CN105463076B - 突变检测分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种样品分析方法。在某些实施方案中，所述方法包括：a)扩增来自包括基因组座位的野生型拷贝和与基因组座位的所述野生型相关的一个点突变的基因组座位突变体拷贝的样品的产物，以生成扩增的样品，其中：i.扩增使用第一引物和第二引物完成；并且ii.第一引物包括与点突变碱基配对的3’末端核苷酸和还包括与基因组座位除了在3’末端核苷酸6个碱基内有一个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；和b)使用活瓣分析检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用侵入寡核苷酸。本发明还提供进行所述方法的试剂盒。

Description

突变检测分析
本申请是2011年11月2日提交的同名发明专利申请201180053023.3的分案申请。
【相关申请的交叉引用】
本申请要求2010年11月15日递交的美国专利申请系列号12/946,752的申请日的优先权，该申请公开的内容通过引用的方式并入本文。
【背景】
人类基因组中的一些点突变与疾病有直接关联。例如，发现一些生殖系KRAS突变与努南综合征(Schubbert等人Nat.Genet.2006 38:331–6)和心-面-皮肤综合征(Niihori等人.Nat.Genet.2006 38:294–6)相关联。同样，发现体细胞的KRAS突变在白血病、结直肠癌(Burmer等人.Proc.Natl.Acad.Sci.1989 86:2403–7)、胰腺癌(Almoguera等人.Cell1988 53:549–54)和肺癌(Tam等人.Clin.Cancer Res.200612:1647–53)中高频出现。人类基因组中有许多点突变与疾病没有明显的致病关联。
点突变的检测方法可用于，例如，提供与点突变相关联的疾病的诊断。
【概述】
本发明提供样品分析的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：a)从样品扩增产物以产生扩增的样品，所述样品包含基因组座位的野生型拷贝和所述基因组座位的突变体拷贝，所述突变体拷贝相对于所述基因组座位的所述野生型拷贝具有点突变，其中：i.扩增使用第一引物和第二引物完成；以及ii.第一引物包含与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸，还包含与所述基因组座位中除了在所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；和b)使用活瓣分析(flap assay)检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用侵入寡核苷酸。本发明还提供进行所述方法的试剂盒。
【附图说明】
图1示例性说明了活瓣分析的一些一般原则。
图2示例性说明了所述方法的一个实施方案。
图3-7各提供更详细描述于本申请实施例部分的数据。
【定义】
本文使用的术语“样品”涉及材料或材料的混合物，通常情况下，尽管这不是必须的，以液体形式，含有一种或多种感兴趣的分析物。
术语“核苷酸”旨在包括那些不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基而且包含已被修饰的其他杂环碱基的基团(moieties)。这些修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，烷基化的核糖或其他杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些包含半抗原或荧光标记并可以不仅包含常规核糖和脱氧核糖的糖，而且也可以包含其他糖的基团。修饰的核苷或核苷酸也包括对所述糖基团的修饰，例如，一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，官能化为醚、胺等。
术语“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可以互换使用，用于描述任意长度的聚合物，例如，长于大约2个碱基，长于大约10个碱基，长于大约100个碱基，长于大约500个碱基，长于大约1000个碱基，长达大约10,000个或更多碱基组成的核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并可通过酶法或合成法制备(例如，PNA记载于美国专利号5,948,902和其中所引用的参考文献)其可以与天然存在的核酸以序列特异性的方式进行杂交，该方式与两种天然存在的核酸杂交类似，例如，能够参与沃森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶(分别为G、C、A和T)。
本文使用的术语“核酸样品”指含有核酸的样品。
本文使用的术语“靶多核苷酸”指研究中的目的多核苷酸。在某些实施方案中，靶多核苷酸含有研究中的一个或多个目的靶位点。
本文使用的术语“寡核苷酸”指大约2至200个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以通过合成或可以通过酶法制备，并且，在一些实施方案中，长度为10至50个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体(即，可以为寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以为10至20、11至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150或150至200个核苷酸。
本文使用的术语“双链体”或“双链的”描述两个互补的碱基配对的多核苷酸，即，杂交在一起。
本文使用的术语“引物”指这样的寡核苷酸，其具有与靶多核苷酸的一个区域互补的核苷酸序列。在引物延伸条件下，使用靶核酸作为模板，引物结合至所述互补区域并延伸。引物可为大约15至大约50个核苷酸范围内，但也可使用在上述长度范围之外的引物。引物可通过聚合酶的作用从引物的3’末端开始延伸。不能通过聚合酶的作用从其3’末端开始延伸的寡核苷酸不是引物。
本文使用的术语“延伸”指向核酸末端添加一个或更多的核苷酸，例如通过寡核苷酸的连接或通过使用聚合酶。
本文使用的术语“扩增”指使用靶核酸作为模板产生一个或更多拷贝的靶核酸。
本文使用的术语“变性”指核酸双链体分开为两条单链。
本文的术语“测定(determining)”、“测量(measuring)”、“评估(evaluating)”、“评估(assessing)”、“分析(assaying)”、“检测(detecting)”、“分析(analyzing)”可以互换使用，指任何形式的测量，并包括测定一种成分(element)存在与否。这些属于包括定性和/或定量测定。评估可为相对或绝对。“评估其存在”包括测定存在的某种物质的量，以及测定其存在或不存在。
术语“使用”有其常规含义，因此，是指采用，例如，将方法或组合物付诸运行至结束。
本文使用的术语“Tm”指寡核苷酸双链体的解链温度，在该温度，一半的双链体保持杂交而一半的双链体解离成单链。寡核苷酸双链体的Tm可以通过实验测定或使用下述公式预测：Tm＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(部分G+C)–(60/N)，其中N是链长且[Na+]小于1M。参见Sambrook和Russell(2001；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor N.Y.,ch.10)。还有其他预测寡核苷酸双链体的Tm的公式并且一个公式可以或多或少地适用于给定的条件或一组条件。
本文使用的术语“Tm-匹配的”指多个核酸双链体有在定义范围内的Tm，例如，在互相的5℃或10℃范围内。
本文使用的术语“反应混合物”指试剂的混合物，所述试剂能够在能够在适当的外部条件下经过一段时间一起反应产生产物。反应混合物可以包含PCR试剂和活瓣切割试剂，例如，各自在本领域已知的配方。
本文使用的术语“混合物”指成分的组合，所述成分是散在的并没有任何特定顺序。混合物是异质的且没有在空间上分离成其不同成分。混合物成分的实施例包括大量不同的溶解于相同水溶液的成分，或大量不同的附着到固相载体的成分或在没有特定顺序上不同成分在空间上没有不同。混合物是无法定位的(addressable)。举例说明，作为本领域中通常已知的，空间上分离的表面结合多核苷酸的阵列不是表面结合多核苷酸的混合物，因为此类表面结合多核苷酸空间上不同且所述阵列是可以定位的。
本文使用的术语“PCR试剂”指对模板进行聚合酶链式反应(PCR)所必需的所有试剂。正如本领域中已知的，PCR试剂基本上包括第一引物、第二引物、热稳定聚合酶和核苷酸。取决于所使用的聚合酶，也可存在离子(例如，Mg2+)。PCR试剂可以任选地包含可扩增靶序列的模板。
本文使用的术语“活瓣分析”指一种分析，其中活瓣寡核苷酸以重叠依赖的方式通过活瓣核酸内切酶切割从而释放随后被检测到的活瓣。活瓣分析的原理众所周知并且记载于，例如，Lyamichev等人.(Nat.Biotechnol.1999 17:292-296)、Ryan等人(Mol.Diagn.1999 4:135-44)和Allawi等人(J Clin Microbiol.2006 44:3443–3447)。为了清楚，某些应用于活瓣分析的试剂记载如下。活瓣分析的原理如图1所示。如图1所示的活瓣分析，侵入寡核苷酸2和活瓣寡核苷酸4与靶6杂交产生包含在位置10处有一个核苷酸重叠的第一复合体8。第一复合体8是活瓣核酸内切酶的底物。活瓣核酸内切酶12切割活瓣寡核苷酸4从而释放活瓣14，活瓣14与FRET盒16杂交，FRET盒16包含猝灭剂“Q”和附近的淬灭荧光基团“R”，“R”被猝灭剂Q淬灭。活瓣14与FRET盒16的杂交产生包含在位置20处有一个核苷酸重叠的第二复合体18。第二复合体也是活瓣核酸内切酶的底物。活瓣核酸内切酶12切割FRET盒16导致荧光基团22的释放，这产生荧光信号。这些成分在下面进行更详细的记载。
本文使用的术语“侵入寡核苷酸”指一种与靶核苷酸的一个区域互补的寡核苷酸。侵入寡核苷酸的3’末端核苷酸可以与靶的核苷酸碱基配对，也可以不配对(例如，其可为SNP的位点或例如突变)。
本文使用的术语“活瓣寡核苷酸”指一种包含活瓣区域和与靶核酸的区域互补的区域的寡核苷酸。侵入寡核苷酸上的靶互补区域和活瓣寡核苷酸重叠单个核苷酸，因而当它们与靶核酸退火时，互补序列重叠。正如已知的，如果：a)侵入核苷酸的3’末端核苷酸和b)与活瓣寡核苷酸中的那个核苷酸重叠的核苷酸二者均与靶核酸中的核苷酸碱基配对，那么形成一种具体结构。这种结构是酶的底物，所述酶如下定义为活瓣核酸内切酶，其从活瓣寡核苷酸的靶互补区域切割活瓣。如果侵入寡核苷酸的3’末端核苷酸没有与靶核酸里的核苷酸碱基配对，或如果活瓣寡核苷酸中的重叠核苷酸没有与靶核酸中的核苷酸碱基配对，复合体不是所述酶的底物并只有很少或者没有切割。
本文使用的术语“活瓣核酸内切酶”或简称“FEN”指一类核苷酸分解酶，其作为结构特异性核酸内切酶作用于DNA结构，所述DNA结构于一条链上包含单链5’突出端或活瓣，该条链被核酸的另一条链取代，即，使得在单链和双链DNA之间的交界处有重叠核苷酸。FEN催化单链和双链DNA交界处的磷酸二酯键水解断裂，释放所述突出端，或所述活瓣。活瓣核酸内切酶由Ceska和Savers(Trends Biochem.Sci.1998 23:331-336)及Liu等(Annu.Rev.Biochem.2004 73:589-615)综述。FEN可以是单独的酶、多亚基酶或作为其它酶或者蛋白复合体的活性存在，例如，DNA聚合酶。活瓣核酸内切酶可以是热稳定的。
本文使用的术语“切割的活瓣”指活瓣分析的切割产物的单链寡核苷酸。
本文使用的术语“FRET盒”指包含荧光基团和附近的淬灭所述荧光基团的猝灭剂基团的发夹寡核苷酸。切割的活瓣与FRET盒的杂交产生活瓣核酸内切酶所需的二级底物。一旦形成该底物，包含5’荧光基团的碱基从盒切割出，从而产生荧光信号。
本文使用的术语“活瓣分析试剂”指对底物进行活瓣分析所需的所有试剂。正如本领域已知的，活瓣分析包括如上所述的侵入寡核苷酸、活瓣寡核苷酸、活瓣核酸内切酶和FRET盒。活瓣分析试剂可以任选地包含所述侵入寡核苷酸和活瓣寡核苷酸结合的靶。
本文使用的术语“基因组座位”指基因组中的指定区域。基因组座位存在于来自同一个体的不同细胞的基因组的相同位置，或不同个体中。一个细胞或个体的基因组座位可有与不同细胞或个体的相同基因组座位相同或非常相似(即，超过99％相同)。不同细胞或个体中相同基因组座位之间核苷酸序列的差异可以是因为一个或多个核苷酸取代。SNP(单核苷酸多态性)是点突变的一种类型，在人群中不同个体之间相同的基因组座位中发生点突变。点突变可以是体细胞的，其发生在同一个体的不同细胞之间。基因组座位突变可通过基因组坐标、名称或使用符号进行定义。
本文使用的“突变位点”指基因组座位中核苷酸取代的位置。除非另有说明，核酸中突变位点可具有突变体等位基因或突变的野生型等位基因。突变位点可通过基因组坐标或相对于基因起始密码子的坐标进行定义(例如，“KRAS G35T突变”的情形)。
本文使用的术语“点突变”指基因组座位的突变体拷贝的突变位点处的核苷酸的特性。所述核苷酸可位于双链DNA分子的任一条链。
本文使用的术语“野生型”，参照基因组座位，指含有野生型序列的基因组座位的等位基因。在含有SNP的基因组座位的情形下，野生型序列可含有SNP的主要等位基因。
本文使用的术语“突变体”，参照基因组座位，指含有突变体序列的基因组座位的等位基因。在含有SNP的基因组座位的情形下，突变体序列可含有SNP的次要等位基因。基因组座位的突变体等位基因可含有核苷酸取代，其不是沉默的，因为其或者改变蛋白质的表达或者改变蛋白质的氨基酸序列，这导致细胞中的表型改变(例如，癌症相关表型)，所述细胞相对于包含野生型序列的细胞其突变体序列是杂合的或纯合的。另外，基因组座位的突变体等位基因可含有沉默的核苷酸取代。
本文使用的术语“相应于(corresponds to)”及其语法等价词在，例如，相应于突变位点的寡核苷酸中的核苷酸，的上下文中，旨在当两个核酸(例如，寡核苷酸和包含突变的基因组DNA)杂交时用来识别与突变位点相应位置相关(即，定位于对面的)的核苷酸。同样，除非另有指明(例如，在与点突变“没有碱基配对”或“碱基配对”的核苷酸的情形下)相应于突变位点的核苷酸可与序列的无论是突变体还是野生型等位基因碱基配对。
包含“基因组座位野生型拷贝和基因组座位突变体拷贝二者”及其语法等价词的样品，指包含同一基因组座位的多个DNA分子的样品，其中样品包含基因组座位野生型拷贝(其拷贝包含基因组座位的野生型等位基因)和同一基因组座位的突变体拷贝(其拷贝包含基因组座位的突变体等位基因)。在这个上下文中，术语“拷贝”并非旨在意味着序列互相拷贝。相反，术语“拷贝”旨在表明序列是不同细胞或个体的同一基因组座位的。
本文使用的术语“核苷酸序列”指核酸中核苷酸的连续序列。显而易见的是，核苷酸序列中核苷酸的数量可以有很大差异。在具体实施方案中，核苷酸序列(例如，寡核苷酸的核苷酸序列)可以是长度足够与其他核酸中的互补核苷酸序列杂交的。在这些实施方案中，核苷酸序列的长度可为至少10至50个核苷酸，例如，12至20个核苷酸长，尽管超出这些范围的长度可用于很多情形。
在与第二核酸完全互补的第一核酸的上下文中，本文使用的术语“与……完全互补”指当第一核酸中核苷酸的连续序列的每一个核苷酸与第二核酸中互补的核苷酸碱基配对的情形。正如下文将要记载的，核酸可以与其它序列“除了具有单个碱基错配之外”完全互补，意味着所述序列除了具有单个碱基错配之外完全互补(即，单个核苷酸没有与其它核酸中相应的核苷酸碱基配对)。
本文使用的术语“引物对”用于指能够用于聚合酶链式反应来扩增基因组座位的两个引物。在某些情形下引物对可被认为包含“第一引物”和“第二引物”或“正向引物”和“反向引物”。任何这些术语的使用是任意的并且并未旨在说明引物与双链核酸的上面的链还是下面的链杂交与否。
寡核苷酸的核苷酸可通过其相对于寡核苷酸的3’末端核苷酸的位置指定。例如，寡核苷酸的3’末端核苷酸紧接着的5’核苷酸处于“-1”的位置，处于-1位置的核苷酸紧接着的5’核苷酸是“-2”核苷酸，以此类推。3’末端核苷酸的“6个碱基内”的核苷酸处于相对于3’末端核苷酸的-1、-2、-3、-4、-5和-6位置。
【具体实施方式】
在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明并不局限于所描述的特定实施方案，当然，因而可以发生变化。还应当理解，本文使用的术语仅为了用于描述特定实施方案，并没有意图是限制性的，因为在本发明的范围将仅由所附的权利要求限定。
当提供范围值时，应当理解，每个间值，除非上下文明确指出否则到下限单位的十分之一，在范围的上限和下限之间和任何其他规定的或在指定范围内的间值，包含于本发明。这些更小范围的上限和下限可独立地被包含于所述更小的范围并也包含于本发明，受所述规定的范围中任何明确排除的限制。当所述规定的范围包括一个或二者限制时，排除那些所包括的限制之一或二者的范围也包含于本发明。
除非另外定义，本发明使用的所有技术和科学术语对于本发明所属的技术领域的普通技术人员来说具有通常理解的相同含义。尽管与本文记载的那些方法和材料相似或相同的任何方法和材料也能够用于本发明的实践或检测，现在记载优选的方法和材料。
本说明书引用的所有出版物和专利在此通过引用并入本发明，就像每个单独的出版物或专利具体地和单独地指出通过引用并入并且通过引用并入本发明并公开和记载出版物所引用的方法和/材料。任何出版物的引用是在申请日前为了公开并不应当解释为承认本发明无权凭借着在先发明早于这种公开。此外，所提供的出版物的日期可不同于实际公开日期，其可能需要单独确认。
必须注意如本发明使用的和所附权利要求使用的，除非上下文明确指出否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数对象。还注意权利要求可撰写成排除任何可选成份。正因为如此，该声明旨在作为使用这些排他性术语如“仅仅”、“仅”和权利要求成份的记载的类似的术语或使用“负面”限制的先行基础。
正如对于本领域技术人员阅读该公开明显的，本发明记载的和示例的每个单独的实施方案有分立的组成和特征，其可以很容易地与任何其它几种实施方案的特征分开或组合而不脱离本发明的范围或精神。任何记载的方法可以记载的事件顺序进行或逻辑上可能的任何其它顺序进行。
在下面的记载中，本领域技术人员将理解大量的聚合酶和活瓣核酸内切酶的任何一个可用于所述方法，包括但不限于，那些从热稳定的或超热稳定的原核生物、真核生物或古细菌生物分离出的。本领域技术人员也将理解用于所述方法的酶，例如，聚合酶和活瓣核酸内切酶，不仅包括天然存在的酶，而且包括重组酶，所述重组酶包括野生型酶的酶活性片段、切割产物、突变体和变体。
在进一步记载的方法中，将先记载用于所述方法的试剂混合物，随后是可用于所述方法的反应条件的记载。
反应混合物
用于所述方法的反应混合物通常含有：a)足以从核酸样品扩增靶基因组座位的扩增试剂，其中用于扩增的引物之一包括与基因组座位中点突变碱基配对的3’末端核苷酸并且还包含与基因组座位中除了3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；b)包括活瓣核酸内切酶和FRET盒的活瓣分析试剂；c)核酸样品。反应混合物特征在于其可在样品中基因组座位的野生型拷贝的背景下扩增和检测基因组座位的突变体拷贝的存在。
具体地，用于所述方法的反应混合物可含有：a)扩增试剂，其包括热稳定的聚合酶、核苷酸(例如，dGTP,dATP,dTTP和dCTP)、反应缓冲液(其包含Mg2+)、用于从核酸样品扩增靶基因组座位的第一引物和第二引物；其中第一引物：i.包含与基因组座位中点突变碱基配对的3’末端核苷酸；和ii.包含与基因组座位中除了在3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；b)活瓣分析试剂，其包括活瓣核酸内切酶、FRET盒和包含与所述点突变碱基互补的核苷酸的活瓣寡核苷酸；和c)核酸样品，其中核酸样品包含基因组座位的野生型拷贝和相对于基因组座位的野生型拷贝具有点突变的基因组座位的突变体拷贝。反应混合物特征在于其能够扩增和检测样品中基因组座位的所述突变体拷贝的存在。
在某些实施方案和在下文将详细记载的，扩增试剂的所述第一引物可用作活瓣分析试剂中的侵入引物。但在其它实施方案中，反应混合物任选地包含与第一引物不同的、具有与点突变碱基配对的3’末端核苷酸的侵入寡核苷酸。因此，根据分析如何进行(即，取决于PCR引物之一是否用作活瓣分析的侵入寡核苷酸)，反应混合物可另外含有不同于PCR引物的侵入寡核苷酸。
存在于反应混合物的试剂的确切的性质和浓度可与独立地应用于PCR和活瓣切割分析的试剂相似或相同，例外的是反应混合物包含Mg2+的浓度高于应用于常规PCR反应混合物(其包含Mg2+浓度在大约1.8mM与3mM之间)。在某些实施方案中，本发明记载的反应混合物包含Mg2+浓度范围为4mM至10mM，例如，6mM至9mM。可用于所述反应混合物的示例性的反应缓冲液和DNA聚合酶包括那些记载于多种出版物的(例如，Ausubel,等人.,Short Protocolsin Molecular Biology,3rd ed.,Wiley&Sons 1995和Sambrook等人.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Third Edition,2001Cold Spring Harbor,N.Y.)。适于PCR的反应缓冲液和DNA聚合酶可从多种供应商处购买，例如，Invitrogen(Carlsbad,CA),Qiagen(Valencia,CA)和Stratagene(La Jolla,CA)。尽管许多其它聚合酶可应用于某些实施方案，示例性聚合酶包括Taq，Pfu，Pwo，UlTma和Vent。与聚合酶一同适合使用的反应成份以及适合使用的条件的指引，可在聚合酶提供的文献中发现。引物设计记载于多种出版物，例如，Diffenbach和Dveksler(PCR Primer,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress 1995)；R.Rapley(The Nucleic Acid Protocols Handbook(2000),Humana Press,Totowa,N.J.)；Schena和Kwok等(Nucl.Acid Res.1990 18:999-1005)。引物和探针设计软件程序也有市售的，包括但不限于，Primer Detective(ClonTech,Palo Alto,Calif.),Lasergene,(DNASTAR,Inc.,Madison,Wis.)；和Oligo软件(National Biosciences,Inc.,Plymouth,Minn)以及iOligo(Caesar Software,Portsmouth,N.H)。
示例性的活瓣切割分析试剂见于Lyamichev等(Nat.Biotechnol.1999 17:292-296)，Ryan等(Mol.Diagn.1999 4:135-44)和Allawi等(J Clin Microbiol.2006 44:3443–3447)。活瓣核酸内切酶的合适条件或者是已知的，或者可使用本领域已知的方法容易测定(参见，例如，Kaiser等J.Biol.Chem.274:21387-94,1999)。可用于所述方法的示例性的活瓣核酸内切酶包括但不限于，水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶I、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶I、哺乳动物FEN-1、闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)FEN-1、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)FEN-1、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)FEN-1、嗜热碱甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)FEN-1、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)FEN-1、CLEAVASETM(Third Wave,Inc.,Madison,Wis.)、酿酒酵母(S.cerevisiae)RTH1,酿酒酵母(S.cerevisiae)RAD27、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)rad2、噬菌体T5 5'-3'核酸外切酶、Pyroccus horikoshii FEN-1、人类核酸外切酶1、小牛胸腺5'-3'核酸外切酶,包括其真细菌、真核生物和古细菌同源物,例如II类结构特异性酶家族成员,以及酶活性突变体或其变体。切割酶的说明可见于，在其它地方中，Lyamichev等,Science 260:778-83,1993；Eis等,Nat.Biotechnol.19:673-76,2001；Shen等,Trends in Bio.Sci.23:171-73,1998；Kaiser等J.Biol.Chem.274:21387-94,1999；Ma等,J.Biol.Chem.275:24693-700,2000；Allawi等,J.Mol.Biol.328:537-54,2003；Sharma等,J.Biol.Chem.278:23487-96,2003；和Feng等,Nat.Struct.Mol.Biol.11:450-56,2004。
在具体实施方案中，反应混合物可包含用于平行分析多个(例如，至少2、3、4或更多)不同靶序列的试剂。在这些情况下，反应混合物可包含多对PCR引物，具有不同活瓣的多个不同的活瓣寡核苷酸，和用于检测不同活瓣的多个不同FRET盒，一旦它们被切割。在一个实施方案中，混合物中的寡核苷酸可具有共同的活瓣但不同的结合序列，以允许，例如，一组突变切割共同的FRET盒并报告信号，其中单个荧光基团指示突变的存在。在这个实施方案中，哪个突变存在于样品中可在鉴定突变的存在之后进行测定。任选地，如果PCR引物之一没有用作侵入寡核苷酸，反应可以包含多个侵入寡核苷酸。FRET盒切割后，可观察到多个可明显区分的荧光信号。尽管可应用许多其它的荧光基团，荧光基团可选自，例如，6-羧基荧光素(FAM)，其激发和发射波长分别为485nm和520nm，雷德蒙红(Redmond Red)，其激发和发射波长分别为578nm和650nm以及雅基马黄(Yakima Yellow)，其激发和发射波长分别为532nm和569nm，以及Quasor670其激发和发射波长分别为644nm和670nm。在某些情况下，至少PCR引物对之一、活瓣寡核苷酸和FRET盒可用于检测内参。
如上所述，PCR引物之一(任意地指定为“第一”的引物)，包括与基因组座位中点突变(即，突变体等位基因)碱基配对的3’末端核苷酸并还包含与基因组座位中除了3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列(即，相对3’末端核苷酸，位于-1位置，-2位置，-3位置，-4位置，-5位置或-6位置)。换句话说，除了仅与基因组座位中突变的突变体等位基因碱基配对的3’末端核苷酸之外，引物还在靠近3’末端有不稳定的错配，其既不与基因组区域的突变体等位基因也不与野生型等位基因配对。不限于任何特定的理论，相信去稳定的错配使得第一引物3’末端与野生型序列的杂交不稳定至比突变体序列更大的延伸，从而导致突变体序列的优先扩增。如在下文将详细记载的，用第一和第二引物扩增的产物的存在可使用活瓣分析检测，所述活瓣分析采用第一引物或具有去稳定突变和仅与基因组座位的突变体等位基因碱基配对的末端核苷酸的其它寡核苷酸。检测步骤使用这种序列(即，包含去稳定突变和仅与基因组座位的突变体等位基因碱基配对的末端核苷酸的序列)在扩增产物中突变体和野生型序列之间提供了进一步的区分。不限于任何特定的理论，相信突变体和野生型之间的这种区分大量发生于扩增的开始几轮，因为扩增的序列(即，扩增子)为PCR引物杂交提供了完全互补的序列。野生型序列应当不会被扩增，而突变体序列应当有效扩增。
所述去稳定的错配可通过用其它核苷酸取代与点突变碱基配对的核苷酸来完成。取代入序列的核苷酸可为其它天然核苷酸(例如，dG,dA,dT或dC)，或，在某些情形下，修饰的核苷酸。在某些实施方案中，第一引物的3’末端可包含多于1个(例如2或3个)错配。在特定实施方案中，所使用的错配类型(例如，错配是G:T错配还是C:T错配等)影响引物区分野生型和突变体序列的能力。一般而言，各种错配的稳定性顺序(从最稳定至最不稳定)如下：G:T>G:G＝A:G>T:G>G:A＝T:T>T:C>A:C>C:T>A:A>C:A>C:C(如记载于Gaffney和Jones(Biochemistry 1989 26:5881-5889))，但错配周围的碱基会在某些情形下影响该顺序(参见，例如Ke等人Nucleic Acids Res.1993 21:5137-5143)。所使用的错配可通过实验优化以提供期望的区分。
正如将是明显的，设计用于所述方法的多种寡核苷酸使其互不干扰。例如，在具体的实施方案中，活瓣寡核苷酸可在其3’末端加帽，从而阻止其延伸。同样，在某些实施方案中，如果不用作PCR引物之一，侵入寡核苷酸可在其3’末端加帽。在具体的实施方案中，如果侵入寡核苷酸不用作PCR引物之一，那么侵入寡核苷酸的浓度可以在PCR引物浓度的5％至50％范围内，例如，10％至40％。此外，在某些情形下，活瓣部分和活瓣寡核苷酸的靶互补区域的Tm可独立地比PCR引物的Tm低至少10℃(例如，低10-20℃)，这导致a)活瓣寡核苷酸与靶核酸在较高温度(65℃至75℃)较少的杂交以及b)任何切割的活瓣与FRET盒在较高温度(65℃至75℃)较少的杂交，因而允许基因组座位通过PCR在活瓣没有有效杂交的温度进行扩增。
在一个多重反应中，引物设计成具有类似的热力学性质，例如，相似的Tm，G/C含量，发夹稳定性，并且在某些实施方案中可以全部有相似的长度，例如，从18至30nt，例如，20-25nt长。用于反应混合物的其它试剂也可为Tm匹配的。
所述分析混合物可以存在于容器中，包括但不限于，试管；多孔板，例如96孔、384孔、1536孔板；和微流控装置。在某些实施方案中，多个多重反应在同一个反应容器中进行。取决于反应如何进行，反应混合物体积可为5μl至200μl，例如，10μl至100μl，尽管可以预见此范围之外的体积。
在某些实施方案中，所述反应混合物还可以含有核酸样品。在具体的实施方案中，样品可以含有基因组DNA或其扩增产物(例如，使用Lage等Genome Res.2003 13:294-307或例如公开的专利申请US20040241658的方法扩增的基因组DNA)。在示例性的实施方案中，基因组样品可以包含从哺乳动物细胞例如人、小鼠、大鼠或猴子细胞而来的基因组DNA。所述样品可由培养的细胞或临床样品的细胞制备，所述临床样品例如，组织活检、刮或灌洗或法医样品细胞(即，在犯罪现场收集的样品细胞)。在具体的实施方案中，基因组样品可来自福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。
在具体的实施方案中，核酸样品可获取自生物样品，例如细胞、组织、体液和粪便。感兴趣的体液包括但不限于，血液、血清、血浆、唾液、黏液、痰(phlegm)、脑脊髓液(cerebral spinal fluid)、胸腔积液、眼泪、阴道管液(lactal duct fluid)、淋巴液、痰液(sputum)、脑脊液(cerebrospinal fluid)、关节液、尿液、羊水和精液。在具体的实施方案中，样品可获取自个体，例如，人类，并可在用于个体分析之前处理。例如，核酸可在用之前从样品提取，方法是已知的。
例如，DNA可通过任何不同的方法从粪便中提取，包括记载于，例如Coll等(J.ofClinical Microbiology 1989 27:2245-2248)，Sidransky等(Science 1992 256:102-105)，Villa(Gastroenterology1996 110:1346-1353)和Nollau(BioTechniques 1996 20:784-788)，以及美国专利5463782、7005266、6303304和5741650。除了其它之外，用于从粪便中提取DNA的商业化DNA提取试剂盒包括QIAamp粪便迷你试剂盒(QIAGEN,Hilden,Germany)，Instagene Matrix(Bio-Rad,Hercules,Calif.)，和RapidPrep微基因组DNA分离试剂盒(Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway,N.J.)。
样品分析方法
在进行所述方法时，上述反应混合物可经受一组或多组热循环条件。示例性的条件包括，例如那些记载于Allawi等(J Clin Microbiol.2006 44:3443–3447)。在一个实施方案中，反应混合物可经受常规PCR热循环(即，多轮变性温度超过90℃，例如，大约95℃，退火温度65℃-75℃且延伸温度65℃-75℃)随后一段高温以变性热稳定的聚合酶(例如，大约99℃)，并且然后一段温度为低于延伸温度约10℃，在此过程中检测荧光。
在其它实施方案中，反应混合物可经受循环条件，其中扩增产物的量的增加(由荧光的量表明)可实时检测，其中术语“实时”旨在指在反应进程和产物积累的同时进行检测。检测可以拷贝的绝对数量表示或与样品中的对照核酸标准化之后的相对量表示。在一个实时实施方案中，反应可经受记载于，例如，Tadokoro(J.Vir.Methods 2009155:182-186)的热循环条件。在这个实施方案中，反应混合物可经受四步骤的多个循环，包括温度超过90℃(例如，大约95℃)的变性步骤，温度范围为61℃-69℃的退火，温度50℃的活瓣切割，以及温度72℃的延伸。在这个实施方案中，荧光可在每个循环监测以提供在反应混合物中积累的产物的量的实时检测。
在可选的实施方案中，反应混合物经受下列热循环条件：第一组5至15(例如，8至12)个以下循环：i.至少90℃的第一温度；ii.60℃-75℃范围(例如，65℃至75℃)的第二温度；iii.65℃-75℃范围的第三温度；随后：第二组的20-50个以下循环：i.至少90℃的第四温度；ii.比第二温度低至少10℃的第五温度(例如，50℃至55℃的范围)；以及iii.65℃-75℃范围的第六温度。在热循环过程中，例如，在第一组和第二组循环之间，没有额外的试剂需要加到反应混合物中。在具体的实施方案中，热稳定聚合酶在第一组和第二组条件之间不是失活的，因此允许靶在第二组循环的每个循环过程中扩增。在具体的实施方案中，第二和第三温度可以是相同的温度，这样进行“两步”热循环条件。每个循环可独立地持续10秒至3分钟的范围，尽管很容易采用此范围之外的持续时间。在第二组循环的每个循环中(例如，当反应处于第五温度)，活瓣探针切割产生的信号可被测定从而提供样品中靶核酸的量的实时检测。
图2示意性示例了所述方法的例子的一些原则。参照图2，所述方法包括从包含基因组座位的野生型拷贝34和相对于基因组座位的野生型拷贝34具有点突变38的基因组座位的突变体拷贝36的样品32扩增产物30，以产生扩增的样品。使用第一引物40和第二引物42完成扩增，其中第一引物包含与点突变碱基配对的3’末端核苷酸44，还包含与基因组座位除了3’末端核苷酸44的6个碱基内的单个碱基错配46(即，碱基与靶基因组座位中相应碱基不互补)之外的序列完全互补的核苷酸序列。扩增的样品中产物30的存在使用活瓣分析检测，所述活瓣分析采用具有与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸的侵入寡核苷酸48。如图2所示，第一引物40用作活瓣分析中的侵入寡核苷酸48，但在可选的实施方案中，可以使用不同于第一引物的第二寡核苷酸。如上所述和图1中记载的，活瓣分析依赖于含有活瓣寡核苷酸50、侵入寡核苷酸48和由活瓣核酸内切酶(未显示)作用产物30释放的活瓣52的复合物32的切割。释放的活瓣52然后与FRET盒54杂交形成第二复合物63，第二复合物由活瓣核酸内切酶切割，从复合物切割荧光基团并产生可被检测用于显示扩增的样品中的产物的量的荧光信号56。
样品中产物的量可相对样品中存在的对照核酸的量进行标准化，从而确定样品中突变体拷贝的相对量。在某些实施方案中，对照核酸可以是与基因组座位不同的座位，在某些情形下，可用采用具有与基因组座位的野生型拷贝于点突变的位点碱基配对的3’末端核苷酸的侵入寡核苷酸的活瓣分析来检测，从而检测所述样品中基因组座位的野生型拷贝的存在。对照可以在同一个反应混合物或不同的反应混合物与检测产物平行的方式进行检测。如果在同一个反应混合物检测对照，活瓣分析可包括进一步的试剂，具体为第二侵入寡核苷酸、第二活瓣探针，所述第二活瓣具有第二活瓣及产生与用于突变体序列的FRET盒可区分的信号的第二FRET盒。在具体实施方案中，反应混合物还可包括PCR试剂和用于扩增和检测第二基因组座位或检测同一基因组座位的第二点突变的活瓣试剂。
在某些情形下，指示切割的活瓣的量的荧光可通过自动荧光计检测，设计成进行实时PCR，具有如下特征：激发FRET盒的荧光基团的光源，加热和冷却反应混合物的系统以及检测FRET盒的荧光的荧光计。这些特征的组合，允许实时检测切割的活瓣，因而允许样品中的靶核酸的量得到定量。运行实时PCR反应的自动荧光计是本领域已知的并且可以适用于该具体分析，例如，Bio-Rad Laboratories的ICYCLERTM(Hercules,Calif.)，Stratagene的Mx3000PTM，MX3005PTM和MX4000TM，ABI PRISMTM 7300,7500,7700和7900Taq Man(AppliedBiosystems,Foster City,Calif.)，SMARTCYCLERTM,ROTORGENE 2000TM(CorbettResearch,Sydney,Australia)和GENE XPERTTM系统(Cepheid,Sunnyvale,Calif.)以及LIGHTCYCLERTM(Roche Diagnostics Corp.,Indianapolis,Ind.)。不同反应温度之间的升温速度并不是决定性的并且，在某些实施方案中，可应用预设于热循环仪上的默认升温速度。
在某些情形下，所述方法可进一步包括对几个循环切割的量进行制图，从而提供靶核酸丰度的实时评价。预测可通过测定临界循环次数来计算(即，该荧光增至预定的阈值之上的循环；“Ct”值或“Cp”值)。该预测可与对照进行比较(对照可在同一反应混合物作为感兴趣的基因组座位进行分析)以提供标准化的预测。热循环仪也可以含有测定每个样品的临界循环的应用软件。测定临界循环的示例性方法见于，例如，Luu-The等(Biotechniques 2005 38:287-293)。
还提供了进行样品分析的装置。在某些实施方案中，所述装置包括：a)被编排用于进行上述方法的热循环仪和b)包含上述反应混合物的容器。
实用性
所记载的方法可用于多种应用，这些应用通常包括样品分析应用，其中在给定的样品中检测靶核酸序列的存在。
特别地，上述方法可用于诊断，预测治疗的反应，或研究癌性病症或其他哺乳动物疾病，包括但不限于，白血病，乳腺癌，前列腺癌，阿尔兹海默症，帕金森症，癫痫，肌萎缩性侧索硬化，多发性硬化，中风，孤独症，智力迟钝和发育障碍。许多核苷酸多态性与这些障碍有关并被认为是产生这些障碍的因素。已知核苷酸多态性的类型和定位可对多种哺乳动物疾病的诊断、预后和理解有相当大的帮助。此外，本文中记载的分析条件可用于其它核酸检测应用包括，例如，用于检测感染性疾病，病毒载量监测，病毒基因分型，环境检测，食品检测，法医学、流行病学和其它用于检测具体核酸序列的领域。
在一些实施方案中，生物样品可获取自患者，并且样品可使用所述方法分析。在具体的实施方案中，所述方法可用于鉴定和/或评价生物样品中基因组座位的突变体拷贝的量，所述样品包含基因组座位的野生型拷贝和基因组座位的突变体拷贝，所述突变体拷贝具有与基因组座位的野生型拷贝相关的点突变。在这个实施例中，样品可包含基因组座位的野生型拷贝比突变体拷贝至少多100倍(例如，至少1,000倍，至少5,000倍，至少10,000倍，至少50,000倍或至少100,000倍)。
在这些实施方案中，所述方法可应用于检测癌基因突变(其可以是体细胞突变)，例如，PIK3CA、NRAS、KRAS、JAK2、HRAS、FGFR3、FGFR1、EGFR、CDK4、BRAF、RET、PGDFRA、KIT或ERBB2，所述突变可与乳腺癌、黑色素瘤、肾癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、白血病、大肠癌、前列腺癌、间皮瘤、神经胶质瘤、meullobastoma、红细胞增多症、淋巴瘤、肉瘤或多发性骨髓瘤相关(参见，例如，Chial 2008Proto-oncogenes to oncogenes to cancer.NatureEducation 1:1)。
在这些实施方案中，反应混合物可含有第一引物和第二引物，其中第一引物包含与点突变碱基配对的3’末端核苷酸。第一引物可用作第二组循环中的侵入寡核苷酸，或者，在某些情形下，在反应混合物中可以有分开的也与点突变碱基配对的3’末端核苷酸的侵入寡核苷酸。由于基因组座位中的点突变可与癌症(例如，结直肠癌)直接相关，所述方法可用于诊断患有癌症或癌前状况(例如，腺瘤等)的患者，单独地，或与其它临床技术(例如，物理检查如结肠镜检查)或分子生物学技术(例如，免疫组化分析)结合。例如，获取自所述分析的结果可与其他信息结合，例如，其他座位的甲基化状态信息，相同基因组座位或不同座位的重排或取代信息，细胞遗传学信息，重排信息，基因表达信息或端粒长度的信息，来提供癌症或其他疾病的整体诊断。
在一个实施方案中，样品可收集自第一位置的患者，例如在临床环境，如在医院或在医生办公室，以及所述样品可转至第二位置，例如，处理样品和进行上述方法生产报告的实验室。本发明所述“报告”是电子的或有形的文件，包括提供检测结果的报告元素，检测结果可包括Ct值或Cp值或者类似的指示样品中基因组座位突变拷贝存在的结果。一旦生成，所述报告可转至其他位置(可为与第一位置相同的位置)，可由健康专家(例如，临床医生，实验室技术人员，或如肿瘤科医生，外科医生，病理学家的医生)作为临床诊断的一部分进行解读。
试剂盒
还提供实践如上所述方法的试剂盒。试剂盒的成份可存在于分开的容器，或多种成份可存在于单一容器。在具体的实施方案中，试剂盒可包括：a)PCR试剂，其包括第一引物和第二引物，其中第一引物包含与基因组座位中的点突变碱基配对的3’末端核苷酸，还包含除了在3’末端核苷酸6个碱基内具有一个碱基错配之外与基因组座位序列完全互补的核苷酸序列；以及b)活瓣分析试剂，其包括具有与点突变碱基配对的3’末端核苷酸的侵入寡核苷酸。这些试剂的详情如上所述。试剂盒还包括用于扩增和检测对照核酸的PCR和活瓣试剂。
除了上述成份，试剂盒还可包括使用试剂盒成份实践所述方法的说明书。实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如说明书可以打印于例如纸或塑料等的基质上。这样，说明书可作为包装附页存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其成份的容器的标签(即，与包装或者子包装结合)等。在其它实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件存在，例如CD-ROM、磁盘等。又在其它实施方案中，实际说明书不在试剂盒中，而是以从远程资源获取说明书的方式例如通过因特网提供。这个实施方案的例子是包括网址的试剂盒，通过该网址可查看说明书和/或下载说明书。获取说明书的这种方式与说明书一起记录于合适的基质。除了所述说明书，试剂盒还可包括一种或多种对照样品，例如，用于测试试剂盒的阳性或阴性对照分析物。
在本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用的方式并入本文，就像每个单独的出版物或专利申请具体地和单独地通过引用的方式并入。任何出版物的引用是在申请日前为了公开，不应当被解释为承认本发明无权凭借着在先发明早于这种公开。
尽管上述发明通过示例和实施例的方式为了清楚理解的目的已详细描述，对本技术领域的普通技术人员明显的是，在不脱离所附的权利要求书的精神或范围的情况下，可对本发明进行某种改变和修改。
【实施例】
实施例1
KRAS G35A分析
下述分析设计用于在野生型序列背景下检测含有KRAS G35A突变的核酸序列。如下显示的KRAS的野生型和G35A突变体等位基因的部分核苷酸序列作为参考。
KRAS野生型的扩增区域的部分序列(位置35以下划线标示)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGA(SEQID NO:1)
KRAS突变体G35A的扩增区域的部分序列(位置35以下划线标示)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGA(SEQID NO:2)
在这个实验中，特异性检测和区分G35A突变的全部责任在于活瓣探针。正向和反向引物结合区域在位置35突变之外。侵入寡核苷酸与任何一个引物均不是相同的序列。扩增该区域的引物是5’-AGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’(SEQ ID NO:3)和5’-TTGTTGGATCATATTCGTCCAC-3’(SEQ ID NO:4)。
KRAS G35A突变体的均相检测是通过使用核酸内切酶可切割的活瓣探针、侵入寡核苷酸探针、可切割的FRET盒和热稳定活瓣核酸内切酶来完成的。为了检测G35A突变，活瓣探针序列是5’-CGCCGAGGATGGCGTAGGCA-3’/3C6/(SEQ ID NO:5)，其中下划线显示突变体碱基并且为了抑制引物延伸3’末端用己二醇基团封闭。切割的活瓣部分，其随后与FRET盒结合，并随后从它的猝灭剂释放荧光基团，包括5’末端至突变特异的A的所有碱基。该实施例中使用的侵入寡核苷酸是5’-TGTGGTAGTTGGAGCTGg-3’(SEQ ID NO:6)，其中3’g对G35A不是特异性的。引物、侵入寡核苷酸和活瓣探针作为非目录产品由Integrated DNATechnologies(IDT,Coralville,Iowa)提供。
使用的FRET盒是/Red/TCT/猝灭剂/TCGGCCTTTTGGCCGAGAGACCTCGG CGCG/3C6/(SEQ ID NO:7)，其中雷德蒙红是荧光染料，猝灭剂是Dark猝灭剂，并且为了抑制引物延伸3’末端用己二醇基团封闭。FRET盒由Hologic(Madison,Wisconsin)提供。该FRET盒可称为Arm 1Red FRET盒)。
引物、侵入探针和活瓣探针结合区域的相对定位可在如下序列的下划线区域看到，活瓣探针结合区域斜体显示：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT
TGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAAT ATGATCCAACAATAGA(SEQ ID NO:8)
循环条件是95℃2min；50个循环95℃20sec，50℃1min和70℃30sec，最终保持在40℃。荧光信号获取是在循环的50℃的点完成的。PCR反应在480Multiwell96Plates(Roche,Indianapolis)上、于含7.5mM MgCl2和250μM dNTPs(Promega,Madison,Wisconsin)的10mM MOPS pH 7.5中完成。Taq聚合酶是iTaq酶(BioRad,Hercules,California)，切割酶是Cleavase 2.0(Hologic,Madison,Wisconsin)。正向引物浓度是500nM，反向引物浓度是500nM，活瓣探针是500nM，侵入寡核苷酸探针是70nM并且FRET盒以终浓度200nM使用。所有的扩增和检测在LightCycler 480光学热循环仪(Roche,Indianapolis,Indiana)上进行。
包含KRAS基因(无论是野生型还是突变体)的片段的质粒用于评估实验系统检测掺入野生型拷贝中KRAS 35A突变体拷贝的能力，在4种不同突变体水平进行，包括104突变体拷贝于105野生型拷贝(1：10)，103突变体拷贝于105野生型拷贝(1：100)，102突变体拷贝于105野生型拷贝(1：1000)和10突变体拷贝于105野生型拷贝(1：10000)。
图3显示扩增样品中突变体与野生型的不同比例的动力学扩增曲线数据和“交叉点”(Cp；Roche LightCycler 480手册,Indianapolis,IN)。在这些分析中，Cp作为荧光上升至最大荧光的18％的点进行计算。用于该实施例的引物、侵入探针和活瓣探针的设计在所述基因的野生型为突变体形式的100倍以上时不能检测G35A突变。
实施例2
KRAS G35A分析
如实施例1中所述，该分析设计用于在多种水平野生型序列存在下检测G35A突变。突变体和野生型序列如实施例1所述(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。在该分析中，正向引物也起到侵入寡核苷酸的作用。正向引物的3’和活瓣探针的重要位置均含有类似突变体的A碱基。
使用的引物是5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3’(SEQ ID NO:9)，其中以下划线标示的3’碱基相应于突变，以及5’-CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’(SEQ ID NO:10)。所使用的活瓣探针与实施例1中的相同，5’-CGCCGAGGATGGCGTAGGCA-3’/3C6/(SEQ ID NO:5)，其中下划线显示突变体碱基，并且为了抑制引物延伸，3’末端用己二醇基团封闭。引物和活瓣探针作为非目录产品由Integrated DNA Technologies(IDT,Coralville,Iowa)提供。
引物、侵入探针和活瓣探针结合区域的相对定位可在如下序列的下划线区域看到，活瓣探针结合区域斜体显示：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGA(SEQID NO:11)
使用的FRET盒是/Red/TCT/猝灭剂/TCGGCCTTTTGGCCGAGAGACCTCGGCGCG/3C6/(SEQID NO:25)，其中雷德蒙红是荧光染料，猝灭剂是Dark猝灭剂，并且为了抑制引物延伸，3’末端用己二醇基团封闭。FRET盒由Hologic(Madison,Wisconsin)提供。
循环条件是95℃2min；50个循环95℃20sec，53℃1min和70℃30sec，并保持在40℃。荧光信号获取是在循环的53℃的点完成的。PCR反应在480Multiwell96Plates(Roche,Indianapolis)上、于含7.5mM MgCl2和250μM dNTPs(Promega,Madison,Wisconsin)的10mM MOPS pH 7.5中完成。Taq聚合酶是iTaq酶(BioRad,Hercules,California)，切割酶是Cleavase 2.0(Hologic,Madison,Wisconsin)。正向引物浓度是500nM，反向引物浓度是500nM，活瓣探针是500nM，并且FRET盒于终浓度200nM使用。所有的扩增和检测在LightCycler 480光学热循环仪(Roche,Indianapolis,Indiana)上进行。
包含KRAS基因(无论是野生型还是突变体)的片段的质粒用于评估实验系统检测掺入野生型拷贝中KRAS 35A突变体拷贝的能力，在4种不同突变体水平进行，包括104突变体拷贝于105野生型拷贝(1：10)，103突变体拷贝于105野生型拷贝(1：100)，102突变体拷贝于105野生型拷贝(1：1000)和10突变体拷贝于105野生型拷贝(1：10000)。
图4显示扩增样品中突变体与野生型的不同比例的动力学扩增曲线数据和“交叉点”(Cp；Roche LightCycler 480手册,Indianapolis,IN)。在这些分析中，Cp作为荧光上升至最大荧光的18％的点进行计算。用于该实施例的引物和活瓣探针的设计在野生型下无法检测G35A突变，且没有真正的剂量效应。
实施例3
以二次错配进行KRAS G35A、G35T和G35C分析
在这个实施例中，正向引物加入二次错配，正向引物还作为这些切割分析中的侵入探针。第二错配加至第四碱基，从与突变匹配的3’末端碱基开始数。在所有情形下，第二错配碱基是A，相应于序列中的C，并从而产生突变体和野生型序列的A:G错配。采用3’末端是A、T或C的引物(其也是侵入探针)，应用去稳定的A错配，这相应于KRAS位置35发现的所有三个突变。
野生型KRAS的靶序列如实施例1中记载(SEQ ID NO:1)。所检测的G35A是实施例1中所示之一(SEQ ID NO:2)。
KRAS突变体G35T的扩增区域的部分序列(位置35以下划线标示)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGA(SEQID NO:12)
KRAS突变体G35C的扩增区域的部分序列(位置35以下划线标示)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGCTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGA(SEQID NO:13)
用于所有三个突变体检测的反向引物的设计是与实施例2中所示的一个相同，5’-CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’(SEQ ID NO:10)。检测G35A的正向引物是5’-TTGTGGTAGTTGGAGATGA-3’(SEQ ID NO:14)，其中3’末端以下划线标示的碱基相应于靶突变，以下划线标示的从3’末端起第四位碱基是旨在增强3’末端错配效果的去稳定错配。用于G35A的活瓣探针与实施例1中的相同，5’-CGCCGAGGATGGCGTAGGCA-3’/3C6/(SEQ ID NO:5)，其中下划线显示突变体碱基，并且为了抑制引物延伸，3’末端用己二醇基团封闭。
检测G35T的正向引物是5’-TTGTGGTAGTTGGAGATGT-3’(SEQ ID NO:15)，其中3’末端以下划线标示的碱基相应于靶突变，以下划线标示的从3’末端起第四位碱基是旨在增强3’末端错配效果的去稳定错配。用于G35T的活瓣探针是5’-CGCCGAGGTTGGCGTAGGCA-3’/3C6/(SEQ ID NO:16)，其中下划线显示突变体碱基，并且为了抑制引物延伸，3’末端用己二醇基团封闭。
检测G35C的正向引物是5’-TTGTGGTAGTTGGAGATGC-3’(SEQ ID NO:17)，其中3’末端以下划线标示的碱基相应于靶突变，以下划线标示的从3’末端起第四位碱基是旨在增强3’末端错配的不稳定错配。用于G35C的活瓣探针是5’-CGCCGAGGCTGGCGTAGGCA-3’/3C6/(SEQ ID NO:18)，其中下划线显示突变体碱基，并且为了抑制引物延伸，3’末端用己二醇基团封闭。
引物和活瓣探针的空间构型与实施例2中所示的类似(SEQ ID NO:11)。
引物和活瓣探针作为非目录产品由Integrated DNA Technologies(IDT,Coralville,Iowa)提供。
为所有这些突变检测系统使用的FRET盒是/Red/TCT/猝灭剂/TCGGCCTTTTGGCCGAGAGACCTCGGCGCG/3C6/(SEQ ID NO:25)，其中雷德蒙红是荧光染料，猝灭剂是Dark猝灭剂，并且为了抑制引物延伸，3’末端用己二醇基团封闭。FRET盒由Hologic(Madison,Wisconsin)提供。
循环条件是95℃2min；50个循环95℃20sec，53℃1min和70℃30sec；并保持在40℃。荧光信号获取是在循环的53℃的点完成的。PCR反应在480Multiwell96Plates(Roche,Indianapolis)上、于含7.5mM MgCl2和250μM dNTPs(Promega,Madison,Wisconsin)的10mM MOPS pH 7.5中完成。Taq聚合酶是iTaq酶(BioRad,Hercules,California)，切割酶是Cleavase 2.0(Hologic,Madison,Wisconsin)。正向引物浓度是500nM，反向引物浓度是500nM，活瓣探针是500nM，并且FRET盒于终浓度200nM使用。所有的扩增和检测在LightCycler 480光学热循环仪(Roche,Indianapolis,Indiana)上进行。
包含KRAS基因(无论是野生型还是分别是三个突变体之一)的片段的质粒用于评估实验系统检测掺入野生型拷贝中KRAS 35A、T或C突变体拷贝的能力，在4种不同突变体水平进行，包括104突变体拷贝于105野生型拷贝(1：10)，103突变体拷贝于105野生型拷贝(1：100)，102突变体拷贝于105野生型拷贝(1：1000)和10突变体拷贝于105野生型拷贝(1：10000)。
图5显示扩增样品中突变体与野生型的不同比例的动力学扩增曲线数据和“交叉点”(Cp；Roche LightCycler 480手册,Indianapolis,IN)。在这些分析中，Cp作为荧光上升至最大荧光的18％的点进行计算。用于该实施例的引物和活瓣探针的设计可以从野生型序列区分突变体序列，并且它的扩增效率没有被低至大约1：100突变体/野生型比例的过量的野生型序列所抑制。但是，分析无法在1：1000突变体/野生型比例时可信地检测突变体序列(图5)。
实施例4
用其它二次错配进行KRAS G35A、G35T和G35C分析
在这个实施例中，与实施例3相似，测试二次错配，除了已知更加去稳定的碱基配对的错配，具体是A-C和C-C错配在倒数第二的位置进行了测试，与3’末端错配相邻，分别对于G35A和G35T。与实施例3中使用的相同的引物组用于检测G35C。此外，使用活瓣探针的不同活瓣臂以及相应的配对的FRET盒。
三个突变的靶序列与实施例1和实施例3中记载的那些相同。用于所有三个突变体检测的反向引物的设计与实施例2中所示的一个相同，5’-CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’(SEQ ID NO:10)。
检测G35C的正向引物与实施例3记载的相同，5’-TTGTGGTAGTTGGAGATGC-3’(SEQID NO:17)，其中以下划线标示的3’末端碱基相应于靶突变，以下划线标示的从3’末端起第四位碱基是旨在增强3’末端错配的效果的去稳定错配。
检测G35A的正向引物是5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTAA-3’(SEQ ID NO:19)，其中以下划线标示的3’末端碱基相应于靶突变，以下划线标示的倒数第二位碱基是旨在增强3’末端错配的效果的去稳定错配。检测G35T的正向引物是5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTCT-3’(SEQ IDNO:20)，其中以下划线标示的3’末端碱基相应于靶突变，以下划线标示的倒数第二位碱基是旨在增强3’末端错配的效果的去稳定错配。
检测G35A的活瓣探针是5’-GACGCGGAGATGGCGTAGGCA-3’/3C6/(SEQ ID NO:21)，其中下划线显示突变体碱基，并且为了抑制引物延伸，3’末端用己二醇基团封闭。检测G35T的活瓣探针是5’-GACGCGGAGTTGGCGTAGGCA-3’/3C6/，其中下划线显示突变体碱基，并且为了抑制引物延伸，3’末端用己二醇基团封闭。检测G35C的活瓣探针是5’-GACGCGGAGCTGGCGTAGGCA-3’/3C6/(SEQ ID NO:23)，其中下划线显示突变体碱基，并且为了抑制引物延伸，3’末端用己二醇基团封闭。
在这个实施例中为突变检测使用的FRET盒是5’-FAM/TCT/猝灭剂/AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACTCCGCGTCCGT-3’/3C6(SEQ ID NO:24)，其中FAM是荧光素，猝灭剂是Dark猝灭剂，并且为了抑制引物延伸，3’末端用己二醇基团封闭。FRET盒由Hologic(Madison,Wisconsin)提供。循环条件是95℃2min；50个循环95℃20sec，53℃1min和70℃30sec；并保持在40℃。荧光信号获取是在循环的53℃的点完成的。PCR反应在480Multiwell 96Plates(Roche,Indianapolis)上、于含7.5mM MgCl2和250μM dNTPs(Promega,Madison,Wisconsin)的10mM MOPS pH 7.5中完成。Taq聚合酶是iTaq酶(BioRad,Hercules,California)，切割酶是Cleavase 2.0(Hologic,Madison,Wisconsin)。正向引物浓度是500nM，反向引物浓度是500nM，活瓣探针是500nM，并且FRET盒于终浓度200nM使用。所有的扩增和检测在LightCycler 480光学热循环仪(Roche,Indianapolis,Indiana)上进行。
包含KRAS基因(无论是野生型还是分别是三个突变体之一)的片段的质粒用于评估实验系统检测掺入野生型拷贝中KRAS 35A、T或C突变体拷贝的能力，在4种不同突变体水平进行，包括104突变体拷贝于105野生型拷贝(1：10)，103突变体拷贝于105野生型拷贝(1：100)，102突变体拷贝于105野生型拷贝(1：1000)和10突变体拷贝于105野生型拷贝(1：10000)。
图6显示扩增样品中突变体与野生型的不同比例的动力学扩增曲线数据和“交叉点”(Cp；Roche LightCycler 480手册,Indianapolis,IN)。在这些分析中，Cp作为荧光上升至最大荧光的18％的点进行计算。用于该实施例的引物和活瓣探针的设计可以从野生型序列区分突变体序列，并且它的扩增效率没有被过量的野生型序列所抑制。KRAS G35A和G35C分析可低至1：1000突变体/野生型比例线性检测突变体序列，并且G35T分析可低至1：100突变体/野生型比例线性检测(图6)。
实施例5
额外实验确定KRAS G35A检测的最佳二次错配
在这个实施例中，与先前的实施例相似，正向引物(也作为侵入探针)中二次错配的去稳定效果用于KRAS位置35突变的检测。如其它实施例中的，通过与过量野生型序列在多种比例比较来评估G35A突变的检测。靶扩增区域序列与实施例1中的相同(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。用于所有三个突变体检测实验的反向引物的设计与实施例2、3和4中所示的一个相同：5’-CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’(SEQ ID NO:10)。
活瓣探针(SEQ ID NO:21)和FRET盒(SEQ ID NO:24)与实施例4中用于检测G35A的那些相同。列出这些系列正向探针(其也作为用于切割分析的侵入寡核苷酸)，其中以下划线标示的3’末端相应于靶突变，以下划线标示的其它碱基是旨在增强3’末端错配的效果的去稳定错配。
KRAS 35A P2C:5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTCA-3’(SEQ ID NO:25)
KRAS 35A P4A:5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGATGA-3’(SEQ ID NO:26)
KRAS 35A P6T:5’-CTTGTGGTAGTTGGTGCTGA-3’(SEQ ID NO:27)
KRAS 35A P5C:5’-AACTTGTGGTAGTTGGACCTGA-3’(SEQ ID NO:28)
KRAS 35A P3A:5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCAGA-3’(SEQ ID NO:29)
循环条件是95℃2min；50个循环95℃20sec，53℃1min和70℃30sec；并保持在40℃。荧光信号获取是在循环的53℃的点完成的。PCR反应在480Multiwell96Plates(Roche,Indianapolis)上、于含7.5mM MgCl2和250μM dNTPs(Promega,Madison,Wisconsin)的10mM MOPS pH 7.5中完成。Taq聚合酶是iTaq酶(BioRad,Hercules,California)，切割酶是Cleavase 2.0(Hologic,Madison,Wisconsin)。正向引物浓度是500nM，反向引物浓度是500nM，活瓣探针是500nM，并且FRET盒于终浓度200nM使用。所有的扩增和检测在LightCycler 480光学热循环仪(Roche,Indianapolis,Indiana)上进行。
包含KRAS基因(无论是野生型还是分别是三个突变体之一)的片段的质粒用于评估实验系统检测掺入野生型拷贝中KRAS 35A、T或C突变体拷贝的能力，在4种不同突变体水平进行，包括104突变体拷贝于105野生型拷贝(1：10)，103突变体拷贝于105野生型拷贝(1：100)，102突变体拷贝于105野生型拷贝(1：1000)和10突变体拷贝于105野生型拷贝(1：10000)。
图7显示扩增样品中突变体与野生型的不同比例的动力学扩增曲线数据和“交叉点”(Cp；Roche LightCycler 480手册,Indianapolis,IN)。在这些分析中，Cp作为荧光上升至最大荧光的18％的点进行计算。在所检测的5个引物/侵入探针设计中，发现倒数第二位错配，产生C:C错配，指定为KRAS 35A P2C，显示在过量野生型序列存在时定量突变体的能力最佳，显示对1：1000突变体/野生型的水平的剂量效应(图7)。
本说明书还包括下列内容：
1.一种样品分析方法，其包括：
a)从样品扩增产物以产生扩增的样品，所述样品包含基因组座位的野生型拷贝和所述基因组座位的突变体拷贝，所述突变体拷贝相对于所述基因组座位的所述野生型拷贝具有点突变；
其中：
i.所述扩增使用第一引物和第二引物完成；以及
ii.所述第一引物包含与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸，还包含与所述基因组座位中除了在所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；
b)使用活瓣分析检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用：
i.侵入寡核苷酸，其具有与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸，和
ii.活瓣寡核苷酸，其包含与所述点突变碱基配对的核苷酸。
2.实施方式1的方法，其中所述第一引物用作所述活瓣分析中所述侵入寡核苷酸。
3.实施方式1或2的方法，其中所述样品含有的所述基因组座位的野生型拷贝为所述基因组座位的突变体拷贝的至少100倍。
4.实施方式1-3任一项的方法，进一步包括将所述扩增的样品中所述产物的量相对于所述样品中存在的对照核酸的量进行标准化，从而确定所述样品中所述突变拷贝的量。
5.实施方式4的方法，其中所述对照核酸是不同于所述基因组座位的座位。
6.实施方式4或5的方法，其中所述对照核酸使用活瓣分析检测，所述活瓣分析采用具有于所述点突变位点与所述基因组座位的所述野生型拷贝碱基配对的3’末端核苷酸的侵入寡核苷酸，从而检测所述样品中所述基因组座位的野生型拷贝的存在。
7.实施方式4-6任一项的方法，其中所述活瓣分析采用第一活瓣分析试剂，所述第一活瓣分析试剂包括第一侵入寡核苷酸、具有第一活瓣和第一FRET盒的第一活瓣探针，并且其中所述对照核酸使用第二活瓣分析试剂来检测，所述第二活瓣分析试剂包括第二侵入寡核苷酸、具有第二活瓣和产生可区分于所述第一FRET盒的信号的第二FRET盒的第二活瓣探针，其中所述第一和第二活瓣试剂处于相同的反应混合物中。
8.实施方式1-7任一项的方法，其中所述基因组座位的突变与癌症相关联。
9.实施方式8的方法，其中所述基因组座位是KRAS基因。
10.实施方式8的方法，其中所述基因组座位是BRAF基因。
11.实施方式1-10任一项的方法，其中所述样品获取自人。
12.实施方式11的方法，其中所述样品是粪便。
13.实施方式12的方法，还包括基于在所述粪便中所述基因组座位的突变体拷贝是否被鉴定出来对结肠癌或腺瘤进行诊断。
14.实施方式1-13任一项的方法，其中所述第一引物中所述错配是相对于所述末端核苷酸位于位置-1、位置-2、位置-3、位置-4或位置-5。
15.实施方式1-14任一项的方法，其中所述扩增和检测步骤使用含有PCR试剂和活瓣试剂的反应混合物完成，并且在所述扩增和检测步骤之间没有向所述反应混合物中加入额外的试剂。
16.实施方式15的方法，其中所述反应混合物进一步包含用于扩增和检测第二基因组座位的PCR试剂和活瓣试剂。
17.实施方式15的方法，其中所述反应混合物进一步包含用于扩增和检测第二基因组座位中点突变的PCR试剂和活瓣试剂。
18.一种反应混合物，其包含：
a)扩增试剂，其包括热稳定的聚合酶、核苷酸、用于从核酸样品扩增靶基因组座位的第一引物和第二引物；其中第一引物：
i.包含与所述基因组座位中点突变碱基配对的3’末端核苷酸；以及
ii.包含与所述基因组座位中除了所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；
b)活瓣分析试剂，其包括活瓣核酸内切酶、FRET盒、和包含与所述点突变碱基配对的核苷酸的活瓣寡核苷酸；
c)所述核酸样品，其中所述核酸样品包含所述基因组座位的野生型拷贝和所述基因组座位的突变体拷贝，所述基因组座位的突变体拷贝相对于基因组座位的所述野生型拷贝具有点突变；
其中所述反应混合物特征在于其能够扩增和检测所述样品中所述基因组座位的所述突变体拷贝的存在。
19.实施方式16的反应混合物，其中反应混合物任选地包含与所述第一引物不同的、具有与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸的侵入寡核苷酸。
20.一种试剂盒，其包括：
a)PCR试剂，其包括第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含与基因组座位中的点突变碱基配对的3’末端核苷酸，还包含与所述基因组座位中除了所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；以及
b)活瓣分析试剂，其包括侵入寡核苷酸和活瓣寡核苷酸，所述侵入寡核苷酸具有与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸，所述活瓣寡核苷酸包含与所述点突变碱基配对的核苷酸。
21.实施方式20的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于扩增和检测对照核酸的PCR试剂和活瓣试剂。
22.实施方式21的试剂盒，进一步包括用于进行实施方式1的方法的说明书。

Claims (22)

1.一种用于非诊断目的的样品分析方法，其包括：
(a)从样品扩增产物以产生扩增的样品，所述样品包含KRAS的野生型拷贝和KRAS的突变体拷贝，所述突变体拷贝相对于KRAS的所述野生型拷贝具有点突变；其中：
(i)所述扩增使用第一引物和第二引物完成；以及
(ii)所述第一引物
包含与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸，还
包含与KRAS中除了在所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；
(b)使用活瓣分析检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用：
(i)所述第一引物，和
(ii)活瓣寡核苷酸，其包含与所述点突变碱基配对的核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述样品含有的KRAS的野生型拷贝为KRAS的突变体拷贝的至少100倍。
3.权利要求1的方法，进一步包括
将所述扩增的样品中所述产物的量相对于所述样品中存在的对照核酸的量进行标准化，
从而确定所述样品中所述突变拷贝的量。
4.权利要求3的方法，其中所述对照核酸是不同于KRAS的座位。
5.权利要求3的方法，
其中所述活瓣分析采用第一活瓣分析试剂，所述第一活瓣分析试剂包括所述具有第一活瓣和第一FRET盒的第一活瓣探针，并且
其中所述对照核酸使用第二活瓣分析试剂来检测，所述第二活瓣分析试剂包括具有第二活瓣和产生可区分于所述第一FRET盒的信号的第二FRET盒的第二活瓣探针，
其中所述第一和第二活瓣试剂处于相同的反应混合物中。
6.权利要求1的方法，其中所述样品获取自人。
7.权利要求6的方法，其中所述样品是自粪便提取的DNA。
8.权利要求1的方法，其中所述第一引物中所述错配是相对于所述末端核苷酸位于位置-1、位置-2、位置-3、位置-4或位置-5。
9.权利要求1的方法，其中
所述扩增和检测步骤使用含有PCR试剂和活瓣试剂的反应混合物完成，并且
在所述扩增和检测步骤之间没有向所述反应混合物中加入额外的试剂。
10.权利要求9的方法，其中所述反应混合物进一步包含用于扩增和检测第二基因组座位的PCR试剂和活瓣试剂。
11.权利要求10的方法，其中所述反应混合物进一步包含用于扩增和检测第二基因组座位中点突变的PCR试剂和活瓣试剂。
12.一种反应混合物，其包含：
(a)扩增试剂，其包括热稳定的聚合酶、核苷酸、用于从核酸样品扩增靶KRAS的第一引物和第二引物；其中第一引物包含：
(i)与KRAS中点突变碱基配对的3’末端核苷酸；以及
(ii)与KRAS中除了在所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；
(b)活瓣分析试剂，其包括活瓣核酸内切酶、FRET盒、和包含与所述点突变碱基配对的核苷酸的活瓣寡核苷酸；
(c)所述核酸样品，其中所述核酸样品包含KRAS的野生型拷贝和KRAS的突变体拷贝，KRAS的突变体拷贝相对于KRAS的所述野生型拷贝具有点突变；
其中所述反应混合物不包含与所述第一引物不同的侵入寡核苷酸，并且
其中所述反应混合物特征在于其能够扩增和检测所述样品中KRAS的所述突变体拷贝的存在。
13.权利要求12的反应混合物，其中所述反应混合物还包含用于扩增和检测对照核酸的扩增试剂和活瓣测定试剂。
14.权利要求12的反应混合物，其中所述KRAS是人KRAS。
15.权利要求12的反应混合物，其中所述样品获取自人。
16.权利要求15的反应混合物，其中所述样品是自粪便提取的DNA。
17.权利要求12的反应混合物，其中所述第一引物中所述错配是相对于所述末端核苷酸位于位置-1、位置-2、位置-3、位置-4或位置-5。
18.一种试剂盒，其包括：
(a)PCR试剂，其包括第一引物和第二引物，其中所述第一引物
包含与KRAS中的点突变碱基配对的3’末端核苷酸，还
包含与KRAS中除了在所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；以及
(b)活瓣分析试剂，其包括活瓣寡核苷酸，所述活瓣寡核苷酸包含与所述点突变碱基配对的核苷酸，
其中所述活瓣测定试剂不包含与所述第一引物不同的侵入寡核苷酸。
19.权利要求18的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于扩增和检测对照核酸的PCR试剂和活瓣试剂。
20.权利要求18的试剂盒，其进一步包括用于进行权利要求1的方法的说明书。
21.权利要求18的试剂盒，其中所述KRAS是人KRAS。
22.权利要求18的试剂盒，其中所述第一引物中所述错配是相对于所述末端核苷酸位于位置-1、位置-2、位置-3、位置-4或位置-5。
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