进行变复性，90℃30秒，50℃1分钟。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）中加入的DNA提取液的体积根据提取液中DNA浓度而调整，使加入的DNA量达到10ng。

7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3）中，PCR扩增产物样本在进行熔解曲线分析时，仪器以0.2℃/s的速度从55℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线。

8. 一种含有特异性探针的检测人结直肠癌KRAS基因突变的试剂盒，该试剂盒包括：PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、特异性引物对、荧光染料、水和野生型对照，其特征在于，该试剂盒还包括特异性探针；其中，DNA聚合酶为HotStarTaq DNA聚合酶，荧光染料为SYTO 9 荧光染料，特异性探针的DNA序列为SEQ ID No：7；特异性引物对选自：引物对A、引物对B或引物对C；其中，引物对A包括：正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2，引物对B包括：正向引物SEQ ID No：3和反向引物SEQ ID NO：4，引物对C包括：正向引物SEQ ID No：5和反向引物SEQ ID NO：6；特异性探针SEQ ID No：7。