CN101381779A - kRas基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测kRas基因突变的核酸探针、液相芯片及检测方法。所述kRas基因突变检测液相芯片，包括有：包被有氨基修饰的针对kRas基因密码子Codon 12、13和/或61的野生型和突变型探针的微球，以及用于扩增出富集有kRas基因密码子Codon 12、13和/或61的需检测的相应突变位点的、末端具有生物素标记目标序列的引物，本发明所提供的方法快速，准确，操作简便，且可在一个孔中同步检测多个突变位点，大大提高检测效率。本发明所述液相芯片可用于kRas基因突变检测，可作为胰腺癌早期诊断的辅助，并且可准确预测分子靶向药物治疗的有效性，便于临床准确用药，避免不必要治疗的时效损失和经济损失。

Description

kRas基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的是涉及kRas基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法。
背景技术
一、kRas基因突变与胰腺癌的早期诊断
Ras基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。Ras基因家族由kRas、hRas和nRas组成，基因家族的各成员相互间同源性可达85％。Ras基因编码的蛋白质是P21蛋白。P21蛋白位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参于传导细胞增生信号的调控系统。其激活状态为GTP结合状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活动性致癌基因的主要部位是第12、13和61密码子的突变。kRas基因激活在胰腺癌的发生中已有肯定的研究，其中以kRas12密码子点突变最常见。突变的kRas蛋白p21仅有微弱的GTP酶活性，不能迅速分解GTP，因此ras信号传导蛋白“锁定”在GTP结合的激活状态，活化状态的ras信号蛋白通过细胞信号传导途径造成细胞不可控制地增殖、恶变。
kRas基因的突变率在不同的肿瘤组织中并不相同。在结肠癌中，其突变频率为43％，肺癌中为30％，甲状腺癌中为29％，膀胱、肝、肾和子宫癌中，则该突变发生频率为10％或低于10％。
在胰腺癌中，kRas基因的突变率高达75％-95％，突变几乎总是发生在第12位密码子上，突变方式也几乎皆为CGT、GTT及GAT，而正常胰腺组织、急慢性胰腺炎、胰岛素瘤、胰腺良性囊肿及胰腺其他疾病均无K-ras基因突变。同时，kRas基因突变是胰腺癌发生过程中早期即有的一种表现，且在肿瘤发生过程中突变率不同：增生期26％，乳头增生期46％，原位癌期76％，腺癌期80％，淋巴转移期43％。因此，检测kRas基因第12位密码子有无突变，有助于临床判断胰腺肿块的良恶性及胰腺癌的诊断。从胰液、胆汁、十二指肠液、粪便、外周血中检测K-ras基因12密码子点突变是胰腺癌诊断的一个重要辅助工具。
二、kRas基因突变与非小细胞肺癌对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药
kRas基因是表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路中的一个关键的下游调节分子。EGFR是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，为ErbB家族的四个成员之一，因此又名HER1或ErbB1。EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，为以EGFR为靶向的肿瘤治疗和针对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。因此，以表皮生长因子受体(EGFR)为治疗靶标的分子靶向治疗成为国内外肿瘤界关注的焦点。其中，EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(Genfitinib，Irressa)和厄洛替尼(Erlotinib，特罗凯，Tarceva)已被美国食品药品监督管理局批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。我国在2005年2月也批准了吉非替尼进入临床。这些药物用于其他肿瘤(如乳腺癌、结肠癌和胃癌等)的治疗，目前也已经进入临床试验阶段。
吉非替尼，厄洛替尼是一种口服的小分子EGFR拮抗剂，可与ATP竞争结合EGFR酪氨酸激酶区的ATP结合袋从而抑制EGFR的活性，已应用于晚期和不适宜传统化疗方案的非小细胞肺癌患者的临床治疗，是目前对于部分NSCLC患者治疗最有效的药物。然而，患者对这种分子靶向药物的反应性与个体的遗传背景相关。2004年6月，美国哈佛医学院的研究人员Lynch等和Paez等率先报道，肺癌细胞中EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变是靶向治疗药物奏效的一个必要前提条件。研究结果显示，对EGFR酪氨酸激酶基因编码区突变型肿瘤，吉非替尼的有效率高达80％以上，而对无突变的野生型肿瘤上述药物基本无效。这一最新研究结果发表后受到了各国学者的高度重视，并在不足一年的时间内相继被美国、日本、韩国和我国(包括台湾)学者的研究所证实(Pao W等，2004；Han SW等，2005；Mitsudomi T等，2005；HuangSF等，2004；Mu XL等，2005)。
EGFR外显子19的缺失突变和外显子21的点突变使患者对吉非替尼，厄罗替尼等靶向治疗药物敏感，而另外有些突变则使患者对这些药物耐受，或者称耐药性。耐药性分原发性耐药和继发性耐药(获得性耐药)。EGFR外显子20的T790点突变与靶向治疗药物的继发性耐药相关。而位于EGFR信号传导通路下游的编码GTP酶的kRas基因突变则是吉非替尼(Gefitinib)、厄罗替尼(Erlotinib)原发耐药的原因。大约15％-30％的非小细胞肺癌患者(NSCLC)中存在kRas基因点突变，并与患者靶向治疗的预后差相关。这些突变多位于第二外显子的12和13密码子。研究表明，有kRas基因突变的非小细胞肺癌对激酶抑制剂吉非替尼和厄罗替尼的敏感性差。这一发现最早由William Pao等人报道。研究者选择了60位对吉非替尼或厄罗替尼治疗敏感与不敏感的腺癌病人，检测其EGFR突变与kRas突变情况。在所有对吉非替尼或厄罗替尼治疗不敏感的病人中，有24％(9/38)的病人存在kRas基因的突变；而所有对这两个靶向治疗药物敏感的病人中，没有一个存在kRas基因突变(0/21)。
2006年，Baoli Qin等人则在细胞水平上研究了EGFR信号传导通路的关键分子与吉非替尼靶向治疗耐药性之间的关系。作者发现Src和Ras基因的激活可使肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性增强30倍至200倍。此外，韩国的Sae-Won Han等人(Clinical Cancer Res 2006；12(8))选择69位接受吉非替尼治疗的非小细胞肺癌病人，检测EGFR基因拷贝数，K-ras基因突变，HER2，EGFR外显子18-21的突变，以及Akt的磷酸化状况来研究与吉非替尼药物敏感性相关的因素。分析结果显示，kRas突变的患者均对吉非替尼治疗不敏感。在EGFR野生型患者中，携带kRas突变或者p-Akt过表达的患者均存在较差的治疗效果，且容易复发(P＝0.017)。一般来讲，kRas突变和EGFR突变是相互排斥的，EGFR突变主要见于不吸烟者，而kRas突变更常见于吸烟相关的癌症。
三、kRas基因突变与结直肠癌对西妥昔单抗的耐药
kRas基因的突变不仅与非小细胞肺癌对吉非替尼，厄罗替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制剂的原发耐药相关，最近的研究还发现这一基因突变还与结直肠癌对西妥西单抗的耐药性密切相关。
表皮生长因子受体(EGFR)靶向药物西妥昔单抗对难治性结直肠癌有效，与伊立替康为主的化疗方案联合应用时，有助于克服伊立替康耐药。但是，仅部分患者能从西妥昔单抗治疗中获益，因此明确疗效预测因素非常重要。
法国巴黎笛卡尔大学Lievre等报告，采用西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌患者，肿瘤kRas突变可预测治疗有效性和患者生存率(Cancer Res 2006；66：(8))。
研究者发现，肿瘤细胞kRas突变与西妥昔单抗耐药和总生存期(OS)较短相关。在30例用西妥昔单抗治疗的转移性结肠癌患者中，作者通过测序法分别检测了kRas，BRAF以及PIK3CA基因的突变情况。研究发现30例患者中，西妥昔单抗对11例患者有效，而19例患者无疗效反应。在这19例患者中，68.4％的患者存在kRas基因的突变，而11例西妥昔单抗治疗有效的患者中均不存在kRas基因突变。同时，没有kRas基因突变的患者其总生存期与存在kRas基因突变的患者相比具有显著的差别(分别为16.3个月与6.9个月，P＝0.016)。
在此基础上，研究者纳入89例伊立替康耐药的结直肠癌患者进行了回顾性分析[J ClinOncol 2008，26(3)：374]。患者分别接受伊立替康加西妥昔单抗(88％)、西妥昔单抗加氟尿嘧啶和叶酸(10％)、单纯西妥昔单抗(2％)治疗。
免疫组化显示，所有患者均高表达EGFR。总体上，西妥昔单抗对26例患者有效。西妥昔单抗治疗对24例有kRas突变的患者均无效，治疗有效者均为无突变患者(26/65例，P<0.001)。无突变患者的无进展生存期(PFS)和OS均显著长于有突变患者(PFS：31.4周对10.1周，P＝0.0001；OS：14.3个月对10.1个月，P＝0.026)。
该研究与其他数项已发表的研究结果一致，提示在难治性结直肠癌患者开始西妥昔单抗治疗前，应该充分考虑检测kRas突变情况，这样可能既有利于节约治疗成本，避免无谓地使用昂贵试剂，又能使患者受益，使其免受无谓治疗的毒性作用。
四、kRas突变检测试剂目前的开发状况
目前的kRas基因突变检测产品多数采用实时荧光定量PCR的方法，检测的灵敏度最低为野生型中1-2％的突变型，同时该方法存在着假阳性率偏高的问题。利用液相芯片技术平台进行kRas基因突变检测的产品在国内外均属空白。
另外，由于肿瘤的异质性，游离核酸中可能仅有非常小量的突变基因，而含有大量的野生型基因，混杂的大量野生型基因会阻碍突变基因的检出，因此如何排除野生型序列对kRas基因突变检测的干扰是首要解决的一个关键问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供用于kRas基因突变检测的探针序列。
实现上述目的的技术方案如下：
用于kRas基因突变检测的探针，包括有：
针对kRas基因密码子Codon 12的：5’GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG3’、和引入酶切位点BstOI的5’GACCTGGTGGCGTAGGCAAG3’的野生型探针，以及选自碱基序列为5’GACCTCGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTAGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTTGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTGATGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTGCTGGCGTAGGCAAG3’、和5’GACCTGTTGGCGTAGGCAAG3’中的一种或多种的引入酶切位点BstOI的突变型探针；和/或
针对kRas基因密码子Codon 13的：5’AGCTGGTGGCGTAGGCAAGA3’、和引入酶切位点NarI的5’AGCTGGTGGCGCCGGCAAGA3’野生型探针，以及选自碱基序列为5’AGCTGGTGACGCCGGCAAGA3’和5’AGCTGGTTGCGCCGGCAAGA3’中的一种或二种引入酶切位点NarI的突变型探针；和/或
针对kRas基因密码子Codon61的：5’AGCAGGTCAAGAGGAGTACAGT3’野生型探针、引入酶切位点BclI的5’AGCTGATCAAGAGGAGTACAGT3’、和引入酶切位点BglII的5’AGCAGGTCAAGATCTGTACAGT3’的野生型探针，以及选自引入酶切位点BclI的碱基序列为5’AGCTGATAAAGAGGAGTACAGT3’、5’AGCTGATCTAGAGGAGTACAGT3’、引入酶切位点BglII 5’AGCAGGTCATGATCTGTACAGT3’中的一种或多种突变型探针。
本发明的另一目的是提供kRas基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测kRas基因密码子Codon 12、13和/或61(Codon 12、13位于Exon 2，Codon 61位于Exon 3上)的相关突变，不但可用于胰腺癌早期诊断，而且可预测非小细胞肺癌EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼或厄罗替尼，以及结直肠癌西妥西单抗或帕尼单抗药物治疗疗效。
实现上述目的的技术方案如下：
一种kRas基因突变检测液相芯片，主要包括有：A.包被探针的微球：包被有氨基修饰的针对kRas基因密码子Codon 12的碱基序列为SEQ ID NO.1—2的野生型探针的微球，以及包被有氨基修饰的选自碱基序列为SEQ ID NO.2—8中的一种或多种突变型探针的微球；和/或
包被有针对kRas基因密码子Codon 13的碱基序列为SEQ ID NO.9—10的氨基修饰的野生型探针的微球，以及包被有选自碱基序列为SEQ ID NO.11—12中的一种或二种氨基修饰的突变型探针的微球；和/或
包被有针对kRas基因密码子Codon 61的碱基序列为SEQ ID NO.13—15的氨基修饰的野生型探针的微球，以及包被有选自引入酶切位点BclI的碱基序列为SEQ ID NO.16—17、和引入酶切位点BglII SEQ ID NO.18中的一种或多种引入的氨基修饰的突变型探针的微球；
上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，且每种微球具有不同颜色编码；以及
B.引物：用于扩增出富集有kRas基因密码子Codon 12、13和/或61的需检测的相应突变位点的目标序列的引物，且该目标序列的末端具有生物素标记。
优选地，所述间隔臂为5—40个T的序列，更优选为10个T的序列。
优选地，用于扩增出富集有Codon 12、13和/或61突变位点的目标序列的引物包括有：
用于扩增出具有kRas基因密码子Codon 12突变位点的目标序列的碱基序列为SEQ ID NO.19—21的引物，上述引物中至少有一条带有末端的生物素标记；和/或
用于扩增出富集有kRas基因密码子Codon 13突变位点的目标序列的碱基序列为SEQ IDNO.22—25的引物，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记；和/或
用于扩增出富集有kRas基因密码子Codon61突变位点的目标序列的碱基序列为SEQ IDNO.26—32的引物，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。
本发明的另一目的还在于提供一种kRas基因突变的检测方法，该方法具有快速、准确、操作简便等优点。
一种kRas基因突变的检测方法，使用上述的kRas基因突变检测液相芯片，包括以下步骤：
(1)用带有酶切位点的PCR引物对野生型和突变型的标本进行第一轮PCR扩增；
(2)将步骤(1)中的PCR扩增后的产物进行酶切；
(3)以酶切后的产物为模板进行对突变型的kRas基因进行第二轮PCR扩增；
(4)第二轮PCR扩增产物与上述相应的包被有探针的微球进行杂交；
(5)杂交反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，然后进行信号检测。
本发明的主要优点在于：
(1)采用本发明提供的kRas基因突变检测液相芯片，可同时对kRas基因突变相对频率较高的位点进行检测，检测时的反应条件均一，检测结果特异性好，灵敏度高，检测准确度达99％以上。
(2)本发明的检测方法步骤简单，因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率。
(3)本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。
(4)本发明采用“引入酶切位点，然后酶切富集”的方法进行目标序列的PCR扩增进而用于检测，避免了产物中大量野生型序列对检测结果所造成的干扰。
(5)本发明所提供的液相芯片、检测方法不仅能检测肿瘤组织样本中的kRas基因突变，同时也能检测肿瘤病人体液中的kRas基因突变，从而具有采样方便、病人痛苦小、能够动态监测的优势。
附图说明
图1是Exon 2和Exon 3突变区的序列信息示意图；
图2是BstOI的酶切富集codon 12的6种突变型示意图；
图3是通过NarI的酶切富集codon 13的2种突变型示意图；
图4是酶切富集codon 61的3种突变型示意图；
图5是实施例2中酶切结果分析示意图；
图6是kRas基因Codon 12的灵敏度实验结果分析示意图；
图7是kRas基因Codon 12在野生型质粒中检出突变型的实验结果分析示意图。
具体实施方式
本公司已开发的EGFR项目是通过内切先去除大量的野生型基因，然后用PCR去扩增突变型基因。但因为kRas基因在三个突变位点处(Exon 2的第12、13密码子和Exon 3的第61密码子)都没有相应的酶切位点可以把野生型有目的的去除。本实验首次采用通过PCR技术在突变区引入酶切位点的方法，然后通过酶切来去除野生型，从而达到富集突变型序列的目的。
1)1stPCR引入酶切位点
kRas基因转变为活动性致癌基因的主要突变为点是Codon 12、13和61。Codon 12、13位于Exon 2(图1)，Codon 61位于Exon 3(参见图1)。
Codon 12(kRas基因的第10569bp到10571bp)一般存在6种突变：GGT->GAT，GGT->GCT，GGT->GTT，GGT->AGT，GGT->CGT，GGT->TGT。在Codon 12处引入酶切位点是通过把10566bp的“G”突变为“C”，从而引入BstOI(BstNI)的酶切位点(参见图2)，为了降低风险，还设计了另一种方案，就是把10566bp的“G”突变为“A”，通过引入BselI(BsrSI)的酶切位点来切除野生型。设计一对引物，扩增约150bp的片段来富集含有Codon 12的片段，通过酶切可以去除野生型，富集6种突变型。
Codon 13(kRas基因的第10572bp到10574bp)一般存在2种突变：GGC->GAC，GGC->TGC。在Codon 13处引入酶切位点是通过把10576-10577bp的“TA”突变为“CC”，从而引入NarI的酶切位点来切除野生型。设计一对引物，扩增约150bp的片段来富集含有Codon 13的片段，通过NarI的酶切可以去除野生型，富集2种突变型(参见图3)
Codon 61(kRas基因的第28578bp到28580bp)一般存在3种突变：CAA->AAA，CAA->CTA，CAA->CAT。因为在Codon 61处无法通过引入单个酶切位点的方法酶切富集3种突变型，要通过引入BclI(28574bp的“A”突变为“T”，28576bp的“G”突变为“A”)和BglII(28583-28585bp的“GGA”突变为“TCT”)两个酶切位点来切除野生型。设计两对引物，分别扩增从28558bp到28701bp共144bp的片段和扩增从28459bp到28600bp共142bp的片段来富集含有Codon 61的片段，通过BclI的酶切可以富集CAA->AAA，CAA->CTA两种突变型，通过BglII的酶切可以富集CAA->CAT的突变型(参见图4)。
本项目需要用到的主要材料
1)野生型(质粒名称：Exon2和Exon 3)及11种突变型质粒(表1)
表1本实验需要使用的突变型质粒
Figure A200810218430D00121
溶液配方：偶联液(pH4.5)：0.1mol/L MES(Sigma M-2933)
洗涤液：0.2ml/L Tween-20(Sigma P-9416)，1g/L SDS(Sigma L-4390)
TE(pH8.0)(储存液)：10mmol/L Tris(Sigma337501)，1mmol/L EDTA(Sigma E-5134)
2×Tm杂交缓冲液
 
试剂 来源 终浓度 每250ml的用量
1MTris-HCl，pH8.0 SigmaT3038 0.2M 50ml
5M NaCl Sigma S5150 0.4M 20ml
Triton X-100 Sigma T8787 0.16％ 0.4ml
过滤后贮存于4℃。
实施例1
kRas基因突变检测液相芯片的制备
一、探针序列设计及微球包被
针对kRas基因Codon 12、13和61的野生型与突变型序列，设计特异的寡核苷酸探针。每种微球包被的具体步骤如下：
(1)取微球母液(购自Luminex公司)vortex(漩涡震荡)30s，超声处理1min；
(2)取出8ul微球母液，共含0.8×105—1.2×105个微球至0.5ml离心管中；
(3)15,000rpm离心10min，小心弃去上清液；
(4)加入10ul偶联液(pH4.5)，vortex30s，超声处理1min；
(5)加入2pmol/ul探针工作液2ul；
(6)加入2.5ul浓度为5mg/ml的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐)工作液，25℃避光孵育30min；重复该步骤一次；
(7)加入0.2ml洗涤液，vortex 30s，12,000g离心5min，小心弃去上清液；重复该步骤一次；
(8)加入500ulTE溶液，vortex 30s，超声处理30s；
(9)12,000g离心5min，小心弃去上清液；
(10)加入20ulTE溶液，储存于2-8℃。
制备得到的kRas基因突变检测液相芯片包括有：A.包被探针的微球，每种微球包被的探针的碱基序列如下：
 
微球号 探针名称(突变位点) 探针碱基序列 SEQ NO
12 60C12W1 5’NH2-TTTTTTTTTTGAGCTGGTGGCGTAGGCAAG3’ 1
20 60C12WE1(GCT->CCT) 5’NH2-TTTTTTTTTTGACCTGGTGGCGTAGGCAAG3’ 2
28 60C12MEE1(GGT->CGT) 5’NH2-TTTTTTTTTTGACCTCGTGGCGTAGGCAAG3’ 3
16 60C12ME2(GGT->AGT) 5’NH2-TTTTTTTTTTGACCTAGTGGCGTAGGCAAG3’ 4
18 60C12ME3(GGT->TGT) 5’NH2-TTTTTTTTTTGACCTTGTGGCGTAGGCAAG3’ 5
21 60C12ME4(GGT->GAT) 5’NH2-TTTTTTTTTTGACCTGATGGCGTAGGCAAG3’ 6
45 60C12ME5(GGT->GCT) 5’NH2-TTTTTTTTTTGACCTGCTGGCGTAGGCAAG3’ 7
63 60C12ME6(GGT->GTT) 5’NH2-TTTTTTTTTTGACCTGTTGGCGTAGGCAAG3’ 8
38 60C13W 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCTGGTGGCGTAGGCAAGA3’ 9
53 60C13WN(GTA->GCC) 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCTGGTGGCGCCGGCAAGA3’ 10
72 60C13MN1(GGC->GAC) 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCTGGTGACGCCGGCAAGA3’ 11
66 60C13MN2(GGC->TGC) 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCTGGTTGCGCCGGCAAGA3’ 12
22 C61W1 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCAGGTCAAGAGGAGTACAGT3’ 13
25 C61WBc1(AGG->TGA) 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCTGATCAAGAGGAGTACAGT3’ 14
32 C61MBc1(CAA->AAA) 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCTGATAAAGAGGAGTACAGT3’ 16
36 C61MBc2(CAA->CTA) 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCTGATCTAGAGGAGTACAGT3’ 17
76 C61WBg1(GGA->TCT) 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCAGGTCAAGATCTGTACAGT3’ 15
77 C61MBg1(CAA->CAT) 5’NH2-TTTTTTTTTTAGCAGGTCATGATCTGTACAGT3’ 18
B.引物：用于扩增出富集有kRas基因密码子Codon 12、13和61的需检测的相应突变位点的目标序列的引物，且扩增出的目标序列的末端可具有生物素标记，每种引物的碱基序列如下：
 
引物名称 密码子 碱基序列 一轮或二轮 SEQ.
K12EF Codon 12 5’ATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT 3’ 一轮及二轮 19
K12R1 Codon 12 5’CTGTATCAAAGAATGGTCCTGC 3’ 一轮 20
K12R-bio Codon 12 5’biotin-ATGGTCCTGCACCAGTAATATG 3’ 二轮 21
 
K13R Codon 13 5’CGTCAAGGCACTCTTGCCGGCG 3’ 一轮 22
K13R-bio Codon 13 5’biotin-CGTCAAGGCACTCTTGCCGGCG 3’ 二轮 23
K13F1 Codon 13 5’TGGAGTATTTGATAGTGTATTAACC 3’ 一轮 24
K13F2 Codon 13 5’TGATAGTGTATTAACCTTATGTGTG 3’ 二轮 25
K61BcF Codon 61 5’TTGGATATTCTCGACACAGCTGAT 3’ 一轮及二轮 26
K61BcR1 Codon 61 5’AATTTAAACCCACCTATAATGGTG 3’ 一轮 27
K61BcR1-b Codon 61 5’biotin-CCACCTATAATGGTGAATATCTTC 3’ 二轮 28
K61BgR1 Codon 61 5’GTCCCTCATTGCACTGTACAGATC 3’ 一轮 29
K61BgR1-b Codon 61 5’biotin-GTCCCTCATTGCACTGTACAGATC 3’ 二轮 30
K61BgF1 Codon 61 5’GTAAAAGGTGCACTGTAATAATCC 3’ 一轮 31
K61BgF2 Codon 61 5’TAATCCAGACTGTGTTTCTCCC 3’ 二轮 32
实施例2、kRas基因密码子12(Codon12)通过PCR引入酶切位点及野生型的切除
针对kRas基因密码子12的序列，设计的一对带有BstOI的酶切位点引物对野生型和突变型粒进行扩增，通过酶切可以有效地去除野生型，而突变型不会被酶切，从而达到富集突变型的目的。
一、PCR的扩增
PCR反应体系：
 
Codon 12反应体系 每反应(μl)
灭菌ddH2O 28.8
5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 10
2.5mM dNTP混合液 2
MgCl2 25mM 5
引物F：K12EF(10uM) 1
引物R：K12R1(10uM) 1
GoTaq Hot Start polymerase(5U/ul) 0.2
模板DNA 2
总体积 50
PCR反应条件：
Figure A200810218430D00141
Figure A200810218430D00151
二、PCR产物BstOI酶切：
反应体系如下：
 
样品体系(60℃温育2小时) 每反应(μl)
10×Buffer C 5
BstOI内切酶(10U/ul) 0.5
BSA 0.5
PCR产物 10
灭菌ddH2O 34
总体积 50
酶切结果图5。PAGE胶的结果表明Codon 12野生型被酶切而且酶切完全，但突变型没被酶切。这结果证明了PCR引入酶切位点去除野生型，富集突变型方法的可行性。
实施例3、kRas基因Codon 12的灵敏度实验
为了测定Codon 12的灵敏度，取Codon 12突变型质粒1，3，9，27，81.243,729个拷贝进行检测，每种拷贝数重复4次。
一、PCR扩增及酶切
1.第一轮PCR扩增
PCR反应体系与实施例2相同。
PCR反应条件：
Figure A200810218430D00152
Figure A200810218430D00161
2、PCR产物BstOI酶切：
反应体系同实施例2。
3、第二轮PCR扩增
PCR反应体系：
 
Codon 12反应体系 每反应(ul)
灭菌ddH2O 28.8
5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 10
2.5mM dNTP混合液 2
MgCl2 25mM 5
Codon 12引物F：K12EF(10uM) 1
Codon 12引物R：K12R-bio(10uM) 1
GoTaq Hot Start polymerase(5U/ul) 0.2
模板DNA 2
总体积 50
PCR反应条件：
二、Luminex检测
杂交及Luminex检测(可参照常规Luminex液相芯片的杂交检测)：
(1)配制微球工作液：将实施例1中的每种包被有针对kRas基因密码子Codon 12的碱基序列为SEQ ID NO 1-8的探针(探针名称：60C12W1、60C12WE1、60C12MEE1、60C12ME2、60C12ME3、60C12ME4、60C12ME5、60C12ME6)的微球Vortex 30sec，超声处理30sec，充分混匀，随即取出所需微球到灭菌离心管中(每反应0.5ul，其中每种微球为2000个/ul)，加入1.5X杂交液缓冲液(每个反应32.5ul)和TE缓冲液(每个反应14ul)，此为微球工作液；
(2)根据样品情况，使用记号笔对96孔板(杂交板)进行标记(阴性对照孔标记为“N”)，然后每孔加入47ul微球工作液；
(3)各样品孔加入3ul相应的待杂交检测样品(第二轮PCR产物)；“N”孔加入3ul TE；
(4)置杂交板于PCR仪中，95℃变性3min；60℃杂交15min；
(5)用1X杂交缓冲液配制SA-PE(链亲和素藻红蛋白)工作液(10ug/ml)，并置60℃水浴锅预热；
(6)往杂交完毕的杂交板中加入已预热至60℃的SA-PE工作液(10ug/ml)，每孔25ul；
(7)置PCR仪上60℃反应5min；
(8)将Luminex仪器托盘温度设置为60℃，按Luminex仪器使用方法设置仪器参数(每个样品读取微球100个，读数时间25s)。将杂交板置于Luminex仪器托盘中，检测样品MFI值。
三、结果分析
杂交检测的结果如图6，MFI值大于100的为有效数值。3和9个拷贝的在4次检测中只有一次被检测出，MFI的平均值都低于100(SD值较高)，81个拷贝的4次检测中均能被检测，重复性较好(SD值较低)。结果说明了对于低拷贝数检测的重复性较差，对于大于80个拷贝数的检测的重复性较好。
实施例4、kRas基因Codon 12在野生型质粒中检出突变型的实验
为了在大量的野生型中检出少量的突变型，以kRas Codon 12野生型和突变型质粒按不同比例混合为模板(总拷贝数为20000)，分别进行酶切富集，再进行Luminex检测，每种比例做复孔。两轮PCR扩增，酶切富集，微球包被，杂交及luminex检测的方法与实施例3的相同。
检测的结果如图7(MFI值大于100的为有效数值)：
检测的结果表明：Codon 12可以在20000个拷贝中检测出80个突变型质粒。这实验结果说明了用PCR引入酶切位点的方法可在大量的野生型kRas基因中测出少量的突变型基因。
实施例5、运用kRas基因突变检测液相芯片对结直肠癌样本的检测
一、待测样本的准备(血浆、血清和胸水上清游离核酸的提取均可按以下方法)：
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明，详细步骤如下：
(1)取患者抗凝静脉血或胸腔积液约2.5ml，3000rpm离心15分钟，取300μl上清加到一个1.5ml干净无菌的离心管中；
(2)向离心管中加入500μl AP1缓冲液，涡旋振荡充分混匀；
(3)加入100μl AP2缓冲液，涡旋振荡充分混匀；
(4)室温下12,000rpm离心10分钟
(5)小心吸取上清加入放在2ml收集管上的吸附柱AxyPrep中，盖上盖子，以6,000rpm离心1分钟；
(6)倒掉废液收集管中的废液，用800μl缓冲液W1洗涤1次，以6,000rpm离心1分钟；
(7)倒掉废液收集管中的废液，加入800μl缓冲液W2，以12,000rpm离心1分钟；倒掉废液收集管中的废液，加入500μl缓冲液W2，以12,000rpm离心1分钟，弃掉废液；
(8)将吸附柱AxyPrep放回空收集管中，12,000rpm离心1分钟；
(9)将吸附柱AxyPrep置于一干净无菌的1.5ml离心管中，加入40μl TE缓冲液，室温下放置1分钟，12,000rpm离心1分钟洗脱DNA，电泳检测，-20℃保存。
二、待测样品的PCR扩增与酶切富集：
Codon 12样本的酶切富集PCR扩增与实施例3相同。
Codon 13的酶切富集PCR扩增如下：
1.第一轮PCR扩增
PCR反应体系：
 
Codon 13反应体系 每反应(μl)
灭菌ddH2O 28.8
5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 10
2.5mM dNTP混合液 2
MgCl225mM 5
Codon 13引物F：K13F1(10uM) 1
Codon 13引物R：K13R(10uM) 1
GoTaq Hot Start polymerase(5U/ul) 0.2
模板DNA 2
总体积 50
PCR反应条件：
Figure A200810218430D00181
Figure A200810218430D00191
2、PCR产物NarI酶切：
反应体系如下：
 
样品体系(37℃温育2小时) 每反应(ul)
10×Buffer G 5
BSA 0.5
NarI内切酶(10U/ul) 0.5
PCR产物 10
灭菌ddH2O 34
总体积 50
3、第二轮PCR扩增
PCR反应体系：
 
Codon 12反应体系 每反应(ul)
灭菌ddH2O 28.8
5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 10
2.5mM dNTP混合液 2
MgCl225mM 5
Codon 13引物F：K13F2(10uM) 1
Codon 13引物R：K13R-bio(10uM) 1
GoTaq Hot Start polymerase(5U/ul) 0.2
模板DNA 2
总体积 50
PCR反应条件：
Figure A200810218430D00192
Figure A200810218430D00201
Codon 61的BclI酶切富集PCR扩增如下：
1.第一轮PCR扩增(引入BclI的酶切位点)
PCR反应体系：
 
Codon 61反应体系 每反应(μl)
灭菌ddH2O 28.8
5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 10
2.5mM dNTP混合液 2
MgCl225mM 5
Codon 61引物F：K61BcF(10uM) 1
Codon 61引物R：K61BcR1(10uM) 1
GoTaq Hot Start polymerase(5U/ul) 0.2
模板DNA 2
总体积 50
PCR反应条件：
Figure A200810218430D00202
2、PCR产物BclI酶切：
反应体系如下：
 
样品体系(50℃温育2小时) 每反应(ul)
10×Buffer G 5
 
BSA 0.5
BclI内切酶(10U/ul) 0.5
PCR产物 10
灭菌ddH2O 34
总体积 50
3、第二轮PCR扩增(引入BclI的酶切位点)
PCR反应体系：
 
Codon 61反应体系 每反应(ul)
灭菌ddH2O 28.8
5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 10
2.5mM dNTP混合液 2
MgCl225mM 5
Codon 61引物F：K61BcF(10uM) 1
Codon 61引物R：K61BcR1-b(10uM) 1
GoTaq Hot Start polymerase(5U/ul) 0.2
模板DNA 2
总体积 50
PCR反应条件：
Codon 61的BglII酶切富集PCR扩增如下：
1.第一轮PCR扩增(引入BglII的酶切位点)
PCR反应体系：
 
Codon 61反应体系 每反应
 
(μl)
灭菌ddH2O 28.8
5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 10
2.5mM dNTP混合液 2
MgCl2 25mM 5
Codon 61引物F：K61BgF(10uM) 1
Codon 61引物R：K61BgR1(10uM) 1
GoTaq Hot Start polymerase(5U/ul) 0.2
模板DNA 2
总体积 50
PCR反应条件：
Figure A200810218430D00221
2、PCR产物BglII酶切：
反应体系如下：
 
样品体系(37℃温育2小时) 每反应(ul)
10×Buffer G 5
BSA 0.5
BglII内切酶(10U/ul) 0.5
PCR产物 10
灭菌ddH2O 34
总体积 50
3、第二轮PCR扩增(引入BglII的酶切位点)
PCR反应体系：
 
Codon 61反应体系 每反应(ul)
灭菌ddH2O 28.8
5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 10
2.5mM dNTP混合液 2
MgCl225mM 5
Codon 61引物F：K61BgF2(10uM) 1
Codon 61引物R：K61BgR1-b(10uM) 1
GoTaq Hot Start polymerase(5U/ul) 0.2
模板DNA 2
总体积 50
PCR反应条件：
Figure A200810218430D00231
二、Luminex检测
杂交及Luminex检测
(1)配制微球工作液：将实施例1中的每种包被有针对kRas基因密码子Codon 12、codon 13、和codon 61的碱基序列为SEQ ID NO.1-18的探针的不同微球Vortex 30sec，超声处理30sec，充分混匀，随即取出所需微球到灭菌离心管中(每反应0.5ul，其中每种微球为2000个/ul)，加入1.5X杂交液缓冲液(每个反应32.5ul)和TE缓冲液(每个反应14ul)，此为微球工作液；
(2)其余杂交检测及Luminex检测步骤同实施例3中杂交及Luminex检测部分。
三、检测结果与数据分析
反应后产物通过Luminex序列分析仪器检测，检测结果如表1所示。Codon 12以荧光值(MFI)大于100为cut-off值，当Codon 12突变型探针的MFI值大于100时，判定该样本为存在Codon 12的突变，否则判定该样本为Codon 12野生型。Codon 13和Codon 61以荧光值(MFI)大于200为cut-off值，当Codon 13或Codon 61突变型探针的MFI值大于200时，判定该样本为存在Codon 13或Codon 61的突变，否则判定该样本为Codon 13或Codon 61野生型。
根据上述判定标准，本实施例所检测的10份样本中，6例存在Codon 12点突变(2号，3号，4号，5号，6号，9号样本)，4例存在Codon13点突变(1号，4号，5号，10号样本)，3例存在Codon 61点突变(1号，2号，3号样本)。
表1血清样本的检测结果
 
序号NO.   阳性对照(MFI) 阴性对照(MFI)    12W(MFI) 12M(MFI) 13W(MFI) 13M(MFI) 61W(MFI) 61M(MFI)
1 3395 26 1751 70 469 989 369 789
2 3545 30 362 993 1256 116 401 921
3 4053 15 473 839 1941 95 451 1036
4 4456 17 332 903 569 1002 901 66
5 3986 24 436 876 454 1153 1061 81
6 3937 20 256 754 1008 71 1161 90
7 4369 11 1066 65 961 99 986 95
8 4255 24 983 43 1171 128 943 86
9 3061 15 346 818 1225 86 861 79
10 4126 16 1169 48 623 954 1261 89
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>kRas基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法
<160>32
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
212>DNA
<213>人工序列
<400>1
Figure A200810218430D00251
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
Figure A200810218430D00252
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
Figure A200810218430D00262
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
Figure A200810218430D00263
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
Figure A200810218430D00271
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
Figure A200810218430D00272
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
Figure A200810218430D00273
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
Figure A200810218430D00274
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
Figure A200810218430D00281
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
Figure A200810218430D00282
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
Figure A200810218430D00291
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
Figure A200810218430D00292
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
Figure A200810218430D00293
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
Figure A200810218430D00301
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
Figure A200810218430D00302
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
Figure A200810218430D00303
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
Figure A200810218430D00311
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
Figure A200810218430D00312
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
Figure A200810218430D00313
<210>23
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
Figure A200810218430D00321
<210>24
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
Figure A200810218430D00322
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
Figure A200810218430D00323
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
Figure A200810218430D00324
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
Figure A200810218430D00331
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
Figure A200810218430D00332
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
Figure A200810218430D00333
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
Figure A200810218430D00341
<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
Figure A200810218430D00342
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
Figure A200810218430D00343

Claims (7)

1.用于kRas基因突变检测的探针，其特征是：包括有：
针对kRas基因密码子Codon12的：5’GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG3’、和引入酶切位点BstOI的5’GACCTGGTGGCGTAGGCAAG3’的野生型探针，以及选自碱基序列为5’GACCTCGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTAGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTTGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTGATGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTGCTGGCGTAGGCAAG3’、和5’GACCTGTTGGCGTAGGCAAG3’中的一种或多种的引入酶切位点BstOI的突变型探针；和/或
针对kRas基因密码子Codon13的：5’AGCTGGTGGCGTAGGCAAGA3’、和引入酶切位点NarI的5’AGCTGGTGGCGCCGGCAAGA3’野生型探针，以及选自碱基序列为5’AGCTGGTGACGCCGGCAAGA3’和5’AGCTGGTTGCGCCGGCAAGA3’中的一种或二种引入酶切位点NarI的突变型探针；和/或
针对kRas基因密码子Codon61的：5’AGCAGGTCAAGAGGAGTACAGT3’野生型探针、引入酶切位点BclI的5’AGCTGATCAAGAGGAGTACAGT3’、和引入酶切位点BglII的5’AGCAGGTCAAGATCTGTACAGT3’的野生型探针，以及选自引入酶切位点BclI的碱基序列为5’AGCTGATAAAGAGGAGTACAGT3’、5’AGCTGATCTAGAGGAGTACAGT3’、引入酶切位点BglII的碱基序列为5’AGCAGGTCATGATCTGTACAGT3’中的一种或多种的突变型探针。
2.一种kRas基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：A.包被探针的微球：
包被有针对kRas基因密码子Codon12的碱基序列为5’GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG3’、GACCTGGTGGCGTAGGCAAG3’的氨基修饰的野生型探针的微球，以及包被有氨基修饰的选自碱基序列为5’GACCTCGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTAGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTTGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTGATGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTGCTGGCGTAGGCAAG3’、和5’GACCTGTTGGCGTAGGCAAG3’中的一种或多种突变型探针的微球；和/或
包被有针对kRas基因密码子Codon13的碱基序列为5’AGCTGGTGGCGTAGGCAAGA3’、5’AGCTGGTGGCGCCGGCAAGA3’的氨基修饰的野生型探针的微球，以及包被有选自碱基序列为5’AGCTGGTGACGCCGGCAAGA3’和5’AGCTGGTTGCGCCGGCAAGA3’中的一种或二种氨基修饰的突变型探针的微球；和/或
包被有针对kRas基因密码子Codon61的碱基序列为5’AGCAGGTCAAGAGGAGTACAGT3’、5’AGCTGATCAAGAGGAGTACAGT3’、5’AGCAGGTCAAGATCTGTACAGT3’的氨基修饰的野生型探针的微球，以及包被有选自引入酶切位点BclI的碱基序列为5’AGCTGATAAAGAGGAGTACAGT3’、5’AGCTGATCTAGAGGAGTACAGT3’、引入酶切位点BglII 5’AGCAGGTCATGATCTGTACAGT3’中的一种或多种氨基修饰的突变型探针的微球；
上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，且每种微球具有不同颜色编码；以及
B.引物：用于扩增出富集有kRas基因密码子Codon 12、13和/或61的需检测的相应突变位点的目标序列的引物，且该目标序列的末端具有生物素标记。
3.根据权利要求2所述的kRas基因突变检测液相芯片，其特征是，所述引物包括有：
用于扩增出富集有kRas基因密码子Codon12突变位点的目标序列的碱基序列为5’ATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT 3’、5’CTGTATCAAAGAATGGTCCTGC 3’、和5’ATGGTCCTGCACCAGTAATATG 3’的引物，上述引物中至少有一条带有末端的生物素标记；和/或
用于扩增出富集有kRas基因密码子Codon13突变位点的目标序列的碱基序列为5’CGTCAAGGCACTCTTGCCGGCG 3’、5’CGTCAAGGCACTCTTGCCGGCG 3’、5’TGGAGTATTTGATAGTGTATTAACC 3’、和5’TGATAGTGTATTAACCTTATGTGTG 3’的引物，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记；和/或
用于扩增出富集有kRas基因密码子Codon 61突变位点的目标序列的碱基序列为5’TTGGATATTCTCGACACAGCTGAT 3’、5’AATTTAAACCCACCTATAATGGTG 3’、5’CCACCTATAATGGTGAATATCTTC 3’、5’GTCCCTCATTGCACTGTACAGATC 3’、5’GTCCCTCATTGCACTGTACAGATC 3’、5’GTAAAAGGTGCACTGTAATAATCC 3’、和5’TAATCCAGACTGTGTTTCTCCC 3’的引物，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。
4.根据权利要求2所述的kRas基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5—40个T的序列。
5.一种kRas基因突变的检测方法，其特征是，使用权利要求2所述的kRas基因突变检测液相芯片，包括以下步骤：
(1)用带有酶切位点的PCR引物对野生型和突变型的标本进行第一轮PCR扩增；
(2)将步骤(1)中的PCR扩增后的产物进行酶切；
(3)以酶切后的产物为模板进行对突变型的kRas基因进行第二轮PCR扩增；
(4)第二轮PCR扩增产物与权利要求2中相应的所述的包被有探针的微球进行杂交；
(5)杂交反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，然后进行信号检测。
6.根据权利要求5所述的kRas基因突变的检测方法，其特征是，第一轮PCR扩增所用引物为：
针对kRas基因密码子Codon 12突变位点的5’ATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT 3’、5’CTGTATCAAAGAATGGTCCTGC 3一对引物；和/或
针对kRas基因密码子Codon 13突变位点的5’CGTCAAGGCACTCTTGCCGGCG 3、5’TGGAGTATTTGATAGTGTATTAACC 3’一对引物；和/或
针对kRas基因密码子Codon 61突变位点的5’TTGGATATTCTCGACACAGCTGAT 3’、5’AATTTAAACCCACCTATAATGGTG 3’一对引物以及5’GTCCCTCATTGCACTGTACAGATC 3’、5’GTAAAAGGTGCACTGTAATAATCC 3’一对引物。
7.根据权利要求5所述的kRas基因突变的检测方法，其特征是，第二轮PCR扩增所用引物为：
针对kRas基因密码子Codon 12突变位点的5’ATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT 3’、5’biotin-ATGGTCCTGCACCAGTAATATG 3’一对引物；和/或
针对kRas基因密码子Codon 13突变位点的5’biotin-CGTCAAGGCACTCTTGCCGGCG 3’、5’TGATAGTGTATTAACCTTATGTGTG 3’一对引物；和/或
针对kRas基因密码子Codon 61突变位点的5’TTGGATATTCTCGACACAGCTGAT 3’、5’biotin-CCACCTATAATGGTGAATATCTTC 3’的一对引物以及5’biotin-GTCCCTCATTGCACTGTACAGATC 3’、的5’TAATCCAGACTGTGTTTCTCCC 3’的一对引物。
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